DIPLOMSKO DELO

U

L

F

DIPLOMSKO DELO

Barbara Jaklič

Ljubljana, 2021

U

L

F

Univerzitetni študijski program 1. stopnje BIOKEMIJA

Raznolikost ortobunjavirusov v komarjih v Sloveniji

DIPLOMSKO DELO

Barbara Jaklič

M

: prof. dr. Tatjana Avšič Županc

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Barbara Jaklič sem avtorica diplomskega dela z naslovom Raznolikost ortobunjavirusov v komarjih v Sloveniji.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Tatjane Avšič Županc,

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

 je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 23. 8. 2021 Podpis avtorice:

Zahvala

Hvala akad. prof. dr. Tatjani Avšič Županc za koristne nasvete in vodenje pri izvedbi diplomskega dela.

Hvala znan. sod. dr. Miši Korva za seznanitev z laboratorijskimi postopki in pomoč pri delu v laboratoriju.

Hvala tudi Samu Zakotniku, mag. biokem., za pomoč pri analizi rezultatov in nasvete pri pisanju diplomskega dela.

Hvala mojim prijateljem in najbližjim, ki so me med študijem podpirali in verjeli vame.

Raznolikost ortobunjavirusov v komarjih v Sloveniji

Povzetek: Za ortobunjaviruse je značilna preprosta zgradba virusnih delcev iz samo štirih strukturnih proteinov, njihov genom pa predstavlja tridelna negativno orientirana enoverižna DNA. Spadajo med arboviruse, kar pomeni, da jih prenašajo členonožci.

Njihovi najpogostejši prenašalci so komarji, ki so pomembni vektorji tudi drugih porajajočih se virusov v Evropi, Afriki, Ameriki in Aziji. Raziskave na komarjih, kot prenašalcih porajajočih se mikroorganizmov, so bile v preteklosti večinoma prezrte. Z izbruhom virusa čikungunja v Italiji avgusta 2007 in pojavom tigrastega komarja v Sloveniji ter hitrim širjenjem in porastom njegove populacije pa smo prišli do spoznanja, da Slovenija predstavlja eno od vstopnih točk za vektorsko prenosljive bolezni v Evropi.

Poleg virusov, ki so dokazano patogeni za ljudi, lahko komarji prenašajo tudi številne viruse z neznanim patogenetskim potencialom. Med takšne sodijo mnogi ortobunjavirusi, ki jih pogosto opisujejo kot del komarjevega viroma. Hkrati so med njimi že dokazali tudi za človeka nevarne viruse. Nekateri poznani ortobunjavirusi namreč povzročajo vročico – virus Bunyamwera (BUNV), samoomejevalno mrzlico – virus Oropouche (OROV), hemoragično mrzlico – virus Ngari ali encefalitis – virus La Crosse (LACV). Poleg tega imajo nekateri ortobunjavirusi tudi teratogene učinke, primer takšnega je virus doline Cache.

Namen diplomskega dela je bil preveriti pogostost okužbe z ortobunjavirusi v različnih vrstah komarjev, ulovljenih na 28 različnih lokacijah po Sloveniji v letih 2017, 2018 in 2019. S podrobnejšo analizo virusnega genoma smo želeli opredeliti raznolikost ortobunjavirusov v Sloveniji glede na leto, kraj in vrsto komarja. Od 1344 analiziranih vzorcev, ki so vsebovali od 1 do 40 komarjev, smo pri 153 vzorcih (11,4 odstotkov) dokazali okužbo z ortobunjavirusi. Večina skupin komarjev s prisotno okužbo je iz leta 2019, pri čemer je treba upoštevati, da je bilo vzorčenja iz leta v leto več. Z določitvijo zaporedja ohranjenih regij genomskega segmenta L in s primerjavo dobljenih nukleotidnih zaporedij z bazo podatkov GenBank smo izbrali 15 najbolj podobnih in sorodnih zaporedij. Pripadajo virusom, ki jih uvrščamo v rod Orthobunyavirus iz družine Peribunyaviridae in rodova Phasivirus ter Goukovirus iz sorodne družine Phenuiviridae.

Vsi trije rodovi so do leta 2019 pripadali družini Bunyaviridae, ki so jo zaradi pospešenega odkrivanja novih virusov razdelili v nove družine znotraj redu Bunyavirales.

Na podlagi nadaljnje filogenetskega analize nukleotidnih zaporedij smo lahko sklepali, da je v izbranem časovnem obdobju prihajalo do akumulacije točkovnih mutacij in vnosa novih virusnih vrst, saj so skupine komarjev iz let 2017 in 2018 praviloma v ločenih vejah filogenetskega drevesa. Poleg tega smo opazili tudi korelacijo med krajem vzorčenja komarjev oziroma vrsto komarjev v skupinah in raznolikostjo virusov, saj so se v filogenetskem drevesu oblikovale 4 večje skupine z zelo podobnimi zaporedji, ki so si bila dokaj enotna bodisi v kraju zbiranja bodisi po vrsti komarjev v vzorcu.

Ključne besede: ortobunjavirusi, komarji, filogenetska analiza.

Diversity of orthobunyaviruses in mosquitos in Slovenia

Abstract: Orthobunyaviruses belong to one of the four genera in the Peribunyaviridae family and have a structurally simple virion, comprising of only four proteins, and a tripartite, negative-sense, single-stranded RNA genome. As for the others arboviruses, they are transmitted by blood-feeding arthropod vectors, most commonly mosquitos. The importance of studies on mosquitos in Slovenia remained unrecognized until lately.

However, since the outbreak of Chikungunya virus in 2007 in Italy and emergence of tiger mosquito in Slovenia and its rapid spreading, our country is acknowledged as entry point for vector-borne diseases. Currently known orthobunyaviruses can have devastating effects either by causing disease symptoms in humans such as febrile illness (Bunyamwera virus), self-limited fever (Oropuche virus), haemorrhagic fever (Ngari virus) and encephalitis (La Crosse virus). Besides, there are some orthobunyaviruses known more to have a potential teratogenic effects, for instance Cache Valley virus.

The aim of this thesis was to test the frequency of orthobunyavirus infection in mosquitos, collected on 28 locations all across Slovenia during the years 2017, 2018 and 2019. We found out that out of 1344 tested groups of mosquitos 153 groups, representing 11.4%, contained orthobunyavirus-infected mosquitos. The majority of these are from 2019, when considerably more sampling was made. In addition, our purpose was to define the diversity of orthobunyaviruses, in relation to the year and place of collection or species of their arthropod host. With Sanger sequencing of conserved genomic regions in the L segment and comparison of obtained nucleotide sequences with GenBank database, we selected fifteen closely related sequences, belonging to genera Orthobunyavirus, Phasivirus and Goukovirus. All three of them used to belong to Bunyaviridae family, which was recently divided into separated families in the Bunyavirales order. Based on the phylogenetic analysis, we noticed genetic drift, because the samples from 2017 and 2018 generally formed separate clades. Furthermore, we confirmed the correlation between diversity of viruses and different sampling sites as well as different species of mosquitos, because there were four large groups visible in the phylogenetic tree, comprising of sequences obtained from mosquitos that were similar either in place of their collection or mosquito species.

Keywords: orthobunyaviruses, mosquitos, phylogenetic analysis.

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Ortobunjavirusi ... 1

1.1.1 Splošen opis ortobunjavirusov in njihova klasifikacija ... 1

1.1.2 Zgradba ortobunjavirusov ... 2

1.1.3 Organizacija genoma ortobunjavirusov ... 3

1.1.4 Replikacija ortobunjavirusov ... 5

1.1.5 Prenos ortobunjavirusov s členonožci in patogeneza v vretenčarskih gostiteljih ... 6

1.1.6 Evolucija ortobunjavirusov ... 8

1.1.7 Antigenost ortobunjavirusov ... 8

2 Namen dela in hipotezi ... 9

3 Materiali in metode ... 11

3.1 Materiali ... 11

3.1.1 Vzorci komarjev ... 11

3.1.2 Kemikalije ... 11

3.1.3 Pufri ... 12

3.1.4 Kompleti reagentov ... 12

3.1.5 Standarda velikosti DNA ... 12

3.1.6 Začetna oligonukleotida ... 13

3.2 Aparature ... 13

3.3 Izolacija RNA ... 13

3.4 Pomnoževanje izolirane RNA s RT-PCR ... 14

3.5 Agarozna gelska elektroforeza ... 16

3.6 Določanje nukleotidnih zaporedij z metodo po Sangerju ... 16

3.7 Bioinformatska analiza pridobljenih nukleotidnih zaporedij ... 17

4 Rezultati ... 19

4.1 Rezultati pomnoževanja virusne RNA z RT-PCR ... 19

4.2 Rezultati določevanja nukleotidnih zaporedij ... 21

5 Razprava ... 33 6 Zaključek ... 37 7 Literatura ... 39

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

AGE – agarozna gelska elektroforeza ang. – angleško

ak – aminokislina bp – bazni par

BUNV – virus Bunyamwera

cDNA – komplementarna DNA (ang. complementary DNA) CŽS – centralni živčni sistem

dH2O – deionizirana voda

DNA – deoksiribonukleinska kislina ddNTP – dideoksinukleotidtrifosfat dNTP – deoksinukleotidtrifosfat DMSO – dimetilsulfoksid

dsRNA – dvoverižna RNA (ang. double-stranded RNA) EDTA – etilendiamintetraocetna kislina

ER – endoplazemski retikulum

FS – polimeraza s sposobnostjo hitrega podaljševanja (ang. fast) GA – Golgijev aparat

kb – kilobazni par LACV – virus La Crosse

mRNA – informacijska RNA (ang. messenger RNA)

NSs in NSm – mali in srednji nestrukturni protein (ang. small and medium non-strucural protein)

nt – nukleotid

OBV – ortobunjavirus

ORF – odprt bralni okvir (ang. open reading frame) OROV – virus Oropouche

PCLV – virus, podoben virusu Phasi Charoen (ang. Phasi Charoen-like virus) PCR – verižna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction)

RdRp – od RNA odvisna RNA-polimeraza RNA – ribonukleinska kislina

Rnp – ribonukleoproteinski kompleks

RT – reverzna transkripcija

RT-PCR – reverzna transkripcija in verižna reakcija s polimerazo SBV – virus Schmallenberg

SFTS L – genomski segment L virusa STSF (ang. severe fever with thrombocytopenia syndrome virus)

ssRNA – enoverižna RNA (ang. single-stranded RNA) TAE – pufer, ki vsebuje Tris, acetat, EDTA

TBPVL – segment L flebovirusov, ki se prenašajo s klopi (ang. tick-borne phleboviruses) Tris – 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol

UTR – neprevajajoča se regija (ang. untranslated region)

1

1 Uvod

1.1 Ortobunjavirusi

1.1.1 Splošen opis ortobunjavirusov in njihova klasifikacija

Ortobunjavirusi (OBV) so številčen rod arbovirusov (ang. arthropod-borne viruses). Za vse arboviruse je značilno, da jih prenašajo členonožci (latinsko ime debla je Arthropoda), ki se hranijo s krvjo, hkrati pa lahko okužijo tudi vretenčarske vrste ¹. OBV so ime dobili po vasi Bunyamwera v Ugandi, kjer so leta 1943 iz komarjev Aedes spp. med raziskovanjem rumene mrzlice izolirali virus Bunyamwera (BUNV), ki je postal prvi predstavnik tega rodu ². Temu je sledilo odkritje nekaterih genetsko sorodnih virusov, ki so jih sprva uvrstili v serološko skupino Bunyamwera. Nadaljnje biokemijske in strukturne informacije o novoodkritih virusih so leta 1975 vodile k uvedbi nove družine Bunyaviridae. Družina je do nedavnega veljala za največjo in najbolj raznoliko družino RNA-virusov, sestavljalo pa jo je več kot 350 vrst, razdeljenih v 5 rodov. Od tega so predstavniki rodov Orthobunyavirus, Nairovirus in Phlebovirus spadali med arboviruse, druga dva rodova pa ne. Rod Topsovirus so sestavljali virusi, ki jih prav tako prenašajo členonožci – resarji, vendar povzročajo okužbe rastlin, predvsem paradižnika in lubenic.

V rod Hantavirus pa so spadali virusi, ki jih prenašajo glodavci ¹.

Zaradi boljših molekularnih pristopov v zadnjem času število poznanih virusov narašča, zato od leta 2019 zgoraj opisani rodovi nekdanje družine Bunyaviridae tvorijo ločene družine razreda Bunyavirales, z izjemo flebovirusov, ki so zelo obsežen rod danes najštevilčnejše družine RNA-virusov Phenuiviridae (prav tako iz razreda Bunyavirales).

OBV torej uvrščamo v družino Peribunyaviridae, ki je po velikosti druga največja in jo sestavljajo 4 rodovi. Eden od rodov je Orthobunyavirus, katerega predstavniki so vanj uvrščeni na podlagi primerjave aminokislinskega zaporedja proteina L, ki ima vlogo ima vlogo od RNA odvisne RNA-polimeraze. Različne vrste rodu imajo manj kot 96-odstotno ujemanje aminokislinskega zaporedja celotnega segmenta L . Rod združuje 88 opisanih vrst, ki so razporejene v 18 seroloških skupin ².

Najbolj poznani predstavniki OBV so zagotovo tisti, ki povzročajo bolezni pri ljudeh, na primer povzročitelji vročice – virus Bunyamwera (BUNV), samoomejevalne mrzlice – virus Oropouche (OROV), hemoragične mrzlice – virus Ngari in encefalitisa – virus La Crosse (LACV) ¹. Poleg tega imajo nekateri OBV teratogene učinke in lahko povzročijo splav ali smrt novorojene živine. Primer takšnega je virus doline Cache, ki je endemičen v Severni Ameriki ³.

Večje zanimanje za ortobunjaviruse je leta 2011 vzbudil izbruh virusa Schmallenberg (SBV) v Evropi. Omenjeni virus spada v serološko skupino Simbu ⁴ in povzroča okvare

2

centralnega živčnega sistema (CŽS) pri novorojenih prežvekovalcih. Pojav tega virusa je spodbudil razmišljanje o potencialu ortobunjavirusov za razširjanje na nove lokacije in pojav večjih epidemij ¹.

1.1.2 Zgradba ortobunjavirusov

OBV so kroglaste ali pleomorfne oblike, s premerom okrog 80−120 nm ⁵. Obdaja jih lipidna ovojnica, ki izvira iz Golgijevih membran gostiteljske celice ⁶. Lipidi ovojnice, ki predstavljajo 20–30 odstotkov teže virionov, vsebujejo fosfolipide, sterole, maščobne kisline in glikoplipide ⁷. Kužni delci OBV so zelo preprosti, saj jih sestavljajo le štirje strukturni proteini – dva površinska (Gn in Gc) ter dva notranja (protein N in portein L).

Protein L ima vlogo od RNA odvisne RNA-polimeraze (RdRp), ki se poveže z ribonukleoproteinskimi kompleksi (Rnp), sestavljenimi iz genomske RNA in nukleokapsidnih proteinov N ⁸. Za nukleoproteine je značilno, da vsebujejo skupinskospecifične antigenske determinante, medtem ko so na zunanji ovojnici iz glikoproteinov tipskospecifični antigeni ⁶.

Slika 1.1: Zgradba OBV. Shematski prikaz viriona OBV iz samo štirih strukturnih proteinov – glikoproteinov Gn in Gc, proteina L z vlogo RdRp in endonukleaze ter proteinov N, ki obdajajo vsakega od treh segmentov RNA-genoma. Virion obdaja kroglasta lipidna ovojnica z urejeno mrežo glikoproteinskih konic, ki štrlijo 18 nm od površine. Vsaka heterodimerna piramidalna konica Gn-Gc je sestavljena iz α-helikalne domene v obliki glave (27 kDa), peclja iz dveh identično zvitih tandemskih β-sendvičev (19 kDa) in podstavka iz ektodomen Gc ^{1, 8} (prirejeno po ref. 1).

Notranje komponente OBV so torej tri nukleokapside, vsaka iz enega segmenta genomske RNA, obdanega z nukleoproteini N, in polimeraze L (slika 1.1). S krioelektronsko mikroskopijo so pridobili boljši vpogled v strukturo površine kroglastega ali

3

pleomorfnega viriona, ki ima lokalno urejeno mrežo glikoproteinskih konic piramidalne oblike, ki štrlijo 18 nm iz membrane ⁹. Na površini enega viriona je približno 650 kopij glikoproteinskih konic ¹⁰. Konice sestavljajo trimeri heterodimerov Gn-Gc. S strukturnimi analizami so ugotovili, da N-končno polovico glikoproteina Gc sestavljata 2 domeni, in sicer, α-helikalna domena v obliki glave ter peceljna domena iz dveh tandemskih β-sendvičev z identičnim zvitjem. Opisane izpostavljene konice so glavna tarča nevtralizacijskih protiteles ⁸.

1.1.3 Organizacija genoma ortobunjavirusov

Genom vseh virusov iz družine Peribunyaviridae predstavlja enoverižna negativno (ali delno pozitivno) orientirana RNA (ssRNA, ang. single-stranded RNA), sestavljena iz treh segmentov (slika 1.2) ².

Slika 1.2: Organizacija ortobunjavirusnega genoma. Genom OBV predstavlja negativno orientirana enoverižna tridelna RNA. Segment L nosi zapis za RdRp. Segment M nosi zapis za glikoproteina Gc in Gn ter nestrukturni protein NSm, ki nastanejo kot poliproteinski prekurzor, ki je kotranslacijsko podvržen delovanju gostiteljskih peptidaz. Segment S nosi zapis za protein N ter druge nestrukturne proteine NSs z alternativnim, nasprotno orientiranim ORF ² (prirejeno po ref. 2).

Negativno orientiran veliki segment L (ang. large), velik 6,9 kb, nosi zapis za transkriptazo oziroma RdRp. Ta je potrebna tako za transkripcijo kot tudi replikacijo virusa. N-končna domena ima funkcijo endonukleaze, ki cepi oligonukleotide iz 5'-metilirane kape gostiteljske mRNA, ki sodelujejo pri začetku virusne transkripcije.

Proces se angleško imenuje cap snatching ¹¹.

Negativno, lahko tudi deloma pozitivno, orientiran srednji, segment M (ang.

medium), velik 4,5 kb, kodira virusna glikoproteina Gn in Gc ter nestrukturni protein NSm. Zaporedje za Gn je v segmentu navzgor od Gc, vmes pa je zapis za NSm

4

(16-18 kDa). Vsi trije proteini nastanejo kot ena poliproteinska prekurzorska molekula, ki jo gostiteljske restriktaze (signalne peptidaze in signalne peptid peptidaze ¹²) cepijo na tri ločene molekule ⁸. Proteina Gn in Gc spadata med integralne membranske glikoproteine tipa I . Pri OBV se precej razlikujeta v velikosti; Gc je štirikrat večji od Gn.

Oba sta N-glikozilirana in bogata s cisteinskimi ostanki, ki predstavljajo do 5 odstotkov celotnega števila aminokislinskih (ak) ostankov. Zaradi ohranjenosti lokacije cisteinskih ostankov se predvideva, da tvorijo inter- in intra-molekularne disulfidne vezi, ključne za pravilno proteinsko strukturo in funkcijo ¹.

Glikoproteina v ER tvorita heterodimer, ki se nato odvisno od tarčnega signala v transmembranski domeni Gn transportira v GA, kjer se združujejo komponente virusnega delca in prihaja do brstenja. Kadar se Gc izraža samostojno, se zadržuje v ER, saj Gn deluje kot šaperon za pravilen transport Gc do GA pred brstenjem virusa. Za Gc predvidevajo, da vsebuje fuzijsko domeno razreda II, ki se vstavi v membrane zgodnjih endosomov in pripomore k »slačenju« virusnega delca ¹³.

Majhni segment S (ang. small) z velikostjo 1,0 kb nosi zapis za nukleokapsidni protein N, pri večini OBV pa še dodatne manjše nestrukturne proteine NSs (10 kDa), ki sprožijo začetek imunskega odziva ¹⁴. Protein N (25-30 kDa) je glavni protein, ki nastaja v okuženih celicah, saj ščiti segmente pozitivno in negativno orientirane virusne RNA pred razgradnjo. Je zelo imunogen in izzove nastanek protiteles, ki se vežejo na komplement (ang. complement-fixing). Protein N v virusnem delcu ovija genomsko (-) in antigenomsko (+)RNA, ne pa tudi virusne mRNA, in tvori Rnp-je. Signal za ovijanje je na 5'-koncu genomske in antigenomske ssRNA ¹.

Z raziskovanjem strukture proteina N pri 4 vrstah OBV so ugotovili, da ima unikatno zvitje, ki ni prisotno v nobeni od sorodnih virusnih družin (flebovirusi, nairovirusi).

Protein N je sestavljen iz dveh glavnih domen, ki imata fleksibilne N- in C- končne roke, vmes pa pozitivno nabito režo, kamor se veže virusna RNA. Monomeri proteina N s heterolognim načinom vezave (glava-rep) tvorijo tetramer. Centralna reža vsakega monomera se poravna tako, da se ustvari RNA-vezavni žleb, ki veže RNA v konfiguraciji, podobni križu. Vezana RNA je s tem zelo zaščitena, zato mora pred vezavo RdRp priti do konformacijskih sprememb v N- in C-končni roki ter nekaterih RNA-vezavnih ostankih v žlebu ¹.

Vsi trije segmenti genoma imajo podobno organizacijo s previsnimi 3'- in 5'-neprevajajočimi se regijami (UTR, ang. untranslated region). Previsne konce sestavljata komplementarni ohranjeni zaporedji 5′-AGTAGTGT…ACACTACT-3′ ¹⁵, ki služita parjenju koncev v stabilno strukturo, podobno ročaju ponve (ang. panhandle), tako da je posamezen segment genoma nekovalentno povezan v zaprto krožno obliko. Dolžina kodirajočih regij in pripadajočih kodiranih proteinov je med različnimi vrstami precej ohranjena; večja raznolikost je opazna pri dolžini in nt zaporedju UTR. Neprevajajoče se regije so poleg funkcije promotorjev potrebne tudi kot signal za ovijanje genomske RNA

5

s proteini N, prekinitev prepisa mRNA in za pakiranje RNP v virone ¹. Dokazano je, da je delecija notranjih zaporedij UTR v BUNV privedla do utišanja virusne replikacije in izgube citopatogenega učinka v kulturi sesalskih celic ¹⁶.

V genomu bunjavirusov so odkrili tri odprte bralne okvirje (ORF, ang. open reading frame), na vsakem od segmentov L, M in S po enega. Ti trije ORF kodirajo RdRp na segmentu L, glikoproteine na segmentu M in nukleoproteine na segmentu S. Vsi poznani OBV imajo še dodaten, to je četrti, ORF na segmentu S, ki kodira nestrukturne proteine NSs ¹⁷. Zaporedje za NSs je znotraj zaporedja za nukleokapsidne proteine in se prevede iz skupne mRNA z uporabo alternativnega start kodona AUG. Proces se imenuje puščajoče skeniranje ribosomov (ang. leaky ribosomal scanning). Protein NSs je pretežno hidrofoben, njegovo ak zaporedje pa je zelo variabilno med različnimi vrstami OBV ¹. Virusi sorodnih družin brez NSs, kot je virus, podoben virusu Phasi Charoen (PCLV), nimajo poznane razvojne stopnje v vretenčarskih gostiteljih, kar je verjetno povezano prav z odsotnostjo NSs. Predvidevajo, da NSs sicer niso nujno potrebni za replikacijo, predstavljajo pa enega glavnih virulenčnih dejavnikov ¹⁷. Dokazali so, da imajo NSs pri sesalcih tudi anti-interferonsko aktivnost ¹⁸, poleg tega naj bi inhibirali sintezo RNA in zavirali imunski odziv zaradi zmanjšanega nastanka virusnih transkriptov ¹⁹. Pri nekaterih vrstah bunjavirusov so ugotovili tudi, da NSs zavirajo apopotozo, medtem ko imajo pri drugih vrstah ravno nasprotni učinek ²⁰.

Drugi pomemben virulenčni dejavnik OBV so nestrukturni proteini NSm. V raziskavah, kjer so uvedli delecije celotnega NSm, so ugotovili, da sta se znižali kužnost in verjetnost prenosa pri komarjih vrste Aedes aegypti v primerjavi z izvornim virusom ²¹. NSm je usmerjen v GA, kjer pride do brstenja virusa, zato predvidevajo, da sodeluje pri združevanju komponent virusnega delca ²².

1.1.4 Replikacija ortobunjavirusov

Prvo stopnjo okužbe predstavlja pripenjanje virusa na membrano gostiteljske celice in vključuje interakcijo med glikoproteinoma Gn in Gc ter receptorji na površini gostiteljske celice, ki so zaenkrat neznani ¹. Gc naj bi bil primarni protein za interakcijo z gostiteljsko membrano, ki ji sledi vstop virusa endocitozo, posredovano s klatrinom. Kislo okolje zgodnjih endosomov povzroči s pH inducirano vstavljanje fuzijskega proteina Gc v membrano endosomov ¹³. To olajša združevanje membran oziroma slačenje virusa in posledično sprostitev Rnp-jev v citoplazmo gostiteljske celice ²³. Takoj po sprostitvi Rnp-jev poteče primarna transkripcija (proces biosinteze oziroma eklipse), s katero se na osnovi matrične genomske (-)RNA sintetizira (+)mRNA. Samo s proteini N oviti segmenti RNA služijo kot matrica za primarno transkripcijo in replikacijo, komplementarni 5'- in 3'-konci pa predstavljajo promotorje tako za sintezo mRNA kot tudi antigenoma (pozitivno orientiranega prepisa virusnega genoma) ²⁴. Primarna transkripcija je odvisna od gostiteljskega začetnega oligonukleotida, zato ima mRNA na 5'-koncu 12-17 ali 18 nt dolgo nevirusno zaporedje, ki izvira iz gostitelja. Poleg tega je

6

nastala mRNA za nekaj 100 nt krajša od pripadajoče virusne RNA, saj se primarna transkripcija zaključi pred 3'-koncem matrične RNA ⁶. Pri OBV še niso zaznali poliA-regije na 3'-koncu mRNA, v genomu pa ne regij, bogatih z U, ki služijo kot signal za poliadenilacijo. 3'-konci virusne mRNA lahko potencialno tvorijo strukture

“pecelj-zanka”, ki naj bi bile vključene v spodbujanje translacije brez vezave ribosoma na poliA-regijo. Tudi terminacijski signali v posameznih segmentih niso univerzalno ohranjeni ¹.

Primarni transkripciji sledi translacija, za katero virus izkorišča proteine gostiteljske celice. Bunjavirusi imajo unikatno lastnost med (-)RNA-virusi; za transkripcijo je potrebna translacija v teku (ang. on-going translation) ¹. Tako kot pri vseh RNA-virusih, ki imajo negativno kodirajočo ureditev, translacija pri OBV poteka iz komplementarnega zaporedja mRNA ²⁵. Translacija proteinov N in nestrukturnih proteinov NSs na segmentu S poteka s prekrivajočih se bralnih okvirjev ⁶.

Z dostopnostjo novih genskih produktov se lahko začne virusna replikacija. Matrica za replikacijo je pozitivno orientirana RNA, ki jo imenujemo tudi antigenom in nastane iz negativno orientiranega genoma brez začetnega oligonukleotida ter je enake dolžine kot genom. Molekularne osnove preklopa med transkripcijo in replikacijo ostajajo nejasne.

Za oba procesa so potrebni samo proteini N in virusna RdRp, ki najverjetneje obstaja v več različnih oblikah. Antigenom je v celici vedno ovit s proteini N, kar preprečuje interakcije z matrico za transkripcijo in zmanjšuje možnosti nastanka dsRNA, ki bi jo lahko prepoznal imunski sistem gostiteljske celice ¹. V celicah, ki so hkrati okužene z dvema različnima OBV, lahko hčerinski virioni vsebujejo genomske segmente obeh staršev. Proces se imenuje premeščanje segmentov, nastali virioni pa imajo lahko spremenjene biološke lastnosti ²⁶.

Sekundarna transkripcija, ki je odvisna od replikacije RNA, vodi v sintezo večjih količin mRNA in virusnih proteinov. Temu sledi zorenje virusnih delcev v cisternah GA gostiteljske celice. Tam pride do združevanja virusnih komponent in brstenja virusnih delcev ²⁷. Podobno kot pri številnih virusih tudi pri OBV prihaja do težav pakiranja samo ene kopije vsakega genomskega segmenta v virion. Predvidejo, da so signali za pakiranje pri OBV prisotni le v neprevajajočih se regijah ²⁸.

Novonastali virioni se iz celice sprostijo z eksocitozo, tako da pride do zlitja veziklov in membrane gostiteljskih celic ²⁷.

1.1.5 Prenos ortobunjavirusov s členonožci in patogeneza v vretenčarskih gostiteljih OBV spadajo med arboviruse, ki jih prenašajo členonožci, ki se hranijo s krvjo.

Najpogostejši prenašalci OBV so komarji, lahko pa tudi klopi, grizoče mušice in tudi stenice ²⁹. Le redke členonožne vrste so kompetentne za prenos posameznih vrst OBV, saj je prisotna koevolucijska vektorska preferenca tudi v regijah, kjer sobiva več vrst OBV

7

in njihovih prenašalcev ¹. Kljub temu so OBV razširjeni po vseh celinah, z izjemo Antarktike ⁶.

Hematofagni členonožci, najpogosteje samice komarja, pridobijo virus z obrokom okužene krvi. Pri Aedes spp. so opazili spremembe prehranjevalnega obnašanja samic, okuženih z LACV. Okužene samice naj bi bile nagnjene k pogostejšemu hranjenju, hkrati naj bi bile bolj uspešne tudi pri parjenju. Poleg opisanega horizontalnega prenosa je možen tudi vertikalen prenos iz samice na potomce oziroma jajčeca, kar je pomemben mehanizem za prezimitev virusov ¹.

V nasprotju z običajnimi litičnimi okužbami vretenčarskih celic okužba členonožcev z OBV povzroči trajno okužbo. Celične interakcije med virusom in gostiteljem omogočajo uspešno virusno replikacijo brez poškodb vektorja ¹.

OBV se pomnožujejo v obeh gostiteljih – permisivnem členonožnem vektorju in vretenčarskem gostitelju. Zaradi načina okužbe v nobenem trenutku ni potrebe po preživetju virusa izven živega organizma. Ne poznamo pa obeh gostiteljev za vse člane rodu. Obstajajo vrste, ki nimajo permisivnega členonožnega vektorja ali pa manjka dokaz za pomnoževanje v vretenčarskih gostiteljih, kar je lahko tudi posledica pomanjkanja mikrobioloških testov in težavne izolacije virusa ⁶.

Začetek okužbe vretenčarskega gostitelja predstavlja ugriz okuženega členonožca, pri čemer se virus razširi v prečnoprogaste mišice, kjer se začne pospešena replikacija, ki povzroči visoko viremijo. Virus se nato razširi v večino organov in je zmožen tudi prečkanja krvnomožganske pregrade. Okužba centralnega živčnega sistema (CŽS) je povezana s starostjo gostitelja, mladiči so navadno za okužbo bolj dovzetni od odraslih živali. Prenos na CŽS je možen tudi prek vohalnih živcev ¹.

OBV so do sedaj izolirali iz raznolikih vretenčarskih gostiteljev, med njimi so veverice (LACV), netopirji (virus Mojuí dos Campos), zajci (virus snežnega zajca – ang. snowshoe hare virus), kopitarji (virus Akabane), lenivci (OROV) in ptice (virus Mermet) ²⁹. Inkubacijska doba OBV pri ljudeh je običajno dolga samo nekaj dni, čemur sledi nenaden pojav vročice, glavobola, bolečine v kosteh in sklepih ter velikokrat tudi pojav slabosti in izpuščajev. Večina bolnikov ozdravi brez dolgoročnih posledic, razen pri okužbah z vrstami OBV, ki povzročajo encefalitis, ali imajo teratogene učinke na zarodke nekaterih živine ¹⁴.

Tudi vretenčarski gostitelji pripomorejo k razširjanju virusa zaradi svojega načina življenja, na primer migracij. Lahko se zgodi, da se virus pojavi tudi v netipičnih gostiteljih, kjer pa ne pride do replikacije in imunskega odziva. V nekaterih gostiteljih se virus replicira samo do določene mere, ki pa ni zadostna za visoko stopnjo viremije ⁶.

8

1.1.6 Evolucija ortobunjavirusov

Čeprav je od RNA odvisna RNA-polimeraza nagnjena k napakam, veliko arbovirusov, vključno z ortobunjavirusi, ostaja precej genetsko stabilnih, predvsem zaradi zahtev po replikaciji v vretenčarskih in nevretenčarskih celicah ¹⁴. Noben OBV, izoliran na isti lokaciji, a ob različnem času, oziroma ob istem času, a na različnih lokacijah, nima popolnoma identičnih nukleotidnih zaporedij. Vendar lahko vseeno dokažemo bližnjo sorodnost tako izoliranih virusov, kar nakazuje na evolucijo z akumulacijo točkovnih mutacij ⁶. Tako imenovani genetski zdrs je razlog za zemljepisne razlike, opažene med sevi virusov ¹⁴.

Glavna gonilna sila evolucije bunjavirusov je genetski odmik, ki temelji na tridelni zgradbi genoma OBV. Pri koinfekciji vektorja z več kot enim OBV namreč lahko pride do preurejanja segmentov genoma (ang. segment reassortment) ¹⁴. Komarji so rezervoarji za takšno premeščanje segmentov med heterotipičnimi OBV s skupnimi serološkimi značilnostmi ²⁶, ki lahko privede do nastanka novih virusov s povečano patogenostjo ali z novimi možnimi vektorji in gostitelji ¹⁴. Predvidevajo, da so vsi trenutno poznani bunjavirusi posledica rekombinacije segmentov obstoječih in nekaterih izumrlih virusov ³⁰.

1.1.7 Antigenost ortobunjavirusov

Vzrok za inhibicijo hemaglutinacije in nastanek nevtralizacijskih protiteles pri okužbi z OBV sta glikoproteina Gn in Gc v štrlečih konicah na površini OBV. Nukleokapsidni proteini pa v gostiteljskem organizmu izzovejo nastanek protiteles, ki vežejo proteine komplementa ³¹. Na podlagi seroloških preizkusov, ki preverjajo navedene lastnosti, so OBV razporejeni v 18 seroloških skupin in dodatno skupino nerazvrščenih virusov ³².

9

2 Namen dela in hipotezi

Z diplomsko nalogo smo želeli ugotoviti pogostost okužbe z ortobunjavirusi v različnih vrstah komarjev, ulovljenih na različnih lokacijah po Sloveniji. Poznamo namreč več kot trideset vrst OBV, ki se prenašajo s komarji in povzročajo bolezni ljudi ter živine. Poleg tega pa obstajajo mnogi OBV, ki jih opisujejo kot del komarjevega viroma in spadajo med viruse z neznanim patogenetskim potencialom. S podrobnejšo genetsko analizo genoma smo želeli opredeliti raznolikost ortobunjavirusov v Sloveniji glede na lokacijo in čas zbiranja komarjev ter vrsto gostiteljskih komarjev.

Na podlagi prebrane literature smo postavili naslednji hipotezi:

1. Med testiranimi skupinami slovenskih komarjev bo samo pri manjšem deležu prisotna okužba z OBV.

2. Pridobljena nukleotidna zaporedja iz ohranjenih segmentov genoma OBV bodo pripadala oziroma bodo podobna različnim do sedaj odkritim in opisanim OBV.

11

3 Materiali in metode

3.1 Materiali

3.1.1 Vzorci komarjev

Izhodiščni material so bili komarji, ulovljeni v letih 2017 (179 komarjev/40 skupin), 2018 (3054 komarjev/346 skupin) in 2019 (7968 komarjev/1058 skupin) na 28 različnih lokacijah po Sloveniji. Vsak vzorec je vseboval od 1 do 40 komarjev, iz katerih smo nato izolirani RNA. Lokacije vzorčenja so prikazane na zemljevidu na sliki 3.1 ³³.

Slika 3.1: Lokacije vzorčenja komarjev v Sloveniji. Črne pike predstavljajo lokacije vzorčenja v letih 2017–2018, sive pike predstavljajo lokacije vzorčenja leta 2019.

3.1.2 Kemikalije

Pri eksperimentalnem delu smo uporabili naslednje kemikalije:

 agaroza (Invitrogen),

 EDTA (Sigma-Aldrich),

 ddH2O (Promega),

 SYBR Safe Gel Stain (1000x v DMSO) (Invitrogen) in

 Tris (Sigma-Aldrich).

12

3.1.3 Pufri

Za pripravo gela in izvedbo AGE smo uporabili 1× koncentriran pufer TAE (vsebuje 40 mM bazo Tris, 20 mM natrijev acetat, 18 mM natrijev klorid, 2,5 mM EDTA;

pH = 8,3).

3.1.4 Kompleti reagentov

Za izolacijo RNA iz homogenatov komarjev smo uporabili EZ1 Virus Mini Kit v2.0 (Qiagen).

Za RT-PCR smo uporabili komercialni komplet reagentov PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa). Za čiščenje dobljenih produktov PCR smo preizkusili kompleta reagentov ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent (Applied Biosystems) in QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen). V nadaljevanju smo se odločili za prvega, ker je njegova uporaba bolj preprosta in hitrejša, rezultati čiščenja pa so bili primerljivo uspešni kot z drugim.

Za reakcijo določanja nukleotidnih zaporedij smo uporabili komplet reagentov BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), za čiščenje produktov pa komercialni komplet reagentov BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystem).

3.1.5 Standarda velikosti DNA

Za določitev velikosti fragmentov pri AGE smo si pomagali s standardom velikosti GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Thermo Scientific) in GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific), ki sta prikazani na sliki 3.2.

Slika 3.2: Razporeditev lis standarda velikosti GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Thermo Scientific) v 1,7-odstotnem agaroznem gelu (levo) in razporeditev lis standarda velikosti GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific) v 1,7-odstotnem agaroznem gelu (desno). Prvi standard zajema velikosti od 100 do 1000 bp, drugi pa od 100 do 3000 bp. Vsak pas lis vsebuje 0,5 µg DNA ^{34, 35}.

13

3.1.6 Začetna oligonukleotida

Za izvedbo RT-PCR in reakcije za določanje nukleotidnih zaporedij smo uporabili začetna oligonukleotida, ki so jih objavili v članku Matsuno in sodelavci ³⁶, in sicer TBPVL2795F (F označuje smerni oligonukleotid, ang. forward) in TBPVL3267R (R označuje protismerni oligonukleotid, ang. reverse), ki se vežeta na ohranjene regije segmenta L v RNA flebovirusov (TBPV) ³⁶. Njuni zaporedji sta navedeni v tabeli 3.2.

Tabela 3.1: Nukleotidni zaporedji uporabljenih začetnih oligonukleotidov ³⁶. Nestandardni nukleotidi;

I: inozin, S: gvanin (G) in citozin (C), Y: pirimidin (timin in citozin).

Začetni oligonukletid Nukleotidno zaporedje (5'  3')

TBPVL2795F CAGCATGGIGGICTIAGAGAGAT

TBPVL3267R TGIAGIATSCCYTGCATCAT

3.2 Aparature

Za izolacijo RNA smo uporabili napravo BioRobot EZ1-XL Advanced (Qiagen).

RT-PCR smo izvajali v aparaturi Eppendorf Mastercycler pro (Eppendorf).

Dobljene produkte PCR smo analizirali z agarozno gelsko elektroforezo (aparatura proizvajalca Hoefer, Inc.).

Čiščenje izbranih produktov PCR, reakcijo za določanje nukleotidnih zaporedij in čiščenje produktov sekvečne reakcije smo izvajali v aparaturi Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems).

Nukleotidno zaporedje smo vzorcem določili z avtomatskim genetskim analizatorjem ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) z uporabo programskega paketa BDx Standard Sequencing Reaction (Applied Biosystem).

3.3 Izolacija RNA

Izolacijo nukleinskih kislin iz alikvotov homogentov vzorčenih skupin komarjev smo izvedli z napravo BioRobot EZ1-XL Advanced (Qiagen). Uporabili smo komplet reagentov EZ1 Virus Mini Kit v2.0 (Qiagen), ki temelji na uporabi magnetnih delcev, prevlečenih s silikagelom. Postopek izolacije sestavljajo štirje koraki: liza s proteinazo K,

14

vezava na magnetne delce (pri ustreznem pH in koncentraciji soli), spiranje in elucija (v našem primeru s 60 µL elucijskega pufra) ³⁷.

Za leto 2019 smo dobljene vzorce RNA združili v podskupine po 10 (pri zadnji samo 8), tako da smo iz 1058 vzorcev dobili 106 skupin za nadaljnji RT-PCR.

3.4 Pomnoževanje izolirane RNA s RT-PCR

Reverzna transkripcija in verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR) je različica metode PCR, s katero pomnožimo točno določen odsek tarčnega zaporedja, vendar za razliko od klasične metode PCR, kjer pomnožujemo odsek zaporedja DNA, tu izhajamo iz RNA.

Kakor klasična metoda PCR tudi ta vključuje tri osnovne stopnje, dodatni korak pa je na začetku. Pri pomnoževanju enoverižne virusne RNA je namreč potrebna reverzna transkripcija (RT) RNA v komplementarno DNA (cDNA). S tem nastane hibridna dvojna vijačnica RNA/DNA. Encim reverzna transkriptaza s svojo aktivnostjo RNAze H razgradi RNA verigo v tej vijačnici, zato se cDNA sintetizira na matrični molekuli DNA in nastane dvojna vijačnica DNA. Po začetnem koraku reverzno transkriptazo inaktiviramo s segrevanjem reakcijske mešanice. Reverzni transkripciji sledi denaturacija, kjer s kratkotrajnim segrevanjem genskega materiala dosežemo razpad dvojne vijačnice na posamezni verigi. Sledi prileganje, pri katerem z znižanjem temperature omogočimo vezavo komplementarnih začetnih oligonukleotidov na enoverižno matrično DNA. Zadnji korak je podaljševanje verige z DNA-polimerazo, ki je stabilna pri visokih temperaturah (polimeraza Taq). Opisane korake (brez reverzne transkripcije) ciklično ponavljamo, pri čemer število kopij želenega fragmenta eksponentno narašča. Po določenem številu ponovitev dosežemo mejo, ko novi produkti nehajo nastajati, zato je število ciklov omejeno in prilagojeno uporabljenim reagentom (tabela 3.2).

Za vsak vzorec smo pripravili 20 μl reakcijske mešanice, ki je vsebovala komponente, navedene v tabeli 3.3. Z uporabo para začetnih oligonukleotidov TBPVL2795F in TBPVL3267R smo iz začetne RNA dobili pomnožke, velike 514 bp. Poleg vzorcev izolirane RNA iz komarjev smo uporabili tudi pozitivno kontrolo – SFTS L in negativno kontrolo – reakcijsko mešanico brez RNA. Virus STSF je bil izbran, ker se je pri predhodni vpeljavi metode izkazal kot dobra pozitivna kontrola. Prav tako smo iz vpeljave metode vedeli, da lahko z uporabljenim protokolom RT-PCR pomnožimo različne ortobunjaviruse, tudi tiste nepatogene.

15

Tabela 3.2: Protokol spreminjanja temperature s časom za izvedbo RT-PCR

Stopnja Temperatura Čas Ponovitve

Reverzna transkripcija 50 °C 30 min.

Inaktivacija reverzne transkriptaze 94 °C 2 min.

Denaturacija 94 °C 30 s

} ^55×

Prileganje 55 °C 30 s

Podaljševanje 72 °C 30 s

Zaključno podaljševanje 72 °C 5 min.

Ohlajanje 4 °C ∞

Tabela 3.3: Koncentracije in volumni komponent reakcijske mešanice za RT-PCR. Dvakratni pufer in PrimeScript 1 step Enzyme Mix sta del kompleta reagentov PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa,).

Reagenti Začetna

koncentracija

Začetni volumen [μl]

Končna koncentracija

2× pufer 2× 10 1×

TBPVL2795F 10 μM 1 0,5 μM

TBPVL3267R 10 μM 1 0,5 μM

PrimeScript 1 step

Enzyme Mix 1

ddH2O 2

RNA (vzorec) 5

SKUPAJ 20

16

3.5 Agarozna gelska elektroforeza

Za detekcijo in analizo produktov PCR smo uporabili agarozno gelsko elektroforezo (AGE). To je metoda, s katero ločimo molekule DNA na podlagi različnih velikosti in oblik. Način delovanja temelji na zgradbi ogrodja nukleinskih kislin, v katerem so negativno nabite fosfatne skupine, zato molekule DNA v električnem polju potujejo skozi agarozni gel od negativno nabite katode proti pozitivno nabiti anodi.

Pripravili smo 2-odstotni agarozni gel v 1× pufru TAE (pufer Tris acetat EDTA), ki smo mu na koncu dodali barvilo SYBR Safe Gel Stain (Invitrogen), ki služi vizualizaciji molekul DNA v gelu pod modro ali UV svetlobo in je varnejši od interkalatorja etidijevega bromida. V dvanajst žepkov gela smo nanesli standard velikosti, 9 različnih produktov PCR ter negativno in pozitivno kontrolo. Elektroforezo smo izvajali 30 minut pri napetosti 110 V. Uspešnost reakcije oziroma pozitiven rezultat smo potrdili, če je velikost produkta PCR ustrezala velikosti pozitivne kontrole. Virusi navadno nimajo velikih delecij ali insercij, ki bi bistveno spremenile velikost pomnožka PCR, še zlasti ne v ohranjenih regijah genomskega segmenta L. Zato smo predvidevali, da bo velikost produktov PCR ortobunjavirusov ustrezala velikosti pomnožka PCR iz virusa SFTS.

3.6 Določanje nukleotidnih zaporedij z metodo po Sangerju

Določanje nukleotidega zaporedja po Sangerju je metoda z zaustavitvijo podaljševanja verige in spada v prvo generacijo metod za določanje nukleotidnih zaporedij. Temelji na sintezi verige DNA z dodajanjem deoksinukleotidov in fluorescenčno označenih specifičnih terminatorjev – dideoksinukleotidov (ddNTP), ki imajo na mestu 3' vezano -H namesto -OH skupine. V reakciji za določanje nukleotidnega zaporedja dobimo mešanico produktov vseh možnih dolžin, ki se končajo na različnih terminacijskih mestih. Ker je vsak terminator označen z drugačnim barvilom, lahko pomnožene odseke DNA avtomatizirano ločimo s kapilarno gelsko elektroforezo in z laserskim čitalcem določimo končne nukleotide glede na značilen fluorescenčni spekter.

Za vsak vzorec smo uporabili 20 μl reakcijske mešanice, ki je vsebovala komponente, navedene v tabeli 3.4. Za vse pozitivne produkte PCR smo najprej izvedli reakcijo za določanje nukleotidnega zaporedja s smernim začetnim oligonukleotidom TBPVL2795F.

Če so bila analizirana zaporedja prekratka ali neustrezna, smo reakcijo za določanje nukleotidnega zaporedja ponovili še z uporabo protismernega začetnega oligonukleotida TBPVL3267R in tako določili zaporedje druge (-) verige dvojne vijačnice. Reakcijo za določanje nukleotidnega zaporedja smo izvedli v 25 ciklih, ki so navedeni v tabeli 3.5.

17

Tabela 3.4: Primer reakcijske mešanice za reakcijo določanja nukleotidnega zaporedja. BDT in pufer sta del kompleta reagentov BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems). BDT vsebuje dNTP-je, ddNTP-je in polimerazo FS Taq ³⁸.

Reagenti Začetni

volumen [μl]

10 μM začetni

olugonukleotid 1,5

BDT 2,0

pufer 3,0

ddH2O 8,5

DNA (vzorec) 5,0

SKUPAJ 20,0

Tabela 3.5: Protokol reakcije za določanje nukleotidnega zaporedja. Navedene so stopnje, trajanje in temperature posamezne stopnje v ciklu pomnoževanja.

Stopnja Temperatura Čas Ponovitve Denaturacija 96 °C 20 s

} ^25×

Prileganje 50 °C 10 s Podaljševanje 60 °C 3 min.

Ohlajanje 4 °C ∞

3.7 Bioinformatska analiza pridobljenih nukleotidnih zaporedij

Podatke, pridobljene z metodo po Sangerju, smo računalniško obdelali s programom ApE – A plasmid Editor v2.0.61, izdanim leta 2020. Odrezali smo neberljiv začetek in konec predvidoma 514 bp dolgih nukleotidnih zaporedij. Dobljena zaporedja smo primerjali s podatki v zbirki GenBank s spletnim orodjem BLASTN.

18

Za poravnavo nukleotidnih zaporedij smo uporabili algoritem MUSCLE ³⁹ znotraj programov AliView 1.26 , izdanega leta 2014 ⁴⁰, in Jalview v2.11, izdanega leta 2009 ⁴¹. Filogenetska drevesa smo izrisali s programom IQ-TREE v1.6.12, izdanim leta 2015 ⁴², in sicer z uporabo modela Best-fit, ki ga je po metodi ModelFinder samodejno izbral program za vsa narisana drevesa. Za predstavitev filogenetskih dreves smo izbrali program FigTree v1.4.4, izdan leta 2018 ⁴³. Poleg tega smo za filogenetsko analizo (filogenetske mreže in geografski prikaz) uporabili program POPART, izdan leta 2015 ⁴⁴.

19

4 Rezultati

4.1 Rezultati pomnoževanja virusne RNA z RT-PCR

Z reverzno transkripcijo in verižno reakcijo s polimerazo (RT-PCR) smo pomnožili ohranjene regije segmenta L virusne RNA s pričakovano velikostjo 514 bp. Dobljene produkte smo nanesli na 2-odstotni agarozni gel in preverili uspešnost reakcije s primerjavo velikosti pomnožkov s pozitivno kontrolo (SFTS L) in negativno kontrolo (reakcijsko mešanico brez RNA) (slika 4.1). Pri skupinah komarjev, ki so bili okuženi z OBV, je bila na agaroznem gelu vidna lisa pri velikosti okrog 500 bp, enako kot pri pozitivni kontroli. Virus STSF v segmentu L namreč vsebuje ohranjene regije, iz katerih z RT-PCR z začetnima oligonukleotidoma TBPVL2795F in TBPVL3267R dobimo pomnožke, velike 514 bp. Lise negativnih vzorcev so se pojavljale na agaroznem gelu precej nižje, nekje pri velikosti 100 bp.

Od skupno 1344 testiranih skupin komarjev smo okužbo z OBV dokazali v 153 skupinah (11,4 %). Okužbo smo zaznali v 7 od 40 skupin vzorcev iz leta 2017, 13 od 246 skupin iz leta 2018 in 133 od 1058 skupin komarjev iz leta 2019 (vse skupine komarjev s potrjeno okužbo so navedene v prilogah v tabeli 8.1). V letu 2019 je bil skladno z večjim številom pozitivnih skupin komarjev tudi nabor vzorcev precej večji, zato smo izolirano RNA še dodatno združili v podskupine (ang. pool) po 10 izolatov RNA. Od 106 podskupin (označenih s P1/19 – P106/19) smo ortobunjaviruse dokazali v 47 podskupinah, nato smo med pozitivnimi analizirali posamezne izolate RNA. Na agaroznem gelu so lise podskupin mnogo debelejše in bolj izrazite, ker navadno združujejo več pozitivnih skupin komarjev.

20

Slika 4.1: Rezultati pomnoževanja odseka segmenta L virusnega genoma z RT-PCR z začetnima oligonukleotidoma TBPVL2795F in TBPVL3267R. Na 2-odstotnem agarozni gel smo v prvi žepek (zgoraj in spodaj) nanesli standard velikosti GeneRuler 100 bp Plus (Invitrogen), nato 9 pomnožkov iz RT-PCR ter v predzadnji žepek negativno kontrolo – reakcijsko mešanico brez RNA in v zadnjega pozitivno kontrolo – genomski segment L virusa SFTS. Na zgornjem agaroznem gelu pri prvem vzorcu z leve (Ko849/19) in na spodnjem agaroznem gelu pri tretjem vzorcu z leve (Ko506/19) je vidna lisa pri velikost okrog 500 bp, kar ustreza pričakovani velikosti produktov PCR – 514 bp. Pozicija lise se ujema tudi s pozitivno kontrolo, kjer opazimo izrazito liso pri podobni velikosti. Pri vzorcu Ko739/19 na spodnjem agaroznem gelu je prav tako vidna močnejša lisa pri isti velikosti, vendar so v tem vzorcu verjetno prisotne še nečistoče in daljši odseki DNA ali pa konkatemeri pomnožkov DNA.

21

4.2 Rezultati določevanja nukleotidnih zaporedij

Vsem dobljenim pomnožkom PCR ohranjenih regij segmenta L bunjavirusov iz 153 skupin komarjev z dokazano okužbo z OBV smo določili nukleotidno zaporedje z metodo po Sangerju s smernim začetnim oligonukleotidom (TBPVL2795F). Večina reakcij za določanje nukleotidnega zaporedja je bila uspešnih in dobili smo nukleotidna zaporedja z malo nedefiniranimi mesti. Vseeno je bilo treba pri nekaterih vzorcih reakcijo za določanje nukleotidnega zaporedja ponoviti še z uporabo protismernega začetnega oligonukleotida in s tem pridobiti zaporedje še druge (-) verige DNA. V tem primeru je bilo treba pred nadaljnjo analizo dobljeno zaporedje pretvoriti v obratno komplementarno zaporedje, ki je tako predstavljalo (+) verigo dvojne vijačnice.

Iz 153 pozitivnih skupin smo pridobili 142 nukleotidnih zaporedij, saj metoda za določevanje po Sangerju ni uspela za vsa zaporedja ali pa so bila pridobljena zaporedja prekratka za poravnavo. Na podlagi primerjave dobljenih nukleotidnih zaporedij s podatki iz zbirke GenBank smo izbrali reprezentativna zaporedja in naredili poravnavo s pomočjo algoritma MUSCLE. Izločili smo tista zaporedja, pri katerih z uporabo spletnega orodja BLASTN nismo našli podobnih nukleotidnih zaporedij (podan rezultat iskanja:

ang. No significant similarity found) ali so bila najdena zaporedja le domnevna. Poleg tega so nekatera pridobljena nukleotidna zaporedja namesto OBV pripadala genomu komarjev in bakterij ali pa niso imela znanega izvora, kar je lahko odraz nespecifičnosti začetnih oligonukleotidov.

V nadaljnjo genetsko analizo smo zato vključili 124 od 142 nukleotidnih zaporedij.

Dodali smo jim tudi odseke nukleotidnih zaporedij iz zbirke GenBank, ki so se najbolj ujemala z našimi zaporedji. Pri tem smo kot ključna kriterija upoštevali čim večjo pokritost (ang. query cover) in čim nižjo vrednost E (tabela 4.1), kar pomeni, da je bilo čim manj zadetkov najdenih samo po naključju. Vseeno smo upoštevali dejstvo, da se v izračunu E-vrednosti upošteva tudi dolžina nukleotidnega zaporedja, zato so lahko pri kratkih poravnavah E-vrednosti višje.

Glede na analizo z BLASTN je v bazi GenBank najbolj podobno našim zaporedjem zaporedje Serbia bunya-like virus 1 isolate 100284 RNA-dependent RNA polymerase gene, partial cds, pridobljeno iz komarja Culex pipiens (Sequnece ID: MT822182.1, pridobljeno 4. 5. 2021). Pri poravnavi odseka tega zaporedja in zaporedij Ko28-19, Ko200-18 in Ko500-19 smo dobili 100-odstotno pokritost in vrednost E 0 (slika 4.3).

Takšna E-vrednost pomeni, da v bazi ne obstaja nobeno nukleotidno zaporedje, ki bi se bolje ujemalo z vnesenim zaporedjem, oziroma da je to najbolj signifikanten zadetek iskanja.

22

Tabela 4.1: Najustreznejši zadetki, pridobljeni s primerjavo dobljenih nt zaporedij in z zaporedji iz baze podatkov GenBank. V tabeli so navedena imena nukleotidnih zaporedij, ki so najbolj podobna dobljenim zaporedjem. Izbrana so tista nukleotidna zaporedja, pri katerih je pokritost pri poravnavi z našimi zaporedji 98–100 % in je bila hkrati vrednost E manjša od 10^-10. Najnižja vrednost E za posamezno zaporedje je zapisana v zadnjem stolpcu.

Ime nukleotidnega zaporedja iz baze podatkov GenBank

Št. pripadajočih dobljenih zaporedij s

pokritostjo več kot 98 %

Najnižja E-vrednost med

analiziranimi zaporedji Phasi Charoen-like phasivirus strain Ab-AAF segment

L, complete sequence 10 7,00E-80

Phasi Charoen-like virus RNA-dependent RNA

polymerase gene, complete cds 10 3,00E-79

Phasi Charoen-like phasivirus strain PB-AAF-1-4

segment L, complete sequence 8 2,00E-67

Bunyaviridae environmental sample clone

sfra.cpip_contig84 RNA-dependent RNA polymerase

gene, complete cds 6 2,00E-49

Culex Bunya-like virus isolate FTA1-6 segment L,

complete sequence 6 7,00E-49

Xinzhou Mosquito Virus strain XC3-5 RNA-

dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds 4 3,00E-15

Serbia bunya-like virus 1 isolate 100284 RNA-

dependent RNA polymerase gene, partial cds 3 0,0

Culex pseudovishnui bunya-like virus 17CxNGK- Cps1 L gene for RNA-dependent RNA polymerase,

partial cds 3 6,00E-37

Atrato Gouko-like virus 1 strain Cx 1773-10 segment

L cRNA sequence 3 1,00E-33

Culex Bunya-like virus strain CBunVL/Fresno,

complete genome 2 5,00E-44

Salarivirus Mos8CM0 segment L RNA-dependent

RNA polymerase gene, partial cds 2 6,00E-24

Phasi Charoen-like phasivirus isolate C302F/2016/BR

segment L, complete sequence 1 5,00E-76

Phasi Charoen-like phasivirus strain Ab-AAM

segment L, complete sequence 1 1,00E-71

Broome phasivirus 1 isolate BPV1/pool-1 segment L

RNA-dependent RNA polymerase gene, partial cds 1 1,00E-44

Parry's Creek phasivirus 1 isolate PCPV1/pool-10 segment L RNA-dependent RNA polymerase gene,

complete cds 1 3,00E-21

23

Slika 4.3: Poravnava odseka nukleotidnega zaporedja Serbia bunya-like virus 1 isolate 100284 RNA- dependent RNA polymerase gene, partial cds in nukleotidnih zaporedij Ko200-18 ter Ko500-19. Vsa nukleotidna zaporedja so enake dolžine (430 bp) in se ujemajo v 98 % bp (422 bp). Tudi zaporedje Ko28-19 je enake dolžine, vendar se ujema z odsekom Serbia bunya-like virus 1 isolate v 96 % bp.

Na osnovi poravnave vseh zbranih nukleotidnih zaporedij smo narisali filogenetsko drevo. Opazili smo, da se v njem tvorijo večje gruče, v katerih so bile skupine komarjev bodisi ulovljene na isti lokaciji (slika 4.4) bodisi so bili komarji v skupinah večinoma iz istega rodu (slika 4.5) ali pa so bile skupine enotne v najbolj podobnih nukleotidnih zaporedjih iz baze GenBank (slika 4.6). Zaradi preglednosti smo se odločili, da največjo gručo zelo podobnih nukleotidnih zaporedij združimo v skupno zaporedje, sestavljeno iz zaporedij, med katerimi je na filogenetskem drevesu razdalja 0 (slika 4.7). Skupno nukleotidno zaporedje smo določili s programom JalView, v katerem smo 31 zaporedij iz te gruče poravnali z algoritmom MUSCLE (slika 4.8). Vsako mesto poravnave je obarvano glede na odstotek prevladujočih nt med zaporedji na tem mestu. Pod poravnavo je navedeno pripadajoče skupno nukleotidno zaporedje. Vse razen treh skupin komarjev iz te gruče so bile ulovljene na isti lokaciji (Rakitnik) in so se ujemale v vrsti komarjev v skupini (Ochlerotatus genitalicus), poleg tega je bilo veliko od teh skupin komarjev ulovljenih na isti datum, kar še dodatno pripomore k podobnosti zaporedij.

24 Slika 4.4: Filogenetsko drevo analiziranih nukleotidnih zaporedij, obarvanih glede na lokacijo vzorčenja komarjev v posameznih skupinah.

Filogenetsko drevo prikazuje 124 analiziranih nukleotidnih zaporedij, razporejenih z uporabo modela Best-fit, izbranega s funkcijo ModelFinder znotraj programa IQ-Tree. Pod filogenetskim drevesom je merilo, ki označuje dolžino medgenske razdalje med zaporedji, in kazalo barv, ki označuje, na kateri od 29 lokacij je bila ulovljena posamezna skupina komarjev.

25 Slika 4.5: Filogenetsko drevo analiziranih nukleotidnih zaporedij, obarvanih glede na vrsto komarjev v skupinah. Filogenetsko drevo zajema 124 analiziranih nukleotidnih zaporedij, razporejenih z uporabo modela Best-fit, izbranega s funkcijo ModelFinder znotraj programa IQ-Tree. Pod filogenetskim drevesom je merilo, ki predstavlja dolžino medgenske razdalje med zaporedji, in kazalo barv, s katerimi so obarvana imena skupin komarjev, iz katerih izhajajo analizirana nukleotidna zaporedja ter ponazarjajo eno od 14 vrst komarjev, ki so jih skupine vsebovale.

26

Slika 4.6: Filogenetsko drevo analiziranih nukleotidnih zaporedij, obarvanih glede na najboljši zadetek iz baze podatkov GenBank, pridobljen s spletnim orodjem BLASTN. Na filogenetskem drevesu je z uporabo modela Best-fit, izbranega s funkcijo ModelFinder znotraj programa IQ-Tree, razporejenih 124 analiziranih nukleotidnih zaporedij. Imena zaporedij so obarvana skladno z najboljšim zadetkom iz baze GenBank, navedenim v legendi. Pod filogenetskim drevesom je merilo, ki predstavlja dolžino medgenske razdalje med zaporedji.

NAJBOLJŠI ZADETEK PRIDOBLJEN Z BLASTN BARVA

27

Slika 4.7: Filogenetsko drevo gruče analiziranih nukleotidnih zaporedij, združenih v skupno nukleotidno zaporedje in obarvanih glede na vrsto komarjev. Filogenetsko drevo zajema 31 analiziranih nukleotidnih zaporedij, ki smo jih na podlagi podobnosti združili v skupno zaporedje.

Zaporedja so razporejena z modelom Best-fit, izbranim s funkcijo ModelFinder znotraj programa IQ-Tree.

Medgenska razdalja med zaporedji je skoraj 0 oziroma 10^-6. Pod filogenetskim drevesom je merilo, ki predstavlja dolžino medgenske razdalje med zaporedji. Imena zaporedij so obarvana glede na vrsto komarjev v posamezni skupini. Barve so skladne s sliko 4.5, dodana je legenda z zoženim naborom barv.

28

Slika 4

Slika 4.8: Poravnava gruče nukleotidnih zaporedij, združenih v skupno nukleotidno zaporedje. Z algoritmom MUSCLE smo v programu JalView poravnali 31 zelo podobnih nukleotidnih zaporedij iz leta 2019, za katera smo ugotovili, da vsa, razen treh, pripadajo skupinam komarjev, ulovljenih na isti lokaciji (Rakitnik). Te skupine so z izjemo treh enotne tudi v vrsti komarjev, ki so okuženi z OBV (večinoma pripadajo vrsti Ochlerotatus genitalicus). Na sliki so nt poravnanih zaporedij obarvani glede na odstotek podobnosti med zaporedji (ang. percentage identity). Najtemnejša vijolična barva pomeni, da se na določenem mestu poravnave pri več kot 80 % zaporedij pojavlja enak bazni par. Svetlejša vijolična označuje nad 60 % in najsvetlejša nad 40 %. Neobarvani so le iz poravnave štrleči konci nekaterih zaporedij.

29

Z risanjem filogenetskega drevesa smo želeli dobiti boljši vpogled v porazdelitev nukleotidnih zaporedij glede na leto zbiranja. Skupine komarjev iz let 2017 in 2018 se v primerjavi s tistimi iz leta 2019 (slika 4.9) večinoma pojavljajo v ločenih vejah ali manjših gručah. Pri tem je potrebno upoštevati, da je bilo vzorčenje v letih 2017 in 2018 v primerjavi z letom 2019 manj številčnejše.

Slika 4.9: Filogenetsko drevo analiziranih nukleotidnih zaporedij z barvno označenimi zaporedji iz skupin komarjev, zbranih v letih 2017 in 2018. Filogenetsko drevo enako kot na slikah 4.4–4.6 zajema 124 analiziranih nukleotidnih zaporedij, razporejenih z uporabo modela Best-fit, izbranega s funkcijo ModelFinder znotraj programa IQ-Tree. Posebej so označena zaporedja iz leta 2017 (zeleno) in zaporedja iz leta 2018 (rdeče). Zaradi preglednosti je 31 najbolj podobnih zaporedij združenih v skupno nukleotidno zaporedje. Ob filogenetskem drevesu je merilo, ki predstavlja dolžino medgenske razdalje.

30

Na podlagi narisanih filogenetskih dreves smo lahko sklepali, da ima zelo pomembno vlogo pri raznolikosti virusov lokacija vzorčenja komarjev, saj so bile v gruči, ki smo jo združili v skupno nukleotidno zaporedje, skoraj vse skupine komarjev z iste lokacije, in sicer Rakitnik. Poleg tega veliko drugih bližnjih lokacij spada v isto regijo, kar zaradi majhnosti Slovenije ne predstavlja velike zemljepisne oddaljenosti. Za še boljšo predstavo vpliva zemljepisne razporeditve zbiranja komarjev na vrsto virusa smo s pomočjo metode Minimum Spanning Network znotraj programa POPART pripravili filogenetsko mrežo (slika 4.10), kjer so najbolj podobna nukleotidna zaporedja združena v gruče. Velikost krogov odraža število združenih zaporedij v gruči, obarvani pa so skladno z deležem zaporedij iz posamezne slovenske regije. Največ skupin komarjev z dokazano okužbo z OBV izhaja iz Primorsko-notranjske in Obalno-kraške regije, torej JZ Slovenije, tam pa je bilo ulovljenih tudi največ komarjev. Dodaten zemljepisni prikaz na sliki 4.11 ponazarja raznolikost vrst komarjev, pri katerih smo dokazali okužbo z OBV, v odvisnosti od lokacije vzorčenja. Zaradi številčnosti lokacij precej blizu ena drugi so te združene po regijah, za vsako regijo je s tortnim diagramom prikazan delež komarjev posamezne vrste, ki so bili ulovljeni po lokacijah v tej regiji. V Osrednjeslovenski, Podravski, Savinjski in Posavski regiji je prevladovala vrsta Aedes vexans, največja raznolikost med vrstami komarjev, okuženih z OBV, je bila prisotna v JV Sloveniji in Obalno-kraški regiji.

Slika 4.10: Filogenetska mreža nukleotidnih zaporedij iz 124 analiziranih skupin komarjev. Na filogenetski mreži so analizirana nukleotidna zaporedja združena glede na podobnost v skupine, prikazane s krogi, katerih velikost odraža število zaporedij (najmanj 1 in največ 53 združenih zaporedij). Krogi so obarvani skladno z regijo, v kateri so bile ulovljene skupine komarjev. Število mutacij med skupinami nukleotidnih zaporedij je prikazano kot število prečnih črtic na povezavah med krogi.

31

Slika 4.11: Zemljepisni prikaz raznolikosti vrst komarjev, okuženih z OBV, razporejenih po slovenskih regijah glede na lokacijo vzročenja. Ob zemljevidu Slovenije z označenimi regijami so prikazani tortni diagrami, ki predstavljajo delež posamezne vrste komarjev, ki so bili ulovljeni na lokaciji znotraj določene regije in pri katerih smo dokazali prisotnost okužbe z OBV. Vrste in pripadajoči deleži so zapisani na diagramih, poleg tega je na desni strani še legenda barv, ki predstavljajo različne vrste oziroma rod komarjev.