UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Monika LAH
NEENCIMSKO PORJAVENJE POMARANČNEGA SOKA
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Monika LAH
NEENCIMSKO PORJAVENJE POMARANČNEGA SOKA
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana
NON-ENZYMATIC BROWNING OF ORANGE JUICE
B. SC. THESIS
Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition
Ljubljana, 2021
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Živilstvo in prehrana. Delo je bilo opravljeno na Katedri za biokemijo in kemijo živil, Oddelek za živilstvo.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za živilstvo je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Blaža Cigića in za recenzenta prof. dr. Rajka Vidriha.
Mentor: prof. dr. Blaž CIGIĆ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Recenzent: prof. dr. Rajko VIDRIH
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik:
Mentor:
Recenzent:
Datum zagovora:
Monika Lah
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 663.81:634.31:577.1(043)=163.6
KG pomarančni sok, neencimsko porjavenje, spermidin, putrescin, askorbinska kislina, dehidroaskorbinska kislina, Maillardova reakcija, barva
AV LAH, Monika
SA CIGIĆ, Blaž (mentor), VIDRIH, Rajko (recenzent) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021
IN NEENCIMSKO PORJAVENJE POMARANČNEG SOKA
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana) OP VIII, 24 str., 7 pregl., 12 sl., 3 pril., 27 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Pomarančni sok pomembno vpliva na dnevni vnos sadja, prehranske vlaknine in mikrohranil ter zmanjša verjetnost za pojav bolezni. Pomembna lastnost pomarančnega soka je njegova barva, zato je za živilsko industrijo porjavenje neželeno. Do porjavenja lahko v pogojih z nizko koncentracijo kisika prihaja zaradi Maillardove reakcije, pri kateri reagirajo proste amino skupine in reducirajoči sladkorji, in razgradnje askorbinske kisline. Posledica obeh reakcij je pojav rjavih pigmentov. Poleg spremembe barve lahko pride tudi do izgube hranil in kakovosti, ter tvorbe nekaterih neželenih spojin. V diplomski nalogi smo ugotavljali vpliv dodatkov askorbinske kisline, dehidroaskorbinske kisline, spermidina in putrescina na spremembo barve pomarančnega soka pri 50 oC. Predvidevali smo, da bodo vsi dodatki pospešili reakcije porjavenja. Barvo smo merili s kromametrom v trajanju dveh tednov in ugotovili, da le dehidroaskorbinska kislina pospešuje nezaželeno spremembo barve, saj se je v primerjavi s kontrolo značilno bolj povečala vrednost parametra a* in zmanjšala L*. Bioaktivna amina spermidin in putrescin ter askorbinska kislina, ki so naravno prisotni v pomarančnem soku, so v primerjavi s kontrolo delovali zaviralno na pojav porjavenja saj smo pri veliki večini časovnih točk določili manjše vrednosti a* in večje vrednosti L* v primerjavi s kontrolo.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 663.81:634.31:577.1(043)=163.6
CX orange juice, non-enzymatic browning, spermidine, putrescin, ascorbic acid, dehidroascorbic acid, Maillard reaction, color
AU LAH, Monika
AA CIGIĆ, Blaž (supervisor), VIDRIH, Rajko (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2021
TI NON-ENZYMATIC BROWNING OF ORANGE JUICE
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition) NO VIII, 24 p., 7 tab., 12 fig., 3 ann., 27 ref.
LA sl AL sl/en
AB Orange juice has an important role in daily fruit, dietary fiber and nutrients intake as well as in reducing chronical diseases. The attractive orange color is very important feature, therefore browning is unwanted in food industry. Browning can occur even in non-oxidizing medium, where the main browning reactions are Maillard reaction (a reaction between amino groups and reducing sugars) and degradation of ascorbic acid. Products of both reactions are brown pigments. Furthermore, the Maillard reaction and degradation of ascorbic acid can result in loss of nutrients, as well as in the formation of some unwanted compounds. In the thesis we studied the influence of ascorbic acid, dehydroascorbic acid, spermidine and putrescin on color change during incubation at 50 oC. We assumed that each of four compounds will stimulate the browning reaction. We used chroma meter to quantify the change in color during a period of two weeks. The results revealed that only dehydroascorbic acid potentiated unwanted change of color, as larger increase in the parameter a* and larger decrease in L* were found. Bioactive amines putrescine and spermidine and ascorbic acid that are naturally present in the orange juice, decreased the browning rate, as smaller a* and larger L* were determined in comparison with the control at most time points.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VI
KAZALO SLIK
KAZALO PRILOG VII
VIII
1 UVOD 1
2 PREGLED OBJAV 1
2.1 POMARANČNI SOK 1
2.1.1 Sestava pomarančnega soka 2
2.1.1.1 Sladkorji 4
2.1.1.2 Kisline 4
2.1.1.3 Vitamin C (askorbinska kislina) 5
2.2 NEENCIMSKO PORJAVENJE 5
2.2.1 Pretvorbe askorbinske kisline 6
2.2.2 Maillardova reakcija 6
2.2.2.1 Dejavniki, ki vplivajo na Maillardovo reakcijo 8
2.2.2.2 Vplivi na hranilno vrednost živila 8
2.3 BIOAKTIVNI AMINI 8
3 MATERIAL IN METODE 10
3.1 MATERIAL 10
3.1.1 Pomarančni sok 10
3.1.2 Kemikalije za pripravo dodatkov 11
3.1.3 Ostale kemikalije 11
3.1.4 Aparature 11
3.1.5 Ostala laboratorijska oprema 11
3.2 METODE 11
3.2.1 Priprava dodatkov 12
3.2.2 Priprava vzorcev 12
3.2.3 Priprava vzorcev na toplotno obdelavo in toplotna obdelava 12
3.2.4 Shranjevanje vzorcev 13
3.2.5 Merjenje barve 13
3.2.5.1 CIELAB sistem barv 13
3.2.6 Prikaz rezultatov 14
4 REZULTATI Z RAZPRAVO 14
4.1 SPREMEMBE PARAMETRA a* 14
4.2 SPREMEMBE PARAMETRA b* 16
4.3 SPREMEMBE PARAMETRA L* 17
4.4 SKUPNA SPREMEMBA BARVE 18
5 SKLEPI 20
6 POVZETEK 21
7 VIRI 22
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Kemijska sestava ter energijska vrednost pomaranč in pomarančnega soka na 100 g (Lanza, 2003)
3 Preglednica 2: Povprečna hranilna vrednost na 100 mL končnega napitka
glede na priporočeno razmerje mešanja (1 del sirupa proti 5,5 delom vode)
10
Preglednica 3: Zatehte sadnega sirupa, destilirane vode in dodatkov za pripravo vzorcev
12 Preglednica 4: Uravnavanje vrednosti pH vzorcev glede na kontrolni vzorec 12 Preglednica 5: Povprečje meritev barve za parameter a* pri vzorcih A (z
dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom
dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z dodatkom spermidina), brez TO (kontrolni vzorec brez toplotne obdelave, hranjen pri 8 °C)
14
Preglednica 6: Povprečje meritev barve za parameter b* pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom
dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z dodatkom spermidina), brez TO (kontrolni vzorec brez toplotne obdelave, hranjen pri 8 °C)
16
Preglednica 7: Povprečje meritev barve za parameter L* pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom
dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z dodatkom spermidina), brez TO (kontrolni vzorec brez toplotne obdelave, hranjen pri 8 °C)
17
KAZALO SLIK
Slika 1: Diagram poteka predelave pomaranč v pomarančni sok (Lanza, 2003)
2 Slika 2: Prečni prerez ploda pomaranče in sestavni deli (Lanza, 2003) 3 Slika 3: Antioksidativno delovanje askorbinske kisline in tvorba resonančno
stabilnega radikala semidehidroaskorbinske kisline (Abramovič in sod., 2017)
5
Slika 4: Reakcije degradacije askorbinske kisline (Bharate in Bharate, 2014) 6 Slika 5: Kemizem Maillardove reakcije med glukozo in spojino z amino
skupino (Bharate in Bharate, 2014) 7
Slika 6: Biosintezna pot poliaminov (Gloria, 2003) 9
Slika 7: CIELAB barvni diagram (Ly in sod., 2020: 5) 13 Slika 8: Sprememba parametra a*v odvisnosti od časa skladiščenja pri
vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom
dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z dodatkom spermidina)
15
Slika 9: Sprememba parametra b* v odvisnosti od časa skladiščenja pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom
dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z dodatkom spermidina)
17
Slika 10: Sprememba parametra L* v odvisnosti od časa skladiščenja pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom
dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z dodatkom spermidina)
18
Slika 11: Vzorci prvi dan po toplotni obdelavi - zadnja vrsta od leve proti desni: K-a (kontrolni vzorec, paralelka a), K-b (kontrolni vzorec, paralelka b), A-a (vzorec z askorbinsko kislino, paralelka a), A-b (vzorec z askorbinsko kislino, paralelka b), D-a (vzorec z
dehidroaskorbinsko kislino, paralelka a), D-b (vzorec z
dehidroaskorbinsko kislino, paralelka b), P-a (vzorec s putrescinom, paralelka a), P-b (vzorec s putrescinom, paralelka b), S-a (vzorec s spermidinom, paralelka a), S-b (vzorec s spermidinom, paralelka b);
sprednja vrsta: dve paralelki kontrole hranjene pri 8 °C
19
Slika 12: Vzorci petnajsti dan po toplotni obdelavi - od leve proti desni:
kontrola hranjena pri 8 °C, vzorec z dodatkom spermidina, vzorec z dodatkom putrescina, kontrola, vzorec z dodatkom
dehidroaskorbinske kisline, vzorec z dodatkom askorbinske kisline
19
KAZALO PRILOG Priloga A: Meritve barve vzorcev v 15 dneh
Priloga B: Povprečja in standardne deviacije meritev barve v 15 dneh
1 UVOD
Neencimske reakcije vplivajo na porjavenje pomarančnega soka, kar je za potrošnike nesprejemljivo in neatraktivno. Porjavenje je povezano z Maillardovo reakcijo, ki poteče med reducirajočimi sladkorji in spojinami z aminoskupino. Pomarančni sok poleg prostih aminokislin vsebuje tudi veliko bioaktivnega amina putrescina, ki lahko vstopa v Maillardovo reakcijo . Na potek porjavenja pomarančnega soka ima velik vpliva tudi vitamin C. Predvsem oksidirana oblika vitamina C (dehidroaskorbinska kislina) naj bi pospešila proces porjavenja.
V nalogi želimo ugotoviti vpliv dodatka askorbinske kisline, dehidroaskorbinske kisline ter bioaktivnih aminov putrescina in spermidina na hitrost in obseg porjavenja pomarančnega soka. Spremljali bomo spremembo barve.
Predvidevamo, da bo bodo tako dodani amini kot askorbinska in dehidroaskorbinska kislina pospešili proces porjavenja pomarančnega soka.
2 PREGLED OBJAV
2.1 POMARANČNI SOK
Pomarančni sok je zelo popularen napitek in znatno vpliva na dnevni vnos sadja (Paravisini in Peterson, 2019). Poleg tega ima zaradi vsebnosti vitaminov, mineralov, prehranske vlaknine in drugih biološko aktivnih spojin pomemben vpliv na zadosten vnos mikrohranil in zmanjšanje tveganja za kronične bolezni. Citrusi so znani tudi po svojih farmakoloških in zdravstvenih vplivih na naše zdravje (Bharate in Bharate, 2014).
Kljub dejstvu, da pomaranče ne sodijo med klimakterijsko sadje, njihova kvaliteta po obiranju začne padati. Zato mora predelava v sok poteči kmalu po obiranju, da lahko ohranimo mikrobiološko stabilnost ter senzorično in hranilno kakovost.
Predelava v sok se izvede s stiskanjem sladkih pomaranč (Citrus sinensis), kar nam da sok s pulpo in oljem. Nadalje s centrifugiranjem ločimo olje od vodnega dela. Pulpo od seruma ločujemo z ultrafiltracijo, termično obdelamo in nato ponovno vmešamo v serum (Slika 1).
Sok lahko proizvedemo po treh postopkih:
• sveže stisnjen sok, ki ni toplotno obdelan, zamrznjen ali koncentriran in ima najkrajši rok uporabe (Pao in Fellers, 2003) (Lanza, 2003);
• sok, ki ni narejen iz koncentrata, je minimalno toplotno obdelan, njegova kakovost lahko močno niha;
• zmrznjen koncentrat pomarančnega soka je dostopen celo leto in ima definirane kakovostne parametre, ki vsebujejo merjenje vsebnosti kislin, sladkorjev (°Brix), njuno razmerje, delež olja, vsebnost pulpe in barvo.
Sok je pasteriziran z namenom inaktivacije pektolitičnih encimov, ki povzročajo motnost, in preprečevanja kvara. Nato sok vakuumiramo, da dosežemo ustrezno nizko koncentracijo raztopljenega kisika (Lanza, 2003). Posledica zmanjšane vsebnosti raztopljenega kisika je tudi večja stabilnost askorbinske kisline (Bharate in Bharate, 2014). Negativni učinki take obdelave so povezani s spremembo redukcijsko oksidacijskega potenciala, izgube nekaterih hlapnih komponent in pojav neželenih arom (p-vinilgvajakol, p-vinilfenol, dekarboksilacijski produkti hidroksicimetnih kislin).
Hlapne komponente med evaporacijo zbiramo in nato ločimo na vodotopno (aroma) in v maščobi topno fazo (eterično olje). V živilski industriji se za izdelavo sokov uporabljajo hlapne komponente pridobljene med evaporacijo, da ima napitek primeren okus in aromo (Lanza, 2003).
Slika 1: Diagram poteka predelave pomaranč v pomarančni sok (Lanza, 2003)
Med samim skladiščenjem pomarančnega soka prav tako prihaja do porjavenja in pojava neželenih arom (Shinoda in sod.,2005).
2.1.1 Sestava pomarančnega soka
Plod pomaranče sestavljata semena in perikarp, ki ga delimo na epikarp, mezokarp in endokarp. Endokarp je pravzaprav notranji užitni del s pulpo in sokom. Epikarp in mezokarp sestavljata olupek. Epikarp se nadalje deli na epidermis in hipodermis, mezokarp pa na zunanji in notranji mezokarp. Epikarpu in zunanjemu mezokarpu rečemo tudi flavedo, albedo pa je notranji mezokarp (Izquierdo in Sendra, 2003). Posamezni deli ploda imajo različno sestavo:
• v pulpi najdemo vitamine, aminokisline, oksikisline, karotenoide, antocianine in sladkorje;
• membrano sestavljajo flavonoidi, pektini, sladkorji in celuloza;
• flavedo vsebuje olja, karotenoide in antociane;
• v albedu najdemo flavonoide, celulozo, pektin in aminokisline;
• semena vsebujejo lipide, proteine in minerale (Lanza, 2003). Obstajajo sorte pomaranč, ki nimajo semen ali jih imajo manj (Hamlin, Washington navel, Valencia) (Pao in Fellers, 2003).
Slika 2: Prečni prerez ploda pomaranče in sestavni deli (Lanza, 2003)
Kemijska sestava ploda pomaranče in pomarančnega soka je predstavljena v Preglednici 1.
Preglednica 1: Kemijska sestava ter energijska vrednost pomaranče in pomarančnega soka na 100 g (Lanza, 2003)
Plod Pomarančni sok
Užitni del (%) 80 100
Voda (g) 87,2 89,3
Beljakovine (g) 0,7 0,5
Lipidi (g) 0,2 0
Ogljikovi hidrati (g) 7,8 8,2
Vlaknine (g) 1,6 -
kcal 34 33
kJ 142 138
Natrij (mg) 3 3
Kalij (mg) 200 200
Železo (mg) 0,2 0,2
Kalcij (mg) 49 15
Fosfor (mg) 22 17
Tiamin - vitamin B1 (mg) 0,06 0,05 Riboflavin – vitamin B2 (mg) 0,05 0,03 Niacin – vitamin B3 (mg) 0,2 0,4 Vitamin A kot ekvivalenta retinola (μg) 71 38
Vitamin C (mg) 50 44
Poleg tega pomaranče vsebujejo tudi visoke vsebnosti flavonoidov, to je flavonov v obliki glukozidov, flavonolov in antocianinov (Pao in Fellers, 2003).
2.1.1.1 Sladkorji
Topne trdne snovi, ki jih najdemo v soku citrusov, so večinsko sladkorji in kisline, od česar sladkorji predstavljajo 70-80 % trdnih snovi. Njihova vsebnost narašča med zorenjem in se ustavi v območju med 9 in 14 °Brix (1 Brix je ekvivalent saharoze izražen v gramih na 100 gramov raztopine). V soku pomaranč najdemo tri sladkorje, ki dajejo sladek okus: saharozo, glukozo in fruktozo. Poleg tega sok v sledovih vsebuje tudi galaktozo, heptulozo, manozo, ramnozo in ksilozo (Izquierdo in Sendra, 2003).
Fruktoza je monosaharid, ki ga najdemo predvsem v sadju. Za razliko od glukoze, manoze in galaktoze vsebuje fruktoza pet hidroksilnih skupin in keto skupino na drugem ogljiku. Je higroskopična molekula in se iz raztopine ne izkristalizira hitro. Pri 20°C je njena topnost v vodi 78 g na 100 ml vode. Je reducirajoči sladkor in tako reaktivna molekula v reakcijah neencimskega porjavenja (Maillardova reakcija). Senzorično je slajša od saharoze, njena vsebnost in s tem tudi sladkost pa se zmanjša s starostjo raztopine in uporabo visokih temperatur (Johnson in Conforti, 2003), kjer prihaja do kemijskih modifikacij.
Glukoza je prav tako monosaharid, ki v rastlinah nastaja v reakcijah fotosinteze. Njena molekulska formula je enaka kot pri fruktozi, vendar se sladkorja razlikujeta v strukturi. Za razliko od fruktoze, ki je ketoza, je glukoza aldoza (Sreeranjit in Lal, 2003). Kot reducirajoči sladkor tudi glukoza lahko vstopa v reakcije neencimskega porjavenja. Senzorično je manj sladka od saharoze, ki jo uporabljamo kot standard sladkosti.
Saharoza je prav tako naravno prisotna v številnih rastlinah, še posebej v sladkornem trsu in sladkorni pesi, iz katerih jo pridobivamo. Je disaharid sestavljen iz glukoze in fruktoze.
Zaradi vezave reducirajočih koncev obeh monosaharidov je saharoza nereducirajoči sladkor in tako sama ne vstopa v Maillardovo reakcijo, ampak šele po hidrolizi na glukozo in fruktozo. Pri 20 °C je njena topnost 66,6 g na 100 g vode.
2.1.1.2 Kisline
Najbolj zastopana kislina, ki jo najdemo v citrusih, je citronska kislina. Sledi ji jabolčna kislina. V majhnih koncentracijah najdemo tudi druge organske kisline, kot so mlečna, fosforna, vinska, oksalna in druge.
Kakor vsebnost sladkorjev se tudi vsebnost kislin tekom zorenja spreminja. V pomarančnem soku niha med 0,5 in 1,5 % ekvivalenta citronske kisline (Izquierdo in Sendra, 2003).
2.1.1.3 Vitamin C (askorbinska kislina)
Vitamin C ali L-askorbinska kislina je v vodi topen vitamin, ki je kofaktor večjega števila encimov v našem organizmu, med drugim tudi prolil hidroksilaze, ki je ključen encim za sintezo funkcionalnega kolagena. Prav tako je najpomembnejši antioksidant v izvenceličnem matriksu (Kall, 2003).
Zaradi antioksidativne vloge jo uporabljamo kot aditiv za živila. Skupaj s svojimi derivati spada v skupino antioksidantov, ki stabilizirajo proste radikale in so reducenti. Ko askorbinska kislina reagira s prostim radikalom in ga stabilizira, sama postane radikal, a je zaradi svojih konjugiranih dvojnih vezi in aromatskega obroča resonančno stabilizirana. To pomeni, da je manj reaktivna od prostega radikala, ki ga je stabilizirala, kar je ključno za njeno funkcionalnost (Abramovič in sod., 2017). Pri lovljenju prostih radikalov dobimo semidehidroaskrobinsko kislino, ki je neaktivni radikal, medtem ko v reakcijah oksidacije nastane dehidroaskorbinska kislina. Pretvorba v dehidroaskorbinsko kislino je lahko katalizirana z oksidanti (molekularni kisik, kovinski ioni, halogeni, encimi). Pretvorba nazaj v askorbinsko kislino lahko in vitro poteče s pomočjo tiol vsebujočih molekul (cistein, glutation...). Poleg antioksidativnih lastnosti lahko askorbinska kislina v prisotnosti redoks aktivnih kovinskih ionov železa in bakra stimulira nastanek prostih radikalov.
Slika 3: Antioksidativno delovanje askorbinske kisline in tvorba resonančno stabilnega radikala semidehidroaskorbinske kisline (Abramovič in sod., 2017)
Tako askorbinska kot dehidroaskorbinska kislina sta nestabilni v vodnih raztopinah, upad njune koncentracije je zaradi delovanja encimov in oksidacije opazen zelo kmalu.
Vsebnost vitamina C v živilih je odvisna od vrste živila, pogojev pridelave, pogojev shranjevanja in procesiranja živila. V pomarančnem soku je večina vitamina C v obliki askorbinske kisline (Kall, 2003).
2.2 NEENCIMSKO PORJAVENJE
V primeru inaktiviranih encimov in mikroorganizmov (na primer po toplotni obdelavi) v živilih še vedno potekajo kemijske reakcije (Hole, 2003). Neencimsko porjavenje je ena izmed pomembnejših skupin kemijskih reakcij, ki vpliva na spremembe barve in kakovost izdelkov iz citrusov med skladiščenjem (Bharate in Bharate, 2014). Največjo vlogo imata Maillardova reakcija in procesi razgradnje askorbinske kisline. Gre za kompleksne reakcije,
ki še niso popolnoma poznane (Paravisini in Peterson, 2019). Omenjene reakcije vodijo v izgubo hranil in pojav neželenih spojin v živilu (Bharate in Bharate, 2014).
2.2.1 Pretvorbe askorbinske kisline
Pretvorbe askorbinske kisline že dolgo povezujejo s porjavenjem. Oksidacija askorbinske kisline v dehidroaskorbinsko kislino je reverzibilen proces, saj se lahko v prisotnosti močnih reducentov ali v encimskih reakcijah ponovno tvori reducirana oblika vitamina C. Odpiranje laktonskega obroča dehidroaskorbinske kisline in nastanek 2,3-diketogulonske kisline pa predstavlja ireverzibilen proces, saj je molekula kemijsko nestabilna in v neoksidativnih reakcijah razpada v različne spojine. Pri tem nastanejo nekatere molekule, ki absorbirajo v vidnem delu spektra, ali pa lahko vstopajo v Maillardovo reakcijo, oboje prispeva k rjavemu obarvanju. Gre za počasne reakcije, v kateri nastaneta 3,4-dihidroksi-5-metil-2-(5H)- furanon in 2-furankarboksilna kislina. Prvi daje rjavo obarvanje, medtem ko je drugi produkt brezbarven. Furfural in 2-furankarboksilna kislina reagirata z aminokislinami in tako tvorita rjave pigmente.
Prisotnost aminokislin lahko pospeši pretvorbe askorbinske kisline. V kolikor je v raztopini že prisotna dehidroaskorbinska kislina, nastane več razpadnih produktov v ne-oksidativnih razmerah (Bharate in Bharate, 2014).
Slika 4: Reakcije pretvorbe askorbinske kisline (Bharate in Bharate, 2014)
2.2.2 Maillardova reakcija
Maillardova reakcija je kemijska reakcija med spojinami z amino skupino in reducirajočim sladkorjem, ki poteka pri povišani temperaturi. V kompleksnih reakcijah se tvorijo različne arome, obarvane spojine in polimeri. Ker reakcija poteka hitreje pri povišani temperaturi, so lahko toplotno obdelani sokovi bolj dovzetni za tovrstne spremembe (Bharate in Bharate, 2014). Reakcija lahko poteče tudi med oksidiranim vitaminom C in amino skupino (Nooshkam in sod., 2019).
Kemizem reakcije glukoze s spojino, ki vsebuje amino skupino, je predstavljen na Sliki 5.
Najprej poteče reakcija kondenzacije, ko se amino skupina veže na karbonilno skupino reducirajočega sladkorja (1) in nastane nestabilna spojina (3), ki odda vodo, da nastane imin (4), ki je v ravnotežju z glikozilaminom (5). Z izomerizacijo iz imina (4) nastane Amadorijev produkt (7). Ta ima na C1 amin in na C2 karbonilno skupino. Amadorijev produkt je lahko v ciklični (8) ali neciklični obliki (7). Z enolizacijo in deaminacijo iz Amadorijevega produkta nastane dehidroredukton (11). Iz slednjega nato z odcepitvijo vode nastane hidroksimetilfurfural (HMF, 12), ki je zelo reaktiven in reagira v rekcijah polimerizacije, v katerih nastajajo visokomolekularni rjavi pigmenti melanoidini (Bharate in Bharate, 2014).
V zadnji stopnji Maillardove reakcije deoksiozoni (11) razpadejo na reaktivne dikarbonile, ki nato reagirajo z aminokislinami (Ames, 2003). Reakcija med aminokislinami in dikarbonili se imenuje Streckerjeva razgradnja, s katero dobimo Streckerjeve aldehide (etanal, metilpropanal in 2-feniletanal,…), ki dajejo močan vonj (Bharata in Bharata, 2014).
Končni produkti so tudi visokomolekularni pigmenti imenovani melanoidini, ki ključno prispevajo k porjavenju. Melanoidini in nekateri drugi produkti Maillardove reakcije imajo lahko tudi pozitiven vpliv na naše zdravje, saj so antioksidanti in lovijo proste radikale (hidroksilne radikale, vodikove perokside, superokside), delujejo protimikrobno, kelirajo različne minerale in spodbujajo rast koristnih bakterij (Arihara in sod., 2017).
Slika 5: Kemizem Maillardove reakcije med glukozo in amino skupino (Bharate in Bharate, 2014)
2.2.2.1 Dejavniki, ki vplivajo na Maillardovo reakcijo
Na to, kako bo reakcija potekala in katere spojine bodo pretežno nastale, vpliva prisotnost prekurzorjev v živilih, temperatura in čas segrevanja, vrednost pH ter vodna aktivnost (aw).
Prav tako na potek reakcije (predvsem v povezavi z askorbinsko kislino) vplivajo tudi redoks aktivni kovinski ioni in kisik. Maillardovo reakcijo lahko omejimo z odstranitvijo reagentov v živilu, nižanjem pH ali z dodatkom zaviralcev Maillardove reakcije (sulfiti).
Pentoze (riboza) reagirajo hitreje od heksoz (glukoza, fruktoza), te pa hitreje od disaharidov.
Tudi vrsta aminokisline vpliva na hitrost reakcije. Izmed prostih aminokislin najhitreje reagirata lizin in glicin, medtem ko cistein reagira najpočasneje. Reaktivnost polipeptidnih verig je odvisna od prisotnosti aminokislin s stransko amino skupino (lizin, arginin).
Reakcije z različnimi aminokislinami vodijo do različnih produktov in posledično različnih arom.
Z višanjem temperature narašča tudi hitrost reakcije, zato lahko s skladiščenjem pri nizkih temperaturah zmanjšamo njeno hitrost. Od temperature in časa segrevanja živila je odvisno, kakšni končni produkti bodo nastali.
Ključen vpliv na potek reakcije ima pH živila. Pri vrednosti pH nižji od 5 reagirajo večinoma 3-deoksiozoni, medtem ko pri pH nad 7 reagirajo večinoma 1- in 4-deoksiozoni. S spreminjanjem pH medija lahko dobimo želene produkte.
Maillardova reakcija poteka bolje v živilih z nižjim aw, saj je voda eden izmed produktov reakcije, hkrati pa je v takšnih sistemih pogostokrat večja tudi koncentracija reaktantov. Pri zelo majhni vodni aktivnosti so reaktanti manj mobilni in tako težje reagirajo med seboj.
Tako reakcija najbolje poteka pri vodni aktivnosti med 0,5 in 0,8 (Ames, 2003).
2.2.2.2 Vplivi na hranilno vrednost živila
Zaradi vstopa v reakcije lahko pride do izgube esencialnih aminokislin, med katerimi je najbolj opazna izguba lizina. Hkrati pride do zmanjšanja vsebnosti vitamina C, ki prav tako vstopa v reakcije, in vitaminov z amino skupino (tiamin). Produkti reakcije lahko vežejo pomembne minerale (baker, cink, železo), zaradi česar postanejo slabše dostopni. Zaradi povezav med proteini se lahko zmanjša njihova funkcionalnost (npr. sposobnost penjenja), lahko pride tudi do slabše prebavljivosti, kar je lahko posledica slabše dostopnosti prebavnim encimom ali direktne inhibicije njihovega delovanja (Ames, 2003).
2.3 BIOGENI AMINI
Biogeni amini imajo številne metabolne in fiziološke vloge v organizmih, zato so prisotni tudi v živilih. V splošnem velja, da je velika vsebnost biogenih aminov v prehrani
nezaželena. To velja predvsem za biogene amine histamin, tiramin, triptamin in fenetilamin, ki nastanejo z mikrobno dekarboksilacijo aminokislin histidin, tirozin, triptofan in fenilalanin (Önal in sod., 2013). Z mikrobno dekarboksilacijo lahko nastaneta tudi biogena amina putrescin in kadaverin, ki ju uvrščamo med poliamine, molekule z najmanj dvema amino skupinama. Povišana koncentracija teh dveh poliaminov v živilih je problematična predvsem zato, ker sta substrata za encime imenovane aminoksidaze, ki v prebavilih katalizirajo oksidacijo prehransko nezaželenih biogenih aminov histamin in tiramin. V prebavilih se posledično razgradi manj histamina in tiramina (Bulushi in sod., 2009). Po drugi strani pa je povišana vsebnost nekaterih biogenih aminov iz skupine poliaminov, kot sta spermin in spermidin, v prehrani zaželena, saj se endogena biosinteza teh molekul s starostjo zmanjšuje, kar lahko v določeni meri nadomestimo s prehrano. V okviru obsežne študije so ugotovili, da posamezniki, ki uživajo prehrano bogato s spermidinom, živijo v povprečju skoraj 6 let dlje od tistih, ki zaužijejo malo spermidina (Kiechl in sod., 2018). Hkrati pa lahko poliamini pospešujejo rast nekaterih vrst rakavih celic, zato moramo biti pri zelo velikem vnosu pozorni (Kralj Cigić in sod., 2020).
Sinteza poliaminov je kompleksen proces, v prvih korakih pa prav tako pride do dekarboksilacije aminokislin iz katerih nastane putrescin. Ključna molekula pri biosintezi spermina in spermidina je S-adenozilmetionin (Gloria, 2003).
Slika 6: Biosintezna pot poliaminov (Gloria, 2003)
Poliamini so prisotni v rastlinah, mesu in mlečnih izdelkih. Njihova vsebnost se med procesiranjem, fermentacijo in skladiščenjem spreminja, odvisna je tudi od higienskih pogojev in temperature. Pomembni prehranski viri spermidina so predvsem stročnice, križnice, gobe in siri. Spermin pa se v večjih količinah poleg zelenjave, stročnic in sira nahaja tudi mesu in jetrih. Za razliko od spermina in spermidina, ki se ne tvorita med
mlečnokislinsko fermentacijo, so s putrescinom bogata mnoga fermentirana živila tako rastlinskega kot živalskega izvora (Muñoz-Esparza in sod., 2019; Ali in sod., 2011). Med nefermentiranimi živili rastlinskega izvora najdemo največ putrescina v agrumih in soku iz agrumov. Vsebnost v pomarančah in pomarančnem soku tako presega 100 mg/kg, oziroma 100 mg/L (Ali in sod., 2011) in pomembno vpliva na senzorične lastnosti. Pomaranče so tudi dober prehranski vir spermidina, saj vrednosti dosegajo do 10 mg/kg, kar predstavlja 20 % vsebnosti v s spermidinom najbolj bogatih vrstah zelenjave. Ker relativno lahko zaužijemo večje količine pomaranč v primerjavi z zelenjavo, agrumi niso nezanemarljiv prehranski vir spermidina.
Poleg tega imajo amini tudi antioksidativno delovanje (Løvaas, 1991). Ugotovili so, da je spermin najboljši antioksidant, sledi mu spermidin in nato putrescin. Do podobnih ugotovitev je v okviru magistrskega dela prišel tudi Gutirea, kjer sta spermin in spermidin v primerjavi s tokoferoli precej bolj učinkovito upočasnila oksidacijo rastlinskih olj (Gutirea, 2018).
3 MATERIAL IN METODE
3.1 MATERIAL 3.1.1 Pomarančni sok
Pri poskusu smo uporabili toplotno obdelan sadni sirup podjetja Nektar natura d.o.o. pod imenom Vita pomaranča.
Sestavine: zgoščen pomarančni sok (min. 83 %); voda; konzervansa: natrijev benzoat, kalijev sorbat; kislina: citronska kislina; ksantan gumi; natrijeva karboksimetil celuloza;
aroma; antioksidant: askorbinska kislina (408 mg/L sirupa).
Izdelek smo do uporabe hranili v hladilnici.
Preglednica 2: Povprečna hranilna vrednost na 100 mL končnega napitka glede na priporočeno razmerje mešanja (1 del sirupa proti 5,5 delom vode)
energijska vrednost 170 kJ / 40 kcal
maščobe vsebuje zanemarljive količine
od tega nasičene maščobe vsebuje zanemarljive količine ogljikovi hidrati 10 g
od tega sladkorji 9,5 g
beljakovine vsebuje zanemarljive količine
sol vsebuje zanemarljive količine
3.1.2 Kemikalije za pripravo dodatkov
Za pripravo dodatkov smo uporabili naslednje kemikalije:
• Askorbinsko kislino (proizvajalec Sigma-Aldrich)
• Dehidroaskorbinsko kislino (proizvajalec Sigma-Aldrich)
• Spermidin (proizvajalec Sigma-Aldrich)
• Putrescin (proizvajalec Sigma-Aldrich) 3.1.3 Ostale kemikalije
• 0,1 M HCl (klorovodikova kislina)
• mQ voda 3.1.4 Aparature
• Analitska tehtnica
• Tehtnica
• Vrtinčnik
• Pečica s termostatom (Kambič)
• Magnetno mešalo
• Kromameter Minolta CR-200B (Minolta, Tokio, Japonska) 3.1.5 Ostala laboratorijska oprema
• Avtomatske pipete (do 1 mL)
• Nastavki za pipete
• Centrifugirke z rumenim pokrovčkom (iz polipropilena, 50 mL)
• Spatula
• Laboratorijska steklovina
• Parafilm
• Puhalka
• Kapalke
• Steklene posodice z ustreznimi pokrovčki (Stenko, 116 mL) 3.2 METODE
V okviru diplomske naloge smo opravili meritve barve na vzorcih pomarančnega soka, ki smo mu dodali askorbinsko kislino, dehidroaskorbinsko kislino, spermidin ali putrescin. Vse vzorce smo pripravili v dveh paralelkah. Da bi preprečili mikrobno rast, smo vse vzorce soka z dodanimi kemikalijami pred inkubacijo na 50 °C termično obdelali. Imeli smo tudi dve različni kontroli z ustreznima paralelkama.
3.2.1 Priprava dodatkov
V posamezno petdeset mililitrsko centrifugirko smo zatehtali 96 mg spermidina, putrescina, askorbinske kisline in dehidroaskorbinske kisline ter jih raztopili v 32 ml mQ vode. Tako smo pripravili raztopine s koncentracijo 3.000 mg/L. Pripravljene raztopine smo premešali na vrtinčniku in shranili do uporabe.
3.2.2 Priprava vzorcev
V 300 mililitrske erlenmajerice smo zatehtali sirup, vodo in dodatke v spodaj podanih vrednostih (Preglednica 3) ter premešali z magnetnim mešalom. Ker so biogeni amini in askorbinska kislina spojine s kislinsko bazičnimi lastnostmi in vrednost pH vpliva na potek Maillardove reakcije, smo raztopinam izmerili vrednost pH in jo z dodatkom 0,1 M HCl uravnali na vrednost kontrolnega vzorca (Preglednica 4). Zaradi majhne količine dodane 0,1 M HCl, smo vpliv na koncentracijo zanemarili.
Preglednica 3: Zatehte sadnega sirupa, destilirane vode in dodatkov za pripravo vzorcev Masa
sirupa (g) Masa destilirane
vode (g) Masa dodatka (g)
Kontrolni vzorec 63 280 0
Vzorec z dodatkom askorbinske kisline 63 250 30
Vzorec z dodatkom dehidroaskorbinske kisline 63 250 30
Vzorec z dodatkom spermidina 63 250 30
Vzorec z dodatkom putrescina 63 250 30
Preglednica 4: Uravnavanje vrednosti pH vzorcev glede na kontrolni vzorec
pH pred dodatkom HCl pH po dodatku HCl
Kontrolni vzorec 4,08 4,08*
Vzorec z dodatkom askorbinske kisline 4,09 4,09*
Vzorec z dodatkom dehidroaskorbinske kisline 4,08 4,08*
Vzorec z dodatkom spermidina 4,18 4,08
Vzorec z dodatkom putrescina 4,16 4,09
*vzorcem nismo dodali 0,1 M HCl
3.2.3 Priprava vzorcev na toplotno obdelavo in toplotna obdelava
Raztopine vsakega izmed petih vzorcev smo v dveh paralelkah (a in b) prenesli v 116 mililitrske šesterokotne steklene posodice proizvajalca Stenko. Pred toplotno obdelavo smo vsem vzorcem pomerili barvo (a*, b* in L*) s kromametrom Konica Minolta. Vzorce smo termično obdelali v sušilcu na temperaturi 80 °C do dosežene središčne temperature 65 °C.
Termična obdelava je trajala 50 minut.
3.2.4 Shranjevanje vzorcev
Vzorce smo hranili v sušilniku na 50 °C. Poleg toplotno obdelanih vzorcev z dodatki in ustrezne kontrole, smo v dve stekleni posodici proizvajalca Stenko prenesli dodatno kontrolo v dveh paralelkah, ki ju nismo toplotno obdelali. Te vzorce smo hranili v hladilniku na 8 °C in na njih prav tako opravljali meritve barve.
3.2.5 Merjenje barve
Barvo smo merili s kromametrom Konica Minolta CR-200B, ki smo ga pred vsako serijo meritev umerili na beli standard. Meritve barve smo izvedli pred in po toplotni obdelavi ter nato prvi, drugi, četrti, šesti, osmi, enajsti in petnajsti dan po toplotni obdelavi. Na obeh paralelkah posameznega vzorca smo opravili po štiri meritve. Za vsako časovno točko in posamezen dodatek smo tako opravili osem meritev parametrov a*, b* in L*. Zaradi delnega posedanja delcev v pomarančnem soku, ki je bilo povezano tudi s termično obdelavo, smo pred vsako meritvijo vsebino dobro premešali in izvedli meritve preden so se delci posedli.
3.2.5.1 CIELAB sistem barv
Podatki pridobljeni s kromametrom Minolta se podajajo v obliki CIELAB sistema barv.
CIELAB je numeričen sistem za vrednotenje barve, ki je mednarodno priznan. Commission Internationale de L’Eclairage (CIE) ga je vzpostavila leta 1978 (Gómez-Polo in sod., 2016).
Definiran je kot barvni prostor s tremi pravokotno ležečimi osmi. Os L* kaže svetlost barve (nižja vrednost pomeni temnejšo barvo), os a*kaže prehod iz rdeče (+a*) v zelene odtenke (-a*), os b* pa prehod iz rumenih (+b*) v modre (-b*) odtenke (Leon in sod., 2006). Vrednosti L* so med 0 in 100, medtem ko so vrednosti a* in b* med -120 in 120.
Slika 7: CIELAB barvni diagram (Ly in sod., 2020)
3.2.6 Prikaz rezultatov
Za namen prikaza rezultatov smo za ustrezne čase inkubacije (tx) izračunali povprečje vseh osmih meritev na posameznem vzorcu soka (štiri meritve za vsako od paralelk) za parametre L*, a* in b*. Vse opravljene meritve so prikazane v prilogi A, izračunane povprečne vrednosti in standardne deviacije meritve so prikazane v prilogi B. Na podlagi povprečij za vsak parameter barve smo nato izračunali spremembe parametrov glede na dan 0 (to) za kontrolo in sokove z dodatkom askorbinske kisline, dehidroaskorbinske kisline, putrescina in spermidina po formulah 1, 2 in 3. Spremembo v odvisnosti od časa smo prikazali na grafih.
L*tx = L*tx- L*to ... (1)
a*tx = a*tx- a*to ... (2)
b*tx = b*tx- b*to ... (3)
4 REZULTATI Z RAZPRAVO
V poglavju rezultati z razpravo smo prikazali spremembo barve vzorcev pomarančnega soka med skladiščenjem.
4.1 SPREMEMBE PARAMETRA a*
Povprečje meritev posameznih vzorcev za parameter a* je prikazano v preglednici 5, spremembe parametra v odvisnosti od časa pa na sliki 8.
Preglednica 5: Povprečne vrednosti meritev barve za parameter a* pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z dodatkom spermidina), brez TO (kontrolni vzorec brez toplotne obdelave, hranjen pri 8 °C)
dan 0 0 po TO 1 2 4 6 8 11 15
A -5,65 -5,61 -5,32 -5,12 -4,79 -4,36 -3,99 -3,55 -3,02 D -5,72 -5,60 -5,01 -4,65 -4,16 -3,53 -3,28 -2,73 -2,24 K -5,67 -5,57 -5,12 -4,82 -4,52 -4,04 -3,73 -3,28 -2,64 P -5,66 -5,60 -5,18 -4,92 -4,67 -4,24 -3,96 -3,47 -3,00 S -5,68 -5,67 -5,22 -5,02 -4,68 -4,23 -3,95 -3,47 -2,90 brez TO -5,76 - -5,67 -5,91 -5,74 -5,86 -5,90 -5,88 -5,53
Iz rezultatov prikazanih v preglednici 5 je razvidno, da ima termična obdelava majhen vpliv na spremembo parametra a*, saj se ta povečal za vrednost 0,01 do 0,12, kar kaže na manjši premik barve proti bolj rdečkasto rjavi. Ker pa so relativne standardne deviacije meritev primerljive z ugotovljenimi spremembami (priloga B), ta relativno kratek čas termične obdelave ne vpliva značilno na porjavenje. Iz povprečnih vrednosti je razvidno, da se
vrednost a* povečuje tokom celotne inkubacije, saj za vsakega od vzorcev velja, da so smo po daljših časih trajanja izmerili večje vrednosti parametra a*. Največje povečanje vrednosti a* (porjavenje) smo ugotovili za dodatek dehidroaskorbinske kisline (a*15dni = 3,48), najmanjše pa za dodatke askorbinske kisline (a*15dni = 2,64). V primeru dodatka spermidina (a*15dni = 2,78) in putrescina (a*15dni = 2,66) smo določili podobno stopnjo porjavenja kot pri dodatku askorbinske kisline. Porjavenje pri kontrolnem vzorcu je bilo nekoliko bolj intenzivno (a*15dni = 3,03). Do porjavenja v vzorcu, ki smo ga shranili v hladilniku na 8 oC, ni prišlo, saj so se vrednosti a* tekom inkubacije le malo in neznačilno spreminjale.
Največjo spremembo smo določili zadnji dan inkubacije (a*15dni = 0,24).
Slika 8: Sprememba parametra a* v odvisnosti od časa skladiščenja pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom
putrescina), S (z dodatkom spermidina)
Iz podatkov predstavljenih na sliki 8 je razvidno, da smo pri vseh časovnih točkah največjo spremembe barve za parameter a* določili pri vzorcu, ki smo mu dodali dehidroaskorbinsko kislino, medtem ko so bile pri vzorcu z dodatkom askorbinske kisline sprememba pri vseh časovnih točkah spremembe najmanjše. Glede na kontrolni vzorec smo p ri vseh časovnih točkah manjše spremembe v parametru a* ugotovili tudi pri vzorcih z dodatkom biogenih aminov. Čeprav razlike v vrednosti a*med posameznimi vzorci za enak čas inkubacije ne presegajo vrednosti 1, so tudi relativne standardne deviacije pri merjenju a* majhne in so v območju 0,1. Posledično lahko sklepamo, da dodatek dehidroaskorbinske kisline statistično značilno pospešuje porjavenje. Na drugi strani pa lahko vsaj pri daljših časih inkubacije (11 in 15 dni) sklepamo, da bi lahko dodatek askorbinske kisline, spermidina in putrescina upočasnil porjavenje. Za nedvomno potrditev, pa bi bilo potrebno opraviti še več število meritev (več neodvisnih vzorcev) in nato rezultate ustrezno statistično obdelati.
V okviru predhodnih študij so ugotovili, da askorbinska kislina pospešuje porjavenje pomarančnega soka. Ključen korak naj bi bil povezan predvsem z oksidacijo askorbinske kisline v dehidroaskorbinsko kislino (Bharate in Bharate, 2014), ki se lahko tvori z direktno
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50
0 5 10 15
∆a*
Čas skladiščenja (dan)
A (z dodatkom askorbinske kisline) D (z dodatkom dehidroaskorbins ke kisline) K (kontrolni vzorec) P (z dodatkom putrescina) S (z dodatkom spermidina)
oksidacijo s kisikom ali pa po redukciji delno oksidiranih fenolov. V okviru diplomskega dela smo tudi pokazali negativen vpliv dehidroaskorbinske kisline na porjavenje. Ker askorbinska kislina ni imela negativnih učinkov predvidevamo, da se je med inkubacijo oksidiralo le malo askorbinske kisline, kar bi lahko pripisali dobri kvaliteti soka (malo oksidiranih polifenolov) in majhni količini kisika, saj smo centrifugirke napolnili do roba.
Pred kratkim so ovrednotili vpliv spojin z amino skupino na porjavenje pomarančnega soka (Paravini in Ptereson, 2019), vendar v tej študiji niso bili vključeni poliamini. Med aminokislinami naj bi predvsem triptofan in glutamin največ prispevala k porjavenju, o vplivu poliamniov na porjavenje pomarančnega soka pa nismo našli literaturnih podatkov.
4.2 SPREMEMBE PARAMETRA b*
Povprečje meritev posameznih vzorcev za parameter b* je prikazano v preglednici 6, spremembe parametra v odvisnosti od časa pa na sliki 9.
Preglednica 6: Povprečje meritev barve za parameter b* pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z
dodatkom spermidina), brez TO (kontrolni vzorec brez toplotne obdelave, hranjen pri 8 °C)
dan 0 0 po TO 1 2 4 6 8 11 15
A 17,34 16,64 16,81 16,60 16,43 16,20 15,88 15,67 15,25 D 17,64 16,91 16,95 16,78 16,47 16,10 15,98 15,64 15,08 K 17,38 16,48 16,49 16,30 16,23 16,07 15,71 15,55 14,89 P 17,28 16,71 16,49 16,27 16,21 15,97 15,89 15,65 15,34 S 17,35 16,66 16,56 16,43 16,23 16,07 15,96 15,72 15,18 brez TO 17,54 - 18,56 19,05 18,70 18,97 19,03 19,17 17,07
Iz meritev je razvidno, da je med skladiščenjem prišlo do zmanjšanja vrednosti parametra b* od okoli 17-18 proti 14,5-15,5. Nižanje vrednosti kaže na spremembo barve iz smeri rumenih odtenkov proti bolj modrim odtenkom.
Iz podatkov o spremembi vrednosti b* s časom skladiščenja je opazno, da je do največje spremembe ponovno prišlo pri vzorcu z dodatkom dehidroaskorbinske kisline, sledi mu kontrolni vzorec. Pri vzorcih z dodatkom biogenih aminov in askorbinske kisline je sprememba v barvi manjša, najmanjša je pri vzorcu z dodatkom putrescina. Skratka tudi pri spremembi parametra b* opazimo podoben trend kot pri spremembi a*, vendar zaradi manjših razlik v spremembi parametra kakor tudi večji standardni deviaciji (priloga B) ne moremo trditi, da so razlike med posameznimi vzorci statistično značilne.
Slika 9: Sprememba parametra b*v odvisnosti od časa skladiščenja pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom
putrescina), S (z dodatkom spermidina)
Iz rezultatov prikazanih na slikah 8 in 9 je tudi razvidno, da ima termična obdelava precej večji vpliv na spremembo parametra b* kot a*. Pri vzorcu z dodatkom askorbinske kisline lahko na dan 1 opazimo celo rahlo zmanjšanje razlike in povečanje vrednosti b*. Za potrditev, ali je povečanje b* posledica dejanske spremembe, bi potrebovali večje število meritev.
4.3 SPREMEMBE PARAMETRA L*
Povprečje meritev posameznih vzorcev za parameter L* je prikazano v preglednici 9, spremembe parametra v odvisnosti od časa pa na sliki 7.
Preglednica 7: Povprečje meritev barve za parameter L* pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z
dodatkom spermidina), brez TO (kontrolni vzorec brez toplotne obdelave, hranjen pri 8 °C)
dan 0 0 po TO 1 2 4 6 8 11 15
A 40,77 39,51 39,85 39,93 39,60 39,34 38,97 38,23 38,06 D 40,68 39,56 39,42 39,20 38,77 38,34 37,94 37,32 37,30 K 40,54 39,67 39,54 39,35 38,98 38,50 38,39 37,82 37,49 P 41,07 39,73 39,79 39,59 39,39 39,06 38,88 38,27 37,78 S 40,76 39,70 39,59 39,93 39,55 39,07 39,03 38,33 37,83 brez TO 41,33 - 41,27 40,99 41,23 40,92 40,75 41,06 41,19
Iz meritev je razvidno, da vrednost L* pada, kar pomeni, da so vzorci postajali temnejši.
Barva kontrolnega vzorca, ki smo ga hranili na 8 °C se med inkubacijo ni spreminjala.
-3,00 -2,50 -2,00 -1,50 -1,00 -0,50 0,00
0 5 10 15
∆b*
Čas skladiščenja (dan)
A (z dodatkom askorbinske kisline) D (z dodatkom dehidroaskorbinske kisline)
K (kontrolni vzorec)
P (z dodatkom putrescina) S (z dodatkom spermidina)
Slika 10: Sprememba parametra L*v odvisnosti od časa skladiščenja pri vzorcih A (z dodatkom askorbinske kisline), D (z dodatkom dehidroaskorbinske kisline), K (kontrolni vzorec brez dodatka), P (z dodatkom putrescina), S (z dodatkom spermidina), brez TO (kontrolni vzorec brez toplotne obdelave, hranjen pri 8 oC)
Iz podatkov o spremembi vrednosti parametra L* je razvidno, da je do največje spremembe prišlo pri vzorcu z dodatkom dehidroaskorbinske kisline, sledi mu vzorec z dodatkom putrescina in nato kontrolni vzorec. Do najmanjše premembe je prišlo pri vzorcu z dodatkom askorbinske kisline in spermidina.
Opazimo lahko tudi, da toplotna obdelava močno vpliva na spremembo (zmanjšanje) parametra L* kar je podobno, kot smo ugotovili za b*. Pri vzorcih z dodatkom spermidina in askorbinske kisline smo nato po prvem in drugem dnevu inkubacije določili celo večjo vrednost parametra L*. Izmerjeno zmanjšanje, kakor tudi razlike med različnimi vzorci po določenih časih inkubacije pa kljub največji absolutni spremembi parametra (v primerjavi z a* in b*), zaradi relativno velikih standardnih deviacij (priloga B) najverjetneje niso statistično značilne.
4.4 SKUPNA SPREMEMBA BARVE
V primerjavi s kontrolo, ki smo jo hranili v hladilniku, je do spremembe barve prišlo pri vseh vzorcih, ne glede na dodatek. Sprememba je opazna tudi s prostim očesom, kar je prikazano na Sliki 11 in 12. Med petimi vzorci, ki smo jih skladiščili pri enakih pogojih, je do največje spremembe barve prišlo pri vzorcu z dodatkom dehidroaskorbinske kisline, do najmanjše spremembe pa v vzorcu z dodatkom askorbinske kisline. Sklepamo lahko, da je v vzorcu z dodatkom dehidroaskorbinske kisline prišlo do reakcij degradacije askorbinske kisline, kot je opisano v poglavju 2.2.1. Poleg tega dehidroaskorbinska kislina vstopa v Maillardovo reakcijo in povzroča porjavenje.
-3,50 -3,00 -2,50 -2,00 -1,50 -1,00 -0,50 0,00
0 5 10 15
∆L*
Čas skladiščenja (dan)
A (z dodatkom askorbinske kisline) D (z dodatkom dehidroaskorbinske kisline)
K (kontrolni vzorec)
P (z dodatkom putrescina) S (z dodatkom spermidina)
Slika 11: Vzorci prvi dan po toplotni obdelavi - zadnja vrsta od leve proti desni: K-a (kontrolni vzorec, paralelka a), K-b (kontrolni vzorec, paralelka b), A-a (vzorec z askorbinsko kislino, paralelka a), A-b (vzorec
z askorbinsko kislino, paralelka b), D-a (vzorec z dehidroaskorbinsko kislino, paralelka a), D-b (vzorec z dehidroaskorbinsko kislino, paralelka b), P-a (vzorec s putrescinom, paralelka a), P-b (vzorec s putrescinom,
paralelka b), S-a (vzorec s spermidinom, paralelka a), S-b (vzorec s spermidinom, paralelka b); sprednja vrsta: dve paralelki kontrole hranjene pri 8 °C
Slika 12: Vzorci petnajsti dan po toplotni obdelavi - od leve proti desni: kontrola hranjena pri 8 °C, vzorec z dodatkom spermidina, vzorec z dodatkom putrescina, kontrola, vzorec z dodatkom dehidroaskorbinske
kisline, vzorec z dodatkom askorbinske kisline
Glede na kontrolni vzorec dodatki askorbinske kisline, putrescina in spermidina na porjavenje delujejo zaviralno, kar se opazi v manjši izmerjeni spremembi barve, ki pa ni vidna s prostim očesom. Glede na to, da je predvsem putrescin kvantitativno zelo pomembna molekula v pomarančnem soku, bi bilo v bodoče smiselno ovrednotiti, kako vsebnost te molekule vpliva na neencimsko porjavenje pomarančnega soka. Dodatek spermidina, ki je prehransko zaželena molekula, ni imel negativnih učinkov na spremembo barve. Še več, dodatek spermidina v koncentraciji 300 mg/L je celo upočasnil proces porjavenja (manjša sprememba a*) v primerjavi s kontrolo. Glede na to, da pomarančni sok že sam po sebi vsebuje nekaj spermidina, bi lahko s spermidinom obogaten pomarančni sok predstavljal prehransko zanimiv izdelek.
5 SKLEPI
Ugotovili smo, da porjavenje značilno pospešuje dodatek dehidroaskorbinske kisline, pri kateri je sprememba parametrov a* in L* največja, medtem ko askorbinska kislina, putrescin in spermidin porjavenje pri 50 °C upočasnijo, saj so spremembe a* in L* pri njih manjše od sprememb pri kontrolnem vzorcu. Z razgradnjo dehidroaskorbinske kisline nastajajo molekule, ki so vključene v Maillardovo reakcijo. Dehidroaskorbinska kislina direktno vstopa v reakcije degradacije askorbinske kisline in Maillardovo reakcijo, medtem ko se sama askorbinska kislina v mediju z majhno količino kisika ne pretvori v dehidroaskorbinsko kislino. Spermidin in putrescin kljub amino skupinam pri 50 °C ne vstopata v Maillardovo reakcijo ali pa so njuni produkti manj intenzivno obarvani. Vsekakor njun dodatek ugodno vpliva na spremembo barve.
Predvsem spermidin zaradi svojih ugodnih učinkov na zdravje predstavlja potencialen dodatek za živila, vendar bo v primeru pomarančnega soka pred tem potrebno raziskati še delovanje v drugačnih pogojih. Predvsem so dejavniki lahko različna prepustnost embalaže za kisik, opravljena deaeracija soka pred polnjenjem, različen pH živil ter temperatura in čas skladiščenja.
6 POVZETEK
Pomarančni sok ima velik pomen pri dnevnem vnosu sadja in pomembno vpliva na vnos mikrohranil. Zaradi svoje hranilne sestave lahko pozitivno vpliva na naše zdravje in preprečuje pojav kroničnih bolezni. Njegova sestava in kakovost sta odvisni od načina izdelave in kakovosti vhodnih surovin. Poleg mikrohranil vsebuje tudi sladkorje, med katerimi prevladujejo saharoza, glukoza in fruktoza, in kisline, od katerih je največ citronske kisline. Pomembno je omeniti tudi vitamin C, ki ima antioksidativno vlogo in h krati predstavlja kofaktor številnih reakcij v našem organizmu. Prav zaradi kemijske sestave lahko tudi po toplotni obdelavi pomarančnega soka v njem potekajo reakcije porjavenja. Ključni sta Maillardova reakcija med amino skupino in reducirajočimi sladkorji in reakcije pretvorbe askorbinske kisline, ki vodita v pojav rjavih produktov, neželenih spojin ter izgubo hranilne in senzorične kakovosti. Pomaranče so tudi bogat vir biogenih poliaminov putrescina in spermidina. Slednji je v naši prehrani zaželen, saj vpliva na staranje in ga s starostjo sintetiziramo vedno manj. Poleg tega imajo poliamini dokazano antioksidativno delovanje.
V diplomski nalogi smo želeli ugotoviti vpliv askorbinske kisline, dehidroaskorbinske kisline, putrescina in spermidina na neencimsko porjavenje pomarančnega soka. Omenjene kemikalije smo v enakih masnih koncentracijah (300 mg/L) dodali v pomarančni sok, vzorce toplotno obdelali do središčne temperature 65 °C in jih nato 15 dni skladiščili na 50
°C. Na izbrane dneve smo inkubiranim vzorcem izmerili barvo (L*, a*, b*) s kromametrom Konica Minolta CR-200B, ki smo ga pred vsako serijo meritev umerili na beli standard.
Meritve smo izvajali na dveh paralelkah vsakega vzorca, in sicer štiri zaporedne meritve. Iz rezultatov smo ugotovili, da dehidroaskorbinska kislina pospešuje porjavenje, medtem ko ostale tri spojine glede na kontrolni vzorec porjavenje upočasnjujejo. Najbolj zaviralno deluje askorbinska kislina, pri kateri so spremembe vrednosti a* in L* najmanjše.
Glede na to, da smo ugotovili pozitivne učinke nekaterih dodatkov v smislu upočasnitve encimskega porjavenja, bi bilo verjetno smiselno opraviti meritve v večjem obsegu, različnih pogojih skladiščenja in pri različnih koncentracijah. Dodatne informacije o vplivu na neencimsko porjavenje in pretvorbi dodanih molekul v tem procesu bi pridobili tudi, če bi kromatografsko določili spremembe v vsebnosti poliaminov, askorbinske in dehidroaskorbinske kisline, kakor tudi spremembe antioksidativnega potenciala med skladiščenjem.
7 VIRI
Abramovič H., Cigić B., Pogačnik L., Poklar Ulrih N., Prislan I., Skrt M., Šegatin N. 2017.
Splošni pregled in klasifikacija aditivov. V: Aditivi v živilih – prednosti in tveganja. 29.
Bitenčevi živilski dnevi 2017. Ljubljana, 15. jun. 2017. Poklar Ulrih N., Abramovič H., Cigić B., Pogačnik L., Prislan I., Skrt M., Šegatin N. (ur.). Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 15-17
Ali M.A., Poortvliet E., Strömberg R., Yngve A. 2011. Polyamines in foods: Development of a food database. Food & Nutrition Research, 55: 5572, doi: 10.3402/fnr.v55i0.5572:
15 str.
Ames J.M. 2003. Browning: Nonenzymatic. V: Encyclopedia of food sciences and nutrition.
Vol. 1. 2nd ed. Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M. (ur.). Amsterdam, Academic Press:
665-672
Arihara K., Zhou L., Ohata M. 2017. Bioactive Properties of Maillard reaction products generated from food protein-derived peptides. Advances in Food and Nutrition Research, 81: 161-185
Bharate S. S., Bharate S. B. 2012. Non-enzymatic browning in citrus juice: chemical markers, their detection and ways to improve product quality. Journal of Food Science and Technology, 51: 2271–2288
Bulushi I.A., Poole S., Deeth H.C., Dykes G.A. 2009. Biogenic amines in fish: roles in intoxication, spoilage, and nitrosamine formation - a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 49: 369–377
Gloria M.B.A. Amines. V: Encyclopedia of food sciences and nutrition. Vol. 2. 2nd ed.
Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M. (ur.). Amsterdam, Academic Press: 173-181 Gómez-Polo C., Portillo Muñoz M., Cruz Lorenzo Luengo M., Purificación V.,
Purificanción G., Martín Casado A.M. 2016. Comparison of the CIELab and CIEDE2000 color difference formulas. Journal of Prosthetic Dentistry, 115, 1: 65-70 Gutirea D. 2018. Vpliv sintetičnih in biogenih aminov na oksidacijo rastlinskih olj.
Magistrsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 54 str.
Hole M. 2003. Storage stability: mechanisms of degradation. V: Encyclopedia of food sciences and nutrition. Vol. 9. 2nd ed. Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M. (ur.).
Amsterdam, Academic Press: 5604-5612
Huberlant J. 2003. Sucrose: properties and determination. V: Encyclopedia of food sciences and nutrition. Vol. 9. 2nd ed. Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M. (ur.). Amsterdam, Academic Press: 5636-5641
Izquierdo L., Sendra J.M. 2003. Citrus fruits: composition and characterization. V:
Encyclopedia of food sciences and nutrition. Vol. 2. 2nd ed. Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M. (ur.). Amsterdam, Academic Press: 1335-1341
Johnson J.M., Conforti F.D. 2003. Fructose. V: Encyclopedia of food sciences and nutrition.
Vol. 5. 2nd ed. Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M. (ur.). Amsterdam, Academic Press:
2748-2752
Kall M.A. 2003. Ascorbic acid: properties and determination. V: Encyclopedia of food sciences and nutrition. Vol. 1. 2nd ed. Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M. (ur.).
Amsterdam, Academic Press: 316-324
Kiechl S., Pechlaner R., Willeit P., Notdurfter M., Paulweber B., Willeit K., Werner P., Ruckenstuhl C., Iglseder B., Weger S., Mairhofer B., Gartner M., Kedenko L., Chmelikova M., Stekovic S., Stuppner H., Oberhollenzer F., Kroemer G., Mayr M., Eisenberg T., Tilg H., Madeo F., Willeit J. 2018. Higher spermidine intake is linked to lower mortality: A prospective population-based study. American Journal of Clinical Nutrition, 108, 2: 371-380
Kralj Cigić I., Rupnik S., Rijavec T., Poklar Ulrih N., Cigić B. 2020. Accumulation of agmatine, spermidine, and spermine in sprouts and microgreens of alfalfa, fenugreek, lentil, and daikon radish. Foods, 9: 547: doi: 10.3390/foods9050547: 20 str.
Lanza C.M. 2003. Citrus fruits: processed and derived products of oranges. V: Encyclopedia of food sciences and nutrition. Vol. 2. 2nd ed. Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M.
(ur.). Amsterdam, Academic Press: 1346-1354
Leon K., Mery D., Pedreschi F., Leon J. 2006. Color measurement in L* a* b* units from RGB digital images. Food Research International, 39, 10: 1084-1091
Løvaas E. 1991. Antioxidative effects of polyamines. Journal of the American Oil Chemists’
Society , 68, 6: 353-358
Ly B.C.K., Dyer E.B., Feig J.L., Chien A.L., Del Bino S. 2020. Cutaneous colorimetry: a reliable technique for objective skin color measurement. Journal of Investigative Dermatology, 140, 1: 3-12
Muñoz-Esparza N.C., Latorre-Moratalla M.L., Comas-Basté O., Toro-Funes N., Veciana- Nogués M.T., Vidal-Carou M.C. 2019. Polyamines in food. Frontiers in Nutrition, 6:
108, doi: 10.3389/fnut.2019.00108: 11 str.
Nooshkam M., Varidi M., Bashash M. 2019. The Maillard reaction products as food-born antioxidant and antibrowning agents in model and real food systems. Food Chemistry, 275: 644-660
Önal A., Tekkeli S.E.K., Önal C. 2013. A review of the liquid chromatographic methods for the determination of biogenic amines in foods. Food Chemistry, 138, 1: 509-515 Pao S., Fellers P.J. 2003. Citrus fruits: Oranges. V: Encyclopedia of food sciences and
nutrition. Vol. 2. 2nd ed. Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M. (ur.). Amsterdam, Academic Press: 1341-1345
Paravisini L., Peterson D. G. 2019. Mechanisms non-enzymatic browning in orange juice during storage. Food Chemistry, 289: 320-327
Shinoda Y., Komura H., Homma S., Murata M. 2014. Browning of model orange juice solution: factors affecting the formation of decomposition products. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 69, 11: 2129-2137
Sreeranjit C.V.K., Lal J.J. 2003. Glucose: properties and analysis. V: Encyclopedia of food sciences and nutrition. Vol. 5. 2nd ed. Caballero B., Trugo L.C., Finglas P.M. (ur.).
Amsterdam, Academic Press: 2898-2903
ZAHVALA
Zahvalila bi se mentorju, prof. dr. Blažu Cigiću, za vso pomoč in mentorstvo pri pripravi diplomske naloge, za strokovnost, pomoč pri dokončanju eksperimentov in dobro voljo.
Prav tako gre zahvala mladim raziskovalcem katedre za kemijo in biokemijo živil, ki so mi radi priskočili na pomoč v laboratoriju.
Posebna zahvala gre tudi Mirti Kadivec, ki mi je bila vedno na voljo za vsa vprašanja v povezavi z izdelavo diplomske naloge, ter Nektar Naturi za vzorec pomarančnega soka in sodelovanje.
Hvala družini in Brunu za spodbude in mir v času pisanja.
