MAGISTRSKO DELO

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

MAGISTRSKO DELO

Tjaša Sorčan

2021

(2)

(3)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE BIOKEMIJA

Ugotavljanje korelacije med trdnostjo celic in mutacijami v keratinih v človeških keratinocitih

MAGISTRSKO DELO

Tjaša Sorčan

MENTOR: prof. dr. Damjana Rozman

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

magistrskega dela

Spodaj podpisana Tjaša Sorčan sem avtorica magistrskega dela z naslovom: Ugotavljanje korelacije med trdnostjo celic in mutacijami v keratinih v človeških keratinocitih.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof. dr.

Damjane Rozman;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

 je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, dne 1.9.2021 Podpis avtorice:

(6)

(7)

Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Biokemija.

Delo je bilo opravljeno na Inštitutu za biokemijo in Inštitutu za biofiziko, Medicinski fakulteti, Univerze v Ljubljani.

Senat UL FKKT je za mentorico imenoval prof. dr. Damjano Rozman.

Recenzenta: doc. dr. Vera Župunski, izr. prof. dr. Marko Novinec.

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela

Predsednica komisije: doc. dr. Vera Župunski

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Članica: prof. dr. Damjana Rozman

Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Center za funkcijsko genomiko in biočipe

Član: izr. prof. dr. Marko Novinec

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

(8)

(9)

Zahvala

Najprej bi se rada zahvalila moji delovni mentorici, znanst. sod. dr. Mirjani Liović. Najlepša hvala za vse predano znanje, potrpežljivost in spodbudo pri opravljanju magistrskega dela.

Hvala tudi moji mentorici, prof. dr. Damjani Rozman, za vso pomoč in hitro odzivnost pri pisanju magistrskega dela.

Zahvalila bi se tudi celotni skupini Medicinskega centra za molekularno biokemijo, katera mi je vedno priskočila na pomoč, če sem kaj potrebovala.

Zahvala gre tudi Inštitutu za biofiziko, predvsem Špeli, za vso pomoč pri samem delu in interpretaciji rezultatov.

Iskrena hvala tudi dragima mami in očetu ter Davidu za vso podporo pri študiju.

Hvala tudi vsem ostalim, ki ste mi vsa ta leta stali ob strani.

(10)

(11)

Ugotavljanje korelacije med trdnostjo celic in mutacijami v keratinih v človeških keratinocitih

Povzetek

Keratinski filamenti so glavni strukturni element v epitelijskih celicah. V celicah vzdržujejo obliko in trdnost ter zagotavljajo fizično odpornost na mehanske obremenitve. Opisanih je bilo več različnih mutacij v keratinih, ki vodijo v različne tipe bolezni. Za mutacije v keratinih 5 in 14 je znano, da povzročijo nastanek bulozne epidermolize simpleks (EBS), bolezni krhkosti kože. V magistrskem delu smo preučevali točkovno mutacijo K14 R125P, ki povzroča hudo obliko EBS. Tipičen fenotipski pojav ob mutaciji je nastanek agregatov, ki pa še ni natančno razložen. Z uporabo optične pincete smo določili togost keratinocitov z vstavljenim konstruktom dodatne kopije K14, z mutacijo R125P, za različne količine mutiranega keratina. Ugotovili smo, da se razlika v togosti pojavi zgolj pri celicah z najnižjim deležem mutiranega keratina, pri katerih smo opazili tudi največ celic z agregati. Agregati so dinamičen organel, ki ga celica lahko reciklira s pomočjo proteosomalnega sistema, kot smo dokazali z njegovo inhibicijo in prenosom po Westernu. Z matematičnim modeliranjem smo razložili tudi nastanek agregatov – z asimetrično vezavo, pri kateri sodelujeta tako keratin divjega tipa kot mutirani keratin, kasneje pa agregati rastejo ob dodajanju predvsem mutiranega keratina.

Ključne besede: epidermis, keratinociti, bulozna epidermoliza simpleks, keratin 14, agregati

(12)

(13)

Determination of correlation between cell strength and keratin gene mutations in human keratinocytes

Abstract

Keratin filaments are a major structural element in epithelial cells. They maintain shape and stiffness of cells by providing physical resistance to mechanical stress. Several different mutations in keratins leading to different types of disease have been described. Mutations in keratins 5 and 14 are known to cause the formation of epidermolysis bullosa simplex (EBS), a disease of skin fragility. In the master's thesis, we studied the point mutation K14 R125P, which causes a severe form of EBS. A typical phenotypic phenomenon with mutation is the formation of aggregates, which has not yet been explained in detail. Using optical tweezers, the stiffness of keratinocytes was determined by inserting a construct with additional copy of K14, with the R125P mutation, for different amounts of mutated keratin. We found that the difference in stiffness occurs only in cells with the lowest amount of mutated keratin, where we also observed the most aggregates. Aggregates are a dynamic organelle that can be recycled by a cell through a proteosomal system, as demonstrated by inhibition and western transfer. With mathematical modeling we also explained the formation of aggregates - with asymmetric binding in which both wild-type keratin and mutated keratin participate, and later the aggregates grow with the addition of mainly mutated keratin.

Keywords: epidermis, keratinocytes, bullous epidermolysis simplex, keratin 14, aggregates

(14)

(15)

Kazalo

1 UVOD ... 1

1.1 STRUKTURA IN FUNKCIJA KOŽE ... 1

1.1.1 Podkožje ... 1

1.1.2 Usnjica ... 2

1.1.3 Povrhnjica ... 2

1.2 INTERMEDIARNI FILAMENTI ... 4

1.2.1 Keratini ... 6

1.3 BULOZNA EPIDERMOLIZA ... 11

1.3.1 Bulozna epidermoliza simpleks ... 13

2 NAMEN DELA ... 19

3 EKSPERIMENTALNI DEL ... 21

3.1 OPREMA IN MATERIALI ... 21

3.1.1 Laboratorijska oprema ... 21

3.1.2 Sterilna plastika ... 22

3.1.3 Kemikalije, pufri in raztopine ... 23

3.1.4 Protitelesa za prenos po Westernu ... 24

3.1.5 Uporabljena celična linija ... 25

3.1.6 Gojišče ... 26

3.2 M^ETODE ... 27

3.2.1 Delo s celicami ... 27

3.2.2 Prenos po Westernu in detekcija proteinov ... 29

3.2.3 Določanje togosti celične membrane z optično pinceto... 34

3.2.4 Mikroskopiranje fluorescenčno označenih celic ... 35

3.2.5 Določanje deleža K14 v peletih vzorcev ... 35

3.2.6 Inhibicija proteasoma ... 36

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 37

4.1 DOLOČANJE DELEŽA KONSTRUKTA V CELICAH ... 37

4.2 DOLOČANJE TOGOSTI CELIČNE MEMBRANE ... 38

4.3 DOLOČANJE ŠTEVILA CELIC Z AGREGATI ... 40

4.4 DOLOČANJE DELEŽA K14 V PELETIH VZORCEV ... 43

4.5 INHIBICIJA PROTEASOMA ... 44

4.6 DINAMIKA KERATINA V CELICAH ... 45

5 ZAKLJUČEK ... 47

6 LITERATURA ... 49

(16)

(17)

Kazalo slik

S^LIKA1:SESTAVA KOŽE. ... 1

S^LIKA2:DOMENE PROTEINOV INTERMEDIARNIH FILAMENTOV. ... 5

SLIKA 3:SESTAVLJANJE INTERMEDIARNIH FILAMENTOV.. ... 6

SLIKA 4:SHEMATSKI PRIKAZ DELA KOŽE, KJER SE STIKAJO EPIDERMIS, BAZALNA MEMBRANA IN DERMIS. ... 13

SLIKA 5:PRIKAZ STRUKTURE KERATINA IN NAJPOGOSTEJŠIH MUTACIJ, KI SO OPISANE PRI K5 IN K14. ... 15

S^LIKA6:CELIČNA LINIJA NEB-1 Z VSTAVLJENIM KONSTRUKTOM EGFP-K14WT^OZIROMAEGFP-K14 Z MUTACIJO R125P. ... 16

S^LIKA7:DIAGRAM DINAMIKE KERATINA V CELICAH.. ... 16

SLIKA 8:SHEMA SENDVIČA ZA PRENOS PO WESTERNU ZA DVA GELA. ... 32

SLIKA 9:PRIKAZ DELEŽA FLUORESCENTNO OZNAČENEGA KONSTRUKTA DODATNE KOPIJE K14 GLEDE NA ENDOGENI K14.. ... 37

SLIKA 10:DOLOČANJE TOGOSTI CELIČNE MEMBRANE CELIC NEB-1 PRI RAZLIČNIH DELEŽIH KONSTRUKTA Z DODATNO KOPIJO K14.. ... 39

S^LIKA11:MIKROSKOPSKA SLIKA CELIC NEB-1^S25-ODSTOTNIM DELEŽEM VSTAVLJENEGA KONSTRUKTA DODATNE KOPIJE K14 Z MUTACIJO R125P.. ... 41

SLIKA 12:MIKROSKOPSKA SLIKA CELIC NEB-1 S 50-ODSTOTNIM DELEŽEM VSTAVLJENEGA KONSTRUKTA DODATNE KOPIJE K14 Z MUTACIJO R125P. ... 42

SLIKA 13:MIKROSKOPSKA SLIKA CELIC NEB-1 S 100-ODSTOTNIM VSTAVLJENIM KONSTRUKTOM DODATNE KOPIJE K14 Z MUTACIJO R125P. ... 42

S^LIKA14:D^ELEŽK14 V TOPNI IN PELETNI FRAKCIJI PROTEINSKIH IZOLATOV CELIC NEB-1 Z VSTAVLJENIM KONSTRUKTOM DODATNE KOPIJE K14 Z MUTACIJO R125P.. ... 43

SLIKA 15:MIKROSKOPSKI SLIKI PRED IN PO TRETIRANJU NEB-1 Z INHIBITORJEM PROTEASOMA MG-132 ... 44

SLIKA 16:NOV PREDPOSTAVLJEN MATEMATIČNI MODEL DINAMIKE KERATINA V CELICI. ... 45

SLIKA 17:MODEL DINAMIKE KERATINA V CELICI.. ... 46

Kazalo tabel TABELA 1:DELITEV INTERMEDIARNIH FILAMENTOV NA 6 PODTIPOV IN NJIHOVA LOKACIJA V TELESU.. ... 6

TABELA 2:PRIKAZ NAJPOGOSTEJŠIH MEST ZA MUTACIJE PRI EBS. ... 14

TABELA 3:SEZNAM UPORABLJENIH KEMIKALIJ. ... 23

TABELA 4:SEZNAM UPORABLJENIH KEMIKALIJ ZA PRIPRAVO PUFRA B. ... 24

T^ABELA5:SEZNAM UPORABLJENIH PRIMARNIH PROTITELES. ... 24

T^ABELA6:SEZNAM UPORABLJENIH SEKUNDARNIH PROTITELES. ... 24

TABELA 7:OKRAJŠAVE ZA UPORABLJENE CELIČNE LINIJE. ... 25

TABELA 8:SEZNAM UPORABLJENIH KEMIKALIJ ZA PRIPRAVO GOJIŠČA. ... 26

TABELA 9:ABSORBANCE PRI VALOVNI DOLŽINI 562 NM ZA GOVEJI SERUMSKI ALBUMIN ZA VSE ZNANE KONCENTRACIJE Z METODO BCA. ... 30

T^ABELA10:SEZNAM USTREZNIH RAZREDČITEV PRIMARNIH PROTITELES V 5-ODSTOTNEM MLEKU. ... 33

T^ABELA11:SEZNAM USTREZNIH RAZREDČITEV SEKUNDARNIH PROTITELES V 5-ODSTOTNEM MLEKU. ... 33

T^ABELA12:DELEŽ CELIC Z AGREGATI... 41

(18)

(19)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

AK aminokislina

Bad agonist celične smrti, povezan z Bcl2 (angl. Bcl2 associated agonist of cell death)

Bcl-xL zelo velik B-celični limfom (angl. B-cell lymphoma-extra large)

bd bidestiliran

BSA goveji serumski albumin Casp-3 kaspaza 3

DMSO dimetil sulfoksid

DPBS fosfatni pufer Dulbecco z NaCl EB bulozna epidermoliza

EBS bulozna epidermoliza simpleks

EDC epidermalni diferenciacijski kompleks EGF epidermalni rastni faktor

EGFR receptor epidermalnega rastnega faktorja

Fas površinski antigen, povezan s FS-7 (angl. FS-7-associated surface antigen), znan tudi kot apoptotski antigen 1 (APO-1)

FADD protein z domeno smrti, povezan s Fas (angl. Fas-associated protein with death domain)

FBS fetusni serum goveda

GAPDH gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (angl. glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)

GFAP glialni fibrilarni kisli protein (angl. glial fibrillary acidic protein) HIP peptidi, ki začnejo s tvorbo vijačnice (angl. helix initiation peptides) HTP peptidi, ki zaključijo vijačnico (angl. helix termination peptides)

(20)

(21)

K14 keratin 14

KFAP proteini, povezani s keratinskimi filamenti (angl. keratin filament associated proteins)

KLK5 kalikrein 5 KRT14 gen za keratin 14

MAPK z mitogenom aktivirana protein kinaza (angl. mitogen-activated protein kinase)

NF-L/M/H lahki/srednji/težki polipeptid nevrofilamentov (angl. neurofilament light/medium/heavy polypeptide)

PVDF poliviniliden difluorid (angl. polyvinylidene difluoride) SDS natrijev dodecilsulfat

TMAO trimetilamin N-oksid

(22)

(23)

Sorčan T. Ugotavljanje korelacije med trdnostjo celic in mutacijami v keratinih v človeških keratinocitih.

Magistrsko delo. Univerza v Ljubljani, FKKT. Ljubljana, 2021.

1

1 Uvod

1.1 Struktura in funkcija kože

Koža je največji organ človeškega telesa in je posledično tudi zelo kompleksna. Predstavlja okoli 2 m² površine odraslega človeka in 15 % telesne teže. Njena glavna naloga je ščititi pred zunanjimi vplivi, npr. zaščita pred patogeni, UV sevanjem, mehanskimi poškodbami in kemijskimi vplivi. Omogoča tudi uravnavanje telesne temperature, shranjevanje lipidov in vode, sintezo vitamina D, ohranjanje ravnovesja tekočin, deluje kot vodoodporna pregrada, hkrati pa nam omogoča interakcijo z zunanjim svetom. Je izredno dinamičen organ, saj se konstantno spreminja, hkrati pa tudi zelo občutljiv, saj lahko s kožo zaznamo tudi najmanj opazne dotike [1].

Koža je sestavljena iz treh plasti, in sicer povrhnjice, usnjice in podkožja (slika 1).

Slika 1: Sestava kože. Na sliki so prikazane vse tri plasti: podkožje, usnjica in vrhnjica, ter najpomembnejši sestavni deli le-teh (povzeto po [2]).

1.1.1 Podkožje

Podkožje oziroma hipodermis predstavlja najbolj notranji sloj kože in povezuje usnjico z mišičnim tkivom. V njem najdemo predvsem maščobne celice, kolagenska vlakna in

(24)

2

debelejše krvne žile ter živce. Služi kot vir zaloge energije, je dober izolator telesa in ščiti notranje organe s tem, da deluje kot amortizer [1, 2].

1.1.2 Usnjica

Usnjica oziroma dermis predstavlja srednji sloj kože. Razdelimo jo lahko na dve plasti, in sicer na spodnjo plast (stratum reticulare) in zgornjo plast (stratum papillare). Spodnja plast tvori mejo s podkožjem, zgornja pa se valovito stika s povrhnjico. V usnjici poleg vode najdemo predvsem kolagen in elastin, ki koži zagotavljata prožnost in jo hkrati naredita čvrsto. Zaradi tega je koža izredno dober blažilec udarcev, v primeru poškodbe, pa je v sloju prisotnih tudi veliko fibroblastov in mastocitov, ki celijo rane. Omenjena vlakna obdaja glikoproteinski gel, ki ima veliko zmogljivost vezave vode. Celoten sloj je tudi prepreden z žilami, ki povrhnjici dovajajo hrano ter kisik in odvajajo odpadne snovi ter pomagajo pri oddajanju toplote. Tu najdemo tudi limfne žile, živčne končiče, čutilna telesca in lasne korenine ter žleze lojnice in žleze znojnice. Lojnice izločajo sebum, znojnice pa znoj (sestavljajo ga voda, soli, sečnina, sečna kislina in maščobne kisline) na površje kože, s čimer tvorijo hidrolipidni film. Ta je izredno pomemben, saj predstavlja dodatno zaščito pred patogeni [2, 3].

1.1.3 Povrhnjica

Povrhnjica oziroma epidermis je najbolj zunanji sloj kože in hkrati tudi biološko najaktivnejši. V 75 – 150 µm debelem sloju nastajajo in dozorevajo keratinociti v procesu keratinizacije, ki traja približno 4 tedne. Gre za proces diferenciacije živih celic v mrtve celice, napolnjene s keratinom.

Glede na stopnjo zorenja keratinocitov jo razdelimo na 4 oziroma 5 plasti, to so bazalna, trnasta, zrnata, svetleča in poroženela plast. Prva, bazalna plast (stratum basale) je najbližje usnjici, loči ju le tanka plast bazalne membrane, na katero so z hemidezmosomi pritrjeni keratinociti. V bazalni plasti najdemo epidermalne zarodne celice, nujne za regeneracijo povrhnjice, melanocite (proizvodnja pigmenta) ter Langerhansove (imunske celice) in Merklove celice (mehanoreceptorji). Z mitozo v bazalni plasti nastajajo nove celice, ki zorijo in migrirajo na površje, kjer nadomestijo odmrle celice [2, 3].

Naslednja je trnasta plast (stratum spinosum), v kateri se začne keratinizacija. Hčerinske celice iz bazalne plasti takoj začnejo proces dokončne diferenciacije. Keratinociti imajo v trnasti plasti velika jedra, ki so aktivna pri sintezi proteinov – predvsem keratina 1 in 10 (namesto keratinov 5 in 14, ki ju sintetizirajo v bazalni plasti) ter kaspaze-14. Vsi omenjeni proteini so markerji za diferenciacijo. Keratinociti imajo v tej plasti vretenasto obliko [4].

(25)

3

V zrnati plasti (stratum granilosum) keratinociti vsebujejo skrčeno celično jedro in granule iz keratohialina. Te granule vsebujejo profilagrin. Gre za prekurzor filagrina, ki ga dobimo med zorenjem do poroženele plasti s proteolitično cepitvijo. Filagrin ima dve funkciji, in sicer združuje in povezuje keratinska vlakna ter je vir prostih aminokislin, ki so bistvenega pomena za normalno hidratacijo. V tej plasti nastane tudi skupek proteinov, imenovan epidermalni diferenciacijski kompleks (EDC). V prehodu do poroženele plasti se aktivira kaspaza-14, ki prispeva k razgradnji filagrina, hkrati pa pride tudi do prečnega povezovanja keratina in ostalih proteinov z encimi iz družine transglutaminaz [4, 5].

Naslednja, svetleča plast (stratum lucidium) je plast, v kateri celice ležijo tesno skupaj in so sploščene, meje med njimi so zabrisane. Zanjo je značilen učinek lomljenja svetlobe.

Najdemo jo le na predelih z debelejšo kožo (dlani in podplati), kjer debelina povrhnjice lahko doseže 600 µm [3].

Zadnja, poroženela plast (stratum corneum) je najbolj zunanja plast povrhnjice, v kateri najdemo sploščene odmrle celice brez jedra, imenovane korneociti. Slednji so dokončno diferencirani keratinociti, bogati s keratinom. Prečno povezana keratinska vlakna tvorijo kornificirano ovojnico, preko katere so korneociti tesno povezani s korneodezmosomi, hkrati pa ovojnica zagotavlja mehansko trdnost. Vgrajeni so v ekstracelularni matriks, bogat z lipidi (ceramidi, holesterol, maščobne kisline). Lipidi se sprostijo iz lamelarnih telesc, ki nastanejo z odcepom od Golgijevega aparata keratinocitov v trnasti plasti, nato pa migrirajo proti poroženeli plasti. Lipidni matriks ima pomembno vlogo pri koheziji celic in luščenju, predvsem pa deluje kot bariera, ki zaščiti telo pred izgubo vode [5, 6, 7].

Keratinizacija ima več stopenj, ki so ireverzibilne, kar celico pripelje v celično smrt. Tri pomembne stopnje, ki vodijo k celični smrti, so razgradnja molekularne mašinerije, ki omogoča zaznavanje. Z odstranitvijo mitohondrijem je prekinjen dovod energije, razgradi se tudi jedro in posledično DNA. Tudi če je kakšna stopnja blokirana, keratinociti sčasoma umrejo [5].

1.1.3.1 Celični stiki med keratinociti

Keratinociti so med seboj tesno povezani z medceličnimi stiki preko intermediarnih filamentov – keratinov. Najpomembnejši je dezmosom, pri katerem gre za stik med dvema sosednjima celicama. Intermediarni filamenti znotraj ene celice so preko citosolnega plaka vezani na transmembranske adhezijske proteine iz družine kadherinov (dezmoglein in dezmokolin), ki prvo celico povezujejo z drugo. Citosolni plak je pomemben za povezovanje transmembranskih proteinov s citoskeletnimi elementi. Sestavljen je iz dezmoplakinov, ki so odgovorni za ustrezno vezavo keratinskih filamentov in samo funkcijo dezmosoma, ter plakofilinov (plakofilini 1–3) in plakoglobinov, ki so pomembni za vezavo s kadherini [8].

(26)

4

Keratinocite na bazalno membrano med usnjico in povrhnjico vežejo medcelični stiki, imenovani hemidezmosomi. Hemidezmosom predstavlja stik med celico in ekstracelularnim matriksom in je sestavljen podobno kot dezmosom. Tu so intermediarni filamenti vezani preko plektina in BP230 na transmembranske adhezijske proteine integrine, ki se v matriksu vežejo na lamine [9].

Korneodezmosomi predstavljajo medcelične stike med korneociti. Gre za spremenjene dezmosome. Glavne zunajcelične sestavine korneodesmosomov so dezmoglein 1 in dezmokolin 1 (enako kot pri dezmosomih) ter korneodezmozin. To je glikoprotein, ki se spontano vgradi med adhezijska proteina in okrepi povezavo. Dobimo ga ob sprostitvi iz lamelarnih telesc [10, 11].

1.1.3.2 Deskvamacija

Skozi proces keratinizacije se keratinociti dokončno diferencirajo – izgubijo možnost proliferacije, postanejo večji in ploščati. Jedro se razgradi, izginejo tudi celični organeli, vendar ta dva mehanizma do danes še nista popolnoma razjasnjena. Na koncu se odluščijo od kože v procesu deskvamacije. Do deskvamacije pride ob razgradnji korneodezmosomov.

Razgradnjo uravnavajo številne proteaze in njihovi inhibitorji [12]. Ene najpomembnejših so kalikreini (KLK5 in KLK7), serinske proteaze. V pro-obliki so shranjeni v lamelarnih telescih, nato pa se ob zlitju z membrano sprostijo v zunajcelični prostor. S proteolizo kalikrein dozori in cilja korneodezmosome oziroma razgradi njegove zunajcelične proteine:

dezmoglein, dezmokolin in korneodezmozin [5]. Drugi regulatorji so še matriptaze, meprin in mezotripsin [12].

1.2 Intermediarni filamenti

Keratinociti vsebujejo keratinske intermediarne filamente, ki so zelo pomembni pri povezovanju celic (dezmosom, hemidezmosom). So del citoskeleta, ki celici zagotavlja predvsem obliko in trdnost, hkrati pa omogoča tudi spreminjanje celice, gibanje organelov, sodeluje pri celični delitvi in signalizaciji. Poleg intermediarnih filamentov med citoskelet uvrščamo še aktinske filamente in mikrotubule. Med seboj se razlikujejo v velikosti in vrsti družine proteinov, ki jih sestavljajo [13].

Intermediarni filamenti (IF) so heterogena skupina, ki jo kodira več kot 70 genov. Različno se izražajo med embriološkim razvojem in so hkrati tudi tkivno specifični. V nasprotju z mikrotubuli in aktinskimi filamenti se ne izražajo v rastlinah in glivah. Proteini iz družine intermediarnih filamentov imajo različno primarno aminokislinsko zaporedje, a podobno organizacijo domen (slika 2). Sestavljeni so iz osrednje α-helikalne regije, dolge približno

(27)

5

310 aminokislin, ki jo lahko nadalje razdelimo na 4 poddomene (1A, 1B, 2A in 2B) in 3 povezovalna zaporedja (L1, L12 in L2). Število aminokislin, ki jih najdemo v posameznih poddomenah (izjema je poddomena 1B), je striktno ohranjeno pri različnih vrstah proteinov IF. Poddomena 1A vsebuje 35 aminokislin, 2A vsebuje 19 aminokislin, 2B pa 115, medtem ko domena 1B lahko vsebuje od 101 do 143 aminokislin. Poddomene so sestavljene iz zaporednih ponavljajočih se enot, ki vsebujejo hidrofobne ostanke na prvem in četrtem mestu na vsakih 7 ostankov – heptadne ponovitve. Zaradi teh hidrofobnih interakcij so zvite α- vijačnice nagnjene k dimerizaciji v obliko ovite vijačnice. Osrednjo α-helikalno regijo pogosto prekinja tudi zaporedje imenovano »stutter« (v prevodu jecljanje), ki lahko lokalno spremeni karakter vijačnice. Na N-koncu helikalno regijo omejuje glava, na C-koncu pa rep.

Konca sta precej bolj fleksibilni in variabilni strukturi, ki ju lahko razdelimo na tri regije:

E1/2 – skrajno poddomeno, ki je močno nabita, V1/2 – variabilno poddomeno, ki vsebuje ohlapne motive ponovitve zaporedja, ter H1/2 – hipervariabilno poddomeno, ki pogosto vsebuje tarčna mesta za fosforilacijo [14, 15].

Slika 2: Domene proteinov intermediarnih filamentov. Z zeleno je označena α-helikalna domena in njena razdelitev na poddomene (1A, 1B, 2A, 2B) ter povezovalna zaporedja (L1, L12, L2). S črno barvo sta označeni glava in rep ter njune poddomene (E1/2, V1/2, H1/2).

Črka S predstavlja prekinjajoče zaporedje »stutter«.

Intermediarni filamenti imajo zmožnost samosestavljanja v filamente citoskeleta (slika 3).

Poglavitno vlogo pri sestavljanju ima osrednja α-helikalna domena, prek katere interagirata dva monomera v dimer (ovita vijačnica), dva dimera pa nato z antiparalelno povezavo tvorita tetramer. Osem tetramerov se lateralno poveže v osnovno enoto ULF (angl. unit length filaments) debeline 16 nm in dolžine 58 nm. Z longitudinalnim dodajanjem osnovnih enot ULF dobimo daljši filament, ki se nato kompaktnejše zapakira na debelino 10 nm [16, 17].

Sestavljanje je regulirano s cikli fosforilacije in defosforilacije. Polimerizacija IF se zgodi hitro in ne potrebuje dodatnih kofaktorjev [15].

(28)

6

Slika 3: Sestavljanje intermediarnih filamentov. IF dobimo z longitudinalnim sestavljanjem osnovnih enot (ULF), ki se nato še kompaktneje zapakirajo na debelino 10 nm. Osnovne enote dobimo z združitvijo osem tetramerov, pri kateri gre za antiparalelno povezavo dveh dimerov (prirejeno po [16]).

Intermediarne filamente lahko v grobem razdelimo na IF jedra (lamini) in IF citoplazme. Za vsa IF jedra je značilno jedrsko lokacijsko zaporedje (NLS) in C-terminalna škatla CAAX, tvorijo pa jedrsko lamino na notranji strani jedrske ovojnice in zagotavljajo mehansko oporo jedru. IF citoplazme teh dveh značilnosti nimajo, vendar so precej bolj raznoliki, saj zavzemajo kar 5 podtipov IF. Pri vretenčarjih IF sicer razdelimo na 6 podtipov glede na njihove lastnosti oziroma homologijo v α-helikalni domeni, kot prikazuje tabela 1 [16]:

Tabela 1: Delitev intermediarnih filamentov na 6 podtipov in njihova lokacija v telesu.

Povzeto po [16].

Podtip Proteini Lokacija

I kisli keratini epitelijske celice

II bazični/nevtralni keratini epitelijske celice

III vimentin, GFAP, dezmin, periferin mezenhimske celice, celice glije, endotelijske celice, mišična

vlakna, nevroni IV NF-L, NF-M, NF-H, α-interneksin,

nestin, sinemin

nevroni, celic glije, matične celice

V lamini (A, B, C) celično jedro

VI filensin, fakinin celice očesne leče

1.2.1 Keratini

Keratini so največji podtip intermediarnih filamentov, saj predstavljajo kar 54 od skupno 70 genov. Geni se nahajajo v dveh gručah na kromosomih 12 (bazični in nevtralni keratini) in 17 (kisli keratini). Z besedo keratin označimo celotno mešanico proteinov (keratine in KFAP) ter encimov iz epitelija, ki tvorijo filamente citoskeleta [18]. Zelo pomembno vlogo imajo

(29)

7

pri zagotavljanju integritete in mehanske stabilnosti tako epitelijskih celic kot epitelijskega tkiva preko medceličnih stikov [19]. So netopni v vodi, razredčenih kislinah in organskih topilih, hkrati pa so odporni na razgradnjo s proteazami, kot sta pepsin in tripsin [18]. Delimo jih na kisle in bazične/nevtralne keratine. Njihova molekulska masa se giblje med 40 in 70 kDa – kisli keratini so manjši (40–64 kDa), bazični/nevtralni so večji (52–70 kDa) [20].

Razlika med kislimi in bazičnimi/nevtralnimi keratini se skriva tudi v izoelektrični točki (pI), pH vrednosti, kjer je neto naboj molekule enak 0. Keratini tipa I imajo pI med 4,9 in 5,4, medtem ko imajo keratini tipa II pI med 6,5 in 8,5. Izoelektrična točka se lahko spreminja zaradi posttranslacijskih modifikacij aminokislin (AK) [18].

Poznamo še več vrst delitev keratinov, in sicer razdelimo jih lahko glede na strukturo osrednje regije, ki se lahko oblikuje v α-heliks ali β-list. Posledično keratine razdelimo na α- keratine, ki jih najdemo pri vretenčarjih (lasje, rogovi, kremplji sesalcev, nohti, povrhnjica kože), ter β-keratine, ki jih najdemo pri plazilcih in ptičih (kremplji, luske, perje, kljuni, povrhnjica kože) [21]. V nadaljevanju se bomo osredotočili zgolj na α-keratine.

Lahko jih delimo tudi glede na to, katere celice oziroma tkivo tvori določen tip keratina.

Epitelijske keratine predstavljajo keratini K1–K20. Za preprost, enoslojen epitelij je značilen par keratinov K8/K18, za razslojen epitelij pa K5/K14. Poznamo tudi strukturne keratine, ki sestavljajo trša tkiva, kot so lasje in nohti [15].

Keratine lahko razdelimo tudi glede na to, kako pogosto jih celice sintetizirajo. Omenjena keratinska para K8/K18 in K5/K14 sodita med primarni keratin, ki ga celice redno sintetizirajo. Poleg teh celice sintetizirajo tudi ostale tipe keratinov, ki jih imenujemo sekundarni keratin. V preprostem epiteliju je to keratinski par K7/K19, v razslojenem pa K6/K16 in K15 [18].

Delimo jih tudi glede na vrsto keratinizacije, ki je lahko mehka ali trda. Mehka je značilna za povrhnjico kože, trda pa za lasno skorjo, lasno ovojnico in nohte [22]. Keratin vsebuje veliko cisteinskih ostankov, ki se preko tiolne skupine (-SH) povezujejo in tvorijo močne kovalentne vezi. Te med seboj povezujejo obe verigi dimera v ovito vijačnico. Razlika med mehkim in trdim keratinom se torej skriva v številu cisteinskih povezav med verigama – mehkejši keratini imajo teh povezav manj [21]. Mehke keratine tipa II predstavljajo K1-K8 ter K71-K80, trde pa K81-K86. Mehke keratine tipa I predstavljajo K9-K23 ter K25-K28, trde pa K31-K40 [18].

1.2.1.1 Struktura keratinov

Primarna struktura: Primarna struktura je določena z zaporedjem AK, ki je za določen keratin podobna pri različnih vrstah. Vsi keratini v koži goveda, miši in človeka so bogati z glicinom,

(30)

8

serinom, levcinom in glutaminsko kislino. Zaporedje AK je zelo pomembno za funkcijo in lastnosti keratinskih filamentov. Zaporedje AK pa se spremeni s posttranslacijskimi modifikacijami primarne strukture. Med pomembnejše uvrščamo naslednje:

 Tvorba disulfidne vezi.

Vse AK z žveplom (cistein, metionin) so zelo pomembne za tvorbo disulfidnih vezi, pa naj bo znotraj keratinske molekule, med dvema molekulama ali med molekulo keratina in KFAP [18]. Te modifikacije pa ne zaznamo pri keratinskem paru K8/K18, in sicer zaradi pomanjkanja cisteinskih AK ostankov [23].

 Fosforilacija in defosforilacija.

Gre za eno najpomembnejših modifikacij, ki vpliva na topnost keratina, organizacijo v filamente in interakcijo z drugimi proteini ter apoptozo in celični stres. Fosforilirani so serinski ali treoninski AK ostanki v domenah glave in repa, ki so bili opaženi pri K8, K6, K18 in K1 [23]. Ser52 je eno največjih fosforilacijskih mest pri K18, pri K8 pa to mesto predstavlja Ser431. Ser431 fosforilirajo kinaze MAPK kot odgovor na aktivacijo receptorja EGFR [24].

 Glikozilacija.

Gre za dinamično modifikacijo serinskih ali treoninskih ostankov z vezavo N- acetilglukozamina, opaženo pri K13, K8 in K18 [23]. Opredeljena so bila tri mesta glikozilacije v domeni glave K18 – serin na mestih 30, 31 in 49. S poskusi na miših, ki so izražale mutante S30/31/49A, a le-te niso mogle biti glikozilirane, so ugotovili, da glikozilacija K18 predstavlja zaščitno vlogo pri poškodbah epitelija s spodbujanjem fosforilacije in aktivacijo kinaz za preživetje celic [25]. Mesta, ki so glikozilirana, so zaščitena pred nadaljnjimi kemijskimi procesi [18].

 Citrulinizacija.

Pri tej modifikaciji se arginin pretvori v citrulin, pri čemer se izgubi pozitivni naboj arginina (citrulin je nevtralen). Zaradi tega lahko pride do konformacijskih sprememb filamentov [18]. Citrulinizacijo povezujejo tudi z boleznijo revmatidnega artritisa [26].

 Tvorba peptidnih vezi.

 Proteolitska cepitev.

Keratini so zelo odporni na proteolitsko cepitev zaradi vseh disulfidnih vezi, lahko pa jih cepimo s specifičnimi encimi, kot so kaspaze in katepsini iz lizosomov [18].

Sekundarna struktura: Predstavljena je v poglavju 1.2. Sekundarno strukturo predstavljajo osrednja α-helikalna domena ter stranski domeni rep in glava.

Domena glave vsebuje variabilno število AK in je pozitivno nabita. Zelo ohranjen AK ostanek je lizin pri K1, K2, K5 in K6. Serinski AK ostanki so podvrženi fosforilaciji in lahko postanejo negativno nabiti, zaradi česar lahko razpade keratinski filament, zato so izredno

(31)

9

pomembni. Pomembni so tudi cisteini, ki tvorijo disulfidne vezi z drugimi molekulami keratina ali KFAP. Domena glave ima globularno strukturo z β-zavoji in vsebuje poddomene E1, V1, H1. Keratini tipa II vsebujejo vse tri, medtem ko keratini tipa I vsebujejo le V1 in E1, zaradi česar je tudi njihova molekulska masa nižja.

Osrednja domena vsebuje štiri desnosučne α-helikalne poddomene 1A, 1B, 2A in 2B, ki so med seboj ločene s povezovalnimi regijami s strukturo β-zavoja in niso v obliki heliksa.

Keratini tipa I imajo vse poddomene negativno nabite, medtem ko sta pri keratinih tipa II negativno nabiti le poddomeni 1B in 2A. Poddomena 2B je nevtralna, 1A pa pozitivno nabita.

Na N-koncu osrednje domene se nahaja mesto iniciacije heliksa (HIP), dolgo 13 AK ostankov in zelo pomembno za iniciacijo oblikovanja α-heliksa, medtem ko se na C-koncu domene nahaja negativno nabito terminacijsko mesto (HTP), ki poveže α-heliks z domeno repa. Povezovalne regije so tri in se nahajajo med poddomenami. L1 vsebuje 8–16 AK ostankov in tvori prožen zgib, L12 je najdaljša povezovalna regija, L2 pa vsebuje le 7 AK ostankov.

Domena repa je globularna in ni v obliki heliksa. Kakor domeno glave tudi domeno repa razdelimo na tri poddomene pri keratinih tipa II in dve poddomeni pri keratinih tipa I. Pri K1 in K10 poddomena V2 vsebuje veliko glicinskih AK ostankov s strukturo ponavljajočih zank.

Slednje so pomembne v procesu keratinizacije [18].

Terciarna struktura: Terciarno strukturo keratinov predstavlja heterodimer, ki ga dobimo s poravnavo osrednje α-helikalne domene kislega in bazičnega/nevtralnega keratina. To je tudi osnova keratinskega filamenta. So obvezni heteropolimeri, ki morajo vsebovati kisli (tip I) in bazični/nevtralni (tip II) keratin, zato mora biti tudi sinteza posameznih keratinov natančno regulirana, da se njihova stehiometrija ne podre. Dva homologna keratina se paralelno poravnata, sama struktura pa se stabilizira preko hidrofobnih interakcij. Heterodimeri so topni v citoplazmi in so hkrati tudi najstabilnejši element keratinskih filamentov [18].

Kvartarna struktura: Kvartarna struktura je zelo kompleksna in jo predstavljajo tetrameri in osnovne enote ULF. Tvorba tetramera poteka z antiparalelno poravnavo dveh heterodimerov, s pomočjo elektrostatskih vezi. Proces poteka v celični periferiji, topnost in nadaljnjo sestavljanje v filamente pa sta odvisna od stopnje fosforilacije, pH-ja oziroma prisotnosti ionov. Osnovne enote ULF nastanejo z lateralno povezavo osmih tetramerov, hitrost pa je odvisno od vrste keratina, pH-ja ali osmolarnosti. Za tvorbo osnovne enote ULF keratinskega para K8/K18 sta potrebni 2 sekundi, medtem ko je za par K1/K10 potrebnih 20 minut. Končni keratinski filament nastane z lateralno in longitudinalno povezavo osnovnih enot. Filamenti niso polarni, kar vpliva na interakcijo z ostalimi molekulami v citoplazmi, so pa prožni zaradi posameznih sestavnih enot, ki lahko drsijo druga ob drugi [18].

(32)

10 1.2.1.2 Mutacije v genih za keratine

Poznamo 54 genov za keratine, od katerih je približno 21 povezanih z dednimi obolenji oziroma motnjami. Kakšen fenotip bolezni se izrazi, je odvisno od več dejavnikov, predvsem od lokacije izražanja in vrste mutiranega gena za keratin. Če se pojavi mutacija v genu za keratin, keratinociti izgubijo strukturno celovitost, kar privede do posledic, kot so najbolj tipična krhkost, mehurjenje, hiperkeratoza ter agregacija keratinskih filamentov.

Najpogosteje se mutacije pojavijo v α-helikalni regiji, predvsem na njenem N- oziroma C- koncu, kjer se nahajata zelo ohranjeni regiji HIP in HTP. Ti regiji sta izredno pomembni pri samosestavljanju molekul keratina v filament, hkrati pa predstavljata vročo točko za mutacije skoraj vseh keratinskih obolenj [20].

Prve mutacije so odkrili v genih, ki zapisujejo K5 in K14 in povzročajo bulozno epidermolizo simpleks. Ta dva keratina najdemo v bazalni plasti povrhnjice, kjer mutirana agregirata in posledično izgubita povezavo z dezmosomi in hemidezmosomi. Ta mutacija torej močno vpliva na zmožnost vzpostavitve funkcionalnega citoskeleta ter odziva na stres [14]. Bolezen se razvije ob mutaciji gena KRT5 ali gena KRT14, vendar nista obe mutaciji enako hudi. Če pride do mutacije v genu KRT14, lahko namesto s K14, heterodimer s K5 tvori K15. Ta oblika bolezni je milejša, kot če pride do mutacije v genu KRT5, saj K5 nima podobnega keratina, ki bi namesto njega tvoril heterodimer s K14 [18].

Mutacije v genih za keratina K1, K2 in K10 povzročajo keratinopatsko ihtiozo (KPI). K1 in K10 sta glavna keratina, ki se začneta izražati v trnasti plasti povrhnjice, v kateri se celice začnejo diferencirati in se začne proces keratinizacije. K2 je keratin, ki se izraža predvsem v končnih stopnjah diferenciacije, v zgornjih plasteh povrhnjice [19]. KPI predstavlja družino redkih motenj v keratinizaciji, med katere uvrščamo epidermolitsko ihtiozo (EI) in površinsko epidermolitsko ihtiozo (SEI, prej imenovana bulozna ihtioza Siemens). EI je sorazmerno redka prirojena bolezen krhkosti kože, ki se deduje avtosomno dominantno.

Bolezen nastane ob razvoju mutacij v genih KRT1 ali KRT10. Načeloma gre za drugačnopomenske mutacije v osrednji α-helikalni regiji oziroma v domeni H1, medtem ko se pri blažjih oblikah bolezni razvijejo mutacije v povezovalni regiji L12. Simptomi vključujejo pordelost kože, močno mehurjenje in razširjeno hiperkeratozo ter luščenje kože.

Mutacije v genu KRT2 pa vodijo v SEI, ki se tudi deduje avtosomno dominantno in ima podobne, vendar blažje klinične značilnosti kot EI. Večina mutacij prizadene HTM regijo K2 [20].

Epidermolitska palmoplantarna keratoderma (EPPK) je bolezen, ki jo povzročajo mutacije v genu za K9 v poddomeni 1A. Gre za keratin, specifičen za končno diferencirane keratinocite na predelu dlani in podplatov. Posledica te bolezni je voščena hiperkeratoza, omejena na povrhnjico podplatov in dlani [15, 19].

(33)

11

Moniletriks je bolezen, ki jo povzročijo mutacije v keratinih las, in sicer K81, K83 in K86.

To predstavlja avtosomno dominantno obliko bolezni, medtem ko recesivno obliko predstavljajo mutacije v genu DSG4 (dezmoglein 4). Bolezen se izraža v suhih, dolgočasnih in krhkih laseh, ki se lahko spontano zlomijo, ter v distrofični alopeciji [28].

Prirojena pahionihija (PC) je ena izmed bolj preučenih bolezni, ki jo povzročijo mutacije v K6, K16 in K17. Gre za keratine, ki jih najdemo v nohtih [19].

1.3 Bulozna epidermoliza

Bulozna epidermoliza (EB) je dedna bolezen krhkosti kože. Gre za heterogeno zelo raznoliko skupino bolezni, tako klinično kot tudi genetsko. Vsebuje več kot 30 različnih fenotipskih podtipov, ki so povezani z mutacijami v vsaj 18 različnih genih. Je redka bolezen, ki prizadene 1 na 400.000 ljudi. Delimo jo na 4 glavne tipe, razvrščene glede na plast kože, ki je z mutacijo prizadeta:

 EB simpleks (EBS), ki je vezana na epidermis;

 junkcijska EB (JEB), ki je vezana na bazalno membrano;

 distrofična EB (DEB), ki je vezana na dermis;

 Kindlerjev sindrom (KEB), ki zajema vse tri plasti [29].

Najznačilnejši pojavi vključujejo nastanek mehurjev in brazgotin na področju blagega mehanskega pritiska. Njihova resnost je odvisna od plasti, v kateri se razcepi kožno tkivo.

Bolj površinske rane, ki povzročajo erozije, nastanejo v primeru EBS, rane pa so lahko globlje in povzročajo razjede, kot v primeru preostalih treh glavnih tipov. Kožne poškodbe lahko postanejo kronične, če so mehanski pritiski trajno prisotni ali se ponavljajo. Bolezen lahko vpliva tudi na prebavni in urogenitalni trakt, na dihalne poti in očesno sluznico. Pri določenih podtipih se lahko pojavijo tudi spremembe na nohtih in laseh. Hujši zapleti so osteoporoza, kontrakcije sklepov, kardiomiopatija, amiloidoza ledvic in zaostalost rasti ter deformacije rok in stopal [30]. Najresnejši zaplet pri odraslih pa je kožni karcinom – tako bazalnocelični (BCC) kot ploščatocelični (SCC) [29].

Vzrok za nastanek bolezni je mutacija v enem izmed 18 različnih genov. Slednji kodirajo strukturne proteine epidermisa, bazalne membrane in zgornjega dela dermisa in so zelo pomembni za celovitost in strukturo kože. Mutacije v tarčnih genih najpogosteje povzročijo zamenjavo ene aminokisline oziroma predčasno zaključevanje prepisovanja gena, zaradi česar se protein nepravilno zvije. Posledično se spremeni dinamika in funkcija teh proteinov, zaradi česar se poruši mehanska stabilnost posameznih plasti kože [29, 30].

Kot smo že omenili, bolezen razdelimo na 4 osnovne tipe.

(34)

12

 EBS je najpogostejši tip, ki se deduje dominantno in se pojavi v 75–85 % vseh bolnikov z EB. Vezan je na mehansko krhkost in mehurjavost v epidermisu, do katere pride zaradi mutacij v keratinu 5 in 14 [29].

 Junkcijska EB se deduje recesivno in je ena izmed redkejših oblik bolezni. Povzročajo jo mutacije v genih za α6β4 integrin, kolagen 17 ali laminin 332 (slika 4) [31].

Laminin 332 je eden izmed pomembnejših proteinov, ki veže keratinocite v epidermisu z dermisom. Na strani epidermisa interagira z α6β4 integrinom v hemidezmosomu oziroma z α3β1 integrinom v fokalnem stiku in se preko kolagena 7 veže v dermis. Kolagen 17 je transmembranski protein, ki povezuje keratinske filamente z bazalno membrano preko interakcij s plektinom, BP230 in α6β4 integrinom [30]. Pri tej obliki bolezni se na mestih mehanskega pritiska pojavijo mehurji z bistro ali krvavo vsebino, ki se celijo dalj časa. Prizadeta je lahko velika površina kože, kar večinoma v prvih mesecih življenja vodi v smrt; če pa je prizadeta manjša površina kože, se mehurji pojavijo z leti in bolniki lahko živijo razmeroma normalno življenje [32].

 Pri distrofični EB pride do mutacij v genu za kolagen 7 (slika 4). Lahko se deduje dominantno ali recesivno, zato jo ločimo na dva podtipa, in sicer na dominantno DEB in recesivno DEB [30]. Dominantna oblika prizadene manjšo površino kože, zato so tudi posledice manjše, medtem ko gre pri recesivni za zelo hudo obliko. Mehurji nastanejo že ob rojstvu ali pa kmalu po njem, hitro počijo in za seboj pustijo različno velike in globoke razjede. Slednje se celijo najpočasneje glede na ostale tri oblike in za seboj pustijo brazgotine. Prisotni so tudi ostali hujši simptomi, kot so odpadanje nohtov, alopecija, zaostanek v rasti in slabokrvnost. Na mestu kroničnih ran se z leti lahko pojavi tudi kožni rak [32].

 Kindlerjev sindrom je zelo redka recesivna oblika bolezni, opisana le pri okoli 250 posameznikov po svetu. Gre za unikatno obliko, ki lahko posnema več različnih podtipov in je zato njena diagnoza otežena. Do cepitve kože lahko pride v več plasteh, v epidermisu, bazalni membrani ali dermisu. Pojavi se posebni klinični fenotip, ki ga ne zaznamo pri ostalih treh tipih – poikiloderma (stanje kože, ki vključuje hiper- in hipopigmentacijo, kuperozo ter atrofijo) in fotoobčutljivost (kaže se kot eritema in sončne opekline) [30]. Do mutacije pride v genu KIND1, ki zapisuje protein kindlin.

Ta je pomemben pri povezovanju aktinskih filamentov z ekstracelularnim matriksom [29].

(35)

13

Slika 4: Shematski prikaz dela kože, kjer se stikajo epidermis, bazalna membrana in dermis. Na sliki so prikazani najpogostejši možni povzročitelji EB (povzeto po [29]).

1.3.1 Bulozna epidermoliza simpleks

Bulozna epidermoliza simpleks je izmed vseh štirih oblik najblažje izražena. Mehurji nastanejo na predelu mehanskega stresa, pogosto zaradi drgnjenja obleke ob kožo. Ti se nato hitro celijo in ne pustijo brazgotin. Bolezen prizadene 1 na 50.000 ljudi.

Delimo jo na 4 najpogostejše podtipe, to so:

 lokalizirana EBS (prej znana kot Weber-Cockayne EBS);

 srednje huda oblika EBS (prej znana kot Koebner EBS);

 huda oblika EBS (prej znana kot Dowling-Meara EBS);

 EBS z lisasto pigmentacijo.

Pri vseh podtipih – razen pri lokalizirani EBS – se bolezen razvije že ob rojstvu ali takoj po njem. Pri lokalizirani EBS se mehurjenje lahko pojavi šele v poznem otroštvu ali v zgodnji odraslosti. Gre za najpogostejši podtip EBS, pri katerem se mehurji ponavadi pojavijo na dlaneh in podplatih [33]. Za EBS z lisasto pigmentacijo so poleg pojava mehurjev značilni tudi lisasta pigmentacija trupa in okončin, pikaste hiperkeratoze dlani in podplatov ter distrofični nohti [15].

Bolezen se razvije zaradi mutacij v genih KRT5 in KRT14, ki kodirata keratin 5 in 14, slednja pa se izražata v bazalnih celicah epidermisa. Gre za intermediarne filamente, keratina tipa I in II, ki drug z drugim tvorita heterodimer. Ti se nato združijo v filamente, ki tvorijo

(36)

14

citoskelet celic, hkrati pa so pomembni pri povezovanju med celicami in povezovanju celic z zunajceličnim matriksom. Glede na lokacijo in vrsto mutacije se delno ali popolno inhibira nastajanje oziroma povezovanje keratinskih filamentov v keratinocitih. To lahko povzroči destabilizacijo citoskeleta in citolizo, kar vodi v nastanek intraepitelnih mehurjev. Najhujše oblike bolezni so povezane z mutacijami v skrajnih regijah osrednje domene. [30, 34].

Tabela 2: Prikaz najpogostejših mest za mutacije pri EBS.

Vrsta

keratina Vroča

točka Točkovna mutacija Lokacija Vrsta EBS

K14 Arg125 R125C, R125S, R125H,

R125L, R125P

HIP huda oblika EBS

Val270 V270M L12 lokalizirana EBS

K5 Pro25 P25L V1 EBS z lisasto

pigmentacijo

Glu475 E475G HTP huda oblika EBS

Najpogosteje pri K14 pride do mutacij aminokislinskega ostanka Arg125. Nahaja se na mestu iniciacije heliksa (HIP) na osrednji domeni K14, ki je izredno pomemben za začetek zvijanja proteina in je ohranjen pri vseh keratinih tipa I. Omenjena vroča točka je povezana z več kot 70 % hude oblike EBS [15, 35]. Najprej je bila opisana točkovna mutacija arginina v cistein – R125C [36], možne pa so tudi druge mutacije Arg v Ser (S), His (H), Pro (P) in Leu (L).

Drugo mesto mutacije pri K14 je aminokislinski ostanek Val270. Nahaja se na povezovalni regiji L12 in je povezan z blažjo obliko EBS – lokalizirano EBS. Ponovno gre za točkovno mutacijo, tokrat Val v Met – V270M [15]. Najpogostejše mutacije pri K5 so v aminokislinskem ostanku Pro25, kjer se pojavi točkovna mutacija prolina v levcin – P25L.

Mutacija je povezana z EBS z lisasto pigmentacijo in se nahaja v regiji V1 domene glave. Še ena izmed pogostejših mutacij pri K5 je v aminokislinskem ostanku Glu475, kjer pride do substitucije Glu v Gly – E475G. Mutacija se nahaja v poddomeni 2B (v regiji HTP) osrednje helikalne regije K5 in je povezana s hudo obliko EBS [15]. Mutacije, povezane s srednje hudo obliko EBS, se nahajajo v sredini osrednje helikalne regije, ali pa so razširjene vzdolž genov za K5 in K14. Najdemo jih tudi v povezovalnih regijah [37]. Lokacije vseh mutacij so prikazane na sliki 4 in povzete v tabeli 2.

(37)

15

Slika 5: Prikaz strukture keratina in najpogostejših mutacij, ki so opisane pri K5 in K14.

Lokacije mutacij so označene s svetlo modro barvo.

1.3.1.1 Tvorba agregatov

Pri hudi obliki EBS izražanje mutiranega keratina vodi v tvorbo agregatov. Gre za enega najbolj tipičnih fenotipov pri pojavu mutacij, ki ga, poleg v pacientih, opazimo tudi in vitro (slika 6) [38]. Mutacija R125P, ki povzroča hudo obliko EBS, je bila prvič opisana v članku Morley et al., 2003, ko so opazili tudi tvorbo agregatov brez apliciranja dodatnega stresa [39].

Nastanek na videz stabilnih agregatov se je obravnaval kot toksičen za celico in je bil hujši od izgube filamentov. To so pripisovali negativnemu učinku mutacij v EBS, ki so poslabšale togost celičnih membran zaradi netopnih ostankov v celicah. Ugotovili so tudi, da se ti agregati razlikujejo od delcev, ki so jih opazili med mitozo. Nahajali so se na periferiji celice in ne v celotni citoplazmi, in so nastali z razpadom, povezanim z mutacijami, in ne z reguliranimi fosforilacijami med celičnim ciklom [40]..

(38)

16

Slika 6: Celična linija NEB-1 z vstavljenim konstruktom EGFP-K14 WT oziroma EGFP- K14 z mutacijo R125P. Leva stran prikazuje celice z dodatno kopijo zdravega K14. Desna stran prikazuje celice z dodatno kopijo K14 z mutacijo, ki povzroča hudo obliko EBS. Z modrimi puščicami so označeni agregati K14 (povzeto po [38]).

Mutacije vplivajo na sestavljanje monomer keratina v filamente. Herrmann et al., 2002, so preučevali vpliv mutacij na polimerizacijo v filamente. Ugotovili so, da K14 lahko pod določenimi pogoji – z mutacijo R125H – tvori funkcionalne filamente s K5 in vitro. Tudi če je celoten K14 mutiran, lahko tvori normalne filamente s K5. Predpostavljajo, da bi agregacija keratina lahko bila povezana s kakšnim drugim procesom, ne pa zgolj z moteno polimerizacijo [41]. Sam mehanizem nastanka agregatov še ni popolnoma razjasnjen. V članku Gouveia et al., 2020, so avtorji predlagali diagram dinamike keratina v celicah (slika 7) [38].

Slika 7: Diagram dinamike keratina v celicah. Oznaka S predstavlja topno obliko monomer keratina, P predstavlja majhne delčke, ki tvorijo agregate, I pa netopno obliko keratina, organiziranega v filamente. Oznake K predstavljajo konstante za posamezne pretvorbe (prirejeno po [38]).

(39)

17

Keratin se v celici nahaja v treh oblikah, in sicer v monomerih (S), majhnih skupkih, ki tvorijo agregate (P) in organiziran v filamente (I). Monomeri se povezujejo v majhne skupke, ki nato polimerizirajo in tvorijo filamente. Pri visokih vrednostih konstante KPI se oblika P ne more akumulirati v celici, zato v njih opazimo zgolj keratin v dveh oblikah: S in I. Tako stanje lahko opazimo v keratinocitah brez mutacij, kot so prikazani na levi strani slike 6. Pri nizkih vrednostih KPI pa se oblika P lahko akumulira v celicah, kar opazimo tudi z mikroskopom.

Mutacija torej zniža konstanto KPI oziroma upočasni polimerizacijo, zaradi česar vidimo agregate, kot so prikazani na desni strani slike 6 [38].

Spontanih keratinskih agregatov ne opazimo vedno v celicah s hudo obliko EBS; če že, obstajajo v manjšem številu. Agregati pa se vedno pojavijo ob izpostavljenosti neki vrsti zunanjega stresa, kot so toplotni šok [42], osmotski šok [34] in mehanski stres [35]. Na drugi strani pa lahko pojav agregatov zmanjšamo z dodatkom kemičnega šaperona, kot je trimetilamin N-oksid (TMAO). V raziskavi Chamcheu et al., 2010, so dokazali zmanjšan pojav agregatov ob predhodnem tretiranju z omenjeno spojino. TMAO stabilizira proteine v njihovem nativnem stanju in vpliva na njihovo pravilno zvijanje ter jih zaščiti pred denaturacijo in agregacijo [43].

(40)

18

(41)

19

2 Namen dela

Keratini so glavna sestavina citoskeleta epitelijskih celic in imajo pomembno vlogo pri zagotavljanju mehanske integritete celic. Najdemo jih predvsem v koži, v keratinocitih, ki predstavljajo glavno vrsto celic epidermisa. Ti izražajo keratine tipa I in II, ki tvorijo stabilno mrežo filamentov in zagotavljajo mehansko stabilnost. Ramms et al., 2013 [44] in Seltmann et al., 2013 [45], so pokazali, da popolna izguba keratinov znatno zmanjša togost keratinocitov. Z meritvami z optično pinceto in mikroskopijo z atomsko silo (AFM) na keratinocitih miši z izbitimi geni skupine keratinov tipa I (mednje sodi tudi K14), so ugotovili, da so celice brez keratinov veliko mehkejše od celic divjega tipa. Ponovno izražanje keratina 14 celicam povrne togost, ponovno se tvori keratinska mreža filamentov z endogeno prisotnim keratinom 5.

Mutacije v keratinu 5 in 14 povzročajo razvoj bulozne epidermolize simpleks, zaradi česar so keratinociti manj odporni na mehanski stres. V magistrskem delu preučujemo predvsem mutacijo K14 R125P, ki so jo v članku Homberg et al., 2015 [46], vstavili v mišje celice z izbitimi geni celotne skupine keratinov I (K14 R131P pri miših). Mutacija je močno vplivala na celice – oslabila je povezave med celicami, vplivala na nastanek keratinske mreže in nastanek agregatov. V študiji so pokazali tudi, da ima omenjena mutacija precej večji vpliv na togost celic v primerjavi s celicami brez vseh keratinov.

Glede na ugotovitve omenjenih člankov predpostavljamo, da obstaja povezava med togostjo celičnih membran in mutacijami v keratinih, ki povzročajo nastanek bulozne epidermolize simpleks. V magistrskem delu želimo določiti različne deleže mutiranega keratina in jih povezati s stopnjo togosti membran v keratinocitih, saj ni znano, koliko keratina je mutiranega pri bolnikih, ki trpijo za to obliko bolezni. Hkrati nas zanima, ali je s tem povezana tudi tvorba agregatov. Predpostavili smo naslednje hipoteze:

Hipoteza 1: Celice z večjim deležem mutirane oblike keratina bodo imele mehkejšo celično membrano.

Hipoteza 2: Celice z mehkejšo celično membrano bodo posledično tvorile več agregatov.

(42)

20

(43)

21

3 Eksperimentalni del 3.1 Oprema in materiali

Delo je potekalo na Medicinski fakulteti v Ljubljani v prostorih Inštituta za biokemijo, (predvsem v Medicinskem centru za molekularno biologijo – MCMB) in delno na Inštitutu za biofiziko.

3.1.1 Laboratorijska oprema

Medicinski center za molekularno biologijo:

 centrifuga MPW-260: MPW Med. Instruments, MPW_22015

 centrifuga 5418 R: Eppendorf, 5401000010

 CO2 inkubatorHeracell 150i: Thermo Scientific, 51026800

 brezprašna komora Airstream: ESCO, AC2-4D1

 vodna kopel: GFL, 1003

 invertni mikroskop: Motic, AE2000

 pipetor: Thermo Scientific, 9531

 pipetor Accu-jet Pro: BrandTech Scientific, 26330

 enokanalne pipete Lambda Plus (2 – 20, 20 – 200, 100 – 1000 µl): Corning

 kriogena Dewarjeva posoda s tekočim dušikom za shranjevanje celic

 Parafilm: Sigma Aldrich, P6543

 čitalec mikrotitrskih plošč Synergy HTX: BioTek Instruments, Inc.

 sistem za prenos western XCell II Blot Module: Invitrogen, EI9051

 sistem za elektroforezo XCell SureLock Mini-Cell: Invitrogen, EI0001

 napajalnik za elektroforezo EPS 500/400: Pharmacia Biotech, 303058

 gel s 15 žepki Novex (4 – 12 % tris-glicin): Invitrogen, XP04125BOX

 stresalnik: Thermo Scientific, 88880022

 tehtnica PCB: KERN

 magnetno mešalo RCT basic: IKA Werke, 0003810000

 PVDF membrana Immobilon-P: Merck Millipore, IPVH00010

 termoblok CH-100: Biosan, BS-010410-BAI

 posodica µ-Dish (35 mm): Ibidi, 81156

 krovno stekelce (borosilikatno steklo): VWR, 631-0150

(44)

22 Inštitut za biokemijo:

 analizator LAS-4000: FUJIFILM Europe GmbH Inštitut za biofiziko:

 optična pinceta: invertni mikroskop Nikon Eclipse Ti, opremljen z lasersko pinceto Tweez 250i, Aresis

o piezo mizica mikroskopa: Mad City Labs, Nano-LPS-200 o objektiv z vodno imerzijo (60 ×, NA 1,00): Nikon

 kremenove kroglice (premer 5,06 µm): Bangs Labs, CS01N

 invertni mikroskop Nikon Eclipse TE-2000-E z možnostjo fluorescentne in konfokalne mikroskopije

o objektiv z oljno imerzijo (60 ×, NA 1,45): Plan Apo TIRF 3.1.2 Sterilna plastika

 gojitvena posodica T25: TPP, 90026

 vakuumski filter: TPP, 99950

 zamrzovalna posodica: TPP, 89020

 centrifugirka ( 15 in 50 ml): TPP, 91015, 91050

 pipeta (5, 10, 25 ml): TPP, 94005, 94010, 94025

 pipeta za aspiriranje (2 ml): VWR, 414004-265

 mikrocentrifugirka: Eppendorf, 0030120.086

 tipsi s filtrom TipOne (20, 200, 1000 µl): Star Lab, S1120-3810-C, S1180-8810-C, S1182-1830

 strgalo za celice: TPP, 99002

 petrijevka: TPP, 93100

 pestilo za homogenizacijo celic: Sigma, BAF199230001