Nataša BUKOVEC
DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA KOMBINACIJE ANTIBIOTIKOV PROTI
VEČKRATNO ODPORNIM SEVOM BAKTERIJE Acinetobacter baumannii
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija
Ljubljana, 2014
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE
Nataša BUKOVEC
DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA KOMBINACIJE ANTIBIOTIKOV PROTI VEČKRATNO ODPORNIM SEVOM
BAKTERIJE Acinetobacter baumannii
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija
EVALUATION OF ANTIBIOTIC COMBINATIONS AGAINST MULTI-DRUG RESISTANT STRAINS OF Acinetobacter baumannii
M. SC. THESIS
Master Study Programmes: Field Microbiology
Ljubljana, 2014
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Mikrobiologije.
Delo je bilo opravljeno v Laboratoriju za bakteriološko diagnostiko respiratornih infekcij Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je na seji dne 29. 5. 2013 za mentorico magistrskega dela imenovala prof. dr. Katjo Seme, dr. med. in za recenzentko prof. dr. Sonjo Smole Možina.
Mentorica: prof. dr. Katja Seme, dr. med.
Recenzentka: prof. dr. Sonja Smole Možina, univ. dipl. inž. živil. tehnol.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: prof. dr. Darja ŽGUR-BERTOK, univ. dipl. biol.
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Članica: prof. dr. Katja SEME, dr. med.
Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo
Članica: prof. dr. Sonja SMOLE MOŽINA, univ. dipl. inž. živil. tehnol.
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum zagovora:
Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Podpisana se strinjam z objavo svojega dela na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je delo, ki sem ga oddala v elektronski obliki, identično tiskani verziji.
Nataša Bukovec
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI)
ŠD Du2
DK UDK 579.61+579.24:615.33:579.84(043)=163.6
KG patogeni mikroorganizmi/Acinetobacter baumannii/odpornost proti antibiotikom/
sinergija/mikrodilucija/ metoda navzkrižnega seta difuzijskih gradientov/metoda šahovnice/metoda time-kill
AV BUKOVEC, Nataša, dipl. mikrobiol. (UN)
SA SEME, Katja (mentorica)/ SMOLE MOŽINA, Sonja (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije
LI 2014
IN DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA KOMBINACIJE
ANTIBIOTIKOV PROTI VEČKRATNO ODPORNIM SEVOM BAKTERIJE Acinetobacter baumannii
TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija) OP XI, 56 str., 8 pregl., 7 sl., 49 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Zdravljenje okužb, ki jih povzroča Acinetobacter baumannii, najbolj otežujejo večkratno odporni izolati. Zaradi visoke odpornosti proti trenutno dosegljivim antibiotikom se v prakso skuša vpeljati kombinirano zdravljenje. Za najustreznejšo kombinacijo se lahko odločimo, če najprej ugotovimo, če pri določenih kombinacijah antibiotikov in vitro obstaja sinergistični učinek. V raziskavi smo želeli ugotoviti katere kombinacije antibiotikov in vitro sinergistično delujejo proti 15 večkratno odpornim izolatom A. baumannii, ki so bili izolirani pri bolnikih hospitaliziranih v Univerzitetnem kliničnem centru v Ljubljani v obdobju enega leta. Želeli smo tudi ugotoviti katera metoda za določanje sinergističnega učinka kombinacije antibiotikov je najbolj primerna za rutinski mikrobiološki laboratorij. Sinergistični učinek smo preverjali z metodo navzkrižnega seta difuzijskih gradientov, metodo šahovnice in metodo time-kill. Preverjali smo kombinacije antibiotikov tigeciklin z imipenemom, tigeciklin z levofloksacinom, tigeciklin s kolistinom in polimiksin B z imipenemom. Z metodo navzkrižnega seta difuzijskih gradientov nismo ugotovili sinergističnega delovanja antibiotikov. Z metodo šahovnice smo ugotovili sinergistični učinek kombinacije polimiksina B in imipenema proti 7 testiranim izolatom in kombinacije tigeciklina in kolistina proti 14 izolatom. Z metodo time-kill smo pri 6 izolatih potrdili sinergistični učinek kombinacije tigeciklina in kolistina, medtem ko nismo potrdili sinergističnega učinka kombinacije polimiksina B in imipenema. Pri dveh izolatih, pri katerih smo z metodo šahovnice ugotovili sinergistični učinek tigeciklina in kolistina, smo z metodo time–kill pri po eni od testiranih koncetracij antibiotikov ugotovili antagonizem. Najbolj hitra in tehnično najmanj zahtevna metoda za ugotavljanje sinergističnega učinka kombinacije antibiotikov je sicer metoda navzkrižnega seta difuzijskih gradientov, vendar ni primerna za uporabo v rutinskem mikrobiološkem laboratoriju, saj njeni rezultati niso zanesljivi. Metodi šahovnice in time-kill sta tehnično veliko bolj zahtevni in zamudni, rezultati so bolj zanesljivi vendar niso popolnoma primerljivi. Kombinacija tigeciklina in kolistina je imela najboljši sinergistični učinek proti slovenskim izolatom večkratno odporne bakterije A. baumannii.
KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)
DN Du2
DC UDC 579.61+579.24:615.33:579.84(043)=163.6
CX pathogens/Acinetobacter baumannii/antibiotic resistance/synergy/microdilution/
crossing set/checkerboard/time-kill AU BUKOVEC, Nataša
AA SEME, Katja (supervisor)/ SMOLE MOŽINA, Sonja (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study in Microbiology
PY 2014
TI EVALUATION OF ANTIBIOTIC COMBINATIONS AGAINST MULTI-DRUG RESISTANT STRAINS OF Acinetobacter baumannii
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Microbiology) NO XI, 56 p., 8 tab., 7 fig., 49 ref.
LA sl AL sl/en
AB Infections caused by multi-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii are most problematic and difficult to treat. Combination therapy can be used in a case of extensive resistance against currently available antibiotics. It is easier to choose the appropriate combination if antibiotic combinations are first evaluated in vitro and synergistic effect is determined. In this study we wanted to determine which combination of antibiotics has in vitro synergistic effect against 15 multi-drug resistant isolates of A. baumannii, which were isolated from patients hospitalized at the University Medical Centre in Ljubljana during one year period. We also wanted to determine which method for the determination of antibiotic synergy is the most convenient and accurate for routine microbiological laboratory. For evaluation of synergy we performed crossing-set, checkerboard and time-kill methods. Combinations of tigecycline with imipenem, tigecycline with levofloxsacin, tigecycline with colistine and polymyxin B with imipenem were tested. Using crossing-set method we were not able to demonstrate any synergy. Using checkerboard method synergy of polymyxin B in combination with imipenem was determined in 7 isolates and of tigecycline in combination with colistine in 14 isolates. Using time-kill method synergy of tigecycline in combination with colistin was detected in 6 isolates but synergy could not be detected for polymyxin B in combination with imipenem. In the case of two isolates, with synergy of tigecycline in combination with colistin detected using checkerboard method we detected antagonism in one of the tested concentrations of antibiotics using time-kill method. The fastest and easy to perform is crossing-set method, but unfortunately according to our results it does not give reliable results. Checkerboard and time-kill methods are technically much more demanding and time-consuming and the results are more reliable, but not fully comparable. The combination of tigecycline with colistin most frequently demonstrated synergy against Slovenian multi-drug resistant strains of A. baumannii.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ... III KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD) ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VIII KAZALO SLIK ... IX OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... X
1 UVOD ... 1
1.1 NAMEN DELA ... 2
1.2 DELOVNE HIPOTEZE ... 2
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 Acinetobacter baumannii ... 3
2.2 MEHANIZMI ODPORNOSTI BAKTERIJE A. baumannii PROTI ANTIBIOTIKOM ... 4
2.2.1 Encimska inaktivacija antibiotikov ... 4
2.2.2 Onemogočanje dostopa do tarčnega mesta v bakterijski celici ... 5
2.2.2.1 Družina membranskih izlivnih črpalk MFS ... 6
2.2.2.2 Družina membranskih izlivnih črpalk RND ... 6
2.2.3 Spremembe tarč ali celičnih funkcij zaradi mutacij ... 7
2.3 ANTIBIOTIKI ZA ZDRAVLJENJE OKUŽB, KI JIH POVZROČA A. baumannii .. 7
2.3.1 Beta-laktamski antibiotiki ... 8
2.3.2 Aminoglikozidni antibiotiki ... 9
2.3.3 Kinoloni ... 9
2.3.4 Glicilciklini ... 9
2.3.5 Polimiksini ... 9
2.4 KOMBINIRANO ZDRAVLJENJE ... 10
2.4.1 Argumenti za in proti kombiniranemu protimikrobnemu zdravljenju ... 11
2.5 LABORATORIJSKE METODE ZA DOLOČANJE in vitro UČINKA KOMBINACIJE ANTIBIOTIKOV ... 12
2.5.1 Metoda navzkrižnega seta difuzijskih gradientov ... 13
2.5.2 Metoda šahovnice ... 14
2.5.3 Metoda time-kill ... 14
3 MATERIALI IN METODE ... 16
3.1 BAKTERIJSKI IZOLATI ... 16
3.2 METODE ... 17
3.2.1 Priprava uporabljenih gojišč ... 17
3.2.2 Priprava bakterijskih izolatov in bakterijske suspenzije ... 18
3.2.3 Izbor in priprava antibiotikov ... 18
3.2.4 Določanje minimalne inhibitorne koncentracije ... 19
3.2.4.1 Metoda difuzijskega gradienta... 19
3.2.4.2 Mikrodilucijska metoda ... 20
3.2.5 Določanje sinergističnega učinka kombinacije antibiotikov ... 21
3.2.5.1 Navzkrižni set difuzijskih gradientov ... 21
3.2.5.2 Metoda šahovnice ... 22
3.2.5.3 Metoda time-kill ... 22
4 REZULTATI ... 26
4.1 DOLOČANJE MIK ANTIBIOTIKOV Z METODO DIFUZIJSKEGA GRADIENTA IN Z METODO MIKRODILUCIJE ... 26
4.2 DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA Z NAVZKRIŽNIM SETOM DIFUZIJSKIH GRADIENTOV ... 28
4.3 DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA Z METODO ŠAHOVNICE ... 30
4.4 DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA Z METODO TIME-KILL ... 32
4.5 PRIMERJAVA METOD ZA DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA ANTIBIOTIKOV ... 37
5 RAZPRAVA ... 40
5.1 DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA KOMBINACIJE TIGECIKLINA IN LEVOFLOKSACINA ... 41
5.2 DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA KOMBINACIJE TIGECIKLINA IN IMIPENEMA ... 42
5.3 DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA KOMBINACIJE TIGECIKLINA IN KOLISTINA ... 43
5.4 DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA KOMBINACIJE POLIMIKSINA B IN IMIPENEMA ... 44
5.5 PRIMERJAVA METOD ZA DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA KOMBINACIJE ANTIBIOTIKOV ... 45
6 SKLEPI ... 48
7 POVZETEK ... 49
8 VIRI ... 51 ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Občutljivost izbranih 15 izolatov na antibiotike, ki se uporabljajo za
zdravljenje okužb z A. baumannii. ... 17
Preglednica 2: Antibiotiki in razpon njihovih koncentracij, ki smo jih testirali pri vseh 15 izolatih A. baumannii ... 19
Preglednica 3: Pregled in primerjava MIK, določenih z metodo difuzijskega gradienta in z mikrodilucijo pri 15 izolatih A. baumannii ... 27
Preglednica 4: Rezultati določanja MIK z metodo difuzijskega gradienta in rezultati metode navzkrižnega seta difuzijskih gradientov za testirane kombinacije antibiotikov pri 15 izolatih A. baumannii ... 29
Preglednica 5: Rezultati določanja MIK z mikrodilucijo in rezultati metode šahovnice za vse testirane kombinacije antibiotikov pri 15 izolatih A. baumannii ... 31
Preglednica 6: Rezultati metode time-kill pri kombinaciji tigeciklina s kolistinom za 14 izolatov A. baumannii ... 34
Preglednica 7: Rezultati metode time-kill pri kombinaciji polimiksina B z imipenemom za 7 izolatov A. baumannii ... 35
Preglednica 8: Primerjava rezultatov testiranja sinergije z metodo navzkrižnega seta difuzijskih gradientov, metodo šahovnice in metodo time-kill pri 15 izolatih A. baumannii ... 38
KAZALO SLIK
Slika 1: Pravilna postavitev E-testov pri izvajanju sinergističnega testa z metodo navzkrižnega seta difuzijskih gradientov in odčitanje vrednosti MIK antibiotika v
kombinaciji (Bonapace in sod., 2000: 46) ... 14
Slika 2: Prikaz metode navzkrižnega seta difuzijskih gradientov in rezultat testiranja sinergije antibiotikov tigeciklina in kolistina ... 30
Slika 3: Rastna krivulja bakterije A. baumannii ... 32
Slika 4: Motnost/bistrost reakcijskih epruvet pri metodi time-kill po 24 urah inkubacije . 33
Slika 5: Primer sinergije tigeciklina s kolistinom pri izolatu A. baumannii ... 35
Slika 6: Primer antagonizma tigeciklina s kolistinom pri izolatu A. baumannii ... 36
Slika 7: Primer indiference tigeciklina in kolistina pri izolatu A. baumannii ... 36
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
ATCC angl. the American Type Culture Collection CFU
CLSI
angl. colony forming units
angl. Clinical and Laboratory Standards Institute DNA deoksiribonukleinska kislina
ESBL EUCAST
laktamaze beta z razširjenim spektrom delovanja
angl. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing FIC angl. fractional inhibitory concentration index
IS insercijska sekvenca
KA krvni agar
LPS m-RNA
lipopolisaharid
informacijska ribonukleinska kislina MBL metalo-beta laktamaze
McF McFarland
MDR večkratno odporni proti antibiotiku (angl. multidrug-resistant) MFP membranski fuzijski protein (angl. membrane fusion protein) MFS angl. major facilitator family
MH Mueller-Hinton agar
MHB Mueller-Hinton bujon
MIK minimalna inhibitorna koncentracija
OD optična gostota
OMP zunanji membranski protein (angl. outer membrane protein)
ORF odprti bralni okvir (angl. open reading frame) PBP
RNA
penicilin vezoči proteini (angl. penicilin binding proteins) ribonukleinska kislina
RND rpm t-RNA
angl. resistance-nodulation-division
število obratov na minuto (angl. revolutions per minute) prenašalna ribonukleinska kislina
XDR široko odporni proti antibiotiku (angl. extensively drug-resistant)
1 UVOD
Acinetobacter baumannii je pomemben povzročitelj bolnišničnih okužb (Peleg in sod., 2008). Zdravljenje okužb, ki jih povzroča A. baumannii v zadnjem času, najbolj otežujejo večkratno odporni (angl. multidrug resistant, MDR) in celo široko odporni (angl.
extensively drug-resistant, XDR) sevi (Kiratisin in sod., 2010). MDR sevi so tisti, ki so odporni proti najmanj enemu antibiotiku v treh ali večih kategorijah antibiotikov. Med XDR seve uvrščamo tiste izolate, ki so občutljivi za le eno ali dve kategoriji antibiotikov (Magiorakos in sod., 2012).
Prav zaradi visoke odpornosti proti zdaj dosegljivim antibiotikom se v prakso skuša vpeljati kombinirano zdravljenje, kjer bolnik sočasno prejema dva ali več antibiotikov z različnim načinom delovanja (Tan in sod., 2007). Za najustreznejšo kombinacijo se lahko odločimo, če najprej ugotovimo, če pri določenih kombinacijah antibiotikov in vitro obstaja sinergistični učinek.
Za ugotavljanje sinergističnega učinka kombinacije antibiotikov se lahko uporablja več različnih metod, najpogosteje metoda šahovnice, time-kill in difuzijski gradient. Vsaka od njih ima svoje prednosti in pomanjkljivosti (Bonapace in sod., 2000).
Vse pogosteje tudi pri slovenskih bolnikih osamimo izolate A. baumannii, ki so odporni proti vsem antibiotikom, primernih za zdravljenje, z izjemo kolistina (Sopirala in sod., 2010).
V Sloveniji zaenkrat določanje sinergističnega učinka kombinacije antibiotikov ne spada med rutinske diagnostične bakteriološke teste.
1.1 NAMEN DELA
V magistrski nalogi smo želeli ugotoviti, katera metoda za določanje sinergističnega učinka kombinacij antibiotikov je najprimernejša. Želeli smo določiti kombinacije antibiotikov, ki in vitro izkazujejo sinergistični učinek proti večkratno odpornim sevom Acinetobacter baumannii.
Na osnovi podatkov iz literature smo pričakovali sinergistični učinek pri kombinacijah, ki smo jih tudi sami uporabili pri testiranju.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Posamezni antibiotik, proti kateremu je bakterija razvila odpornost, lahko v kombinaciji z drugim antibiotikom in vitro uspešno učinkuje proti bakteriji.
Določene kombinacije antibiotikov imajo zaradi sinergističnega učinka večjo učinkovitost proti slovenskim večkratno odpornim sevom A. baumannii kot druge kombinacije in kot posamezni antibiotiki.
2 PREGLED OBJAV
2.1 Acinetobacter baumannii
Bakterija A. baumannii je aeroben, po Gramu negativen kokobacil. Prvič je bakterija bila omenjena leta 1911 pod imenom Micrococcus calco-aceticus, ki ga je zamenjalo še nekaj imen vse do leta 1950, ko je dobila zdajšnje ime. Naravno okolje bakterije A. baumannii sta voda in tla. Pri ljudeh lahko kolonizira kožo, rane, respiratorni in prebavni trakt (Munoz-Price in Weinstein, 2008).
Z bolnišnico povezane okužbe so postale svetovni problem, ki nas veliko stanejo, tako v ekonomskem smislu kot v povečanju mortalitete. Že desetletja so po Gramu negativne bakterije prispevale velik delež k tovrstnim okužbam. Med vsemi po Gramu negativnimi bakterijami je ravno A. baumannii tista, ki konstantno povečuje število primerov bolnišničnih okužb (Fouad in sod., 2013).
Večkratno odporna bakterija A. baumannii se je izkazala kot povzročiteljica najbolj težkih bolnišničnih okužb med po Gramu negativnimi bakterijami, kar se tiče uspešnosti zdravljenja in kontrole. Različni mehanizmi odpornosti, ki jih poseduje, omejujejo možnosti zdravljenja, še posebej, če je bolnik okužen s sevom A. baumannii, ki je odporen proti karbapenemskim antibiotikom. Možnost okužbe z A. baumannii se povečuje s podaljšanim bivanjem v bolnišnici, posebej v enotah intenzivnega zdravljenja, z mehansko ventilacijo, z invazivnimi postopki, operacijami in s stikom z okuženimi bolniki (Maragakis in Perl, 2008).
Acinetobacter spp. je postal pomemben patogen v enotah intenzivne nege in je povezan z bolnišničnimi okužbami, kot so pljučnica, okužbe urinarnega trakta, endokarditis, okužbe kože in ran in meningitis. Identificiranih je bilo več vrst rodu Acinetobacter, vendar je bakterija A. baumannii prepoznana kot vrsta, ki je najpogosteje odgovorna za bolnišnične okužbe. Zadnja leta se je izredno povečalo število izolatov A. baumannii, ki so odporni proti večini dosegljivih antibiotikov. Večina izolatov je odpornih proti starejšim antibiotikom, vključujoč peniciline razširjenega spektra, cefalosporine 1. in 2. generacije, aminoglikozide in tetracikline (Bonapace in sod., 2000).
Zdravljenje okužb z MDR A. baumannii predstavlja pravi izziv zaradi omejene izbire antibiotikov in tudi zato, ker so najpogostejši izbruhi okužb v enotah intenzivnega zdravljenja, kjer so nastanjeni najbolj ranljivi bolniki.
2.2 MEHANIZMI ODPORNOSTI BAKTERIJE A. baumannii PROTI ANTIBIOTIKOM Bakterija A. baumannii je ena izmed najbolj težavnih patogenov, ki se pojavljajo v bolnišničnem okolju. Tako pridobljena kot naravna odpornost prispevata k večkratni odpornosti proti antibiotikom. Pridobljena odpornost je lahko pogojena s pridobivanjem genetskih elementov, ki nosijo informacije za večkratno odpornost ali z mutacijami, ki se odražajo na izražanju porinov in/ali membranskih izlivnih črpalk. Naravna odpornost se izraža preko zmanjšane prepustnosti celične membrane in konstitutivnega izražanja aktivnih sistemov za izčrpavanje (Vila in sod, 2007).
A. baumannii je razvil več mehanizmov, ki mu pomagajo pri boju proti antibiotikom.
Glavni trije mehanizmi so: encimska inaktivacija antibiotikov, onemogočanje dostopa do tarčnega mesta v bakterijski celici in spremembe tarčnega mesta delovanja antibiotikov ali celičnih funkcij zaradi mutacij (Singh in sod., 2013).
2.2.1 Encimska inaktivacija antibiotikov
Najbolj pogost mehanizem rezistence pri A. baumannii je encimska razgradnja betalaktamskih antibiotikov s pomočjo encimov beta-laktamaz. Vsem sevom A. baumannii so skupne kromosomsko kodirane AmpC cefalosporinaze, poznane tudi kot ADCs (angl.
Acinetobacter-derived cephalosporinases). Ključni element, ki regulira prekomerno izražanje encima je element IS (insercijska sekvenca), znan kot ISAba1, ki se nahaja višje od regije, ki kodira encim. Prisotnost te regije močno sovpada s povečanjem izražanja gena in s pojavom odpornosti proti razširjenemu spektru cefalosporinaz (Peleg in sod., 2008).
Encimi beta-laktamaze hidrolizirajo substance kot so penicilini, sintetični cefalosporini in karbapenemi. V povezavi s karbapenemskimi antibiotiki so odkrili penicilinaze razreda D, tip encimov OXA in metalo-beta-laktamaze (MBL) razreda B, ki predstavljajo velik problem, saj se zapisi za encim nahajajo na mobilnih genskih elementih, ki se zlahka prenašajo med bakterijami (Singh in sod., 2013; Munoz-Price in Weinstein, 2008). Najbolj
problematične beta-laktamaze so tipa OXA. Prvi identificiran encim OXA pri A.
baumannii je bil leta 1985 na Škotskem. Tipe encimov OXA delimo v štiri glavne skupine:
OXA-23, OXA-24, OXA-51 in OXA-58. Med njimi je velika homologija v aminokislinskem zaporedju. Sekvence, ki kodirajo zapise za encime, se nahajajo na kromosomu ali na plazmidu. Skupina OXA-51 ima kodiran zapis le na kromosomu. To je tudi edina skupina encimov OXA, ki je naravno prisotna pri A. baumannii. Najpogostejši tip beta-laktamaz OXA pa je encim OXA-23 (Peleg in sod., 2008).
Hitro širjenje sevov A. baumannii, ki so odporni proti vsem beta-laktamom, vključujoč karbapeneme, kaže na dejstvo, da je A. baumannii sposoben hitrega prilagajanja na različne spremembe v okolju in na selekcijski pritisk (Peleg in sod., 2008). Po sekvenciranju celotnega genoma bakterije A. baumannii sta Fourier in Richet (2006) odkrila 86 kilobaz dolg rezistenčni otok v genomu, ki je hkrati tudi en izmed najdaljših opisanih doslej (AbaR1). Izmed skupno 88 predvidevanih odprtih bralnih okvirjev (angl.
open reading frame, ORF) znotraj genomske regije, se za 82 ORF predvideva, da izvirajo iz drugih po Gramu negativnih organizmov, kot so Pseudomonas sp., Salmonella sp. in Escherichia coli. Vsebnost baz gvanina in citozina v tej regiji znaša 52,8 %, v primerjavi s celotnim genomom 38,8 %, kar kaže na to, da ima regija tuj izvor. Identificiranih je bilo 52 rezistenčnih genov, od tega se jih 45 nahaja na genomskem otoku AbaR1 (Fournier in Richet, 2006).
Tudi beta-laktamaze razširjenega spektra (ESBL) so že našli pri A. baumannii, vendar je laboratorijsko dokazovanje teh encimov oteženo in so zato ti encimi velikokrat spregledani (Peleg in sod., 2008).
2.2.2 Onemogočanje dostopa do tarčnega mesta v bakterijski celici
Zunanjo celično membrano bakterije A. baumannii sestavljajo proteini zunanje membrane - porini in membranske izlivne črpalke, ki prispevajo velik delež k mehanizmu odpornosti.
Proteini zunanje membrane tvorijo kanalčke v celični membrani in omogočajo transport hidrofilnih molekul preko lipidnega sloja bakterijske membrane. Lahko so tarča za adhezijo na druge celice in za vezavo baktericidnih komponent na površino pri po Gramu negativnih bakterijah. Variacije v njihovi strukturi in regulacija ekspresije porinov sta načina kako se bakterija obrani pred antibiotiki (Vila in sod., 2007). Če primerjamo A.
baumannii z drugimi po Gramu negativnimi bakterijami, opazimo, da ima A. baumannii manjše število in tudi po velikosti manjše porinske kanalčke, kar prispeva k zmanjšanju prepustnosti zunanje membrane in k naravni odpornosti proti antibiotikom. Odkrili so tudi, da se celična stena bakterije spreminja glede na pogoje v okolju. Tako se v suhem okolju celična stena odebeli in tudi s to spremembo prispeva k večji odpornosti proti visokim temperaturam v okolju (Singh in sod., 2013).
Pri po Gramu negativnih bakterijah zunanja membrana omejuje količino protimikrobnih učinkovin, ki vstopajo v celico, obenem membranske izlivne črpalke aktivno izčrpavajo protimikrobne učinkovine iz bakterije. Sistemi za izčrpavanje so izraženi pri vseh živih celicah, saj jih ščitijo pred toksičnimi komponentami. Tako je velikokrat bakterijska večkratna odpornost povezana s prekomernim izražanjem teh prenašalcev. Protimikrobne učinkovine, ki jih transportni sistemi izčrpajo, morajo v želji po novem vstopu v celico ponovno prečkati slabo permeabilno zunanjo membrano. Najbolj pogosto se izčrpajo tetraciklini, makrolidi in kinoloni (Vila in sod., 2007).
A. baumannii poseduje membranske izlivne črpalke večinoma iz družin MFS (angl. major facilitator family) in RND (angl. resistance-nodulation-division).
2.2.2.1 Družina membranskih izlivnih črpalk MFS
Membranske izlivne črpalke MFS običajno ne služijo kot splošni prenašalci, temveč služijo kot specifični iznašalci za določene razrede protimikrobnih agensov. Delimo jih v skupine Tet, CmlA in MdfA. Izlivne črpalke Tet so odgovorne za odpornost proti tetraciklinu. Gen tet, ki nosi zapis za odpornost, se nahaja na transpozonih, ki so vstavljeni v plazmide. Pri A. baumannii sta glavni izlivni črpalki v tej skupini Tet(A) in Tet(B).
Tet(A) je odgovoren za odpornost proti tetraciklinu, Tet(B) pa proti tetraciklinu in minociklinu. Ti sistemi za izčrpavanje ne vplivajo na nove tetracikline kot so glicilciklini (Vila in sod., 2007).
2.2.2.2 Družina membranskih izlivnih črpalk RND
V to družino črpalk spada sistem AdeABC. Družina AdeABC deluje s pomočjo protonskega gradienta, ki je vir energije za izčrpanje antibiotika. Prekomerno izražanje gena za to membransko izlivno črpalko vodi do odpornosti proti aminoglikozidom, beta-
laktamom, kloramfenikolu, eritromicinu, tetraciklinom in etidijevemu bromidu. Večina tovrstnih prenašalcev reagira z membranskim fuzijskim proteinom (angl. membrane fusion protein, MFP) in z zunanjim membranskim proteinom (angl. outer membrane protein, OMP). Ta interakcija dovoli, da protibakterijska učinkovina prečka notranjo in zunanjo membrano bakterije brez akumulacije v periplazmi. Tako je AdeABC trikomponentni sistem, kjer je AdeA MFP, AdeB je prenašalec in AdeC je OMP. Trije geni, ki kodirajo ta trikomponentni sistem so locirani, en poleg drugega v genomu, so direktno orientirani in tvorijo operon (Vila in sod., 2007).
2.2.3 Spremembe tarč ali celičnih funkcij zaradi mutacij
Pogoste so tudi točkovne mutacije v genih, ki kodirajo tarčne proteine in s tem zmanjšajo afiniteto za protimikrobne substance (Singh in sod., 2013). Bakterija A. baumannii je razvila odpornost proti kinolonskim antibiotikom s spremembo v strukturi encima DNA- giraze ali topoizomeraze IV, s pomočjo mutacije v genih gyrA ali parC. Sprememba rezultira v zmanjšani afiniteti antibiotika do kompleksa encim - DNA (Van Looveren in sod., 2004).
2.3 ANTIBIOTIKI ZA ZDRAVLJENJE OKUŽB, KI JIH POVZROČA A. baumannii Antibiotike uporabljamo v namene zdravljenja bakterijskih okužb. Protimikrobne učinkovine so naravne ali sintetične snovi, ki uničijo ali le začasno zavrejo rast mikroorganizma. Antibiotike glede na učinek na bakterijsko kulturo ločimo na baktericidne, bakteriostatične in bakteriolitične. Bakteriostatiki so pogosto inhibitorji sinteze proteinov in delujejo z vezavo na ribosome. Ob zmanjšanju koncentracije antibiotika, se le ta sprosti iz vezavnega mesta na ribosomu in omogočena je ponovna rast bakterije. Baktericidni antibiotiki se močno vežejo na tarče na bakterijski celici in s svojim delovanjem dokončno uničijo celico. Pri tem mrtve bakterijske celice niso uničene in skupno število bakterijskih celic ostane konstanto. V nasprotju pa bakteriolitični antibiotiki s svojim delovanjem povzročijo lizo celice in s tem sprostitev celičnega materiala v okolico. Liza povzroči znižanje števila bakterijskih celic. Bakteriolitični agensi vključujejo antibiotike, ki inhibirajo sintezo celične stene ali poškodujejo celično membrano (Madigan in sod., 2009).
2.3.1 Beta-laktamski antibiotiki
Ena izmed najpomembnejših skupin antibiotikov je skupina beta-laktamov. Beta-laktamski antibiotiki so inhibitorji sinteze celične stene. Ti antibiotiki odločilno vplivajo na proces transpeptidizacije, ki je pomemben korak pri sintezi bakterijske celične stene. Encimi, ki vodijo proces so transpeptidaze in se ob prisotnosti beta-laktamskega antibiotika vežejo nanj, zato jih imenujemo PBPs (angl. penicillin-binding proteins). Ob vezavi PBPs na antibiotik je preprečena reakcija povezovanja peptidnih verig, vendar se sinteza celične stene kljub temu nadaljuje. Novonastala bakterijska celična stena ni dovolj močno povezana in je zato šibkejša v svoji strukturi. Kompleks antibiotik-PBP nadaljnje stimulira sproščanje avtolizinov in bakterijska celica je obsojena na propad (Madigan in sod., 2009).
Med betalaktamske antibiotike spadajo tudi karbapenemi. Njihov spekter delovanja je najširši med znanimi zaviralci sinteze celične stene (Seme, 2002). Karbapenemski antibiotiki ostajajo prva izbira pri zdravljenju okužb z A. baumannii, če je bakterija še vedno občutljiva na ta antibiotik (Pankey in Ashcraft, 2008). Žal pa je njihova učinkovitost velikokrat zmanjšana zaradi razvoja karbapenemaz razreda D (Cetin in sod., 2013). Upanje za zdravljenje okužb z A. baumannii, ki posedujejo karbapenemaze, je novi sintetični tetraciklinski antibiotik, tigeciklin. Žal pa so se že pojavili prvi sevi, ki izkazujejo zmanjšano občutljivost za tigeciklin (Principe in sod., 2009).
Imipenem spada v skupino karbapenemskih antibiotikov, ki so tudi potencialni kandidati za kombinirano zdravljenje okužb z A. baumannii. Kiratisin in sod. so v svoji študiji (2010), pokazali, da je imipenem boljša izbira pri kombiniranem zdravljenju v primerjavi z meropenemom. Pokazali so tudi, da je uspešnost karbapenemskih antibiotikov višja, če jih uporabimo v kombinaciji z drugimi antibiotiki. Antibiotiki, kot je imipenem, so rezervirani za zdravljenje najbolj težkih infekcij zaradi njihove široke aktivnosti in same varnosti uporabe antibiotika (Fouad in sod., 2013).
Karbapenemski antibiotiki ostajajo prva izbira pri zdravljenju okužb z A. baumannii, če je bakterija še vedno občutljiva za ta antibiotik (Pankey in Ashcraft, 2008).
2.3.2 Aminoglikozidni antibiotiki
Glavna tarča aminoglikozidnih antibiotikov je ribosomska podenota 30S in s tem zaviranje sinteze proteinov. Z vezavo antibiotika na podenoto 30S se prepreči nastanek skupka med m-RNA, formil-metioninom in t-RNA in s tem je preprečena tvorba novih proteinov (Kotnik, 2002).
2.3.3 Kinoloni
Kinoloni s svojim delovanjem vplivajo na pravilno organizacijo DNA. Antibiotiki reagirajo z bakterijsko DNA girazo in tako preprečijo pravilno navijanje DNA, ki je pomemben korak pri organizaciji molekule DNA v bakterijski celici. Ker se encim DNA giraza nahaja pri po Gramu negativnih in pri po Gramu pozitivnih bakterijah, se kinoloni uporabljajo za zdravljenje okužb s po Gramu negativnimi in po Gramu pozitivnimi bakterijami (Madigan in sod., 2009). Levofloksacin, ki smo ga uporabili pri naši raziskavi spada med fluorokinolonske antibiotike.
2.3.4 Glicilciklini
Tigeciklin je bil junija, leta 2005, odobren s strani Food and Drug Administration za zdravljenje infekcij kože, kožnih struktur in intra-abdominalnih infekcij (Sopirala in sod., 2010). Je 9-glicilamidni derivat minociklina in je prvi predstavnik glicilciklinskih antibiotikov, ki je prešel v klinično uporabo in ki je izkazal širšo aktivnost proti različnim bakterijam, vključujoč A. baumannii (Petersen in sod., 2005). Njegovo delovanje proti večkratno odporni vrsti Acinetobacter je bakteriostatično (Singh in sod., 2013).
Tigeciklin s svojim delovanjem prepreči povezavo med nabito t-RNA in ribosomom ter s tem onemogoči proces translacije. Velika prednost tigeciklina pred tetraciklini in minociklini je, da na njegovo delovanje ne vplivajo bakterijski obrambni mehanizmi kot so izčrpanje antibiotika s pomočjo membranskih izlivnih črpalk ali mehanizem zaščite ribosomov (Petersen in sod., 2005).
2.3.5 Polimiksini
Kolistin ali polimiksin E in polimiksin B, ki smo ju uporabili za testiranje sinergije, spadata med polimiksinske antibiotike, ki zavirajo delovanje celične membrane.
Polimiksini zmanjšajo integriteto po Gramu negativne bakterijske membrane preko elektrostatske interakcije z negativno nabitimi fosfatnimi ostanki v lipidu A, ki sestavlja lipopolisaharidni (LPS) del membrane. Kolistin poleg porušenja integritete v citoplazemski membrani poveča permeabilnost zunanje membrane za snovi, ki običajno ne morejo prehajati preko membrane, kot so hidrofobni antibiotiki, ki imajo običajno zmanjšano delovanje proti po Gramu negativnim bakterijam (Gordon in sod., 2010).
Zaradi porasta odpornosti A. baumannii proti vsem dostopnim antibiotikom se je povečala uporaba polimiksinov, ki so jih v preteklosti opuščali zaradi njihove nefrotoksičnosti in nevrotoksičnosti. Zaradi njihove zmanjšane uporabe ostajajo dvomi o njihovi učinkovitosti, optimalni koncentraciji in njihovemu potencialu o morebitnem pojavu odpornosti. V nekaterih primerih je večkratno odporna bakterija A. baumannii že razvila heterorezistenco na kolistin in s tem se je pojavil tudi dvom, ali je kolistin dovolj učinkovit proti bakteriji in ali je primeren antibiotik za monoterapijo. Več študij je potrdilo ugodno delovanje kolistina v kombinaciji z drugimi antibiotiki.
Kolistin se je pokazal kot učinkovit antibiotik v boju proti večkratno odporni A.
baumannii. Znano je, da je toksičen, veliko manj pa vemo o njegovi farmakodinamiki in farmakokinetiki (Kiratisin in sod., 2010).
2.4 KOMBINIRANO ZDRAVLJENJE
Večkratno odporne po Gramu negativne bakterije predstavljajo veliko grožnjo hospitaliziranim bolnikom, ki so v bolnišničnem okolju veliko bolj dovzetni za okužbe in so odgovorne za 30-70 % umrljivost. Pogosta in velikokrat nepotrebna uporaba širokospektralnih antibiotikov pripomoreta k pojavu večkratno odpornih bakterij. Zaradi omejenega izbora antibiotikov, ki so trenutno na tržišču, predstavljajo okužbe z večkratno odpornimi bakterijami veliko skrb (Tamma in sod., 2012). Zato je pomembno, da se nameni več pozornosti izboru antibiotika in premislek ali je res potrebno zdravljenje s protibakterijsko učinkovino.
V primeru široke odpornosti proti trenutno razpoložljivim antibiotikom se v prakso skuša vpeljati kombinirano zdravljenje, kjer bolnik sočasno prejema dva ali več antibiotikov z različnim načinom delovanja. Tovrstno zdravljenje postaja vedno pomembnejše tudi zaradi
dejstva, da nekaj let na tržišče prav gotovo ne bo novih protibakterijskih učinkovin in tudi zato, ker bakterije zelo hitro razvijejo nove mehanizme, ki jim pomagajo pri obrambi pred antibiotiki.
Skupno delovanje kombiniranih antibiotikov je lahko različno. Sinergistični učinek dveh antibiotikov pomeni, da je aktivnost dveh kombiniranih antibiotikov večja v primerjavi s samostojnim delovanjem posameznih antibiotikov. Aditivnost ali indiferenca je pojav, ko je aktivnost kombiniranih antibiotikov enaka aktivnosti samostojnega antibiotika. Lahko se pojavi še antagonistični učinek, kar pomeni, da je aktivnost kombiniranih antibiotikov manjša v primerjavi s samostojnim delovanjem posameznih antibiotikov (Sopirala in sod., 2010).
Za kombinirano zdravljenje okužb s po Gramu negativnimi bakterijami se običajno uporablja kombinacija betalaktamskih in aminoglikozidnih ali fluorokinolonskih antibiotikov. Čeprav teorija podpira kombinirano zdravljenje, ki je potrjeno z in vitro modeli in živalskimi študijami, so klinični rezultati nasprotujoči pričakovanjem.
2.4.1 Argumenti za in proti kombiniranemu protimikrobnemu zdravljenju
Kombinirano zdravljenje je podprto s tremi razlogi: (i) zaobjeti večji razpon in delovanje proti bakteriji z antibiotikoma, ki imata različno aktivnost, (ii) izkoristiti sinergijo, ki je bila dosežena in vitro med dvema antibiotikoma v primerjavi z enim ali (iii) preprečiti ali odložiti pojav rezistence med zdravljenjem (Tamma in sod., 2012).
Čeprav veliko dejstev govori v prid kombiniranemu zdravljenju, pa še vedno ostaja dvom o primernosti tovrstnega zdravljenja. Dodajanje drugega antibiotika za zdravljenje okužbe s po Gramu negativno bakterijo, ki je občutljiva za prvi antibiotik lahko morda celo vodi do povečanja možnosti odpornosti proti prvemu antibiotiku. Skrb povzročajo tudi antibiotiki, ki so dokazano nefro- in nevrotoksični.
Argumenti za uporabo kombiniranega zdravljenja so naslednji (Tamma in sod., 2012):
Širok spekter aktivnosti. V času povečevanja okužb s po Gramu negativnimi bakterijami, kombinirano zdravljenje nudi ustreznejšo pokritost v boju proti povzročitelju. Z dodatnim antibiotikom se lahko izognemo neuspešnemu
zdravljenju, hitremu pojavu rezistence in nekaterim dodatnim zapletom med zdravljenjem.
Prilagoditev terapije za posameznega bolnika. Vsak bolnik je unikaten v smislu zdravstvenega stanja, različnih bolezni, narave infekcije in tudi predhodnega zdravljenja z antibiotiki. Znanje o bolnikovi zdravstveni zgodovini nam omogoči ustrezno izbiranje antibiotika.
Sinergija. Prednost hkratnega zdravljenja z dvema antibiotikoma je dosežek sinergističnega učinka. S kombinacijo antibiotikov lahko dosežemo tudi nižji koncentracijski odmerek antibiotika, ki je še vedno dovolj učinkovit v boju proti bakteriji.
Argumenti proti uporabi kombiniranega zdravljenja so naslednji (Tamma in sod., 2012):
Nefrotoksičnost. Aminoglikozidni antibiotiki se akumulirajo v ledvicah. Vežejo se na glikoproteine ledvičnih tubularnih celic, kar je nujno za delovanje zdravila. Ko se aminoglikozidi koncentrirajo v citosolu celice, aktivirajo apoptozo, ki povzroči celično smrt. Pri tem je pomembno omeniti, da so aminoglikozidni antibiotiki nefrotoksični tudi, kadar se ne kombinirajo z drugimi antibiotiki.
Dodatni zapleti. Kombinirano zdravljenje lahko posledično s sabo prinese več glivnih okužb in potrebo po večkratni kateterizaciji, s čimer bolnika izpostavljamo dodatnim infekcijam. Bolniki, ki so podvrženi okužbi z večkratno odporno bakterijo, prejemajo več zdravil hkrati, kar lahko vodi do neželenih interakcij med učinkovinami, ki lahko nadaljnje vodijo v zaplete.
2.5 LABORATORIJSKE METODE ZA DOLOČANJE in vitro UČINKA KOMBINACIJE ANTIBIOTIKOV
Vedno večje zanimanje za zdravljenje s kombinacijo antibiotikov, ki imajo različno delovanje na bakterijo, vodi do razvijanja metod, s katerimi lahko medsebojni učinek antibiotikov tudi uspešno preverimo. Metode se razlikujejo v izvedbi, tehnični zahtevnosti in času, ki je potreben, da dobimo rezultate. Vsaka od teh lastnosti je pomembna pri izbiri metode, ki jo bomo uporabili za preverjanje sinergističnega učinka.
2.5.1 Metoda navzkrižnega seta difuzijskih gradientov
Relativno nov način določanja sinergističnega učinka antibiotikov temelji na metodi difuzijskega gradienta (Bonapace in sod., 2000). Prvi korak za testiranje sinergističnega učinka je določitev MIK posameznega antibiotika z metodo difuzijskega gradienta.
Metoda navzkrižnega seta difuzijskih gradientov je le ena izmed možnosti preverjanja sinergističnega učinka z metodo difuzijskega gradienta. Pri prvi različici metode navzkrižnega seta difuzijskih gradientov položimo dve membrani z impregriranimi rastočimi koncentracijami antibiotika pravokotno eno na drugo na mestu določene MIK posameznega antibiotika (Slika 1). Pri drugi različici metode je en antibiotik že vgrajen v trdno gojišče in se nato nanj položi membrana z impregriranimi rastočimi koncentracijami drugega antibiotika. Pri tretji različici metode pa se položi prva membrana na gojišče, inkubira eno uro, odstrani in nato na odtis prve položi druga membrana in ponovno inkubira 24 ur (Sopirala in sod., 2010). Pri vseh treh različicah je zadnji korak izvedbe izračun vrednosti FIC (angl. fractional inhibitory concentration index), ki nam pove do kakšnega medsebojnega delovanja antibiotikov je prišlo.
Dobri lastnosti metode sta enostavna in hitra izvedba. Čeprav bi si želeli, da nam metoda daje najbolj zanesljive rezultate, temu ni tako. Metoda navzkrižnega seta difuzijskih gradientov se v številnih primerih izkaže za neustrezno in slabo zanesljivo.
Slika 1: Pravilna postavitev E-testov pri izvajanju sinergističnega testa z metodo navzkrižnega seta difuzijskih gradientov in odčitanje vrednosti MIK antibiotika v kombinaciji (Bonapace in sod., 2000: 46)
2.5.2 Metoda šahovnice
Metoda šahovnice je mikrodilucijska metoda, ki jo izvajamo v mikrotitrski ploščici. Je nekoliko bolj tehnično zahtevna metoda in tudi dolgotrajna. Predpogoj za preverjanje sinergističnega učinka antibiotikov je določitev MIK antibiotikov, ki jih želimo testirati.
MIK antibiotikov določimo z mikrodilucijsko metodo. Določene MIK nam služijo kot orientacija za načrtovanje metode šahovnice. Za preverjanje sinergističnega učinka dveh antibiotikov določimo razpon testiranih koncentracij za vsak antibiotik. Tako se vsaka koncentracija prvega antibiotika kombinira z vsako koncentracijo drugega antibiotika. To dosežemo s konfiguracijo kvadrata (npr. 8×8), ki posnema šahovnico. Delovanje antibiotikov tako kot pri metodi navzkrižnega seta difuzijskih gradientov opredelimo z izračunom vrednosti FIC (Bonapace in sod., 2000).
2.5.3 Metoda time-kill
Metoda time-kill je dinamična metoda, ki nam omogoča ugotavljanje koncentracijsko in časovno odvisne baktericidne aktivnosti antibiotikov. Glede na raziskave daje najbolj zanesljive rezultate in zato velikokrat služi kot potrditvena metoda ostalih dveh metod za določanje sinergističnega učinka. Poleg metode šahovnice je to najbolj uporabljena metoda (Petersen in sod., 2005). Pri metodi time-kill ne računamo vrednosti FIC, temveč
medsebojni učinek antibiotikov opredelimo glede na logaritemsko zmanjšanje bakterijske rasti pri kombiniranih antibiotikih v primerjavi z najbolj aktivno samostojno učinkovino.
Slaba stran metode time-kill je časovna zamudnost in zahtevnost tehnične izvedbe, zato se v rutinskih laboratorijih zelo redko uporablja (Tan in sod., 2007).
3 MATERIALI IN METODE
3.1 BAKTERIJSKI IZOLATI
V raziskavo smo vključili 15 večkratno odpornih bakterijskih izolatov A. baumannii, osamljenih pri 15 bolnikih, ki so bili hospitalizirani v Univerzitetnem kliničnem centru v Ljubljani v obdobju 12 mesecev (od novembra 2012 do oktobra 2013).
Vsi bakterijski izolati so bili izolirani iz spodnjih dihal, v Laboratoriju za bakteriološko diagnostiko respiratornih infekcij Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani. Vsi izolati so bili do uporabe shranjeni pri -80 °C.
Vseh 15 izolatov je bilo odpornih proti imipenemu, ceftazidimu, piperacilinu s tazobaktamom, ciprofloksacinu, gentamicinu in amikacinu. Proti ampicilinu s sulbaktamom in levofloksacinu je bilo odpornih 13 izolatov. Proti trimetoprim- sulfametoksazolu je bilo odpornih prvih 8 izolatov, ostalih 7 je bilo zanj občutljivih. Vsi izolati so bili občutljivi za kolistin, razen enega (Preglednica 1). Izolati niso bili testirani za občutljivost na meropenem in doripenem.
Kot kontrolo kakovosti uporabljenih metod smo uporabili referenčna seva: Escherichia coli ATCC 25922 in Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Preglednica 1: Občutljivost izbranih 15 izolatov za antibiotike, ki se uporabljajo za zdravljenje okužb z A.
baumannii.
Izolat Antibiotik
CAZ IP TZP SAM CIP LE GM AN SXT CO
1 R R R S R R R R R S
2 R R R R R I R R R S
3 R R R R R R R R R S
4 R R R R R R R R R R
5 R R R R R R R R R S
6 R R R R R R R R R S
7 R R R R R R R R R S
8 R R R R R R R R R S
9 R R R R R R R R S S
10 R R R R R R R R S S
11 R R R R R R R R S S
12 R R R R R R R R S S
13 R R R R R R R R S S
14 R R R R R R R R S S
15 R R R I R I R R S S
CAZ, ceftazidim; IP, imipenem; TZP, piperacilin s tazobaktamom; SAM, ampicilin s sulbaktamom; CIP, ciprofloksacin; LE, levofloksacin; GM, gentamicin; AN, amikacin; SXT, trimetoprim-sulfametoksazol;
CO, kolistin; R, rezistenten; S, občutljiv; I, intermediaren.
3.2 METODE
3.2.1 Priprava uporabljenih gojišč Krvni agar (KA)
Za pripravo krvnega agarja smo na 1 L čiste vode dodali 40 g pripravljene mešanice BBL™ Infusion Agar (Blood Agar Base) (BD, Sparks, ZDA). Mešanica je sestavljena iz:
2,0 srčno-mišičnega ekstrakta,
13,0 g pankreasno razgrajenega kazeina, 5,0 g kvasnega ekstrakta,
5,0 g NaCl in 15,0 g agarja.
Nastalo zmes smo avtoklavirali in nato dodali 5 % sterilno govejo kri, citrano z natrijevim citratom.
Mueller-Hinton agar (MH)
Za pripravo Mueller-Hinton agarja smo na 1 L čiste vode dodali 38 g pripravljene mešanice BBL™ Brain Heart Infusion Agar (BD, Sparks, ZDA), ki je sestavljena iz:
2,0 g govejega ekstrakta,
17,5 g kislega hidrolizata kazeina, 1,5 g škroba in
17,0 g agarja.
Kationsko prilagojen Mueller-Hinton bujon (MHB)
Za pripravo kationsko prilagojenega Mueller-Hinton bujona smo na 1 L čiste vode dodali 22 g pripravljene mešanice BBL™ Mueller Hinton II Broth Cation Adjusted (BD, Sparks, ZDA), ki je sestavljena iz:
3,0 g govejega ekstrakta,
17,5 g kislega hidrolizata kazeina in 1,5 g škroba.
3.2.2 Priprava bakterijskih izolatov in bakterijske suspenzije
Izolate, ki so bili zamrznjeni pri - 80 °C smo najprej odmrznili in jih nacepili na osnovno gojišče KA ter inkubirali pri 35 ± 1 °C. Po 24-urni inkubaciji smo jih ponovno precepili na KA in inkubirali pri 35 ± 1 °C, 24 ur.
3.2.3 Izbor in priprava antibiotikov
Antibiotiki, ki smo jih uporabili za testiranje sinergije pri A. baumannii so bili izbrani po pregledu antibiogramov posameznih izolatov, po pregledu literature ter na podlagi rezultatov študij. Protibakterijske učinkovine, ki smo jih vključili v testiranje so bile:
imipenem, kolistin, levofloksacin, polimiksin B in tigeciklin.
Za ugotavljanje sinergističnega učinka smo kombinirali po dva antibiotika, in sicer:
tigeciklin in imipenem, tigeciklin in kolistin, tigeciklin in levofloksacin ter polimiksin B in imipenem.
Za določanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) z metodo difuzijskega gradienta in z metodo mikrodilucije smo za vsak antibiotik pripravili razpon koncentracij, ki so navedene v Preglednici 2. Založna koncentracija antibiotika je bila pripravljena v redestilirani vodi in je vedno predstavljala stokratno koncentracijo najvišje testirane koncentracije antibiotika. Nadaljnje redčenje antibiotika je bilo opravljeno v kationsko prilagojenem Mueller-Hinton bujonu.
Preglednica 2: Antibiotiki in razpon njihovih koncentracij, ki smo jih testirali pri vseh 15 izolatih A.
baumannii
Antibiotik Razpon testiranih koncentracij (µg/mL)
Imipenem 0,002 – 32
Kolistin 0,016 - 256
Levofloksacin 0,002 – 32
Polimiksin B 0,064 – 1024
Tigeciklin 0,016 – 256
3.2.4 Določanje minimalne inhibitorne koncentracije
Za določanje sinergističnega učinka kombinacije antibiotikov smo najprej morali določiti MIK posameznih antibiotikov. MIK smo določali z mikrodilucijsko metodo in metodo difuzijskega gradienta.
3.2.4.1 Metoda difuzijskega gradienta
Pri vseh 15 izolatih iz zbirke bakterijskih izolatov Laboratorija za bakteriološko diagnostiko respiratornih infekcij Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo Medicinske fakultete v Ljubljani smo s pomočjo metode difuzijskega gradienta z uporabo E-testov (bioMérieux SA, Lyon, France) določili minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK).
Po 24 urni inkubaciji pri 35 ± 1 °C smo iz čistih kultur na KA pripravili bakterijsko suspenzijo v fiziološki raztopini in jo prilagodili na gostoto 0,5 po McFarlandu (McF).
Pripravljeno suspenzijo smo s pomočjo sterilnega vatiranega brisa konfluentno razmazali na MH agar. Nato smo nanj položili ustrezen E-test.
Plošče smo inkubirali pri 35 ± 1 °C, 24 ur.
Po inkubaciji smo odčitali MIK za vsak antibiotik. MIK smo odčitali na presečišču inhibicijske cone bakterijske rasti z ustrezno koncentracijo antibiotika na impregniranem traku. Odčitane MIK smo interpretirali na osnovi smernic CLSI (CLSI, 2013).
3.2.4.2 Mikrodilucijska metoda
S pomočjo mikrodilucije smo določili MIK za vseh 15 izbranih izolatov iz zbirke in jih nato uporabili kot vodilo za načrtovanje preverjanja učinka sinergije s pomočjo metode šahovnice in time-kill. Mikrodilucijo smo opravili v mikrotitrski ploščici. Vsi antibiotiki, ki smo jih testirali, so produkti proizvajalca Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).
Priprava inokuluma
Po 24 urni inkubaciji pri 35 ± 1 °C smo iz čistih kultur na KA pripravili bakterijsko suspenzijo v fiziološki raztopini in jo prilagodili na gostoto 0,5 McF. Prilagojeno bakterijsko suspenzijo smo nato redčili v MHB v razmerju 1:20. V 9,5 mL MHB smo dodali 0,5 mL bakterijske suspenzije in vorteksirali 15 – 20 sekund. Tako pripravljen inokulum je vseboval ~ 5 × 106 CFU/mL.
Vsaka luknjica mikrotitrske ploščice je vsebovala 0,1 mL ustrezne koncentracije antibiotika, redčenega v MHB. K temu smo dodali 0,01 mL pripravljenega inokuluma in tako je vsaka luknjica po dodatku bakterijskega inokuluma vsebovala ~ 5 × 104 CFU/mL.
Mikrotitrske ploščice smo inkubirali pri 35 ± 1 °C, 16 – 20 ur.
Po inkubaciji smo pregledali mikrotitrske plošče in določili MIK testiranih antibiotikov. Ta je določena s prvo bistro luknjico, kjer je inhibirana bakterijska rast. Določene MIK testiranih antibiotikov smo interpretirali na osnovi smernic CLSI (CLSI, 2013).
3.2.5 Določanje sinergističnega učinka kombinacije antibiotikov 3.2.5.1 Navzkrižni set difuzijskih gradientov
Z metodo navzkrižnega seta difuzijskih gradientov smo določili sinergistični učinek dveh antibiotikov s pomočjo membran z impregriranim antibiotikom. Metodo smo izvedli v skladu z navodili proizvajalca membran z impregniranim antibiotikom (Liofilchem, 2012).
Iz čiste kulture na KA, po 24 urni inkubaciji pri 35 ± 1 °C, smo pripravili bakterijsko suspenzijo v fiziološki raztopini in jo prilagodili na gostoto 0,5 McF. Pripravljeno suspenzijo smo s pomočjo sterilnega vatiranega brisa konfluentno razmazali na MH agar.
E-testa smo položili pravokotno drug na drugega tako, da je bilo njuno presečišče v točki predhodno določenih MIK. Pravilno postavitev membran z impregriranim antibiotikom nam kaže Slika 1. Plošče smo inkubirali pri 35 ± 1 °C, 24 ur.
Po inkubaciji smo pregledali plošče in odčitali vrednosti MIK posameznega antibiotika.
MIK v kombinaciji smo odčitali tako, kot nam prikazuje Slika 1.
Nato smo s pomočjo formule (1) izračunali vrednost FIC, ki nam pove na kakšen način delujeta antibiotika v kombinaciji.
FIC = (MIKAB ÷ MIKA) + (MIKBA ÷ MIKB) …(1)
MIKA … MIK antibiotika A MIKB … MIK antibiotika B
MIKAB … MIK antibiotika A v prisotnosti antibiotika B MIKBA … MIK antibiotika B v prisotnosti antibiotika A
Interpretacija vrednosti FIC:
FIC ≤ 0,5 … sinergija,
FIC > 0,5 in ≤ 4,0 … indiferenca ali aditivnost, FIC > 4 … antagonizem.
3.2.5.2 Metoda šahovnice
Po določitvi MIK posameznega antibiotika smo določili razpon koncentracij antibiotikov, ki smo jih kombinirali med sabo. Z mikrodilucijsko metodo določen MIK nam je služil kot najvišja testirana koncentracija antibiotika, dodali smo še 7 nižjih koncentracij. Tako smo v x smeri mikrotitrske ploščice nanašali naraščajoče koncentracije enega antibiotika in v y smeri naraščajoče koncentracije drugega antibiotika. Dobili smo konfiguracijo 8×8. S tem smo dosegli kombinacijo vseh koncentracij dveh antibiotikov. V vsako vdolbinico smo dodali 0,05 mL enega antibiotika in 0,05 mL drugega antibiotika ter 0,01 mL bakterijskega inokuluma, pripravljenega po istem postopku kot za mikrodilucijo. Pozitivno kontrolo je predstavljala luknjica z 0,1 mL bakterijskega inokuluma brez dodanega antibiotika.
Mikrotitrske ploščice smo inkubirali pri 35 ± 1 °C, 16 – 20 ur.
Po inkubaciji smo pregledali mikrotitrske ploščice. V luknjicah, ki niso kazale bakterijske rasti je prišlo do uspešnega delovanja antibiotikov. Tako kot pri metodi navzkrižnega seta smo s pomočjo formule (1) izračunali vrednost FIC in opredelili delovanje kombiniranih antibiotikov.
3.2.5.3 Metoda time-kill
Tretja metoda, ki smo jo izbrali za preverjanje sinergističnega učinka kombinacije antibiotikov, je makrodilucijska metoda, imenovana time-kill.
Rastna krivulja
Za uspešno testiranje sinergističnega učinka z metodo time-kill smo morali določiti čas, v katerem se bakterija A. baumannii nahaja v logritemski fazi rasti. Tako smo najprej izdelali rastno krivuljo.
Po 24 urni inkubaciji pri 35 ± 1 °C smo iz čistih kultur na KA pripravili bakterijsko suspenzijo v kationsko prilagojenem Mueller-Hinton bujonu in jo prilagodili na gostoto 0,5 McF. 0,1 mL prilagojene bakterijske suspenzije smo prenesli v stekleno epruveto s 5 mL MHB. Tako pripravljen inokulum smo vorteksirali 15-20 sekund. Delali smo v trikratniku.
Takoj po pripravi inokuluma in tudi vsako uro po inokulaciji smo iz vsake epruvete odvzeli 0,1 mL alikvota in ga redčili v 0,9 mL fiziološke raztopine do 10-5. 0,1 mL vsake redčine smo konfluentno namazali na KA in plošče inkubirali 24 ur pri 35 ± 1 °C. Po 24 urah smo
prešteli zrasle kolonije na števnih ploščah. Števne plošče so tiste, na katerih je poraslo od 30 do 300 kolonij. Izračunali smo število celic v CFU/mL in s pomočjo programa Excel narisali rastno krivuljo.
Izvedba metode time-kill
Pred začetkom testiranja z metodo time-kill, smo morali določiti nekaj parametrov. Najprej smo z mikrodilucijsko metodo določili MIK posameznega antibiotika pri vsakem bakterijskem izolatu. Z metodo time-kill smo testirali le izolate, ki so pri metodi šahovnice pri določeni kombinaciji antibiotikov že izkazali sinergijo. Ker smo torej pričakovali sinergijo, smo testirali kombinacije antibiotikov pri eni četrtini in eni osmini MIK vsakega antibiotika. Tako smo za vsak izolat testirali prvi antibiotik pri eni četrtini MIK, pri eni osmini MIK in enako za drugi antibiotik. Nato pa še kombinacijo dveh antibiotikov pri eni četrtini MIK in kombinacijo antibiotikov pri eni osmini MIK. Za vsak izolat smo imeli še kontrolo rasti, pri kateri epruveta ni vsebovala antibiotika. Določiti smo morali tudi čas vzorčenja. Odločili smo se, da bomo vzorčili pri času 0, torej takoj po dodatku inokuluma v epruveto z antibiotiki, nato pa še po 2, 4, 6 in 24 urah. Ob vsaki meritvi smo iz posamezne epruvete odvzeli alikvot 0,1 mL, ki smo ga nadaljnje redčili v 0,9 mL fiziološke raztopine. Ob času nič smo vse vzorce desetkratno redčili do 10-4. Pri vseh naslednjih vzorčenjih smo vzorce desetkratno redčili glede na vidno motnost vzorca. Rahlo motne vzorce smo redčili do 10-5, močno motne vzorce do 10-6. Iz vsake redčine vzorca smo odvzeli alikvot volumna 0,1 mL in ga konfluentno razmazali na ploščo KA. Plošče smo inkubirali 16-20 ur pri 35 ± 1 °C. Po inkubaciji smo prešteli porasle kolonije in pri rezultatih upoštevali le tiste, ki so bile števne.
Priprava inokuluma in inokulacija
Po 24 urni inkubaciji pri 35 ± 1 °C smo iz čistih kultur na KA pripravili bakterijsko suspenzijo v kationsko prilagojenem Mueller-Hinton bujonu in jo prilagodili na gostoto 0,5 McF. Iz prilagojene suspenzije smo odvzeli 0,1 mL in ga prenesli v 5 mL kationsko prilagojenega Mueller-Hinton bujona. Tako pripravljen inokulum smo inkubirali v stresalniku pri 35 °C na 200 rpm (angl. revolutions per minute) do optične gostote OD595
0,2.
Za pravilno izvajanje preverjanja sinergije antibiotikov z metodo time-kill mora biti bakterija na začetku testiranja v logaritemski fazi rasti (Slika 3). Na podlagi prej določene rastne krivulje za A. baumannii je to med 6 in 7 uro po začetku inkubacije pripravljenega inokuluma pri OD595 0,2. Nato smo prilagodili motnost suspenzije v fiziološki raztopini na 1,0 McF, kar odraža približno 3 × 108 CFU/mL. Standardizirano suspenzijo smo redčili 1:5 tako, da smo 1 mL suspenzije dodali k 4 mL MHB, kar odraža približno 6 × 107 CFU/mL.
Tako pripravljen inokulum smo v volumnu 0,1 mL dodali v vsako epruveto, ki je vsebovala 10 mL MHB z antibiotiki ali brez (kontrola rasti).
Za vsak izolat smo pripravili 7 epruvet, ki so vsebovale:
1) 10 mL kationsko prilagojenega Mueller-Hinton bujona, 2) 9,8 mL MHB + 0,2 mL antibiotika 1 pri 0,25 × MIK, 3) 9,8 mL MHB + 0,2 mL antibiotika 1 pri 0,125 × MIK, 4) 9,8 mL MHB + 0,2 mL antibiotika 2 pri 0,25 × MIK, 5) 9,8 mL MHB + 0,2 mL antibiotika 2 pri 0,125 × MIK,
6) 9,8 mL MHB + 0,1 mL antibiotika 1 in 0,1 mL antibiotika 2 (oba pri 0,25 × MIK), 7) 9,8 mL MHB + 0,1 mL antibiotika 1 in 0,1 mL antibiotika 2 (oba pri 0,125 × MIK).
Interpretacija rezultatov
Po 24 urni inkubaciji smo pregledali vse plošče KA in prešteli kolonije. Upoštevali smo le plošče, ki so bile števne in nato izračunali CFU/mL ter log10 za vsako kombinacijo antibiotikov. S pridobljenimi rezultati smo narisali grafe, pri katerih x os predstavlja čas (ure) vzorčenja, y os pa log10 CFU/mL. Na vsakem grafu so narisane krivulje rastne kontrole, posameznega antibiotika in antibiotika v ustrezni kombinaciji.
Sinergija je potrjena v primeru, da zaznamo ≥ 2-log10 zmanjšanje bakterijske rasti pri kombinaciji antibiotikov v primerjavi z najbolj aktivnim uspešnim samostojnim antibiotikom (Slika 5). Antagonizem je potrjen v primeru, da zaznamo ≥ 2-log10 povečanje bakterijske rasti pri kombinaciji antibiotikov v primerjavi z najbolj aktivnim uspešnim samostojnim antibiotikom (Slika 6). Indiferenca je potrjena v primeru, da zaznamo < 2- log10 povečanje ali zmanjšanje bakterijske rasti pri kombinaciji antibiotikov v primerjavi z najbolj aktivnim uspešnim samostojnim antibiotikom (Sopirala in sod., 2010) ali
kateriokoli drugi izid, ki ne spada v definicijo sinergije ali antagonizma (Bonapace in sod., 2000) (Slika 7).
4 REZULTATI
4.1 DOLOČANJE MIK ANTIBIOTIKOV Z METODO DIFUZIJSKEGA GRADIENTA IN Z METODO MIKRODILUCIJE
V raziskavo smo vključili 15 večkratno odpornih bakterijskih izolatov A. baumannii. Pri vseh izolatih smo določili MIK za imipenem, kolistin, levofloksacin, polimiksin B in tigeciklin z metodo difuzijskega gradienta in z mikrodilucijo.
Na podlagi vrednosti MIK z mikrodilucijsko metodo smo ugotovili, da so bili vsi bakterijski izolati, razen enega, odporni proti imipenemu. Proti kolistinu je bilo odpornih 10 izolatov, občutljivih je bilo 5. Proti polimiksinu B sta bila odporna dva izolata, občutljivih je bilo 13. Za levofloksacin je bil občutljiv le en izolat. Za tigeciklin po smernicah CLSI ni interpretacije.
Z metodama smo določili različne MIK, kar smo tudi pričakovali. V Preglednici 3 so zbrani rezultati določanja MIK in pripisane interpretacije občutljivosti. Največja razlika med metodama se kaže pri določenih MIK za tigeciklin, kjer smo z mikrodilucijo določili precej višje MIK. Največje odstopanje vrednosti od ostalih opazimo pri izolatu št. 4 pri MIK za kolistin. Pri 3 izolatih smo z obema metodama določili enako MIK za imipenem in pri enem izolatu za polimiksin B. Kategorično neujemanje rezultatov gradientne in dilucijske metode smo ugotovili pri več izolatih. V največ primerih smo z metodo difuzijskega gradienta ugotovili občutljivost, medtem ko smo z mikrodilucijo ugotovili odpornost izolata na antibiotik. To se je zgodilo pri enem izolatu pri imipenemu in pri polimiksinu B in pri 10 izolatih pri kolistinu. Odpornost izolata, ugotovljeno z difuzijsko metodo, in občutljivost izolata z mikrodilucijo smo ugotovili s po enim izolatom pri imipenemu in pri levofloksacinu. Pri določanju občutljivosti izolatov za levofloksacin smo pri 2 izolatih z metodo difuzijskega gradienta določili indiferenco, z mikrodilucijo pa odpornost. En takšen primer smo ugotovili tudi pri polimiksinu B. Določene MIK so se razlikovale v večini primerov za več kot 3 razredčine. Pri nekaterih izolatih smo z metodo difuzijskega gradienta določili višje MIK in z mikrodilucijo nižje, pri nekaterih pa ravno obratno.
Preglednica 3: Pregled in primerjava MIK, določenih z metodo difuzijskega gradienta in z mikrodilucijo pri 15 izolatih A. baumannii
MIK (µg/mL)
Izolat Metoda difuzijskega gradienta Mikrodilucija
IP CO LE PO TGC IP CO LE PO TGC
1 32
(R)
0,38 (S)
32 (R)
0,5 (S)
6 (ni)
32 (R)
24 (R)
24 (R)
4 (R)
64 (ni)
2 2
(S)
0,094 (S)
4 (I)
0,38 (S)
4 (ni)
1,5 (R)
1,5 (S)
8 (R)
1 (S)
48 (ni)
3 32
(R)
0,094 (S)
32 (R)
0,25 (S)
4 (ni)
24 (R)
1,5 (S)
24 (R)
1,5 (S)
64 (ni)
4 32
(R)
0,75 (S)
32 (R)
3 (I)
6 (ni)
16 (R)
256 (R)
24 (R)
12 (R)
64 (ni)
5 32
(R)
0,125 (S)
32 (R)
0,38 (S)
3 (ni)
32 (R)
2 (S)
8 (R)
0,5 (S)
48 (ni)
6 32
(R)
0,125 (S)
32 (R)
0,38 (S)
4 (ni)
32 (R)
1,5 (S)
12 (R)
0,75 (S)
48 (ni)
7 32
(R)
0,094 (S)
32 (R)
0,38 (S)
8 (ni)
16 (R)
1,5 (S)
>32 (R)
1 (S)
64 (ni)
8 32
(R)
0,094 (S)
32 (R)
0,38 (S)
6 (ni)
16 (R)
8 (R)
24 (R)
0,38 (S)
48 (ni)
9 32
(R)
0,125 (S)
32 (R)
0,5 (S)
6 (ni)
0,38 (S)
4 (R)
12 (R)
1,5 (S)
16 (ni)
10 32
(R)
0,094 (S)
32 (R)
0,38 (S)
4 (ni)
24 (R)
4 (R)
24 (R)
2 (S)
16 (ni)
11 32
(R)
0,125 (S)
32 (R)
0,38 (S)
6 (ni)
24 (R)
3 (R)
24 (R)
1,5 (S)
16 (ni)
12 32
(R)
0,094 (S)
32 (R)
0,38 (S)
4 (ni)
>32 (R)
4 (R)
12 (R)
1,5 (S)
12 (ni)
13 32
(R)
0,125 (S)
32 (R)
0,5 (S)
4 (ni)
>32 (R)
4 (R)
0,19 (S)
2 (S)
16 (ni)
14 32
(R)
0,125 (S)
32 (R)
0,38 (S)
4 (ni)
24 (R)
4 (R)
24 (R)
1,5 (S)
16 (ni)
15 32
(R)
0,125 (S)
6 (I)
0,38 (S)
4 (ni)
16 (R)
3 (R)
12 (R)
1,5 (S)
12 (ni)
IP, imipenem; CO, kolistin; LE, levofloksacin; PO, polimiksin B, TGC, tigeciklin; R, rezistenten; S, občutljiv; I, intermediaren; ni, ni interpretacije.
4.2 DOLOČANJE SINERGISTIČNEGA UČINKA Z NAVZKRIŽNIM SETOM DIFUZIJSKIH GRADIENTOV
V raziskavo smo vključili 15 večkratno odpornih bakterijskih izolatov A. baumannii. Pri vseh izolatih smo določili MIK imipenema, kolistina, levofloksacina, polimiksina B in tigeciklina z metodo difuzijskega gradienta. Po določitvi MIK za vsak posamezni antibiotik smo izvedli preverjanje sinergije s pomočjo metode navzkrižnega seta (Slika 2).
Pri kombinacijah tigeciklin in kolistin, tigeciklin in imipenem ter tigeciklin in levofloksacin smo testirali 7 bakterijskih izolatov. Pri kombinaciji tigeciklina s kolistinom smo v 6 primerih opazili indiferenco in v enem primeru popolno odsotnost kakršnega koli učinka, torej rezultat, da ni sinergije. Pri ostalih dveh kombinacijah nismo opazili nobenega sinergističnega delovanja dveh antibiotikov. Oznaka »ni učinka« pomeni, da je bakterija prerasla celotno površino agarske plošče, brez pojava inhibicijske cone ob impregriranem membranskem traku.
Na podlagi rezultatov za vse tri kombinacije s tigeciklinom, ki niso pokazale nobenega pozitivnega učinka skupnega delovanja dveh antibiotikov in zaradi velikih težav z dobavo E-testov za tigeciklin smo se odločili, da v nadaljevanju ne bomo testirali ostalih bakterijskih izolatov.
Pri kombinaciji antibiotikov polimiksina B in imipenema smo testirali vseh 15 bakterijskih izolatov. Pri 8 bakterijskih izolatih je bil rezultat kombiniranja indiferenca, pri 7 izolatih ni bilo učinka medsebojnega delovanja antibiotikov, kar smo v Preglednici 4 označili kot »ni učinka«. Za tigeciklin po smernicah CLSI ni interpretacije.
