UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO NAROVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA
Študijski program: Kemija in Biologija
SPECIACIJA V KOMPLEKSU VRSTE RJASTEGA GOZDNIKA (Hipparchia semele) NA BALKANSKEM
POLOTOKU DIPLOMSKO DELO
SPECIATION WITHIN THE SPECIES COMPLEX OF THE GRAYLING (Hipparchia semele) ON THE BALKAN
PENINSULA
GRADUATION THESIS
Mentor: dr. Rudi Verovnik
Kandidatka: Anja Kristl
LJUBLJANA, 2014
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa kemija in biologija.
Opravljeno je bilo na Katedri za zoologijo nevretenčarjev v raziskovalni skupini za speleobiologijo, Oddelka za biologijo, Biotehniške fakultete, Univerze v Ljubljani.
Komisija za dodiplomski študij Oddelka za biologijo je za mentorja diplomskega dela imenovala doc. dr. Rudija Verovnika.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: doc. dr. Cene FIŠER
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta
Član: doc. dr. Simona PREVORČNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta
Mentor: doc. dr. Rudi VEROVNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta
Datum zagovora:
Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.
Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Anja Kristl
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI)
ŠD Dn DK
KG metulji/Lepidoptera/Hipparchia semele/Hipparchia volgensis/Hipparchia senthes/morfologija moških genitali/kriptične vrste
AV KRISTL, Anja
SA VEROVNIK, Rudi (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta LI 2014
IN SPECIACIJA V KOMPLEKSU RJASTEGA GOZDNIKA (Hipparchia semele) NA BALKANSKEM POLOTOKU
TD Diplomsko delo (univerzitetni študij) OP VII, 56 str., 8 pregl., 11 sl., 56 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V diplomski nalogi smo želeli ugotoviti ali se vrste metuljev v kompleksu vrst rodu Hipparchia med seboj razlikujejo na podlagi genetskih markerjev in oblike genitalij samcev. S filogenetsko analizo smo preverili genetsko sorodnost med osebki in sicer z mitohondrijskim genom COI in jedrnim genom GADPH. Vrste v kompleksu rodu Hipparchia so si morfološko zelo podobne, razlikujejo se zgolj v anatomiji genitalij pri samcih. Samcem iz nabranih vzorcev metuljev smo odrezali zadke in po protokolu pripravili trajne preparate genitalij. Pod mikroskopom smo izmerili dolžine njihovih delov in vrednosti meritev statistično analizirali. Mitohondrijski gen COI je primeren za ločevanje H.
senthes od preostalih vrst, ne pa tudi H. semele od H. volgensis. Jedrni gen GAPDH se je izkazal za neprimernega za ugotavljanje vrstne pripadnosti.
Analiza genitalij se je izkazala za ustrezno za določanje metuljev iz rodu Hipparchia. Genitalije H. semele in H. volgensis so v splošnem zelo podobne, razlikujejo se zgolj v dolžini in širini valve. H. senthes ima, glede na ostali dve preučevani vrsti, statistično značilno krajše genitalije. Verjetno je prav različna velikost genitalij glavni vzrok za reproduktivne bariere med vrstami v kompleksu vrst H. semele.
KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)
DN Dn DC
CX butterflies/Lepidoptera/Hipparchia semele/Hipparchia volgensis/Hipparchia senthes/morphology of the male genitalia/cryptic species
AU KRISTL, Anja
AA VEROVNIK, Rudi (supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta PY 2014
TI SPECIATION WITHIN THE SPECIES COMPLEX OF THE GRAYLING (Hipparchia semele) ON THE BALKAN PENINSULA
TD Graduation thesis (University studies) NO VII, 56 p., 11tab., 11 fig., 56 ref.
LA sl AL sl/en
AB In this thesis we wanted to determine whether the butterfly species complex within the genus Hipparchia differ on the basis of genetic markers and the shape of their genital apparatus. By using the phylogenetic analysis, we checked the genetic relatedness between individuals based on mitochondrial COI gene and the nuclear gene GADPH. Species of the genus Hipparchia are morphologically very similar they differ only in the anatomy of the male genitalia. We cut the last part of the abdomen of the sampled males and prepared permanent preparations according to the protocol. Under the microscope, we measured the length of selected genital parts and analysed them. Mitochondrial COI gene was suitable for separating H. senthes from other species, but not of the H. semele from H. volgensis. The nuclear gene GAPDH is unsuitable for identification the studied species. Male genitalia analysis proved to be appropriate for determining the butterflies of the genus Hipparchia. Genitalia of the H. semele and H. volgensis are generally similar they differ only in the length and width of the valve. H. senthes has significantly smaller genitalia compared to the other two studied species. It is probable that incompatibility based on the size of genitalia is a major factor in the development of mechanisms of reproductive isolation among species in the H.
semele complex.
Kazalo vsebine
1 UVOD ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 Žuželke ... 3
2.2 Metulji - red Lepidoptera ... 4
2.3 Poddružina okarjev - Satyrinae ... 5
2.4 Rod Hipparchia ... 6
2.4.1 Hipparchia semele ... 6
2.4.2 Hipparchia volgensis ... 7
2.4.3 Hipparchia senthes ... 8
2.5 Črtne kode DNA ... 9
2.6 Kriptične vrste ... 9
2.7 Simpatrična speciacija ...10
2.8 Struktura genitalij pri samcih ...10
2.9 Vedenjske značilnosti in dvorjenje metuljev iz rodu Hipparchia ...12
3 MATERIALI IN METODE ...14
3.1 Vzorci ...14
3.2 Morfometrične analize...16
3.2.1 Maceracija zadkov, izolacija genitalij, priprava trajnih preparatov ...16
3.2.2 Merjenje genitalnih struktur ...16
3.3 Molekulske analize ...19
3.3.1 Izolacija DNA ...19
3.3.2 PCR ...21
3.3.3 Optimizacija ...21
3.3.4 Agarozna gelska elektroforeza...23
3.3.5 Čiščenje vzorcev ...25
3.3.6 Postopek izdelave filogenetskega drevesa in Bayesova analiza ...25
3.4 Statistična analiza morfoloških podatkov ...27
4 REZULTATI ...30
4.1 Morfologija genitalij samcev ...30
4.2 Filogenija ...35
5 RAZPRAVA ...39
5.1 Določitev osebkov iz rodu Hipparchia na podlagi dolžin struktur genitalij ...39
5.2 Določitev osebkov iz rodu Hipparchia na podlagi genske analize ...40
6 SKLEPI ...43
7 POVZETEK ...44 8 VIRI ...46
Kazalo preglednic
Preglednica 1: Znanstvena klasifikacija rodu Hipparchia ... 6 Preglednica 2: Kode vzorcev in seznam lokacij osebkov uporabljanih v morfometrični analizi genitalij samcev in genetski analizi metuljev iz rodu Hipparchia. Vsaka koda ima dopisano vrsto metulja. ...14 Preglednica 3: Seznam lokacij dodatnih samcev uporabljenih v mofometrični analizi genitalij metuljev iz rodu Hipparchia. Dopisane so tudi vrste metuljev. ...15 Preglednica 4: Legenda kratic osnovnih spremenljivk genitalij samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia (primerjava s sliko 8). Dolžine spremenljivk so bile uporabljene pri statistični analizi. ...27 Preglednica 5: Izračun razmerij genitalij samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia in opis
razmerij. Razmerja so bila uporabljena pri statistični analizi. ...28 Preglednica 6: Deskriptivna analiza za 13 osnovnih in 7 izvedenih spremenljivk analize genitalji samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia. Legenda kratic osnovnih spremeljivk je v preglednici 4, izvedenih spremenljivk pa v preglednici 5. ...31 Preglednica 7: Artimetična sredina 13 osnovnih in 7 izvedenih spremenljivk analize genitalij samcev metuljev iz rodu Hipparchia. Legenda kratic osnovnih spremeljivk je v preglednici 4, izvedenih spremenljivk pa v preglednici 5 ...32 Preglednica 8: F-statistika za normalno porazdeljene spremenljivke (DL, VB2, UL, UB, BL, PL, V2, P) pri samcih metuljev iz rodu Hipparchia. Legenda kratic osnovnih spremeljivk je v preglednici 4, izvedenih spremenljivk pa v preglednici 5. ...33 Preglednica 9: Kruskal Wallis-ov test za nenormalno porazdeljeno spremenljivko V1 (obliko valve) pri samcih metuljev iz rodu Hipparchia. ...33
Kazalo slik
Slika 1: Hipparchia semele ... 7 Slika 2: Hipparchia volgensis ... 8 Slika 3: Hipparchia senthes ... 9 Slika 4: Genitalije samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia z označenimi deli. Označeni uncus, tegumen, parni brachium, parna valva, phallus, vinculum in saccus. ...11 Slika 5: Skica anatomije genitalij samcev pri metuljih. Označeni so parni testis, glandulae, accessoriae, vas defferens, vesiculae seminales, ductus ejaculatorius in aedeagus. ...11 Slika 7: Genitalije samcev pri treh vrstah metuljev iz rodu Hipparchia. Po vrsti si sledijo genitalije H. volgensis, H. semele in H. senthes ...12 Slika 7: Lokacije analiziranih vzorcev vrst Hipparchia semele, H. volgensis in H. senthes na Balkanu. ...15 Slika 8: Genitalije samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia z označenimi meritvami, ki so bile uporabljene pri statistični analizi. ...18
Slika 9: Razrez vzorca rodu Hipparchia po deležu v vzorec vključenih vrst. ...30 Slika 10: Filogenetsko drevo odnosov med vrstami iz rodu Hipparchia na podlagi gena COI po Bayesovi metodi. Številke prikazujejo statistično podporo v odstotkih. Na sliki so označeni kladi s podporo višjo od 50% znotraj raziskovane skupine. Zeleno so označeni zunanjiki. ...37 Slika 11: Filogenetsko drevo odnosov vrst iz rodu Hipparchia na podlagi jedrnega gena GADPH po Bayesovi metodi. Številke na vejah prikazujejo statistično podporo v odstotkih.
Zeleno so označeni zunanjiki. ...38
1 UVOD
Poddružina okarjev (Satyrinae) spada v družino pisančkov (Nymphalidae) in obsega skoraj eno tretjino vseh evropskih vrst metuljev. Večinoma so rjavkastih barv, na krilih imajo značilne dobro izražene obročaste očesne lise, ki so namenjene preusmeritvi napada ptic in kuščarjev od vitalnih delov telesa (Tolman 2008). V poddružino okarjev spada tudi rod gozdnikov (Hipparchia) znotraj katerega so si vrste po krilnih vzorcih zelo podobne, zato je njihovo določevanje na podlagi morfoloških značilnosti težavno.
Pri diplomski nalogi smo se osredotočili na taksonomsko identifikacijo vrst Hipparchia semele (Linnaeus, 1758), Hipparchia volgensis (Mazochin-Porshnjakov, 1952) in Hipparchia senthes (Fruhstorfer, 1908) z molekularno-genetskimi metodami. Za primerjavo vzorcev smo uporabili standardne kratke sekvence DNA prve podenote oksidaznega mitohondrijskega gena (t.i. črtne kode DNA). Identifikacija vzorcev s sistemom črtnih kod temelji na dejstvu, da se v genskem materialu dveh vrst, četudi sta si morfološko zelo podobni, nahaja dovolj razlik, da ju je mogoče taksonomsko razlikovati (Fišer Pečnikar in Verljen Bužan 2011). Črtne kode so v zadnjem času povzročile revolucijo na področju taksonomije, saj je bilo odkritih mnogo novih vrst, ki morfološko niso bile prepoznane (t.i. kriptičnih vrst).
Kljub temu, da danes dobimo mnogo več informacij z molekularnimi analizami v primerjavi z morfološkimi, ne gre zanemariti vrednosti opisnih podatkov. Daly (1985) ugotavlja, da kombiniranje molekularnih in morfoloških podatkov daje zanesljivejšo razlago taksonomskih odnosov med taksoni. Vrste metuljev iz rodu Hipparchia se razlikujejo glede na anatomijo moških genitalij (različne velikosti posameznih delov), zato je njihova analiza pri določanju vrste ključnega pomena. Razlike v obliki in velikosti genitalij so ključne za vzpostavitev reproduktivne bariere med vrstami, zato pričakujemo, da med njimi ni genskega pretoka.
Delovne hipoteze:
- Izhodiščna hipoteza: Vrste iz kompleksa vrst Hipparchia semele se med seboj razlikujejo po genetskih markerjih.
- Hipoteza 1: Morfološke razlike pri genitalijah samcev pri vrstah iz komleksa Hipparchia semele domnevno prispevajo k omejenemu genskemu pretoku.
- Hipoteza 2: Zaradi omenjenih razlik v genitalijah se sorodne vrste iz rodu Hipparchia lahko pojavljajo simpatrično.
2 PREGLED OBJAV
2.1 Žuželke
Žuželke so najbolj številčna in razširjena vrsta živali. Človeku poznanih je skoraj 1.200.000 vrst (Milevoj 2007), kar je 70% vseh do sedaj opisanih vrst. Ocene o številu vrst so zelo različne. Nekateri avtorji navajajo, da jih na svetu obstaja okoli dva milijona (Nielsen in Mound 2000), drugi dvigajo število vrst na pet do šest milijonov (Raven in Yeates 2007). Filogenetski izvor žuželk sega v obdobje kambrija, to je približno 500 milijonov let nazaj. Iz tega obdobja izvirajo fosilni ostanki zgodnjih predstavnikov trilobitov, ki bi naj bili sorodniki poznejših žuželk. Fosili, ki zagotovo pripadajo žuželkam, spadajo v obdobje karbona, kar je približno 250 milijonov let v preteklost. Fosilni ostanki pričajo, da so bile žuželke iz tega obdobja presenetljivo visoko razvite, z dobro razvitimi krili (Jurc 2005).
Žuželke (Insecta) uvrščamo v kraljestvo živali (Animalia), v deblo členonožcev (Arthropoda) in naprej v poddeblo šesteronožcev (Hexapoda), znotraj katerega tvorijo razred žuželk (Insecta) in podrazred krilatih žuželk (Pterygota). Razred žuželk se razčlenjuje na mnogo redov, eden izmed njih je tudi red metuljev (Lepidoptera).
Telo žuželk je razdeljeno na tri telesne regije: glavo, oprsje in zadek. Telesu daje oporo trden zunanji skelet iz kompleksnih ogljikovih polisaharidov – hitina, ki ga v času rasti nekajkrat levijo. Na glavi imajo žuželke par členjenih tipalnic (anten), s katerimi tipajo, vohajo in okušajo. Obustni aparat sestavljata po par maksil in mandibul in neparna spodnja ustna, ki omogočajo sprejemanje hrane, grizenje in žvečenje. Poleg tipalnic in ustnih okončin imajo žuželke na glavi enostavne ocele in še par velikih sestavljenih ali fasetnih oči, sestavljenih iz množice majhnih očesc (omatidijev). Vsak omatidij ima svojo lečo in lastne svetlobne čutnice (Klots in Klots 1970). Očesi sta nameščeni ob straneh glave, ob tipalkah. Pri nočnih žuželkah so oči navadno večje. Na oprsju imajo tri pare členjenih nog, večina žuželk ima tudi dva para kril, ki pa niso okončine. Prepredena so z žilami, ki so oporna struktura kril. V zadku najdemo večino notranjih organov. Sestavljen je iz 9 do 11 členov, na vsakem je par dihalnih odprtin (stigem). Gonopori ali spolne odprtine so pri samicah ponavadi na 8. členu, pri samcih pa na 9. členu. Nekatere žuželčje samice imajo leglico ali ovipozitor, ki služi odlaganju jajčec (Jurc 2005). Žuželka gre v svojem življenju skozi
več razvojnih faz, ki se med seboj popolnoma razlikujejo. Ta pojav imenujemo preobrazba ali metamorfoza (Klots in Klots 1970).
2.2 Metulji - red Lepidoptera
Metulji so s približno 136.500 vrstami eden največjih redov žuželk. Uvrščamo jih v 126 družin (Capinera 2008). Znanstveno ime »Lepidoptera« izhaja iz grščine in pomeni »luskokrilci«. Ena izmed glavnih značilnosti metuljev sta namreč dva para velikih opnastih kril prekrita z dlačicami in luskami (Miller in Miller 2004). Poseljujejo skoraj vse svetovne kopnine, izjema je le Antarktika. Najdemo jih v puščavah, tropskih pragozdovih, na otokih in nadmorski višini do 5000 m (Verovnik 2003).
Metulji imajo popolno preobrazbo (holometabolijo), ki zajema štiri razvojne stopnje:
jajčece (ovum), ličinko (gosenica), bubo (chrysalis) in odrasel osebek (imago).
Samice odlagajo oplojena jajčeca posamično ali v skupinah na točno določene vrste in dele rastlin, ki bodo kasneje hrana gosenicam. Nekatere vrste metuljev jajčeca odmetavajo med letenjem. Gosenice se izležejo iz jajčec po enem ali dveh tednih, njihova glavna naloga je prehranjevanje, prebavljanje in hitra rast med levitvami.
Gosenice so v splošnem enostavne in so skoraj brez izjeme rastlinojede. Ko gosenica zraste do primerne velikosti, se zabubi. Buba je bolj ali manj mirujoč stadij, ki navadno traja dva do tri tedne, v izjemnih primerih pa tudi več mesecev ali let. Ko se preobrazba konča, hitinasta opna bube poči in iz nje prileze odrasel metulj.
Razmnoževanje metuljev je kompleksen proces, sestavljen iz zapletenih vedenjskih vzorcev, svatovanja, dvorjenja in parjenja. Samice in samci komunicirajo s pomočjo feromonov, barvnih vzorcev kril, trepetanja s krili in otipavanja s tipalnicami.
Kopulacija traja od nekaj minut do nekaj ur. Zimo metulji preživijo v stadiju jajčeca, gosenice ali bube. Odrasli metulji živijo lahko od nekaj dni, ali tednov do skoraj pol leta (Polak 2009).
Telo in krila metuljev prekrivajo luske iz hitinastih ploščic. Na glavi imajo enostavne ocele in par velikih polkroglastih sestavljenih ali fasetnih oči, sestavljenih iz nekaj tisoč omatidijev. Metulju omogočajo razlikovanje barv in obrisov. Tipalnice se od vrste do vrste razlikujejo po obliki in so značilne za posamezne družine. Pri dnevnih metuljih so tipalnice dolge mnogočlenske in betičaste, pri nočnih pa oblika variira od enostavne nitaste do peresaste oblike. Tipalnice so vohalni organ, služijo tudi za
komunikacijo med samci in samicami. Ustni deli so sestavljeni iz dolgega rilčka ali sesala, s katerim sesajo medičino ali drugo tekočo hrano v ustno votlino. Kadar rilčka ne uporabljajo, ga spiralasto zvijejo pod spodnji del glave. Pri nekaterih nočnih metuljih je rilček pokrnel (Dierl 2000). Oprsje je zgrajeno iz treh segmentov: predprsja (protoraksa), medprsja (mezotoraksa) in zaprsja (metatoraksa). Vsak segment nosi par nepopolno členjenih nog. Na medprsju in zaprsju so pritrjena opnasta krila, strehasto prekrita z luskami, ki vsebujejo pigment. Mozaik teh lusk tvori barvni vzorec, ki je značilen za vsako vrsto posebej. Zadek je sestavljen iz 10 segmentov, zadnji trije so močno spremenjeni in tvorijo zunanji genitalni aparat. Moški spolni organ tvori valvo, posebno strukturo, ki je namenjena boljšemu oprijemu samice med kopulacijo. Na osmem členu zadka pri samicah je leglica, namenjena odlaganju jajčec (Daccordi s sod. 1988).
2.3 Poddružina okarjev - Satyrinae
Poddružina okarjev je razširjena po vsem svetu, obsega približno 2400 vrst.
Predstavnike najdemo v Aziji, Južni in Severni Ameriki in Evropi. Večinoma poseljujejo vlažne travnike, gozdove, predalpski in alpski svet. Najraje se zadržujejo v senčnih in vlažnih območjih. Nekateri predstavniki poseljujejo arktične predele severne poloble. So del družine Nymphalidae, za katero je značilna redukcija prvega para nog, ki jih ne uporabljajo pri hoji. Večinoma so srednje veliki (razpon kril 4–6 cm), svetlo ali temno rjave barve. Na krilih imajo nekaj večjih ali manjših pegic v obliki očesc, ki so navadno največja in najbolj izrazita pri koncih sprednjih kril. Letajo blizu tal ali med podrastjo v gozdu. Niso dobri letalci, njihovo frfotanje je slabotno in na videz nezanesljivo. V primeru nevarnosti se skrijejo, pri čemer jim pomaga njihova varovalna barva. Slušni organi, če so prisotni, ležijo na korenu kril (Polak 2009).
Gosenice okarjev živijo na različnih vrstah trav. Njihova barva je zelena ali rjava, telo je brez dlačic. Zadek se končuje s parom ostrih konic. Zabubijo se na zemlji ali v njej, nekatere tvorijo zapredkom podobne strukture. Razvoj okarjev je povečini zelo počasen, še posebej pri vrstah, ki živijo v visokogorju. Metulji ostanejo na stopnji gosenice tudi do dveh let (Klots in Klots 1970).
2.4 Rod Hipparchia
V poddružino okarjev (Satyrinae) spada veliko število vrstin tudi vrste rodu Hipparchia (preglednica 1), ki je zagotovo eden kompleksnejših rodov znotraj poddružine . Razširjen je po vsej Evropi, severni Afriki, Turčiji in do Turkmenistana v centralni Aziji. Številne vrste so otoški endemiti Mediteranskih otokov. Nekatere vrste poseljujejo otoke v Atlantskem oceanu (Cerasoni 1993).
Preglednica 1: Znanstvena klasifikacija rodu Hipparchia
Prepoznava vrst in podvrst metuljev tega rodu je še dandanes težavna. Kudrna (1984) je glede na morfometrične študije prepoznal 24 vrst ali dobro definiranih podvrst v tem rodu. Vrste Hipparchia semele, H. senthes in H. volgensis so ozkosorodne kriptične vrste, zato je njihovo določanje na podlagi morfoloških znakov, kot so barva in barvni vzorec kril ter pigmentacija telesa, precej nezanesljivo.
Uporabnejši in manj raznoliki so anatomski znaki povezani z genitalijami samcev in samic (Cuotsis 1984).
2.4.1 Hipparchia semele
Hipparchia semele (Linnaeus, 1758) ali rjasti gozdnik (slika 1) poseljuje skoraj celo Evropo. V Skandinaviji, Baltskih državah, Britaniji in na Irskem naseljuje predvsem obalna območja. Vrsta je odsotna v zahodnem delu Francije, v večjem delu Grčije, Bolgarije in na južnih sredozemskih otokih, razen Sicilije. Živi od morske gladine do 2000 m nadmorske višine. Je endemična evropska vrsta (http://www.iucnredlist.org/details/173254/0).
Kraljestvo Živali (Animalia)
Deblo Členonožci (Antrophoda) Razred Žuželke (Insecta)
Red Metulji (Lepidoptera)
Družina Pisančki (Nymphalidae) Poddružina Okarji (Satrydae)
Rod Gozdniki (Hipparchia)
Živi na suhih apnenčastih traviščih in stepah, suhih silikatnih traviščih, v gozdovih iglavcev in listopadnih gozdovih, na peščenih plažah in sipinah ter na celinskih klifih (http://www.iucnredlist.org/details/173254/0).
H. semele ima samo eno generacijo na leto. Jajčeca izlegajo od julija do septembra na točno določene hranilne rastline iz družine trav, ponavadi na Festuca spp., Agrostis spp. in Bromus spp. Jajčeca so sprva bele barve, po dveh ali treh tednih se obarvajo bledo rumeno. Gosenica raste zelo počasi, hrani se večinoma ponoči.
Intenzivno se hrani do sredine poletja, nato se zabubi na določeni hranilni rastlini.
Buba tvori kokonu podobno strukturo, ki ji omogoči preživetje v tleh od dveh do treh tednov (http://www.iucnredlist.org/details/173254/0).
Vrsta je omejena na neonesnažene in specifične habitate. V zadnjih nekaj letih se je v Avstriji, Belgiji, Sloveniji in na Nizozemskem populacija zmanjšala za več kot 30%, v Belgiji, Nemčiji, Latviji in na Madžarskem pa za 6–30%. Čeprav vrsta kaže upad populacije v okviru evropskega območja, ne sodi med ogrožene vrste (http://www.iucnredlist.org/details/173254/1).
Slika 1: Hipparchia semele
(vir: http://en.wikipedia.org/wiki/Grayling_(butterfly)#mediaviewer/File:Hipparchia_semele- 03_(xndr).jpg)
2.4.2 Hipparchia volgensis
Hipparchia volgensis (Mazochin-Porshjakov, 1952) (slika 2) poseljuje jug Rusije in Balkana. Najdemo jo v Srbiji, Makedoniji, Bolgariji, Romuniji, Turčiji in na severu
Grčije. Živi na nadmorski višini od 600 do 1500 m, včasih tudi do 2500 m. Je endemična evropska vrsta (http://www.iucnredlist.org/details/173233/0).
Življenjski prostor H. volgensis so suha silikatna travišča, listnati gozdovi, mešani gozdovi, celinske pečine in skalnata območja. Odrasli metulji letajo od junija do konca avgusta (http://www.iucnredlist.org/details/173233/0).
Ima eno generacijo na leto. Gosenice se hranijo z rastlinami iz družine trav, natančneje z vrstami iz naddružine Gramineae ali prave trave (http://www.iucnredlist.org/details/173233/0).
Slika 2: Hipparchia volgensis
(vir: http://www.lepidoptera.eu/show.php?ID=6567)
2.4.3 Hipparchia senthes
Hipparchia senthes (Fruhstorfer, 1908) (slika 3) živi predvsem v južnem delu Balkana. Poseljuje Makedonijo, Albanijo, Grčijo in Turčijo. Nadmorska višina, na kateri se pojavlja, je do 2000 m. Habitati, ki jih poseljuje, so suhi in topli. Živi v grmičevju, na sončnih skalnatih pobočjih in gozdnih površinah, kjer rastejo hrasti (http://www.iucnredlist.org/details/173254/0).
Ima eno generacijo na leto. Odrasli metulji letajo od junija do avgusta. Gosenice se hranijo s hranilnimi rastlinami iz družine trav (Poaceae) (http://www.butterfliesofbulgaria.com/hipsen.html).
Slika 3: Hipparchia senthes
(vir: http://www.lepiforum.de/lepiwiki.pl?Hipparchia_Senthes)
2.5 Črtne kode DNA
Zaradi napredka v sekvenciranju in računalniških tehnologijah, so sekvence DNA postale glavni vir informacij, ki poglabljajo razumevanje evolucije in populacijske genetike. Študije na molekularni ravni obravnavajo sorodstvene vezi globljih genotipskih skupin in razlike znotraj populacij posamezne vrste.Te študije so omogočile odkrivanje številnih kriptičnih vrst. Črtne kode DNA temeljijo na kratkih standardiziranih sekvencah, s katerimi je mogoče razlikovati posamezne vrste na osnovi genetskih variacij (Valentini s sod. 2008).
Določitev vrst z metodo črtnih kod se začne s pridobitvijo kratke sekvence DNA (barcode) iz standardnega dela genoma, to je iz specifične genske regije. Vzorec identificiramo na podlagi primerjave z že znanimi sorodnimi vzorci (Hajibabaei s sod.
2007). Pri živalih in nekaterih drugih evkariontih temelji sistem črtnih kod na 648 baznih parov dolgi prvi podenoti mitohondrijskega gena za citokrom c oksidazo (COI). Za identifikacijo s črtnimi kodami je mitohondrijski genom primernejši od jedrnega, saj je manj izpostavljen rekombinaciji in je haploiden, kar omogoča enostavnejšo analizo nukleotidnih zaporedij (Fišer Pečnikar in Verljen Bužan 2011).
2.6 Kriptične vrste
V literaturi najdemo mnogo različnih definicij kriptičnih vrst. Številni avtorji enačijo kriptične vrste s pojmom sorodne vrste (Saez 2005), drugi jih opredeljujejo kot sestrske vrste s skupnim prednikom (Knowlton 1986). Stebbins (1950) meni, da sta dve ali več vrst kriptičnih takrat, kadar sta ali so klasificirane kot ena nominalna vrsta,
ker se morfološko med seboj skoraj ne razlikujejo. Nekateri avtorji k tej definiciji dodajo, da so kriptične vrste tudi tiste, ki so nedavno divergirale in se ločijo med seboj le na nivoju genov, kar je lahko posledica alopatrične evolucije, ki vodi v reproduktivno izolacijo (Stebbins 1950).
2.7 Simpatrična speciacija
O simpatrični speciaciji govorimo takrat, ko dve vrsti nastaneta v istem prostoru.
Simpatrična speciacija med vrstami je redka, saj je na začetku procesa speciacije med nastajajočimi vrstami še pretok genov, ki preprečuje nastanek vrst (Berluenga s sod. 2006).
H. semele in H. volgensis se simpatrično zagotovo pojavljata v nekaterih delih Bolgarije (Abadijev 1993), v Makedoniji (Shaider in Jakšić 1989) in zelo verjetno tudi na območju Albanije. H. semele in H. senthes se na območju Balkana simpatrično pojavljata v Albaniji, Makedoniji, južni Bolgariji in na grških otokih (Egejskih otokih) (Kudrna 1977). H. senthes je s H. volgensis simpatrična predvsem v severnem delu Grčije (Cuotsis 1984).
2.8 Struktura genitalij pri samcih
Genitalne strukture samcev in samic so pomembni taksonomsk znak, še posebej v primeru sorodnih vrst ali kadar so ostali morfološki znaki domala identični (Gomboc 1993).
Genitalije metuljevih samcev sestavljajo (slika 4): tegumen, uncus, saccus, valva, brachium, phallus in vinculum (Higgins 1975). Parna testisa (testes) se s parnimi semenovodi (vasa defferentia) spajata v neparni semenovod (ductus ejaculatorius), ta pa se naprej navezuje na kopulacijski organ (phallus = aedeagus) (slika 5). Na bazo kopulacijskega organa se navezujeta semenska mešička (vesiculae seminales) in ekskretorni žlezi (glandulae accessoriae). Semenčice nastajajo v testisih (Jurc 2005).
Slika 4: Genitalije samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia z označenimi deli. Označeni uncus, tegumen, parni brachium, parna valva, phallus, vinculum in saccus.
(vir: lasten)
Slika 5: Skica anatomije genitalij samcev pri metuljih. Označeni so parni testis, glandulae, accessoriae, vas defferens, vesiculae seminales, ductus ejaculatorius in aedeagus.
(vir: www.cronodon.com/BioTech/Insect_Reproduction.html)
Genitalije H. semele po velikosti zelo variirajo. Populacije, ki živijo južneje, imajo večje genitalije od severnejših. Kljub razlikam v velikosti, pa so razmerja med posameznimi genitalninimi strukturami ustaljena. Edina izjema je populacija iz Škotske, ki ima disproporcionalno kratek brachium. Genitalije vrste H. volgensis in H.
semele se po morfologiji in dolžinah zelo malo razlikujejo. Največja razlika je v obliki in velikosti valve. Pri H. semele je valva trikotne oblike in zelo izrazita, medtem ko je pri H. volgensis manj izrazita (Wakeham-Dawson s sod. 2004. H. senthes se od obeh ostalih vrst razlikuje po velikosti (so manjši metulji) in morfologiji genitalij (Coutsis 1984).
H. volgensis H. semele H. senthes
Slika 6: Genitalije samcev pri treh vrstah metuljev iz rodu Hipparchia. Po vrsti si sledijo genitalije H. volgensis, H. semele in H. senthes
(vir:Jakšić 1998;85)
2.9 Vedenjske značilnosti in dvorjenje metuljev iz rodu Hipparchia
Vedenjski vzorci določene vrste so lahko bistveni za razvoj reproduktivne izolacije (Mayr 1963). Obstaja mnogo oblik vedenjskih vzorcev, vendar je dvorjenje tisto, ki zelo učinkovito ločuje populacije. Rituali dvorjenja imajo pomembno vlogo pri intraspecifični spolni selekciji (Andersson 1994) in prepoznavanju vrst (Wyatt 2003).
Zaradi razlik v spolnem vedenju in vseh lastnostih, ki so povezane s tem (vizualni vzorci, oddajanje vonjav in feromonov, premikanje kril in telesa med dvorjenjem, drža med parjenjem), lahko pride do spolne inkompatibilnosti in nezmožnosti parjenja, ko aktivni posamezniki iz različnih populacij naletijo drug na drugega (Maksymovitch in
Verrell 1993). Taktika dvorjenja se lahko pri določenih metuljih s starostjo spreminja (Scott 1972).
Metulji iz rodu Hipparchia imajo kompleksno zgrajene genitalije, ki že mehanično onemogočajo kopulacijo med različnimi vrstami. Samci imajo dve glavni strategiji za lociranje samic: »prežečo strategijo«, kjer se samec ustali na določeni lokaciji in čaka, da mimo prileti samica in »patruljno strategijo«, kjer samci v letu iščejo samice (Scott 1972; Rutowski 1991). Samci imajo dišavne žleze nameščene med krili ali razpršene po membrani kril (Minzori 2008).
Tinbergen (1941) je opisal stereotipno dvorjenje H. semele, kjer samci dvorijo samici s svojimi vizualnimi vzorci in hlapnimi kemijskimi signalnimi substancami. H. statilinus ima podobno tehniko dvorjenja (Minzari 2008). Samci po navadi letajo in preganjajo druge samce ali samice. Samice nikoli ne letajo za samci. Ko se samica odzove na pobudo samca, še nekaj metrov letata skupaj, da si samica ogleda njegova krila, nato se ustalita na varnem območju in ostaneta negibna. Čez nekaj časa samec začne dvoriti samici v pričakovanju, da pride do kopulacije. Samec postavi antene samice med svoj prvi par kril (»bowing«). Samica je tako v neposrednem stiku z njegovimi feromoni. Samice lahko nato začnejo prhutati s krili ali pa jih odprejo in s tem odženejo samce. Tudi če krila postavijo v nizko pozicijo in dvignejo konico zadka, samcu preprečijo, da bi se jim lahko približal. Po nekaj zavrnitvah, samica dovoli samcu, da se ji približa in pride do kopulacije (Pinzari 2012).
3 MATERIALI IN METODE
3.1 Vzorci
Analizirali smo metulje iz različnih lokacij, pretežno z Balkanskega polotoka, ki jih nismo sami ulovili (preglednica 2, slika 7). Metulji so bili ulovljeni poleti, v različnih letih. Preliminarno določitev osebkov so opravili že na terenu. Genetsko in morfološko smo raziskali samce, dve samici smo uporabili samo v genetski raziskavi.
Preglednica 2: Kode vzorcev in seznam lokacij osebkov uporabljanih v morfometrični analizi genitalij samcev in genetski analizi metuljev iz rodu Hipparchia. Vsaka koda ima dopisano
vrsto metulja.
vzorec lokacija vrsta
LA30 Stara Planina, Dojkinci, Ponor, Srbija (leg. Popović) H. cf. semele muelleri LA31 Stara Planina, Temska-Rudinje, Srbija (leg. Popović) H. cf. semele muelleri LA32 Stara Planina, Gornji Krivodol, Srbija (leg. Popović) H. volgensis
LA33 Kozjak, Makedonija (leg. Radevski) H. volgensis
LA34 Preševo, Makedonija, Suva Reka (leg. Milan Đurić) H. volgensis LA40 Prilep, Tumbij, Makedonija (leg. Verovnik) H. senthes LA41 Erseke Rehove, Gramos, Albanija (leg. Verovnik) H. senthes LA42 Dievoll Gorge, Korce Maliq, Albanija (leg. Verovnik) H. senthes
LA43 M. Mare Okolis, Romunija (leg.?) H. semele muelleri
LA44 Sgourades, Krf, Grčija (leg. Beretta) H. cf. semele LA45 Pantokrator, Krf, Grčija (leg. Beretta) H. volgensis LA46 Soteska S od Gornji Krivodol, Srbija (leg. Verovnik) H. volgensis LA47 Suva Planina, Makedonija (leg. Verovnik) H. volgensis LA48 Suva Planina, Makedonija (leg. Verovnik) H. volgensis LA49 Belovodica, Prilep, Makedonija (leg. Verovnik) H. senthes
LA70 Gacko, BiH (leg. Verovnik) H. semele
LA71 Borilovići, BiH (leg. Verovnik) H. semele
LA72 Poshtime, Albanija (leg. Verovnik) H. senthes
LA73 Granitis, Grčija(leg. Verovnik) H. cf. senthes
LA74 Siatista, Grčija (leg. Verovnik) H. volgensis
Poleg vzorcev, ki so navedeni v zgornji preglednici, smo pri statistični obdelavi podatkov uporabili še štiri samce, katerih trajni preparati so bili že pripravljeni (preglednica 3).
Preglednica 3: Seznam lokacij dodatnih samcev uporabljenih v mofometrični analizi genitalij metuljev iz rodu Hipparchia. Dopisane so tudi vrste metuljev.
vzorec lokacija, legitimacija, datum vrsta
1 Valun, Bres, Hrvaška, (leg. Berreta), 2.7.2007 H. semele 2 Velebit, Oltare, Hrvaška, (leg. Berreta), 24.7.2007 H. semele 3 Alonissos, Grčija, (leg. Nardello), 13.9.2009 H. senthes 4 Gornja Bran.,Velebit, Hrvaška, (leg. Berreta), 2.7.2011 H. semele
Slika 7: Lokacije analiziranih vzorcev vrst Hipparchia semele, H. volgensis in H. senthes na Balkanu.
Legenda:
H. volgensis H. semele H. senthes
Večina ulovljenih osebkov je bila shranjena v papirnatih vrečkah na katerih je bila napisana koda, datum in natančna lokacija ulova metulja. Pet vzorcev za genetsko analizo smo dobili v epruvetah s 96 % alkoholom, v katerih je bila samo noga.
3.2 Morfometrične analize
3.2.1 Maceracija zadkov, izolacija genitalij, priprava trajnih preparatov
Začetek analize genitalij je potekal tako, da smo zadnjo tretjino zadka s skalpelom previdno ločili od preostalega dela in pustili, da se posuši na zraku.
Posušeno tretjino zadka smo dali v epruvete s 15% raztopino KOH. Epruvete smo nato dali v vodno kopel, ki smo jo segreli do vrelišča in pustili vreti. Maceracija je potekala približno 30 minut, mišično in maščobno tkivo s hitiniziranih delov genitalij se je hidroliziralo.
Po končani maceraciji smo zadke s pinceto previdno prestavili iz luga v petrijevko z vodo. Vsak vzorec smo pogledali pod lupo in s pomočjo tanke igle in pincete odstranili luske, ostanke prebavil in maščobnega tkiva, da je ostal samo hitinski del genitalij. Sledila je priprava trajnih preparatov. Genitalije vsakega osebka smo dali najprej v 70%, potem v 80% in na koncu še v 96 % etanol. Medtem smo segreli in raztopili glicerin - želatino, jo kanili na objektno stekelce in pazili da se niso naredili zračni mehurčki. Nato smo pod lupo dali vanjo genitalni aparat in ga pokrili s krovnim stekelcem. Preparat smo pustila en dan, da se je glicerin – želatina strdila.
Ves čas smo pazili, da smo vzorce natančno in sprotno označevali, da ni prišlo do zamenjave.
3.2.2 Merjenje genitalnih struktur
Trajne preparate smo pregledovali s pomočjo lupe Olympus SZX9 z digitalno kamero in osebnega računalnika. Genitalije smo merili s pomočjo programa Cell-B pod 20- do 25-kratno povečavo.
Merili smo različne dele genitalij (slika 8):
a = diagonalna dolžina genitalij (DL), merjena od dorzalnega stičišča tegumen-a in uncus-a do baze saccus-a
b = dolžina valve (VL1)
c = širina valve (VB2), merjena čez najširši osrednji del valve, pravokotno na linijo b
d = posteriorna dolžina valve (VL2), merjena od vrha valve do linije e
e = posteriorna širina valve (VB1), merjena čez najširši končni del valve, pravokotno na linijo b
f = dolžina uncus-a (UL), merjena od vrha uncus-a do središča stikališča tegumen-a in uncus-a
g = širina uncus-a (UB), merjena 0,5 mm od vrha uncus-a, pravokotno na linijo f
h = dolžina brachium-a (BL), merjena od vrha brachium-a do dorzalnega stičišča tegumen-a in brachium-a
i = širina brachium-a(BB), merjena čez stičišče tegumen-a in brachium- a
j = dolžina tegumen-a (TL), merjena od dorzalnega stičišča tegumen-a in uncus-a do stičišča vrha angularis-a in vinculum-a, pod istim kotom kakor linija a
k = širina tegumen-a (TB)
l = dolžina phallus-a (PL)
m = širina phallus-a (PB)
Vzorce smo merili na stotinko milimetra natančno. Meritve smo zapisovali v tabelo in jih kasneje statistično analizirali.
Slika 8: Genitalije samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia z označenimi meritvami, ki so bile uporabljene pri statistični analizi.
(vir: Wakeham-Dawson ind., 2004:106)
3.3 Molekulske analize 3.3.1 Izolacija DNA
Vsakemu metulju smo s pinceto odstranili nogo, iz katere smo izolirali DNA. Pinceto smo pred vsako uporabo razkužili s 96% etanolom, da ni prišlo do kontaminacije.
Metulje, ki so bili spravljeni v epruvetah z alkoholom, smo s pinceto previdno prenesli na papirnato brisačo in počakali, da se posušijo na zraku.
Za prvih nekaj izolacij smo uporabljali izolacijski komplet kemikalij Gen EluteTM, Mammalian genomic DNA Miniprep Kit, Sigma-Aldricht, ZDA, vendar teh kemikalij ni bilo dovolj za vse vzorce, zato smo ostale izolacije opravili z izolacijskim kompletom Smart Helix. Protokola obeh kompletov sta si podobna in dajeta iste rezultate.
Protokol izolacijskega kompleta Sigma-Aldricht (opis za enega metulja velja za vse vzorce):
Nogo metulja damo v mikrocentrifugirko, ki smo jo predhodno označili s kodo vzorca. Nato dodamo 180 µL Lysis solution T in 15 µL proteinaze K.
Vzorec inkubiramo 1 uro in 20 minut na 58 °C.
Vzorec zmaceriramo z macerirno palčko in pazimo, da palčko vedno, kadar se lotimo novega vzorca, predhodno pomočimo v 96% etanol in pobrišemo s papirnato brisačko.
Nato vzorcu dodamo 15 µL proteinaze K.
Vzorec inkubiramo 1–2 uri na 58 °C.
Nato vzorec centrifugiramo 3 minute na 14000 obratih. Supernatant previdno odpipetiramo v novo mikrocentrifugirko, ki smo jo prehodno ustrezno označili s kodo vzorca.
V vzorec dolijemo 300 µL hladnega 96% etanola in 10 sekund vorteksiramo.
Vzorec odpipetiramo v večjo, ustrezno označeno mikrocentrifugirko s filtrom in ga centrifugiramo 1 minuto na 14000 obratov.
Supernatant odlijemo. V mikrocentrifugirko s filtrom odpipetiramo 500 µL raztopine Wash solution.
Vzorec centrifugiramo 1 minuto na 6900 obratih.
Supernatant odlijemo.
V vzorec ponovno odpipetiramo 500 µL raztopine Wash solution.
Centrifugiramo 3 minute na 14000 obratih. Supernatant odlijemo in ponovno centrifugiramo 2 minuti na 14000 obratih.
Filter iz mikrocentrifugirke prestavimo v novo mikrocentrifugirko brez filtra, ki je označene z ustrezno kodo vzorca.
V mikrocentrifugirko nalijemo 30 µL raztopine Elution solution in pustimo 5 minut, da se filter omoči. Nato centrifugiramo 1 minuto na 6500 obratih.
Vzorcu ponovno dolijemo 30 µL raztopine Elution solution, centrifugiramo 1 minuto na 6500 obratih.
Supernatant shranimo v zmrzovalniku.
Protokol izolacijskega kompleta Smart Helix (opis za enega metulja velja za vse vzorce):
Nogo metulja damo v mikrocentrifugirko, ki smo jo predhodno ustrezno označili s kodo vzorca. Nato dodamo 380 µL pufra D.
Vzorec zmaceriramo, pri čemer uporabimo macerirno palčko.
Nato dodamo 20 µL proteinaze K in vzorec postavimo inkubirat na stresalnik za dve uri na 58 °C, nato še 10 minut na 99 °C.
Vzorec centrifugiramo 5 minut na 10000 obratov. S pipeto odpipetiramo supernatant v novo mikrocentrifugirko, ki smo jo predhodno ustrezno označili s kodo vzorca.
Dodamo B-pufer do roba mikrocentrifugirke in vorteksiramo, da se snovi med seboj premešata.
Odpipetiramo 700 µL mešanice v mikrocentrifugirko s filtrom.
Vsebino centrifugiramo 1 minuto na 14000 obratih.
Supernatant odlijemo in v isto mikrocentrifugirko dodamo še preostali del vzorca.
Spet centrifugiramo 1 minuto na 14000 obratov in odlijemo supernatant.
Dodamo 600 µL W-pufra, centrifugiramo 1 minuto na 14000 obratih in odlijemo supernatant.
Dodamo 500 µL W-pufra, centrifugiramo 5 minut na 14000 obratih in odlijemo supernatant.
Dodamo 30 µL E-pufra in počakamo 5 minut, da se je filter mikrocentrifugirke namoči, nato centrifugiramo 1 minuto na 14000 obratih.
Ponovno dodamo 30 µL E-pufra in centrifugiramo 1 minuto na 14000 obratih.
Supernatant, ki vsebuje DNA, odpipetiramo v novo ustrezno označeno mikrocentrifugirko in ga shranimo v zmrzovalnik.
3.3.2 PCR
Verižna reakcija s polimerazo (polymerase chain reaction, PCR) je znanstvena tehnika v molekularni biologiji, pri kateri pomnožujemo DNA molekule in tako večamo koncentracijo DNA. Verižna reakcija poteka v treh glavnih korakih pri treh različnih temperaturah. Pri prvem koraku poteka denaturacija molekule DNA pri visoki temperaturi (90–97 °C), nato sledi drugi korak pri katerem je treba temperaturo znižati (37–55 °C), saj se začetna oligonukleotida začneta prilegati komplementarni DNA (annealing - prileganje). V končnem koraku verižne reakcije se, ob prisotnosti DNA polimeraze, začne pomnoževanje oligonukleotidnih začetnikov in tako pride do učinkovite podvojitve komplementarne verige DNA (Joshi s sod. 2011).
Ker na tržišču obstaja mnogo začetnih oligonukleotidov, ki jih uporabljamo pri verižnih reakcijah s polimerazo, smo se pozanimali, kateri so najprimernejši in najbolj učinkoviti za naše raziskovalno področje. Za mitohondrijsko DNA smo izbrali začetna oligonukleotida LCO in HCO, za jedrni gen GAPDH pa začetna oligonukleotida Frigga in Burre.
Začetni oligonukleotidi za odsek gena COI (Folmel s sod. 1994):
LCO: 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATTGG-3' HC0: 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3' Začetni okligonukleotidi za odsek gena GAPDH:
Frigga: 5'-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3' Burre: 5'-CCAAAGTTGTCATGGATGAC-3' 3.3.3 Optimizacija
Pri PCR reakcijah smo uporabili naslednje reagente za vsak vzorec:
2,5 µL PCR pufra
2,5 µL dNTP
18,3 µL Ω vode
0,33 µL začetnega oligonukleotida (LCO)
0,33 µL začetnega oligonukleotida (HCO)
0,12 µL Taq-DNA-polimeraze
Količina kemikalij je bila pri vseh reakcijah ista. En volumen smo pripravili še za slepi vzorec. Pri PRC reakcijah za jedrni gen smo uporabili začetna oligonukleotida Frigga in Burre.
Ker včasih pri določenih reakcijah ni prišlo do pomnoževanja fragmentov DNA, smo spremenili volumen vzorca in PCR protokol.
a) Prvič smo pri PRC postopku uporabili COI protokol:
- 4 minute na 95 °C – veriga DNA razpade - 1 minuta na 95 °C
- 1 minuta na 45 °C - prileganje ta del se ponovi 40 krat - 2,5 minute na 72 °C
- 7 minut na 72 °C – podaljšana sinteza
Ta protokol smo uporabili pri vzorcih LA30–LA34. Pri vseh reakcijah smo uporabili 1 µL vzorca.
b) Drugič smo prav tako uporabili COI protokol za vzorce LA40–LA49. Pri reakcijah smo uporabili po 1 µL vzorca.
c) Tretjič smo ponovno uporabili COI protokol za vzorce LA70–LA79. Pri reakcijah smo uporabili po 2 µL vzorca. Slepega vzorca pri teh reakcijah ni bilo, ker je prišlo do napake pri odmerjanju količin kemikalij.
d) Četrtič smo spet uporabili COI protokol pri vzorcih LA31, LA40–LA49 in LA74.
Pri reakcijah smo uporabili po 2 µL vzorca.
e) Petič smo uporabili COI postopek, vendar smo temperaturo faze prileganja zmanjšali na 44 °C, število ciklov pa povečali na 42 krat. Vzorci pri reakciji so bili LA31, LA40, LA42–LA49 in LA74. Volumen vzorcev pri reakciji je bil 1 µL.
f) Šestič smo delali PCR postopek za jedrni gen GADPH:
- 3 minute na 95 °C - razpad DNA
- 30 sekund na 95 °C
- 1 minuta na 55 °C ta del se ponovi 40 krat - 2 minuti na 72 °C
- 10 minut na 72 °C – podaljšana sinteza
Pri tej reakciji smo uporabili začetna oligonukleotida za jedrni gen, volumen vzorca je bil 1µL. Vzorci pri reakciji so bili LA30, LA32–LA34, LA70–LA72.
g) Sedmič smo uporabili PCR protokol imenovan Touchdown za jedrni gen GADPH:
- 7 minut na 95 °C
- 30 sekund na 95 °C - 1 minuta na 50–60 °C
- 2 minuti na 72 °C - 30 sekund na 95 °C
- 1 minuto na 53 °C ta del se ponovi 25 krat - 2 minuti na 72 °C
- 10 minut na 72 °C
Pri reakciji smo uporabili začetna oligonukleotida za jedrni gen, volumen vzorca je bil 1 µL. Vzorci pri reakciji so bili LA31, LA41–LA45, LA49 in LA73.
h) Osmič smo spet uporabili PCR protokol Touchdown za jedrni gen GADPH, volumen vzorca je bil 0,5 µL. Vzorci pri reakciji so bili LA31, LA41–LA45, LA49 in LA73.
i) Devetič smo uporabili PCR protokol COI za vzorce LA44–LA49 in LA74 z volumnom vzorca 1µL.
j) Desetič smo uporabili PCR protokol za jedrni gen GADPH za vzorce LA31, LA46, LA47, LA48, LA49 in LA74. Pri teh reakcijah smo uporabili dva volumna vzorcev - 1 µL in 2 µL.
3.3.4 Agarozna gelska elektroforeza
Prisotnost produkta, pridobljenega pri reakcijah PCR, smo preverjali z agarozno gelsko elektroforezo. To je standardna metoda, ki se uporablja za ločevanje in zaznavanje različnih oblik DNA na osnovi njene molekulske mase in konformacije (Hercog-Velikonja 2000).
ta del se ponovi 25 krat
Agaroza je naravni linearni polimer, ki se pridobiva iz morskih alg. Raztopi se v vročem puferskem mediju, pri ohlajanju se pa zamreži in strdi, nastane gost matriks - gel. Premreženost gela določa, kako bomo ločili različno velike molekule DNA.
Hitrost potovanja molekul je odvisna od več parametrov: od velikosti in oblike molekule DNA, od koncentracije agaroznega gela, sestave pufra in napetosti električnega polja. Na potovanje molekul ne vplivata temperatura, pri kateri poteka elektroforeza, in nukleotidno zaporedje. Paziti moramo, da ne presežemo temperaturo tališča gela (Hercog-Velikonja 2000).
Majhni fragmenti molekule DNA potujejo skozi agarozni gel hitreje kot veliki fragmenti.
Postopek elektroforeze smo začeli s pripravo agaroznega gela. Na elektronsko tehtnico smo postavili erlenmajerico v katero smo strestli 1 g agaroznaga gela v prahu. Dolili smo 100 ml elektroforetskega pufra TAE. V erlenmajerico smo dali magnet in vse skupaj postavili v mikrovalovno pečico. Pustili smo, da je mešanica vsaj dvakrat dobro prevrela. Delo smo nadaljevali v digestoriju, kjer smo vrelo mešanico postavili na magnetno mešalo in počakali, da se ohladi do primerne temperature.
Medtem smo pripravili banjico za elektroforezo. Na vsako stran banjice smo dali plastično blokado, da tekoč gel ni dosegel žičk. Nato smo v posebno pipeto odmerili 2 µL etidijevega bromida, ki ga hranimo v hladilniku. Ko se je gel ohladil, smo ga vlili v banjico in sočasno primešali etidijev bromid. Pri tem smo pazili, da se v gelu niso pojavili zračni mehurčki. Na koncu smo v gel pristavili še plastični glavniček in pustili gel v digestoriju, dokler se ni strdil.
Ko se je gel strdil, smo v banjico vlili elektroforetski pufer TAE. Pri tem smo bili pozorni, da je bila prekrita cela površina gela. Nato smo previdno odstranili glavniček in plastični blokadi, nato smo dolili še malo TAE, da sta bili prekriti tudi žici ob straneh banjice.
Na mizo smo prilepili košček filmsko obložene folije in nanjo s pipeto nakapljali kapljice vzorcev. Iz hladilnika smo vzeli Loading pufer in 100 baznih parov. Loading pufer in 5 µL vzorca smo dobro premešali in mešanico previdno prenesli v luknjico na
gelu. Pri tem smo pazili, da smo celotno količino mešanice odpipetirali točno v luknjico in je pri tem nismo poškodovali. Ta postopek smo ponovili z vsakim vzorcem in pri tem vedno menjali nastavke za pipete, da ni prišlo do kontamincije vzorcev. Na koncu smo v luknjico odpipetirali še 1,7 µL baznih parov.
Nato smo banjico pokrili s pokrovčkom in jo preko adapterja priklopili na napetost.
Sprva smo za 5 minut napetost uravnali na 45 V, potem smo jo povečali na 60 V. Ko je fronta Loading pufra pripotovala malo čez sredino gela, smo napetost odklopili.
Iz banjice smo odstranili pokrovček, odlili TAE pufer in gel sprali pod mrzlo tekočo vodo. Gel smo skupaj z banjico nesli v prostor, kjer smo ga postavili pod UV kamero in ga slikali. Tako smo preverili ali je v našem vzorcu prisotna pomnožena DNA.
3.3.5 Čiščenje vzorcev
Čiščenje vzorcev je potekalo v PCR sobi. Vzorce, v katerih je bila pomnožena DNA, smo očistili z eksonukleazo in alkalno fosfatazo. Vzorce smo postavili na podstavek z ledom in vsakemu dodali 0,4 µL eksonukleaze 1-EXO in 2 µL alkalne fosfataze FAST- AP.
Vzorce smo nato postavili v PCR napravo in uporabili program za čiščenje vzorcev:
- 47 minut na 37 °C - 15 minut na 80 °C
Po čiščenju vzorcev smo vsak vzorec odpipetirali v dve novi mikrocentrifugirki, v vsaki je bil volumen vzorca 10 µL. Mikrocentrifugirke smo označili s kodo vzorca in črtno kodo. Kodo posameznega vzorca in črtno kodo smo vpisali v tabelo, ki smo jo skupaj z vzorci poslali na sekvenciranje.
Poleg vzorcev smo priložili še 2 mikrocentrifugirki z začetnimi oligonukleotidi, ki smo ju uporabili pri izolaciji DNA. Začetna oligonukleotida smo redčili z Ω vodo v razmerju 1:1.
3.3.6 Postopek izdelave filogenetskega drevesa in Bayesova analiza
Vzorce, ki smo jih poslali v tujino na sekvenciranje, smo prejeli nazaj v elektronski obliki. Te podatke smo obdelali v naslednjih programih:
BioEdit Sequence Alignment Editor (verzija 7.2.5)
ChromasPro (verizija 1.7.6)
Notepad (verzija 7.1 build 7600)
ClustalX2 (verzija 2.1)
MEGA (verzija 6.05(6140107))
Model Generator (verzija 82)
REDSECQ
MrBayes (verzija 3.2.0)
FigTree (verzija 1.4.0)
CorelDRAW X6 (verzija 16.0.0.707)
Sekvence, ki smo jih dobili v AB1 formatu ., smo odprli v programu ChromasPro, kjer smo jih pregledali. Za posamezen vzorec smo prejeli po dve datoteki, za vsak začetni oligonukleotid posebej. V Bioeditu smo nato obe datoteki združili v dvoverižno sekvenco in jo shranili v GPJ formatu. To smo naredili za vsak vzorec posebej in ga skopirali v program Notepad.
Na spletni strani NCBI-ja smo poiskali ustrezne sekvence zunanjih vzorcev, ki so sorodni rodu Hipparchia, jih ustrezno označili in shranili v Notepad.
Urejene podatke iz programa Notepad smo nato odprli v programu ClustalX2. Vse sekvence smo poravnali tako, da smo odrezali mesta z napakami, ki so nastale pri sekvenciranju. Nekatere napake smo lahko popravili ročno, glede na ostala zaporedja nukleotidov. Končne podatke smo shranili v FASTA formatu.
Preden smo se lotili Bayesove analize, smo v programu MEGA izrisali preliminarno filogenetsko drevo po metodi Maximum likelihood, ki je pokazalo porazdelitev naših in zunanjih vzorcev. Postopek izrisa filogenetskega drevesa v programu MEGA smo začeli tako, da smo uporabili Bootstrap metodo s 100 ponovitvami. Nadaljevali smo z General time reversible metodo (GTR) in Gamma distributed with invariable sites (G+I) parameter. Za neprepoznavne nukleotide smo uporabili metodo Complete deletion ali popolni izbris. Nato je program izrisal filogenetsko drevo. Datoteko smo shranili v EMF formatu.
Nato smo FASTA datoteko odprli v programu Model Generator, ki preverja ustreznost evolucijskega modela in izmed 56 možnosti izbere naustreznejšega. Glede na naše podatke je bil izbran naslednji model: GTR+I+G (general time reversible + invarient sites + gamma distributed).
Na spletni strani REDSECQ smo spremenili FASTA datoteko v NEXUS datoteko in jo uvozili v program MrBayes. V temu programu smo določili parametre po katerih so potekali izračuni za izris filogenetskega drevesa. Za parametre smo uporabili vrednost: NST = 6, rec = gamma, ki pove, po katerem modelu evolucije naj se generira drevo, ngen = 2000000, savebrlens = yes, kar pomeni 2000000 ponovitev in možnost, da se dolžine posameznih vej shranjujejo. Po dve-milijontih ponovitvah, se drevesa med seboj primerjajo. Nato smo izbrisali prvih 5000 dreves, na podlagi vseh ostalih pa dobili končno filogenetsko drevo. Na njegovih vejah so zapisane vrednosti posteriornih verjetnosti, ki povedo, kolikokrat se posamezna veja ponovi.
Obdelavo končnega filogenetskega drevesa smo nadaljevali v programu FigTree, kjer smo drevo dokončno obdelali. Za končno urejanje filogentskega drevesa smo uporabili program CorelDRAW X6.
Za koreninjenje dreves smo si iz spletne baze podatkov National Center for Biotehnology Information izbrali ustrezna nukleotidna zaporednja različnih vrst iz poddružine Satyrinae.
3.4 Statistična analiza morfoloških podatkov
Na pridobljenih podatkih smo naredili statistično analizo. Osnovne podatke smo vpisali v tabelo programa MS Excel in jih uporabili za izračun izvedenih spremenljivk, ki temeljijo na formulah Wakeham-Dawson s sod. (2004, str. 106). Iz 13. osnovnih spremenljivk smo dobili 7 izpeljanih spremenljivk (preglednica 4, preglednica 5).
Preglednica 4: Legenda kratic osnovnih spremenljivk genitalij samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia (primerjava s sliko 8). Dolžine spremenljivk so bile uporabljene pri statistični
analizi.
DL diagonalna dolžina genitalij
VL1 dolžina valve
VB2 širina valve
VL2 posteriorna dolžina valve
VB1 posteriorna širina valve
UL dolžina uncus-a
UB širina uncus-a
BL dolžina brachium-a
BB širina brachium-a
TL dolžina tegumen-ta
TB širina tegumen-ta
PL dolžina phallus-a
PB širina phallusa-a
Preglednica 5: Izračun razmerij genitalij samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia in opis razmerij. Razmerja so bila uporabljena pri statistični analizi.
razmerje D D =DL (diagonalna dolžina)
VL1 (dolžina valve) opiše splošno obliko genitalij
razmerje V1 V1 =VL1 (dolžina 𝑣𝑎𝑙𝑣𝑒)
VB2 (širina 𝑣𝑎𝑙𝑣𝑒) opiše obliko valve
razmerje V2 𝑉2 = VB2 (širina 𝑣𝑎𝑙𝑣𝑒) VB1 (posteriorna širina 𝑣𝑎𝑙𝑣𝑒)
opiše obliko valve iz posteriorne strani
razmerje U U =UL (dolžina 𝑢𝑛𝑐𝑢𝑠 − a)
UB (širina 𝑢𝑛𝑐𝑢𝑠 − a) opiše obliko uncus-a
razmerje B 𝐵 =BL (dolžina 𝑏𝑟𝑎𝑐ℎ𝑖𝑢𝑚 − a)
BB (širina 𝑏𝑟𝑎𝑐ℎ𝑖𝑢𝑚 − a) opiše obliko brachium-a
razmerje T 𝑇 =TL (dolžina 𝑡𝑒𝑔𝑢𝑚𝑒𝑛 − a)
TB (dolžina 𝑡𝑒𝑔𝑢𝑚𝑒𝑛 − a) opiše obliko tegumen-a
razmerje P 𝑃 =PL (dolžina 𝑝ℎ𝑎𝑙𝑙𝑢𝑠 − a)
PB (dolžina 𝑝ℎ𝑎𝑙𝑙𝑢𝑠 − a) opiše obliko phallus-a Vir: Wakeham-Dawson idr., 2004: 105)
Podatke smo statistično obdelali v programu za statistično obdelavo podatkov SPSS 22.0.0, delno tudi v MS Excel. Grafični prikazi rezultatov analize so prav tako izvedeni v omenjenih programih.
Za pridobitev osnovnih opisnih statistik posameznih spremenljivk smo opravili deskriptivno statistično analizo. Z njo smo preverili osnovne značilnosti osnovnih in izvedenih spremenljivk ter normalnost njihove porazdelitve. Kot kriterij normalne porazdel itve spremenljivk smo vzeli razpon koeficienta asimetričnosti in sploščenosti spremenljivk v intervalu [-2,2]. Normalno porazdeljene spremenljivke so torej tiste, ki se nahajajo znotraj tega intervala. V naslednjem koraku smo testirali razlike med tremi skupinami, t.j. vrstami rodu Hipparchia, da bi preverili ali se skupine statistično značilno razlikujejo med sabo po preučevanih spremenljivkah. Razlike smo preverjali z analizo variance (ANOVA).
4 REZULTATI
4.1 Morfologija genitalij samcev
Skupno število statistično obdelanih osebkov je bilo 22, od tega jih 8 (oziroma 36%) pripada vrsti H. semele, 6 (oziroma 27%) vrsti H. senthes in 8 (36%) vrsti H.
volgensis (slika 9).
Slika 9: Razrez vzorca rodu Hipparchia po deležu v vzorec vključenih vrst.
Preglednica 6 prikazuje rezultate deskriptivne analize za 13 osnovnih in 7 izvedenih spremenljivk. Večina spremenljivk je bila izmerjena pri vseh osebkih, z izjemo spremenljivk DL (n=20), BB (n=21), PL (n=20) in PB (n=21), kjer je bil odsoten del genitalij ali uničen del trajnega preparata.
Pregled koeficientov asimetričnosti in sploščenosti kaže, da je večina spremenljivk normalno porazdeljena. Izjema je le spremenljivka VL1, katere koeficienta asimetričnosti in sploščenosti kažeta na nenormalno porazdelitev. Spremenljivki BB in TL imata vrednost koeficienta sploščenosti izven intervala [-2,2], kar kaže, da sta sicer simetrični, a sploščeni. Med izvedenimi spremenljivkami sta glede na koeficient sploščenosti nenormalno porazdeljeni D in V1.
H. semele 36%
H. senthes 27%
H. volgensis36%
Preglednica 6: Deskriptivna analiza za 13 osnovnih in 7 izvedenih spremenljivk analize genitalji samcev pri metuljih iz rodu Hipparchia. Legenda kratic osnovnih spremeljivk je v
preglednici 4, izvedenih spremenljivk pa v preglednici 5.
Spremenljivka N Aritmetična sredina Asimetričnost (Skewness)
Sploščenost (Kurtosis) AS S.E. koeficient S.E. koeficient S.E.
DL 20 3,35 0,20 -0,30 0,51 -1,02 0,99
VL1 22 2,65 0,64 -3,66 0,49 15,38 0,95
VB2 22 0,45 0,09 -0,27 0,49 -0,64 0,95
VL2 22 0,61 0,09 0,09 0,49 -0,01 0,95
VB1 22 0,42 0,05 0,45 0,49 -0,56 0,95
UL 22 1,99 0,27 -0,61 0,49 -0,03 0,95
UB 22 0,13 0,02 0,04 0,49 -1,34 0,95
BL 22 1,64 0,24 -0,85 0,49 0,07 0,95
BB 21 0,44 0,07 1,74 0,50 2,81 0,97
TL 22 1,74 0,41 -1,31 0,49 2,55 0,95
TB 22 1,12 0,11 1,00 0,49 -0,11 0,95
PL 20 2,94 0,34 -0,78 0,51 0,64 0,99
PB 21 0,30 0,04 0,27 0,50 -0,57 0,97
D 20 1,22 0,08 1,22 0,51 3,01 0,99
V1 22 6,19 1,92 -1,09 0,49 4,79 0,95
V2 22 1,47 0,21 -0,31 0,49 -0,69 0,95
U 22 15,13 2,34 0,15 0,49 -1,03 0,95
B 21 3,78 0,59 0,15 0,50 -0,69 0,97
T 21 1,54 0,37 -1,31 0,50 1,77 0,97
P 20 10,05 1,81 0,41 0,51 0,48 0,99
N=numerus vzorcev samcev metuljev iz rodu Hipparchia; AS=aritmetrična sredina;
S.E.=standardna napaka
V preglednici 7 so povprečne vrednosti posameznih spremenljivk pri vseh treh vrstah iz rodu Hipparchia. Uporabili smo jih za preverjanje morfometričnih razlik med genitalijami samcev omenjenih vrst.
Za normalno porazdeljene spremenljivke (DL, VL1, VB2, VL2, VB1, UL, UB, BL, BB, TL, TB, PL in PB) smo uporabili enosmerno ANOVA-o, za nenormalno porazdeljeno spremenljivko (V1) pa neparametrično različico le-te. Statistično značilno različnih je bilo osem normalno porazdeljenih spremenljivk (preglednica 8) in le ena nenormalno porazdeljena (preglednica 9).
