MODULARNA SESTAVA IMUNOLOŠKO AKTIVNIH MOLEKUL NA OSNOVI OBVITIH VIJAČNIC DOKTORSKA DISERTACIJA MODULAR ASSEMBLEY OF IMMUNOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES BASED ON COILED COILS DOCTORAL DISSERTATION Tjaša Plaper

Medicinska fakulteta

MODULARNA SESTAVA IMUNOLOŠKO AKTIVNIH MOLEKUL NA OSNOVI OBVITIH VIJAČNIC

DOKTORSKA DISERTACIJA

MODULAR ASSEMBLEY OF IMMUNOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES BASED ON COILED COILS

DOCTORAL DISSERTATION

Tjaša Plaper

Ljubljana, 2021

Tjaša PLAPER

MODULARNA SESTAVA IMUNOLOŠKO AKTIVNIH MOLEKUL NA OSNOVI OBVITIH VIJAČNIC

Imenovanje mentorja na seji dne: 13. novembra 2018

Komisija za oceno in zagovor imenovana na seji senata dne: 13. novembra 2018 Datum zagovora:15.2.2022

Mentorica: izr. prof. dr. Mojca Benčina Predsednica komisije: dr. Helena Gradišar Članica: prof. dr. Kristina Sepčić

Član: prof. dr. Peter Veranič

Doktorsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela, ki sem ga izvedla pod mentorstvom izr. prof. dr. Mojce Benčina na Odseku za sintezno biologijo in imunologijo Kemijskega inštituta Slovenija. Elektronski izvod disertacije je enak tiskanemu.

Tjaša Plaper

I ZAHVALA

Zahvaljujem se prof. dr. Romanu Jerali za priložnost opravljanja doktorskega dela na Odseku za biotehnologijo in imunologijo.

Zahvaljujem se izr.prof. dr. Mojci Benčina za prevzem mentorstva, hitro in kritično popravo doktorskega dela ter nasvete tekom eksperimentalnega dela.

Članom komisije dr. Heleni Gradišar, prof. dr. Kristini Sepčić in prof. dr. Petru Veraniču se zahvaljujem za komentarje in predloge pri prijavi doktorske teme ter hiter pregled doktorske naloge.

Zahvaljujem se Jani Aupič, za nesebično predajo znanja pri peptidni karakterizaciji in pomoč pri objavi članka.

Zahvaljujem se dr. Fabiu Lapenti, Petri Deklevi ter Sanjinu Luliću za pomoč pri eksperimentih.

Zahvaljujem se rednim in občasnim prebivalcem Odseka za sintezno biologijo in imunologijo za krajšanje ur preživetih v laboratoriju ter moralno podporo ob eksperimentih.

Zahvaljujem se Esteri in Katji, za vse klepete ob kavi, brez katerih bi bila izvedba doktorata neprimerno težja.

Zahvaljujem se staršem in sestri, ker ste me oblikovali v osebo, katera sem danes in me s prijaznimi besedami vedno vodili v pravo smer.

Zahvaljujem se tudi Matjažu, za vso ljubezen in podporo. Hvala, ker mi vedno stojiš ob strani.

II KAZALO VSEBINE

1 Uvod ... 1

1.1 Imunski sistem in odziv telesa na cepljenje ... 1

1.1.1 Prirojena imunost ... 3

1.1.2 Odziv telesa na cepljenje ... 4

1.2 Cepiva... 7

1.2.1 Adjuvansi ... 9

1.2.2 Kombiniranje agonistov različnih PRR za načrtovanje adjuvansov za cepiva .... 10

1.2.3 Dostava cepiva v tarčne celice ... 11

1.2.4 Vstop CPP v citosol ... 15

1.3 Peptidi, ki tvorijo obvite vijačnice, kot nosilci za sestavljanje komponent cepiva ... 16

2 Namen dela in hipoteze ... 19

3 Materiali in metode ... 21

3.1 Kemikalije ... 21

3.2 Raztopine, pufri in standardi ... 22

3.3 Laboratorijska oprema... 23

3.4 Uporabljeni plazmidi ... 24

3.5 Gojenje celičnih kultur ... 24

3.6 Priprava genskih konstruktov ... 24

3.7 Izolacija proteinov ... 25

3.8 Velikostna izključitvena kromatografija ... 25

3.9 Dvojni luciferazni test ... 25

3.10 Priprava peptidov, ki tvorijo obvite vijačnice ... 26

3.11 Spektroskopija cirkularnega dikroizma ... 26

3.12 Meritve izotermne titracijske kalorimetrije ... 27

III

3.13 Velikostna izključitvena kromatografija sklopljena z meritvami statičnega sipanja

svetlobe pri različnih kotih ... 27

3.14 Konfokalna mikroskopija ... 28

3.15 Pretočna citometrija... 28

3.16 Stimulacija celične linije makrofagov z načrtovanimi nanostrukturami ... 28

4 Rezultati ... 30

4.1 Načrtovanje stabilnega seta obvitih vijačnic in določitev njihovih lastnosti in vitro... 30

4.2 Priprava konstruktov cepljene luciferaze za testiranje obvitih vijačnic v sesalskih celicah... 39

4.3 Priprava konstruktov cepljene luciferaze za testiranje tvorbe celičnih sincicijev .... 42

4.4 Priprava konstruktov peptidov, ki tvorijo obvite vijačnice v fuziji z dostavnimi domenami ... 47

4.4.1 Dostavne domene, ki se vežejo na celično membrano ... 47

4.4.2 Dostavne domene za tarčno dostavo v celice ... 49

3.5 Izolacija načrtovanih dostavnih domen iz bakterijskega produkcijskega seva ... 51

3.5 Določitev celične dostave strukture na osnovi tvorbe obvitih vijačnic ... 52

3.6 Določitev izboljšanja imunskega odziva zaradi dostave nanostrukture na osnovi tvorbe obvitih vijačnic ... 58

5 Diskusija ... 63

6 Sklepi ... 67

7 Literatura ... 68

IV KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Kemikalije in encimi, uporabljeni v doktorskem delu ... 21

Preglednica 2: Uporabljeni komercialno dostopni kompleti ... 21

Preglednica 3: Raztopine, pufri in standardi, uporabljeni pri detekciji in izolaciji proteinov . 22 Preglednica 4: Raztopine in pufri uporabljeni za pripravo DNA konstruktov ... 23

Preglednica 5: Uporabljena laboratorijska oprema ... 23

Preglednica 6: Uporabljeni vektorji in plazmidi ... 24

Preglednica 7: Bakterijski sevi, uporabljeni v doktorskem delu... 24

Preglednica 8: Načrtovani paralelni peptidi, ki tvorijo obvite vijačnice ... 30

Preglednica 9: Načrtovani paralelni peptidi, ki tvorijo obvite vijačnice. ... 34

Preglednica 10: Načrtovani z arginini bogati peptidi na osnovi antiparalelnih homodimernih CC-peptidov (APH) ... 47

Preglednica 11: Peptidne dostavne domene ... 48

Preglednica 12: Domene za tarčno dostavo v celice ... 50

Preglednica 13: Uporabljeni CC-peptidi. ... 76

V KAZALO SLIK

Slika 1: Povezava med prirojeno in pridobljeno imunostjo⁶. ... 2 Slika 2: Receptorji za prepoznavo s patogeni povezanih molekulskih vzorcev na antigen predstavitveni celici. ... 4 Slika 3: Odziv imunskega sistema na cepljenje. ... 7 Slika 4: Mehanzimi vstopa CPP v sesalsko celico. Slika je narejena s pomočjo spletnega programa Biorender. ... 13 Slika 5: Diagram postavitve aminokislinskih ostankov v heptadi CC-peptida. ... 17 Slika 6: Peptidi, ki tvorijo obvite vijačnice kot nosilci za načrtovanje neživega cepiva. ... 18 Slika 7: Določitev lastnosti načrtovanih CC-peptidov s pomočjo spektroskopije cirkularnega dikroizma. ... 32 Slika 8: Toplotni zemljevid primerjave talilne temperature posameznih peptidov ter njihovih ortogonalnih parov. ... 33 Slika 9: Določitev konstante disociacije CC-peptidnih parov N1/N2 (A), N5/N6 (B) ter N7/N8 (C) s pomočjo izotermne titracijske kalorimetrije. ... 33 Slika 10: Določitev oligomerizacijskega stanja peptidnih parov N1/N2, N5/N6 ter N7/N8 s pomočjo SEC-MALS. ... 34 Slika 11: Strukturni model N7/N8 ter P7A/P8A para. ... 35 Slika 12: Primerjava talilne temperature PA te N CC-peptidov. ... 35 Slika 13: Določitev lastnosti načrtovanih peptidov s pomočjo spektroskopije cirkularnega dikroizma. ... 36 Slika 14: Določitev konstante disociacije peptidnih parov P5A/P6A (A) in P7A/P8A(B) s pomočjo izotermne titracijske kalorimetrije. ... 36 Slika 15: Določitev oligomerizacijskega stanja peptidnih parov P5A/P6A in P7A/P8A. ... 37 Slika 16: Toplotni zemljevid primerjave stabilnosti novo načrtovanih N in PA variant peptidov s P ter SN variantami. ... 38 Slika 17: Talilne temperature načrtovanih N in PA variant peptidov v primerjavi s P ter SN variantami. ... 38 Slika 18: Shematski prikaz cepljene luciferaze v fuziji s CC-peptidi. ... 39 Slika 19: Sestavljanje cepljene luciferaze preko interakcije peptidov, ki tvorijo obvito vijačnico. ... 40 Slika 20: Potrditev ortogonalnosti načrtovanih CC-peptidov preko sestavljanja cepljene luciferaze v fuziji s CC-peptidi. ... 41

VI

Slika 21: Shematski prikaz regulacije cepljene kresničkine luciferaze z dodatkom sintetičnega peptida v sesalske celice. ... 41 Slika 22: Regulacija aktivnosti sestavljene luciferaze preko interakcije CC-peptidov. ... 42 Slika 23: Shematski prikaz sestavljanja cepljene kresničkine luciferaze ob nastanku celičnega sincicija. ... 43 Slika 24: Sestavljanje cepljene kresničkine luciferaze ob nastanku celičnega sincicija. ... 44 Slika 25: Shematski prikaz sestavljanja cepljenega zelenega fluorescenčnega proteina v fuziji s CC-peptidi, ki omogočajo sestavljanje cepljenega GFP v aktiven encim. ... 44 Slika 26: Shematski prikaz sestavljanja cepljenega zelenega fluorescenčnega proteina ob nastanku celičnega sincicija. ... 45 Slika 27: Spremljanje nastanka celičnih sincicijev s pomočjo konfokalne mikroskopije in pretočne citometirje. ... 46 Slika 28: Shematski prikaz načrtovanih nanostruktur v fuziji z rdečim fluorescenčnim proteinom. ... 51 Slika 29: Določanje čistosti izoliranih nanostruktur s poliakrilamidno elektroforezo. ... 52 Slika 30: Shematski prikaz nanostrukture, ki vsebuje dva fluorescenčna proteina. ngGFP:P8A je v kompleks nanostrukture povezan preko interakcije med CC-peptidi. ... 52 Slika 31: Določitev lastnosti načrtovanih CC-peptidov P5A/P6A (A) ter P7A/P8A (B) s pomočjo spektroskopije cirkularnega dikroizma pri nizkem pH. ... 53 Slika 32: Določanje čistosti izoliranega proteina ngGFP:P8A s poliakrilamidno elektroforezo.

... 53 Slika 33: Določitev celične dostave z arginini bogatih peptidov v fuziji z rdečim fluorescenčnim proteinom mCherry na celični liniji HeLa. ... 55 Slika 34: Določitev celične dostave z dostavnimi domenami, ki ciljajo celične receptorje na celični liniji HeLa. ... 57 Slika 35: načrtovano nanocepivo za stimulacijo celic imunskega sistema. ... 59 Slika 36: Aktivacija imunskega odziva z nanostrukturo na osnovi obvitih vijačnic. ... 60 Slika 37: Določanje čistosti izoliranega proteina KF:P8A s poliakrilamidno elektroforezo. .. 60 Slika 38: ELISA interlevkina 1β in interlevkina 6 kot odziva na stimulacijo z dostavno nanostrukturo in dodanim adjuvansom (kratek flagelin). ... 62

VII POVZETEK

V zadnjem stoletju so cepiva najučinkovitejši način preprečevanja smrti zaradi nalezljivih bolezni. Napredek v znanosti je ključno gonilo razvoja cepiv, zato so raziskave na področju cepiv zelo pomembne. Raziskovanje različnih pristopov načrtovanja novih cepiv je pomembno orodje za izboljšanje njihovih lastnosti. Cepiva ločimo na živa in neživa. Razlika med prvo in drugo skupino je v tem, da prva vsebuje oslabljene patogene, ki se lahko v telesu razmnožujejo, druga pa vsebuje mrtve patogene ali njihove komponente. V doktorskem delu smo se osredotočili na peptide, ki tvorijo obvite vijačnice (ang. coiled coils, CC-peptide) kot nosilce, s katerimi bi združili imunološko aktivne komponente v učinkovito ne-živo cepivo. Zaradi svoje modularne narave, so nam CC-peptidi služili kot dobri gradniki za načrtovanje nanocepiva, ki omogoča hkratno dostavo antigena in adjuvansa v tarčno celico, kar je za učinkovitost cepiva zelo pomembno. Načrtovali smo več parov stabilnih in med seboj ortogonalnih CC-peptidov. Pri tem smo upoštevali dobro definirana pravila umeščanja posamezne aminokisline znotraj CC-peptida. Z energijskega vidika je najpomembnejši položaj tisti, ki tvori hidrofobno sredico, elektrostatske interakcije med nasprotno nabitimi aminokislinskimi ostanki pa so drugi pomemben doprinos k stabilizaciji obvite vijačnice ter ključne za selektivnost parjenja. Sintetične peptide smo, po določitvi njihovih lastnosti in vitro, smo jih uporabili kot dimerizacijske domene za sestavljanje cepljenih proteinov. Na ta način smo se prepričali, ali načrtovani peptidi ohranijo svoje lastnosti v fuziji z večjimi domenami (proteini), kar je bilo ključno za nadaljnje eksperimente. Peptidna para z najustreznejšimi lastnostmi smo uporabili kot sestavna dela nanoogrodja, kjer smo načrtovane peptide izrazili v fuziji s fluorescenčnimi proteini ter s celičnimi dostavnimi domenami. Fluorescenčni protein nam je omogočal spremljanje celične dostave s pomočjo konfokalne mikroskopije ali pretočne citometrije. Ker je za cepivo poleg izbire ustreznega antigena in adjuvansa pomembna tudi tarčna dostava v celice, smo preizkusili več dostavnih domen. Po izbiri najučinkovitejše dostavne domene, smo nanoogrodje uporabili kot nanocepivo s katerim smo tarčno dostavili antigen ter adjuvans (kratek flagelin) v modelno antigen predstavitveno celico. Dokazali smo, da s CC-interakcijami posredovana dostava imunsko aktivnih molekul izboljša vnetni odziv.

VIII ABSTRACT

In the last century, vaccines have been the most effective way to prevent deaths caused by infectious diseases. Advances in science are a key driver of vaccine development, so research in the field of vaccines is very important. Exploring different approaches to designing new vaccines is important for improvement of vaccine efficacy. Vaccines are separated in two types: live-attenuated and inactivated. The difference between the two is that the first contains attenuated pathogens that can reproduce in our body, while non-living ones contain dead pathogens or their components. In this doctoral dissertation, we focused on peptides that form coiled coils (CC-peptides) as carriers with which to combine immunologically active components into an effective inactivated vaccine. Due to their modular nature, CC-peptides have served as good building blocks for the design of a nanovaccine that allows simultaneous delivery of antigen and adjuvant to the target cell, which is important for vaccine effectiveness.

We designed several sets of stable and orthogonal CC-peptides. Well-defined rules for individual position within a CC peptide were followed. Most important positions are those that form the hydrophobic core. Electrostatic interactions between oppositely charged amino acid residues are another important contribution to the stabilization of the coiled helix and crucial for selectivity. After determining the properties of synthetic peptides in vitro, they were used as dimerization domains for the assembly of split proteins. Using split proteins method, we made sure the designed peptides retained their properties in fusion with larger domains (proteins), which was crucial for further experiments. The peptide pairs with most suitable properties were used as components of the nanoscaffold, where the designed peptides were expressed in fusion with fluorescent proteins and cell delivery domains. The fluorescent protein added to the nanostructure allowed us to monitor cell delivery by confocal microscopy or flow cytometry. In addition to selecting the appropriate antigen and adjuvant, target delivery into cells is also important for vaccine efficacy. We thus focused on several delivery domains. After selecting the most efficient delivery domain, the nano framework was used as a nanovaccine to target the antigen and adjuvant (short flagellin) to the model antigen-presenting cell. We have shown that CC-mediated delivery of immunologically active molecules improves the inflammatory response.

IX IZVIRNI ZNANSTVENI ČLANEK

Izvirni znanstveni članek s področja teme doktorske disertacije : https://www.nature.com/articles/s41598-021-88315-3

X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

Ak aminokislina, aminokislinski ostanek

Amp ampicilin

Ang. angleško

APC antigen predstavitvena celice

APS amonijev persulfat

Bp bazni par

CC-peptid peptid, ki tvori obvito vijačnico (ang. »coiled coil forming peptides«) CLR Lektinski receptor tipa C (ang. »C-type lectin receptors«)

CPI mešanica proteaznih inhibitorjev (ang. »protease inhibitor cocktail«) CPP Peptidi, ki lahko penetrirajo v celico (ang. »Cell Penetrating Peptides«) Da / kDa dalton, enota za molekulsko maso oz. kilodalton

DMEM gojišče za celične kulture (ang. »Dulbecco´s Modified Eagle`s Medium«)

DMSO dimetilsulfoksid

DNK deoksiribonukleinska kislina (ang. »Deoxyribonucleic Acid«) dNTP 2´-deoksinukleozid-5´-trifosfat

FBS fetalni telečji serum (ang. »fetal bovine serum«) His histidinski označevalec sestavljen iz 6 histidinov

IL interlevkin

IPTG izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid

LB gojišče Luria-Bertani

LPS lipopolisaharid, imenovan tudi endotoksin

NLR NOD-u podoben receptor (ang. »Nod Like Receptor«)

PAMP molekulski motivi patogenih mikroorganizmov (ang. »pathogen- associated molecular patterns«)

PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza (ang. »polyacrylamide gel Electrophoresis«)

PBS fosfatni pufer s soljo (ang. »phosphate buffered saline«)

PCR verižna reakcija s polimerazo (ang. »polymerase chain reaction«)

XI

MHC poglavitni histokompatibilnostni kompleks (ang.»Major Histocompatibility Complex«, MHC)

PRR receptorji, ki prepoznavajo molekulske motive (ang. »pattern recognition receptors«)

RLR RIG-I helikazi (ang. »RIG-I Like Receptor«) podoben receptor SDS natrijev dodecil sulfat

TEMED N,N,N,N -tetrametil-etilendiamin

TLR Toll-u -podoben receptor (ang. »Toll-like receptor«) Tween 20 polioksietilensorbitan monolavrat

Obr./min obrati na minuto

% (m/v) Odstotni delež mase snovi v volumnu (1% pomeni 1g v 100 ml)

1

1 Uvod

Cepiva so spremenila podobo javnega zdravja, predvsem z uvedbo nacionalnih programov cepljenja v šestdesetih letih prejšnjega stoletja. Cepivo je biološki produkt, ki ga uporabljamo za varno vzbuditev imunskega odziva, ki vodi v zaščito proti okužbi in/ali boleznijo kot posledico stika s patogenom. Da to dosežemo, mora cepivo vsebovati antigene, ki izvirajo iz patogena ali pa pridobimo sintetičnega, ki je podoben naravnim antigenom. Ključna komponenta večine cepiv je eden ali več proteinskih antigenov, ki izzove imunski odziv, ki zagotovi zaščito telesa¹.

Cepiva delimo na živa in neživa (inaktivirana). Razlikujejo se po tem, da prva vsebujejo oslabljene patogene, ki se lahko razmnožujejo, medtem ko neživa vsebujejo zgolj komponente patogena ali mrtve patogene. Poleg tradicionalnih cepiv, razvijamo tudi druge nosilce kot so virusni vektorji, cepiva na osnovi nukleinskih kislin ter virusom podobni delci. Ključna razlika med neživimi in živimi cepivi je, da imajo slednji potencial nekontroliranega razmnoževanja v imunokomprimiranih osebah, kar omejuje njihovo uporabo². Živa cepiva so zasnovana, tako da se v gostitelju razmnožijo dovolj, da izzovejo imunski odziv, vendar ne toliko, da bi sprožila potek bolezni. Z lovljenjem tega ravnotežja je potrebna zadostna oslabitev patogena kar kompenziramo tako, da osebo cepimo večkrat^3,4.

Antigenska komponenta neživih cepiv so lahko antigeni, proteini, izolirani iz patogena, rekombnantni proteini ali polisaharidi. Neživa cepiva pogosto vsebujejo adjuvanse, ki izboljšajo njihovo sposobnost aktivacije imunskega sistema in so iz vidika varnosti pogosto bolj privlačna metoda kot uporaba živih cepiv.

V doktorski nalogi smo se osredotočili na peptide, ki tvorijo obvite vijačnice (coiled coils; CC- peptide) kot nosilce za načrtovanje neživega cepiva, ki bi omogočali združevanje različnih antigenov in adjuvansov. Zaradi modularne narave peptidov, bi le-ti služili kot ogrodje za kombiniranje različnih imunološko aktivnih molekul in načrtovanje cepiv.

1.1 Imunski sistem in odziv telesa na cepljenje

Primarna naloga imunskega sistema je obramba gostitelja pred organizmi, ki bi lahko povzročili celične poškodbe in smrt. Odziv imunskega sistema na patogene delimo na več faz:

2

zaznavanje patogena, vnetje, predstavitev antigenov, razvoj pridobljene imunosti in uničenje patogena. V ta proces je vpletenih veliko celičnih tipov, njihovo funkcijo pa regulirajo medcelične interakcije, površinski receptorji in signalne molekule ⁵.

Slika 1: Povezava med prirojeno in pridobljeno imunostjo⁶.

Po aktivaciji dendritične celice slednja vpliva na zorenje naivne T celice. Naivna T celica lahko diferencira v citotoksičo celico T (CTL), T celico pomagalko tipa 1(Th1), T celica pomagalko tipa 2 (Th2), T celico pomagalko tipa 17 (Th17) ali regulatorno T calico (Treg). Slika je narejena s pomočjo spletno dostopnega orodja BioRender.

Imunski sistem sestavlja kompleksno omrežje anatomskih struktur ter celic v telesu gostitelja, katerih funkcija je, da zaznajo, preprečijo ter odstranijo tuje, nezaželene antigene. To doseže z dvema ločenima, vendar med seboj tesno povezanima vejama imunosti. Govorimo o prirojeni in pridobljeni imunosti. Prirojena imunost je prva linija obrambe proti patogenom. Sestavljajo jo fizične, kemične ter biološke bariere kot so epitelijske celice, bički, sluz ter imunoglobulin A⁷. Rezidualne tkivne dendritične ali antigen predstavitvene celice (ang. »Antigen presenting cell«, APC) omogočajo zaznavanje, procesiranje in predstavitev antigenov pridobljenemu imunskemu sistemu. To vodi v aktivacijo imunskih celic ob toksičnih ali infektivnih signalih ter stimulira odstranjevanje tujih substanc ali okuženih celic. Prirojen imunski sistem lahko aktivira komplement, katerega tarča so bakterije ali pa omogočijo odstranitev celičnih ostankov in protitelesnih kompleksov. Je nespecifičen, deluje hitro in ne tvori imunskega spomina.

Pridobljen imunski sistem, se na antigen odzove z imunskim spominom preko celično posredovane imunosti ali protitelesnih (humoralnih) procesov. To omogočajo celice B in T.

Pridobljeni imunski odziv je bolj specifičen, njegova druga pomembna lastnost pa je, da ločuje

3

med lastnimi in tujimi antigeni. Tako prirojeni kot pridobljeni imunski sistem sta tesno povezana⁷. Celice obeh vej imunskega sistema so vpletene v prepoznavanje za telo tujih antigenov.

1.1.1 Prirojena imunost

Celice prirojene imunosti na svoji površini izražajo receptorje, ki prepoznavajo molekulske vzorce patogenov (ang. »Pattern Recognition Receptors«, PRR), mikrobne strukture, ki jih prepoznavajo, pa imenujemo s patogeni povezani molekulski vzorci (ang. »Pathogen Associated Molecular Patterns«, PAMP). Efekt aktiviranih celic prirojenega imunskega sistema je takojšen, med tem ko morajo celice pridobljene imunosti skozi proces klonalne selekcije ter ekspanzije, preden se aktivirajo. Aktivirane celice pridobljene imunosti se lahko razvijejo v efektorske ali spominske populacije, ki uravnavajo dolgoročno zaščito telesa⁵. Receptorji PRR prepoznavajo ohranjena zaporedja patogenov kot tudi molekulske vzorce značilne za okvaro. Komponente bakterijske celične stene, virusna RNA, ter kratke sintetične DNA molekule (CpG ODN) so tarče PRR, ki jih s pridom uporabljamo za cepiva. Interakcije med PRR in PAMP so predmet veliko raziskav, na podlagi katerih receptorje uvrščamo v 4 glavne skupine: Tollu podobni receptorji (ang. »Toll Like Receprors«, TLR), NOD-u podobni receptorji, ki so ime dobili po nukleotid-vezavni oligomerizacijski domeni (ang. »NOD Like Receptors«, NLR), receptorje podobne RIG-I helikazi (ang. »RIG-I Like Receptor«, RLR) ter lektine tipa C (ang. »C-type lectin receptors«, CLR)⁸. Ti receptorji omogočajo aktivacijo prirojenega imunskega odziva med okužbo ali ob prisotnosti nevarnih signalov ter posredno vplivajo tudi na pridobljeno imunost.

Veliko patogenih mikroorganizmov se hitro odstrani po tem, ko smo jim izpostavljeni, ne da bi organizem pri tem utrpel škodo ali razvil klinične simptome. Odziv nadzorujejo imunološke bariere kot so sluznica, koža, protimikrobni proteini in molekule ter celice kot so makrofagi in nevtrofilci. Prirojena imunost se aktivira takoj ob vdoru patogena, ne prepoznava specifičnih antigenov in ne rabi dolge izpostavitve kot je to značilno za razvoj B in T celičnega odziva⁵. Druga strategija prirojenega imunskega sistema je zaznavanje t.i. s poškodbo povezanih molekul (ang. »Damage Associated Molecular Patterns«, DAMP), ki se sproščajo ob lizi oziroma poškodbi celic gostitelja. To so na primer proteini toplotnega šoka (ang. »Heat Shock Proteins«, HSP), sečna kislina ter drugi alarmini. Tretja strategija prirojenega imunskega sistema pa je zaznavanje celic, ki na svoji površini ne izražajo lastnih antigenov. Tak primer

4

so naravne celice ubijalke, ki napadejo poškodovane celice gostitelja, ki imajo zmanjšano izražanje lastnega poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa MHC I (ang. »Major Histocompatibility Complex«, MHC I) ter na ta način ne predstavljajo več lastnih antigenov ⁷.

Slika 2: Receptorji za prepoznavo s patogeni povezanih molekulskih vzorcev na antigen predstavitveni celici.

Slika je narejena s pomočjo spletnega programa Biorender.

1.1.2 Odziv telesa na cepljenje

Nezreli monociti in makrofagi krožijo po našem telesu, dokler ne pridejo v stik s specifičnim antigenom (naravno prisotnim ali vnesenim s cepivom). Preko PRR celice prepoznajo za patogene specifične vzorce in postanejo aktivirane⁹. Ti signali privlačijo monocite, granulocite in naravne celice ubijalke, ki ustvarijo vnetno mikrookolje, kjer se monociti diferencirajo v makrofage, nezrele dendritične celice pa postanejo aktivirane¹⁰. Ta aktivacija spremeni izražanje receptorjev na površini teh celic ter sproži migracijo dendritičnih celic proti limfnim vozlom kjer se diferencirajo v specifične tkivne makrofage ali dendritične celice¹¹. Ključna vloga zrelih dendritičnih celic pri začetku odziva na cepljenje je njihova sposobnost zagotoviti antigen specifične in ko-stimulatorje signale za celice T¹². Celice B so aktivirane v limfnih vozlih, ki so jih dosegli antigeni cepiva zaradi difuzije ali zaradi stika z dendritičnimi celicami, ki so bile v stiku z antigenom. Proteinski antigeni aktivirajo tako celice B kot tudi T , posledica

5

česar je sprožitev B-celične diferenciacije v specializiranih strukturah imenovanih germinalni centri (ang. »Germinal Centers«, GC)¹³.

Za razliko od prirojenega imunskega odziva, je pridobljen imunski sistem specifičen za določen patogen. Za nastanek takega odziva je potrebno dlje časa, vendar le-ta vodi v nastanek celičnega spomina, kar pomeni, da se bo telo ob naslednjem stiku z istim patogenom/

antigenom odzvalo hitreje. Pridobljeni imunski sistem sestavljajo celice B oziroma protitelesa, ki jih proizvajajo in celice T. Celice B in protitelesa skupaj poimenujemo tudi humoralna imunost ali s protitelesi posredovana imunost. Celice T predstavljajo celično posredovano imunost. Prva veja pridobljenega imunskega sistema je humoralni odziv, ki deluje proti zunanjim patogenom in toksinom. Celice B nastajajo v kostnem mozgu od koder po telesu potujejo do limfnih vozlov. Tukaj zorijo naivne celice B, lahko pa so tudi izpostavljene antigenom. Za razliko od T celic, celice B lahko prepoznajo antigene brez procesiranja antigen predstavitvenih celic oziroma posredovanja T celic pomagalk. Primeri antigenov, ki lahko na ta način aktivirajo celice B na ta način so velike polimerne strukture z več ponavljajočimi se segmenti. Mednje sodijo lipopolisaharidi, dekstran in bakterijski polimerni flagelin¹⁴. Vendar pa je imunski odziv brez posredovanja T celic pomagalk šibkejši ali pa ne vodi v nastanek imunskega spomina, zato pri cepljenju poskušamo vzbuditi imunost posredovano s T celicami pomagalkami¹⁵. Da cepivo lahko izzove imunski odziv, mora zagotoviti dovolj signalov z vnosom antigenov in/ali adjuvansov, da se sproži vnetni odziv, ki ga uravnavajo celice prirojenega imunskega odziva ¹⁶.

Z vezavo antigena na Fab regijo B celičnega receptorja ter citokini, ki jih izločajo celice T, so celice B podvržene somatski hipermutaciji, kar poveča afiniteto Fab regije za antigen. Ta proces stimulira celice B, da dozorijo v plazemske celice, ki proizvajajo specifična protitelesa za določen antigen¹⁷. Iz teh stimuliranih B celic, nastanejo kloni B celic, specifični za antigen.

Le-ti se lahko dalje spremenijo v plazemske celice, ki proizvajajo antigene ali pa postanejo spominske celice, ki ostanejo v limfnih vozlih kjer stimulirajo nov imunski odziv za specifičen antigen. Ti procesi potekajo med primarnim imunskim odzivom, ko je imunski sistem prvič izpostavljen specifičnemu antigenu¹⁸. Proces klonalne ekspanzije poteka več dni in primarno v tem procesu nastajajo protitelesa IgM. Ob nadaljevanju imunskega odziva bodo aktivirane plazemske celice začele proizvajati za antigen specifična protitelesa IgG, ki ima višjo afiniteto in se na antigen vežejo bolj učinkovito¹⁵. Sekundarni imunski odziv s spominskimi celicami, ki so nastale v primarnem imunskem odzivu, bo ob naslednji izpostavitvi antigenu hitrejši in bolj učinkovitejši, nastala bodo predvsem protitelesa.

6

Druga veja pridobljene imunosti, celično posredovana imunost, pa je usmerjena predvsem proti znotrajceličnim patogenom. Celice T zorijo v timusu in se sproščajo v krvni obtok. Celice T delimo v CD4 in CD8. CD4 ali celice T pomagalke imajo CD4 koreceptor in prepoznavajo samo poglavitni histokompatibilnostn kompleks MHC II. Slednjega najdemo na vseh celicah imunskega sistema in služi kot njihov označevalec. CD4+ celice T imajo ključno vlogo pri s protitelesi posredovani imunosti ter pomagajo celicam B pri kontroli zunajceličnih patogenov.

Poznamo dva podtipa CD4+ celic, Th1 in Th2. Celice Th1 pomagajo pri celično posredovani imunosti, Th2 pa pri z antigeni posredovani imunosti. CD8 ali citotoksične celice na svoji površini izražajo CD8 ko-receptor in prepoznavajo le poglavitni histokompatibilnostni kompleks MHC I. Slednjega najdemo na vseh telesnih celicah telesa, ki imajo jedro. Celice CD8 so ključne za celično posredovano imunost ter odstranjevanje znotrajceličnih patogenov^19,15,11.

Za razliko od celic B, celice T prepoznavajo le antigen, ki so ga procesirale antigen predstavitvene celice. Poznamo dva načina procesiranja antigenov. Pri prvem tipu procesiranja je antigen predstavljen s pomočjo kompleksa MHC I. Na ta način so predstavljeni tumorski in virusni antigeni. Pri drugem tipu procesiranja pa je antigen predstavljen preko kompleksa MHC II, s katerim so procesirani antigeni bakterij ali parazitov. Ko je celica T aktivirana z antigen predstavitveno celico začne delovati glede na to ali je diferencirana v celico CD8 ali CD4. Tako kot celice B, gredo tudi celice T v proces klonalne ekspanzije, rezultat česar so dodatne efektorske celice T, ki služijo v trenutni okužbi ali pa nastanejo spominske celice T, ki so pomembne pri naslednji okužbi s tem antigenom¹⁹,¹⁵.

7 Slika 3: Odziv imunskega sistema na cepljenje.

Cepivo je vbrizgano v mišico in proteinski antigen prevzamejo dendritične celice. Ob vezavi antigenov na receptorje za prepoznavo s patogeni povezanih molekulskih vzorcev (PRR) na dendritičnih celicah se le-te aktivirajo in migrirajo v limfne vozle. Tukaj poteka predstavitev antigenov celicam T preko histokompatibilnostnega kompleksa II, ter T celičnega receptorja. Preko kombinacije signaliziranja topnih antigenov preko B celičnega receptorja (BCR) in posredovanja celic T, poteka zorenje celic B. S celicami T posredovano zorenje celic B vodi v zorenje protiteles, ki imajo visoko afiniteto do antigena. Produkcija kratkoživih plazemskih celic, ki aktivno izločajo protitelesa specifična za antigene v cepivu povzročijo hiter skok plazemskih protiteles, 2 tedna po cepljenju. Hkrati nastajajo tudi spominske celice B, ki uravnavajo imunski spomin. Dolgožive plazemske celice, ki proizvajajo protitelesa skozi daljša časovna obdobja potujejo v kostni mozeg. CD8+ spominske celice T lahko proliferirajo hitro, ko srečajo patogen, efektorske celice CD8+ pa so pomembne za odstranjevanje okuženih celic¹.

Slika je narejena s pomočjo spletnega programa Biorender.

1.2 Cepiva

Cepiva so suspenzije, ki jih administriramo z namenom stimulacije odziva imunskega sistema, ki prepoznavajo in odstranjujejo patogene proti kateremu je bil posameznik cepljen. Poleg čiste pitne vode, cepiva predstavljajo najbolj učinkovit način za preprečevanje in širjenje nalezljivih bolezni²⁰. Za številne bolezni cepiva še ne obstajajo, zato so raziskave na tem področju zelo pomembne.

8

Tradicionalen razvoj cepiv poteka na več načinov: (i) lahko gre za administracijo celotnih vendar oslabljenih (na primer cepivo proti ošpicam-mumpsu-rdečkam) ali mrtvih patogenov (na primer inaktiven polio virus), (ii) lahko gre za žive organizme, ki lahko povzročijo zaščitno imunost proti nevarnejšim patogenom, ne da bi pri tem povzročili bolezen (cepivo proti črnim kozam), ali pa gre za (iii) neaktivne toksine (imenovani tudi toksidi, kot je na primer cepivo proti davici in tetanusu)²¹.

Uporaba celotnih mikroorganizmov zagotavlja dostavo večih potencialno zaščitnih komponent, ki simulirajo imunski odziv, in tako predstavlja najboljšo podobnost z naravno okužbo. To še posebej velja za oslabljena živa cepiva, ki se v gostitelju minimalno podvajajo, kar v primerjavi z drugimi pristopi cepljenja omogoča stimulacijo močnejšega in dlje trajajočega imunskega odziva v primerjavi z drugimi pristopi cepljenja. Ta vrsta cepiv ima večji potencial zadostne imunizacije že z enkratno administracijo²¹. Kljub uspešnosti nekaterih cepiv tega tipa, pa imajo omejeno učinkovitost. Na primer, živa oslabljena cepiva proti virusu HIV niso varna ²². Dostava več antigenov ima potencialno večji zaščitni učinek, vendar hkrati dostavimo tudi komponente, ki za zaščitni imunski odziv niso potrebne. Slednje lahko zmanjšajo efektivnost cepiva, saj zmanjšajo imunski odziv proti specifičnemu antigenu^23,24. Za razvoj in produkcijo cepiv, ki vsebujejo celotne patogene, je potrebna tudi kultivacija patogenov, kar ni vedno mogoče²⁵. Zaradi omenjenih pomanjkljivosti razvoj vodi v smeri načrtovanja neživih cepiv, ki namesto celotnega organizma vsebujejo enega ali več definiranih mikrobnih komponent, namesto celega organizma²¹. Taka cepiva vsebujejo očiščene proteine (virusom podobne delce), polisaharide (na primer Salmonella typhi Vi polisaharidno cepivo), protein-polisaharid konjugate (na primer Haemophilus influenzae tip b (Hib) ali kapsularni polisaharidi-tetanus toksoid konjugat), glikolipide ali lipoproteine^26,21. Zaradi dobro definirane narave, imajo taka cepiva več prednosti v primerjavi s tradicionalnimi cepivi. So varnejša (ob ustrezni izbiri antigenov), specifična, stabilnejša in zato boljša za dolgoročno shranjevanje.

Predvsem pa omogočajo možnost načrtovanja različnih kombinacij antigenov, ki usmerijo imunske odzive proti specifičnim epitopom ter krojijo tip imunskega odziva, kot ga želimo^27,21. Kljub omenjenim prednostim so cepiva s posameznimi podenotami patogena lahko manj imunogena. Njihova poenostavitev vodi v izgubo nevarnih signalov, ki opozorijo imunski sistem na okužbo, se ne pomnožujejo in vsebujejo manjši nabor antigenov²⁵. Za izboljšanje delovanja cepiv, sestavljenih iz posameznih podenot, jim dodajamo adjuvanse, ki povečajo možnost zadostnega imunskega odziva. Najpogosteje uporabljene so aluminijeve soli, monofosforil lipid A, oljno-vodne emulzije na osnovi skvalena, vironi virusa influence²⁸.

9 1.2.1 Adjuvansi

Za izboljšanje sposobnosti produkcije novih cepiv potrebujemo nove varne in efektivne sisteme adjuvansov. Dober adjuvans pripomore k stimulaciji produkcije celično posredovane imunosti, pomaga odstraniti različne tipe tumorjev, stimulira sluznični imunski odziv, omogoča nadzor nad tipom imunosti, ki jo izzove ter omogoča produkcijo zadostne količine protiteles, zaradi česar lahko zmanjšamo količino dodanega antigena v cepivu^28,29. Dva pristopa vodita do nove generacije adjuvansov: (i) iskanje novih dostavnih sistemov, ki povečajo privzem v celice in predstavitev antigenov, ter (ii) razvoj modulatorjev, ki pomagajo pri aktivaciji prirojenega imunskega sistema ³⁰.

Adjuvansi so pomembni sestavni del modernih cepiv. Njihova aktivnost je ključna za imunizacijo v oslabljenih imunskih sistemih in ko je učinkovitost cepiva omejena. Poleg tega, da povečajo razsežnost imunskega odziva, lahko adjuvansi preko aktivacije imunskega odziva tudi podaljšajo dolgoročne učinke cepiva. Izboljšani protitelesni odzivi so povezani z nastajanjem germinalnih centrov ter ekspanzijo antigen specifičnih folikularnih celic T pomagalk (TFH)³¹.

Kot adjuvansi so lahko uporabljeni tudi s patogeni povezani molekularni vzorci, ki izzovejo močan imunski odziv. Te mikrobne komponente so evolucijsko ohranjene (na primer nukleinske kisline, komponente bakterijske celične stene ali flagelin), in jih ljudje ne proizvajamo. Lahko jih pridobimo direktno iz mikroorganizmov, jih sintetiziramo ali jih načrtujemo, da imajo optimalne lastnosti kot adjuvans. Sočasna dostava ali fuzija antigenov s PAMP tako predstavlja možnost izboljšanja imunskega odziva proti specifičnemu antigenu.

Več študij je pokazalo, da je fuzija antigenov izzvala boljši in dolgotrajnejši imunski odziv ³². Razlog za to je, da konjugacija antigenov z adjuvansi zagotovi dostavo obeh komponent v isto antigen predstavitveno celico^8,33. Ta strategija prav tako zagotavlja, da sta antigen in adjuvans prisotna v istem fagosomu, kar omogoča optimalno prezentacijo antigena z poglavitnim histokompatibilnostnim kompleksom MHC II (ang. »Major Histocompatibility Complex«, MHCII) ter stimulacijo celic T pomagalk ³⁴. Tako so bile le antigen predstavitvene celice, ki so prišle v stik z antigenom, bile aktivirane tudi z adjuvansom. To vodi v zmanjšanje doze adjuvansov in antigenov, s čimer zmanjšamo možnost stranskih učinkov. Ko so antigeni in adjuvansi vneseni kot mešanica, se lahko komponente oddaljijo druga od druge³⁵. Na ta način bo manj antigen predstavitvenih celic prišlo v stik z antigenom ali adjuvansom, kar ima lahko

10

neželjene posledice, kot so zmanjšan imunski odziv, razvoj imunološke tolerance ali celo aktivacija avtoimunega odziva³⁶.

Zaradi izboljšanega imunskega odziva na antigen-adjuvans konjugate, predvsem preko celično posredovane imunosti³⁷, ta tehnologija predstavlja platformo za razvoj nove generacije cepiv.

Ker pravilno zviti proteinski antigeni predstavljajo večino zaščitnih terapevtskih antigenov³⁸ je pomemben razvoj metod za njihovo pridobivanje. Prednost cepiv na osnovi proteinov je tudi ta, da je mogoča produkcija velikih količin v industrijskih obratih, ne zahteva kompleksnih kemijskih procesov in jih lahko nadalje izboljšamo z inkorporacijo dostavnih sistemov.

Večina neživih cepiv zato potrebuje dodatek specifičnih adjuvansov, da vsebujejo dovolj signalov za nevarnost, da izzovejo zadostno aktivacijo prirojenega imunskega odziva. Te adjuvanse delimo v dve kategoriji. Prvi so t.i. dostavni sistemi, ki podaljšajo dostavo na mestu vnosa cepiva ter s tem vpoklic več dendritičnih celic. Druga pa so modulatorji imunskega sistema, ki zagotovijo dodatne diferenciacijske in aktivacijske signale monocitom ter dendritičnimcelicam ¹⁰.

1.2.2 Kombiniranje agonistov različnih PRR za načrtovanje adjuvansov za cepiva

Naravni patogeni vsebujejo več PRR ligandov. Kombinacija več adjuvansov, ki targetirajo specifične PRR bi tako bolje posnemali naravno okužbo, kar bi vodilo v ojačano imunsko aktivacijo. Na primer, za stimulacijo NOD2 je znano, da ojača signalizacijo preko TLR2, TLR4 ali ter TLR3, ne vpliva pa na odziv TLR5, TLR7 ali TLR9 ⁸. Agonisti NOD1 in NOD2 povečajo proizvodnjo pro-in anti-vnetnih citokinov preko humanih monocitov ter dendritičnih celic preko liganda TLR4³⁹. Kombinacija NOD2 in TLR4 agonistov poveča izražanje ko- stimulatornih molekul ter avtofagno aktivnost dendritičnih celic ter s tem izboljša T celično aktivacijo⁴⁰. Z uporabo flagelina, proteina bakterijskega bička, s katerim so želeli hkrati stimulirati tako TLR5 in NAIP5/NLRC4, so uspešno zamejili okužbo z rotavirusom pri miših⁴¹. Tudi povezovanje dveh agonistov v eno molekulo lahko vodi v izboljšanje imunskega odziva.

Himerni tarčni ligand, tako za NOD2 kot tudi TLR2 je pokazal hkratno indukcijo zorenja dendritičnih celic (ki so se razvile iz monocitov) in produkcijo pro-inflamatornih citokinov.

Posamezna liganda nista imela enakega učinka. Himerni ligand je povečal količino protiteles na sistemskem in sluzničnem nivoji in vivo⁴². Rezultati kažejo, da imajo TLR in NLR receptorji komplementarne funkcije pri oblikovanju odziva pridobljene imunosti.

11

TLR2 signaliziranje lahko vpliva na signaliziranje TLR4 in TLR7. Aktivacija TLR2 na dendritičnih celicah (diferenciranih iz monocitov) onemogoči sproščanje pro-inflamatornih citokinov, ki jih sprožijo TLR7/8 agonisti brez, da bi s tem vplival na zorenje ali proliferacijo celic T ⁴³.

Ko-aktivacija TLR3 s poly(I:C) ter TLR9 s CpG v piščančjih monocitih vodi v unikatni signalizacijski vzorec, ki ga ne vidimo pri stimulaciji z individualnimi ligandi ⁴⁴. Aerosolna dostava teh dveh komponent pri zdravljenju B16 melanoma pljučnih metastaz v C57BL/6 miših kaže na izboljšano aktivnost, kot administracija samih CpG⁴⁵.

1.2.3 Dostava cepiva v tarčne celice

Dostava funkcionalnih proteinov v celice ima dober terapevtski potencial. Majhne molekule slabše posnemajo kompleksne lastnosti proteinov v celicah in imajo pogosto nezaželene stranske učinke⁴⁶. Prednost terapevtskih proteinov pred, na primer, genetskimi je, da za učinkovanje ni potrebno spreminjanje našega genoma, ki lahko vodijo v spremembo ne-tarčnih genov⁴⁷. Razvoj proteinskih zdravil je privlačen tudi iz finančnega vidika, saj je povprečen klinični razvoj in odobritev krajši kot za terapevtske majhne molekule⁴⁸. Za razliko od konvencionalnih terapevtskih učinkovin, je večina proteinov razmeroma velikih in hidrofilnih.

To pomeni, da plazemske membrane ne prečkajo direktno, s čimer je njihov terapevtski potencial omejen. Peptidi, ki lahko penetrirajo v celico (ang. »Cell Penetrating Peptides«, CPP), lahko dostavijo različne molekule ali večje proteine^49,50,51.

V doktorski nalogi smo se osredotočili na različne dostavne domene, ki smo jih glede na delovanje razdelili v dve skupini. V prvo smo uvrstili peptide, ki se vežejo na celično membrano ter omogočijo vstop v celico. Ker pri tem ne moremo zagotoviti tarčne specifičnosti smo poleg teh preizkusili še domeni, ki se vežeta na specifičen receptor in omogočata dostavo v celico.

CPP so sposobni vstopa v celico na ne-invaziven način, kar pomeni, da ne poškodujejo integritete celične membrane in so visoko učinkoviti ter varni. Do sedaj so pokazali, da z njimi lahko uspešno dostavimo molekule kot so peptidi, proteini in nukleinske kisline, ki so zaradi svojih lastnosti težavni za celično dostavo⁵². Zato so uporabljeni v številnih bioloških aplikacijah⁵³. Na splošno definiramo CPP kot raznoliko skupino pozitivno nabitih peptidov z dolžino 30 aminokislin od katerih je visok procent bazičnih. Zanje je značilno tudi, da prehajajo celično membrano različnih celičnih tipov, niso toksični in ne izzovejo imunskega odziva⁵⁴. Tak tip peptidov so prvič opisali v osemdesetih letih prejšnjega stoletja z odkritjem TAT

12

peptida, ki ga kodira človeški virus imunske pomanjkljivosti tipa I (HIV-1)⁵⁵, za katerega so pokazali, da preide celično membrano in se lokalizira v celičnem jedru.

Glede na interakcijo med CPP in terapevtsko učinkovino ločimo dve glavni skupini peptidov.

V prvo sodijo CPP, ki so kovalentno konjugirani s terapevtsko učinkovino bodisi preko kemične konjugacije ali s kloniranjem čemur sledi izražanje oziroma produkcija fuzijskega proteina. Na ta način so bili uporabljene modifikacije TAT peptida, penetratin ter poliarginini⁵⁶. V drugo skupino uvrščamo CPP, ki tvorijo nekovalentni kompleks s terapevtsko učinkovino.

Po navadi so to amfipatični peptidi, ki imajo hidrofilno ter hidrofobno domeno. Mednje sodijo Pep-1 in MPG, ki s terapevtsko učinkovino tvorijo kompleks preko elektrostatskih interakcij^57,56.

Na podlagi razmerja količine hidrofilnih in hidrofobnih aminokislin, ki jih vsebuje CPP ter njihove dolžine uporabljamo še en tip klasifikacije. Glede na te lastnosti jih uvrščamo med primarne oziroma sekundarne amfipatični peptide ali ne-amfipatične peptide. Primarni amfipatični peptidi tipično vsebujejo 20 aminokislin. V njihovem zaporedju se izmenjujejo hidrofilne in hidrofobne domene^54,58. Mednje sodijo MPG, penetratin, CADY ter pVEC. Ti peptidi so toksični za celice tudi v nizkih koncentracijah⁵⁹. Za skupino sekundarnih amfipatičnih peptidov je značilno, da vsebujejo manj kot 20 aminokislin in ob interakciji s fosfolipidnim dvoslojem zavzamejo konformacijo heliksa ali beta pramena⁶⁰. Sekundarni helični CPP imajo hidrofoben del na eni strani, ter kationski, anionski ali polarni na drugi.

Amfipatični CPP, ki zavzamejo konformacijo beta pramena, pa imajo hidrofoben in hidrofilen del, ki je izpostavljen topljencu. Sem sodijo s prolini bogati CPP⁵¹. Ne-amfipatični peptidi so kratki, kot je na primer TAT in vsebujejo velik delež pozitivno nabitih aminokislin kot sta arginin ter lizin. Za učinkovit vnos v celico je potrebnih vsaj osem pozitivno nabitih nabojev⁵¹. 1.2.4 Mehanizmi vstopa CPP v celico

CPP vstopajo v celico s procesom endocitoze (aktivni transport) ali z membransko translokacjo (direktni/ pasivni ali neaktivni transport) (Slika 4). S katerim procesom peptid vstopa v celico je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti peptida, terapevtske učinkovine ter njune koncentracije. Pomembna je tudi struktura celične membrane tarčne celice. Pri fizioloških pogojih peptidi v nizkih koncentracijah vstopajo z endocitozo, pri višjih pa v celico vstopi z direktno translokacijo. Izjema pri tem pravilu je penetratin, ki pri nizkih koncentracijah v celico vstopi s translokacijo, pri visokih pa vstopi z endocitozo⁶¹. Pred procesom vstopa CPP v celico, slednji interagira s površinskimi proteoglikani preko elektrostatskih interakcij ter proteini⁵¹.

13

Zato je učinkovitost vnosa CPP v različne celične tipe, različna⁵². Zelo pomembna je tudi učinkovina, ki jo s CPP vnašamo, saj spremeni naboj kompleksa. Velja pravilo, da manjši kot je kompleks CPP-učinkovina, večja je verjetnost direktne translokacije. Pri večjih pa gre pogosteje za endocitozo. Raziskave TAT peptida so pokazale, da ne-konjugiran vstopi v celico s klatrinom posredovano endocitozo, konjugiran pa s kaveolinom posredovano endocitozo^62,63.

Slika 4: Mehanzimi vstopa CPP v sesalsko celico. Slika je narejena s pomočjo spletnega programa Biorender.

1.2.3.1 Direktna translokacija

Direktna translokacija je proces, za katerega ni potrebna energija. Proces steče v enem koraku pri čemer nastanejo začasne membranske strukture kot so obrnjeni miceli (ang. »inverted micelles«), pore ali model preproge (ang. »Carpet model«)⁵⁸. Pri direktni translokaciji pozitivno nabiti CPP interagirajo z negativno nabitimi komponentami celične membrane kot je fosfolipidni dvosloj⁵⁴. Direktna translokacija trajno ali začasno destabilizira membrano. Na ta način v celico vstopijo peptidi prisotni v visoki koncentraciji, najpogosteje pa na ta način vstopajo primarni amfipatični peptidi kot je na primer transportan.

Med direktno translokacijo pri kateri se formira pora, uvrščamo t.i. model sodčka (ang. »barrel- stave model«) ter toroidalni model (ang. »toroidal model«). Nastanek sodčka je značilen za amfipatične alfa-helikalne peptide, ki reagirajo s celično membrano ter tvorijo strukturo kanala

14

s svojimi hidrofilnimi aminokislinskimi ostanki⁶⁴. Toroidalno poro pa tvorijo peptidi, ki zavzamejo konformacijo alfa-heliksa ob stiku z membrano. Zaradi svoje interakcije z membrano jo ukrivijo in tvorijo poro⁶⁵. Model preproge (ang. »carpet model«) je še ena oblika direktne translokacije kjer se pozitivno nabiti deli CPP paralelno vežejo na kisle dele fosfolipidov celične membrane. Peptidi se tako organizirajo v obliki preproge, njihovi hidrofobni deli pa se vsadijo v lipidno regijo membrane⁶⁶. S tem mehanizmom v celico vstopajo predvsem antimikrobni peptidi kot je na primer dermaseptin.

Z arginini bogati CPP v celico vstopajo s kombinacijo direktne translokacije in endocitoze. Pri nizkih koncentracijah vstopijo s procesom endocitoze, pri visokih pa s translokacijo⁶⁷. Peptidi prisotni v visokih koncentracijah na določenih delih membrane tvorijo nukleacijsko jedro kjer pride do translokacije⁶⁸. Ključno vlogo pri CPP bogatih z arginini ima gvanidinska skupina, ki jo vsebuje omenjena aminokislina, saj interagira s sulfatnimi, fosfatnimi ali karboksilatnimi deli površine membrane⁶⁹. Najbolje raziskan peptid, ki sodi v to skupino je TAT.

1.2.3.2 Endocitoza

Endocitoza je kompleksen proces vstopa v celico, za katerega je potrebna energija. Delimo jo na fagocitozo ter pinocitozo. Prvo opravljajo specializirane celice kot so makrofagi, monociti ali neutrofilci. Pinocitoza je proces s katerim celica privzema tekočino ter topljence in se odvija v vseh celičnih tipih. Pinocitozo delimo na makropinocitozo, s klatrinom posredovano endocitozo, s kaveolinom posredovano endocitozo ter od kaveolina ter klatrina neodvisno endocitozo⁷⁰ (Slika 4). Ko so CPP prisotni v nizki koncentraciji ali konjugirani, v celico vstopijo z mehanizmom, ki potrebuje energijo. Mikropinocitoza je hiter, od lipidnih raftov odvisen ter od receptorjev neodvisen proces⁷¹. Ključni regulatorji tega procesa so kinaze in GTPaze, ki omogočajo z aktinom posredovano preoblikovanje membrane⁷². Dokazano je, da s tem procesom vstopajo konjugati s peptidom TAT⁷¹ ter z arginini bogati CPP⁷³.

Od klatrina odvisna endocitoza je najbolje opisan proces endocitoze v katerega so vpleteni tudi celični receptorji⁷⁴. Poteka v vseh celičnih tipih in je potrebna za sprejem esencialnih nutrientov. Med pomembnejše receptorje sodi tudi transferinski, ki omogoča privzem železa⁷⁰. Transferinski receptor, ki se konstitutivno internalizira, smo uporabili kot tarčo za vnos v celico. Pri endocitozi posredovani s klatrinom so ključni klatrin, adaptorski proteini ter dinamin. Prične se z invaginacijo membrane, ki se podaljša in v končni fazi odcepi od membrane, za kar je potrebna GTPaza dinamin. Temu sledi odstranjevanje klatrina in nastanek

15

zgodnjega ter poznega endosoma. Slednji pa dostavijo svoj tovor do lizosomov⁷⁵. Mesta kjer nastajajo vezikli, so bogata s fosfatidil linozitol 4,5-bifosfatom ter adapterskimi proteini, med katerimi je najpomembnejši adaptorski protein 2 (ang. »adaptor protein 2«, AP2).

S kaveolinom posredovana endocitoza je prisotna pri veliko celičnih tipih⁷⁶. Kaveole so steklenicam podobne invaginacije membrane, ki so obkrožene z domenami bogatimi s holesterolom ter sfingolipidi⁷⁰. Ker so te domene hidrofobne in posledično v drugačnem fizikalnem stanju (tekoča urejena faza) od preostanka membrane, jih poimenujemo tudi lipidni rafti^76,77. Kaveole so tesno povezane z aktinskimi filamenti, zato se ob internalizaciji reorganizira tudi citoskelet. S kaveolinom posredovana endocitoza je, tako kot s klatrinom posredovana, odvisna od GTPaze dinamina, ki je v kontakti s proteinom Cav-1, ki je odgovoren za značilno obliko kaveol. Vezava liganda povzroči reorganizacijo citoskeleta, dinamin in GTPaza pa tvorita obroč, ki omogoča odcepitev kaveola od membrane⁷⁸. Tako kot pri drugih načinih vstopa v celico, je tudi pri s kaveolinom posredovani edocitozi veliko odvisno od tovora. Na ta način vstopajo predvsem s prolini bogati peptidi, kot je na primer transportan.

Vstop v celice omogoča interakcija z glikozaminoglikani v zunajceličnem matriksu^79,80. 1.2.4 Vstop CPP v citosol

Pri vstopu v celico se kompleks CPP in učinkovine pogosto zadržita v endosomih, kar ni vedno cilj aplikacije. Poznamo več mehanizmov, s katerimi želimo doseči vstop učinkovine v citosol ali do tarčnih receptorjev. Eden izmed njih je zmožnost CPP, da poruši integriteto membrane.

Na primer pozitivno nabiti CPP-ji se vežejo na negativno nabite fosfolipide endosomske membrane, kar vodi v nastanek pore. Na ta način iz endosoma izstopi peptid TAT^81,82. Peptidi z visoko vsebnostjo arginina, pa s tvorbo ionskih parov, ki jih tvori z membrano endosoma, slednjega zapustijo⁸². Za izstop iz endosoma se pogosto uporabljajo naravno prisotni peptidi virusov, ki spremenijo integriteto membrane, kot je HA2 peptid⁸³. Na N'-terminalnem koncu ima alfa-helično strukturo, ki v kislem pH endosoma spremeni svojo konformacijo.

Konformacijska sprememba omogoči, da se vstavi v membrano endosoma, čemur sledi vstop virusa v citosol⁸⁴. V ta namen izkoriščamo tudi translokacijske lastnosti davičnega toksina⁸⁵.

16

1.3 Peptidi, ki tvorijo obvite vijačnice, kot nosilci za sestavljanje komponent cepiva Obvite vijačnice (ang. »Coiled Coils«, CC) ali CC-peptidi so strukturni motivi, ki jih lahko najdemo v mnogih fibrilarnih proteinih in transkripcijskih faktorjih ter so pogosto prisotni pri uravnavanju oblike kompleksnejših proteinskih struktur⁸⁶. S študijem proteinov, ki tvorijo obvite vijačnice smo razvili širok nabor supermolekularnih vlaken, hidrogelov ter nanostruktur^87,88. Interakcije med posameznimi enotami teh struktur lahko zelo natančno uravnavamo z aminokislinskim zaporedjem peptidov. Na interakcije lahko vplivajo tudi zunanji dejavniki, kot so prisotnost določenih ionov, temperatura, pH ter interakcija s površinami biomolekul89,90,91,92. Ravnotežje med privlačnimi in odbojnimi interakcijami, ki regulirajo zvijanje in sestavljanje obvitih vijačnic, naredi te molekule privlačne za razvoj nanostruktur za dostavo zdravil in materialov odzivnih na stimulacijo ter razvoj novih terapevtski strategij⁹³.

Možnost uporabe obvitih vijačnic za biomateriale, dostavo učinkovin, cepiva ter terapevtike lahko povečamo z ustvarjanjem fuzijskih proteinov ali pa z ustvarjanjem hibridov s sintetičnimi polimeri, proteini⁹⁴, ogljikovimi hidrati, lipidi, ter z anorganskimi nanodelci preko fizičnih interakcij ali kemijske konjugacije^95,96.

Obvite vijačnice pogosto zavzamejo heptadno ponovitev hidrofobnih (H) in polarnih (P) aminokislinskih ostankov, (HPPHPPP), pri čemer mesta v heptadi označimo s črkami a,b,c,d,e,f,g (Slika 5). Razpon velikosti obvitih vijačnice je velik, od najmanjših, ki vsebujejo 1-2 heptadni ponovitvi, do sekvenc z več kot tri tisoč aminokislinskih ostankov v proteinu gigantinu⁹⁷. Večina v bazah podatkov opisanih obvitih vijačnic ima štiri ali več heptadnih ponovitev. Ti vzorci določajo amfipatične alfa-vijačnice, ki se uredijo tako, da so hidrofobne aminokisline na mestih a in d v hidrofobni sredici alfa-vijačnice⁹⁸.

Obvita vijačnica je preprost motiv proteinske sekundarne strukture ter hkrati tudi najpogostejša oblika inter-ter intramolekularnih interakcij. Te interakcije so med polipeptidnimi verigami ali med domenami znotraj enega proteina. Alfa helikalne obvite vijačnice imajo dobro definirana pravila strukture, oligomerizacijskega stanja ter ortogonalnosti ⁹⁹. Kljub navidezno enostavni strukturi na nivoju aminokislinske sekvence pa obvite vijačnice kažejo visoko stopnjo strukturne raznolikosti. Obvite vijačnice so lahko orientirane paralelno ali antiparalelno ter imajo lahko več oligomerizacijskih stanj.

Položaj posamezne aminokisline v heptadi je pomemben. Z energijskega vidika so najpomembnejši položaji tisti, ki tvorijo hidrofobno sredico in sicer so to aminokisline na

17

položajih a in d. Najpogosteje ta mesta zasedajo alifatske hidrofobne aminokisline alanin, izolevcin, levcin, metionin ali valin in redkeje fenilalanin, triptofan ali tirozin¹⁰⁰. Mesti a in d v heptadi ne zavzemajo nujno le hidrofobne aminokisline, pogosto se uporabljata asparagin ali lizin z namenom vplivanja na dimerizacijo ali konformacijsko specifičnost na račun stabilnosti¹⁰¹.

Elektrostatske interakcije med nasprotno nabitimi aminokislinskimi ostanki na mestih e in g so drugi pomemben doprinos k stabilizaciji obvite vijačnice ter ključni za selektivnost parjenja dveh segmentov. Za lizin na mestu g ene verige in glutaminsko kislino na mestu e druge verige je pričakovana vzpostavitev ionskih interakcij v heterodimerno strukturo obvite vijačnice ¹⁰². Topljencu izpostavljene skupine na mestih b, c in f podpirajo helikalnost in omogočajo dodatno možnosti za načrtovanje lastnosti željene strukture¹⁰¹. Na mestih b in c je pogosto aminokislina alanin, ki doprinese k helikalonsti obvite vijačnice. Mesto f zaseda glutamin ali lizin, kar poveča topnost strukture. Triptofan in tirozin, ki dobro absorbirata v ultravijoličnem spektru svetlobe sta pogosto postavljena na mesto f, saj to omogoča spektroskopske meritve peptidov⁹³. Kot že omenjeno, mesti a ali d ne zavzemata nujno hidrofobne aminokisilne. Polarne aminokisline na teh mestih najdemo v več evolucijsko ohranjenih in strukturno definiranih obvitih vijačnicah. Najpogosteje prisotna polarna aminokislina na tem mestu je asparagin.

Prisotnost te aminokisline na mestu a destabilizira dimerne obvite vijačnice vendar poveča verjetnost tvorbe paralelnih dimerov¹⁰³.

Slika 5: Diagram postavitve aminokislinskih ostankov v heptadi CC-peptida.

Zaporedje sedmih aminokislin (heptadna ponovitev) je označena z abcdefg. Mesti a in d pogosto zavzemajo hidrofobne aminokisline, ki tvorijo hidrofobno sredico, mesti e in g pa nabite aminokisline. Slednje definirajo paralelno orientacijo tvorbe obvite vijačnice preko znotraj-heličnih elektrostatskih interakcij (Gradišar in Jerala, 2011).

Načrtovanje polipeptidov predstavlja možnost nastanka novih struktur, ki jih v naravi ni moč najti. Da jih lahko načrtujemo, potrebujemo dobro definirana pravila sestavljanja. De novo načrtovanje peptidov pomeni konstrukcijo popolnoma novih aminokislinskih zaporedij, ki jih

18

sestavi oblikovalec^101. Zaradi dobro definiranih lastnosti in relativno enostavne možnosti načrtovanja⁹³, so obvite vijačnice privlačne za načrtovanje ogrodja kot nosilca za cepivo (Slika 6).

Slika 6: Peptidi, ki tvorijo obvite vijačnice kot nosilci za načrtovanje neživega cepiva.

Omogočali bi združevanje različnih antigenov in adjuvansov ter služili kot ogrodje za kombiniranje različnih imunološko aktivnih molekul in načrtovanje neživih cepiv. Slika je narejena s pomočjo spletnega programa Biorender.

19

2 Namen dela in hipoteze

Raziskave v zadnjih desetletjih so opredelile temeljno vlogo prirojene imunosti v zaznavanju cepiv in programiranju zaščitnega imunskega odgovora. Postalo je jasno, da za patogene značilni molekulski motivi (PAMP) aktivirajo prirojen imunski odgovor in spodbujajo pridobljeno imunost na antigene, ki so v cepivih¹⁰⁵. Ključni problem pri razvoju novih terapevtskih učinkovin kot so cepiva, je doseči zadosten imunski odziv, ki vodi v dolgotrajno zaščito. Sočasna tarčna dostava različnih aktivatorjev imunskega sistema v isto antigen predstavitveno celico je ključna pri doseganju zadostnega imunskega odziva. Pri tem se lahko usmerimo na aktivacijo endosomalnih in citosolnih receptorjev, zato je pomembno, da načrtovane imunološko aktivne nanostrukture pridejo v stik tako z endosomalnimi kot tudi citosolnimi receptorji¹⁰⁶.

Privlačna možnost za načrtovanje ogrodja za nosilce cepiv je uporaba peptidov, ki tvorijo obvite vijačnice (CC-peptidov). Zaradi svoje modularnosti so primerni za načrtovanje novih proteinskih struktur, saj so pravila na katerih temeljijo interakcije med njimi, dobro poznana¹⁰¹. Ortogonalni pari obvitih vijačnic predstavljajo dobro platformo za načrtovanje ogrodja preko katerega bi lahko povezali različne domene. Cilj doktorskega dela je načrtovati racionalno načrtovano ogrodje iz CC-peptidov z vezanimi imunološko aktivnimi molekulami, ki bodo tarčno dostavljene v celice. Imunološko aktivne molekule bomo izbrali med aktivatorji prirojenega imunskega sistema. Tarčno dostavo načrtovanega ogrodja v izbrane celice želimo doseči s peptidi, ki se vežejo na celično membrano ali receptor.

1. Vijačna struktura peptidov, ki tvorijo obvite vijačnice, se z dodajanjem funkcionalnih domen ne bodo spremenile in jih bomo lahko uporabili pri tvorbi funcionaliziranih polipeptidnih struktur.

Iz literature je poznano, da se intrinzične lastnosti CC-peptidov, kot je tvorba obvitih vijačnic med ortogonalnimi pari, ohranijo tudi v fuziji z drugimi molekulami. Dokazana je uspešna rekonstitucija na ortogonalni par CC-peptidov vezane cepljene luciferaze¹⁰⁷. Na CC-peptide, ki tvorijo obvite vijačnice, lahko s pomočjo kemijske modifikacije vežemo različne funkcionalne domene (npr. enoverižno DNA¹⁰⁸ ali pa CC-peptide izrazimo kot fuzijo z drugim proteinom). Ortogonalni pari CC-peptidov z dodano funkcionalno domeno bodo v raztopini tvorili obvite vijačnice in na ta način povezali dve različni funkcionalni domeni.

20

2. Z vezavo različnih tarčno-ciljanih dostavnih molekul na ortogonalne pare obvitih vijačnic bomo dosegli tarčno dostavo slednjih v sesalske celice.

Z receptorji posredovano tarčno dostavo v celice že dolgo izkoriščamo, saj lahko na ta način razlikujemo med posameznimi celičnimi skupinami, ki aktivno transportirajo terapevtske učinkovine v citosol. Med najbolj znanimi receptorji, ki se uporabljajo v ta namen je transferinski receptor TfR¹⁰⁹, ki ga bomo uporabili kot tarčo za eno izmed funkcionalnih domen. Pri izbiri tarčnih dostavnih domen bomo poskušali zagotoviti tarčno dostavo načrtovanih struktur v endosome kot tudi citoplazmo celic.

3. Predpostavljamo, da bodo načrtovane nanostrukture, ki vsebujejo aktivatorje prirojene imunosti povezane preko obvith vijačnic, izboljšale aktivacijo imunskega odziva.

Za patogene značilni molekulski vzorci (PAMPs), ki aktivirajo receptorje prirojene imunosti (PRR). Z združevanjem različnih imunološko aktivnih komponent, bomo na izbrani celični liniji ugotovili, ali načrtovane nanostrukture izboljšajo imunski odziv.

21

3 Materiali in metode

3.1 Kemikalije

Preglednica 1: Kemikalije in encimi, uporabljeni v doktorskem delu

Proizvajalec Kemikalije

BioWhittaker FBS (Fetal Bovine Serum)

Epicentre T5 exonuclease

Fermentas DNA-standardi: 1 kb DNA Ladder, Gene Ruller DNA Ladder mix, nanašalni pufer za DNA elektroforezo, PageRuler™ Prestained Protein Ladder Plus, restrikcijski encimi (DpnI, HindIII,BamHI EcoRI),

Fluka SDS, DMSO

Inalco IPTG

Invitrogen DMEM + GlutaMAX^TM-I, DNA-polimeraza AccuPrime Pfx, 10-kratni AccuPrime Pfx pomnoževalni pufer, Opti-MEM I medij brez seruma (1-kratni), coelenterazine, proteinski standard SeeBlue Plus 2 PreStained Standard, ProLong® Gold Antifade Reagent

Merck Etanol, metanol, izopropanol, NaCl, ocetna kislina, bakteriološki agar New England Biolabs DNA ligaza TAq , DNA polimeraza Phusion

Quantabio RepliQa HiFi DNA polimeraza IDT (Integrated DNA

Technologies) Začetni oligonukleotidi

Sigma Začetnimoligonukleotidi

Polyplus-transfection transfekcijski reagent JetPEI in JetPRIME

Preglednica 2: Uporabljeni komercialno dostopni kompleti Proizvajalec Komplet

Thermo Scientific Thermo Scientific

Kit za izolacijo fragmentov DNA iz agaroznega gela: GeneJetPCR purification kit Extraction

Kit za izolacijo plazmidne DNA: GeneJet Plazmid Miniprep Kit