PROTIBAKTERIJSKO DELOVANJE ETERIČNIH OLJ ŽAJBLJA,

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI ZDRAVSTVENA FAKULTETA

SANITARNO INŽENIRSTVO, 2. STOPNJA

Eva Jug

PROTIBAKTERIJSKO DELOVANJE ETERIČNIH OLJ ŽAJBLJA, POPROVE METE IN TIMIJANA

magistrsko delo

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF SAGE, PEPPERMINT AND THYME ESSENTIAL OILS

master thesis

Mentor: doc. dr. Rok Fink

Recenzentka: doc. dr. Martina Oder

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

ZAHVALA

Zahvaljujem se mentorju doc. dr. Roku Finku za vso strokovno pomoč in usmerjanje tako pri empiričnem kot tudi pri laboratorijskem delu raziskovalne naloge. Iskrena hvala za spodbudo, potrpežljivost in čas, ki ste mi ga namenili med izdelavo magistrskega dela.

Zahvaljujem se tudi doc. dr. Martini Oder za opravljeno recenzijo magistrskega dela in dr.

Aleksandri Gačić za lektoriranje.

Navsezadnje bi se zahvalila še družini in prijateljem za vso spodbudo in potrpežljivost med celotnim študijem.

(4)

(5)

IZVLEČEK

Uvod: Z nekritično in pretirano uporabo protibakterijskih snovi, nezavedno v afektu reševanja trenutnega problema negativno vplivamo na globalno zdravje. Protimikrobna kriza se kaže kot bakterijska odpornost na antibiotike in posledično kot upad učinkovitih antibiotikov v klinični medicini. Naravne snovi so ena izmed potencialnih alternativ obvladovanja omenjene krize. Sodobni raziskovalci so velik potencial zaznali pri naravnih čistilnih sredstvih in protibakterijskih snoveh na osnovi eteričnih olj. Namen: Namen magistrskega dela je analizirati protibakterijsko delovanje eteričnega olja žajblja, poprove mete in timijana na inhibicijo bakterijskih celic ter ovrednotiti potencial omenjenih eteričnih olj na preprečevanje nastanka biofilma. Metode dela: Preučili smo delovanje eteričnih olj proti nastanku biofilma in njihovo protibakterijsko delovanje na modelne organizme.

Analizirali smo eterično olje žajblja (Salvia officinalis), timijana (Thymus vulgaris) in poprove mete (Mentha piperita), jim določili minimalno inhibitorno koncentracijo za posamezen modelni organizem in ovrednotili njihovo učinkovitost proti nastanku biofilma.

Rezultati: Naši rezultati so pokazali, da ima eterično olje timijana v povprečju najnižjo minimalno inhibitorno koncentracijo, ki v primeru analiziranih modelnih organizmov znaša 0,16 mg/mL. Izkazalo se je tudi, da eterično olje timijana v povprečju najučinkoviteje zavira nastanek biofilma vseh analiziranih bakterijskih kultur. Vsa tri eterična olja so v primeru P.

aeruginosa zmanjšala nastanek biofilma za več kot 60 %. Vendar smo ugotovili, da so bakterije B. cereusa zelo odporne, saj smo z eteričnim oljem žajblja dosegli zgolj 4%

zmanjšanje nastanka biofilma. Ugotovili smo tudi, da imajo razlike v koncentracijah eteričnega olja zanemarljiv vpliv na preprečevanje nastanka biofilma. Razprava in zaključek: Eterična olja, predvsem eterično olje timijana, kažejo dober potencial zaviranja rasti biofilmov Gram pozitivnih bakterij. Smiselno bi bilo raziskati sinergističen vpliv več eteričnih olj na bakterijske celice in morda celo implementirati idejo v izdelke, s katerimi bi posredno preprečili kvarjenje živil. Z uporabo naravnih izdelkov bi naredili velik korak k zmanjševanju ali celo reševanju protimikrobne krize. Potrebna sta kritična presoja in ustrezno znanje za nadzor kakovosti, stabilnosti aktivnih komponent, učinkovitosti in navsezadnje varnosti izdelkov, tako za okolje kot tudi za zdravje ljudi. Navsezadnje je varovanje zdravja ljudi in okolja absolutni predpogoj.

Ključne besede: eterična olja, žajbelj, poprova meta, timijan, biofilm

(6)

(7)

ABSTRACT

Introduction: Careless and excessive use of antimicrobials leads to a negative impact on global health. The antimicrobial crisis shows as bacterial antibiotic resistance and consequently as a decline in effective antibiotics in clinical medicine. Natural substances are one of the potential alternatives for managing the antimicrobial crisis. Modern researchers have discovered the great potential in natural cleaning products, and antimicrobial substances based on essential oils. Purpose: The purpose of the master's thesis was to analyze the antibacterial effect of sage, peppermint and thyme essential oil on the inhibition of bacterial cells and to evaluate the potential of these essential oils to prevent biofilm formation. Methods: We studied the action of essential oils against biofilm formation and their antibacterial action on model organisms. We analyzed the essential oil of sage (Salvia officinalis), thyme (Thymus vulgaris) and peppermint (Mentha piperita), determined the minimum inhibitory concentration for each model organism and evaluated their effectiveness. Results: Our results show that thyme essential oil has, on average, the lowest minimum inhibitory concentration, which is 0.16 mg / mL, in the case of analyzed model organisms. It has also been shown that thyme essential oil, on average, most effectively inhibits the formation of the biofilm of all analyzed bacterial cultures. All three essential oils reduced P. aeruginosa biofilm formation by more than 60%. B. cereus bacteria are apparently very resistant, as we achieved only a 4% reduction in biofilm formation with sage essential oil. We also found that differences in essential oil concentrations have a negligible effect on biofilm prevention. Discussion and conclusion: Essential oils andespecially thyme essential oil show good potential for inhibiting the growth of Grampositive bacteria biofilms. It would make sense to investigate the synergist effect of several essential oils on bacterial cells and perhaps even implement the idea into products that would indirectly prevent food spoilage. Using natural products would make a big step towards reducing or even resolving the antimicrobial crisis. Critical judgment and appropriate knowledge are required to control the quality, stability of active components, efficacy and, last but not least, product safety for the environment and human health. Protection of human health and the environment is an absolute precondition.

Keywords: essential oils, sage, peppermint, thyme, biofilm.

(8)

(9)

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ... 1

1.1 Teoretična izhodišča ... 2

1.1.1 Biofilmi ... 2

1.1.1.1 Modelni organizmi ... 3

1.1.1.1.1 Staphylococcus aureus ... 3

1.1.1.1.2 Pseudomonas aeruginosa ... 3

1.1.1.1.3 Bacillus cereus ... 4

1.1.1.1.4 Bacillus subtilis ... 4

1.1.1.1.5 Escherichia coli ... 4

1.1.1.2 Bakterijska adhezija ... 5

1.1.1.3 Preprečevanje nastanka biofilma ... 6

1.1.2 Eterična olja ... 7

1.1.2.1 Pridobivanje ... 7

1.1.2.2 Kemijska sestava ... 8

1.1.2.3 Delovanje in uporaba ... 9

1.1.2.4 Uporabljena eterična olja ... 12

1.1.2.4.1 Eterično olje žajblja ... 12

1.1.2.4.2 Eterično olje poprove mete ... 13

1.1.2.4.3 Eterično olje timijana ... 13

2 NAMEN ... 15

2.1 Hipoteze ... 15

3 METODE DELA ... 16

3.1 Modelni organizmi ... 16

3.2 Priprava eteričnih olj ... 16

3.3 Priprava prekonočnih kultur ... 17

3.4 Določitev minimalne inhibitorne koncentracije ... 17

(10)

3.5 Ovrednotenje učinkovanja izbranih eteričnih olj proti nastanku biofilma ... 18

3.6 Drugi materiali ... 20

3.7 Statistična analiza ... 21

4 REZULTATI ... 22

4.3 Statistična analiza ... 26

5 RAZPRAVA ... 28

6 ZAKLJUČEK ... 34

7 LITERATURA IN DOKUMENTACIJSKI VIRI... 36

(11)

KAZALO SLIK

Slika 1: Mehanizmi delovanja in tarčna mesta eteričnih olj v bakterijski celici (Povzeto po Nazzaro et al., 2013). ... 11 Slika 2: Shematični prikaz metode za določitev MIK. ... 18 Slika 3: Shematični prikaz metode za ovrednotenje učinkovitosti delovanja eteričnih olj proti biofilmom. ... 19 Slika 4: Ekstrahirano barvilo iz biomase posamezne bakterijske kulture. ... 20 Slika 5: Optična gostota biofilmov P. aeruginosa, S. aureus in B. cereus pri različnih minimalnih inhibitornih koncetracijah eteričnega olja žajblja. ... 23 Slika 6: Učinkovitost (%) eteričnega olja žajblja proti nastanku biofilma P. aeruginosa, S.

aureus in B. cereus. ... 24 Slika 7: Optična gostota biofilmov P. aeruginosa, S. aureus in B. cereus pri različnih minimalnih inhibitornih koncetracijah eteričnega olja timijana. ... 24 Slika 8: Učinkovitost (%) eteričnega olja timijana proti nastanku biofilma P. aeruginosa, S.

aureus in B. cereus. ... 25 Slika 9: Optična gostota biofilmov P. aeruginosa, S. aureus in B. cereus pri različnih minimalnih inhibitornih koncetracijah eteričnega olja poprove mete. ... 25 Slika 10: Učinkovitost (%) eteričnega olja poprove mete proti nastanku biofilma P.

aeruginosa, S. aureus in B. cereus. ... 26

(12)

KAZALO TABEL

Tabela 1: Minimalne inhibitorne koncentracije eteričnih olj. ... 22 Tabela 2: Prikaz rezultatov statistične analize optične gostote biofilma za posamezna eterična olja v odvisnosti od koncentracije eteričnih olj. ... 27

(13)

SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC IN OKRAJŠAV

EPS eksopolisaharidne snovi (angl. Extracellular polymeric substances) DNK deoksiribonukleinska kislina (angl. Deoxyribonucleic acid)

DLVO DerjaguinLandauVerweyOverbeek teorija (teorija koloidnih delcev) UV ultravijolično valovanje

ATP adenozin trifosfat (angl. Adenosine triphosphate) MIK minimalna inhibitorna koncentracija

DMSO dimetilsulfoksid

PBS fosfatni pufer (angl. Phosphatebuffered saline) QS zaznavanje celične gostote (angl. Quorum sensing P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

S. aureus Staphylococcus aureus

B. cereus Bacillus cereus

(14)

(15)

1 UVOD

Vsakdanja rutina ljudi v bivalnem in še posebej delovnem okolju zdravstvenih in živilskih delavcev obsega obvladovanje mikrobne populacije na kontaktnih površinah (Bohinc et al., 2014; Simoes et al., 2010). V to sta nas dodatno prisilili še pandemija koronavirusne bolezni Covid19 in že tako pretirana uporaba protibakterijskih snovi, ki sicer učinkovito nadzorujejo mikrobno populacijo, vendar predstavljajo začetek nove težave – protimikrobne krize. Z nekritično in pretirano uporabo protibakterijskih snovi, nezavedno v afektu reševanja trenutne težave, negativno vplivamo na globalno zdravje. Protimikrobna kriza se kaže kot bakterijska odpornost na antibiotike in posledično kot upad učinkovitih antibiotikov v klinični medicini (Christenson, 2017; Gnanadhas et al., 2013; Aiello, Larson, 2003). Kot že omenjeno, se z uporabo čistilnih sredstev in izdelkov za osebno higieno težava pojavlja tudi v bivalnem okolju (Aiello, Larson, 2003; Hartmann et al., 2016). Sredstva za čiščenje in osebno nego vsebujejo kvartarne amonijeve spojine, klorheksidin, triklosan in druge snovi s protibakterijskim delovanjem (Maillard et al., 2013). Avtorji številnih študij opozarjajo na skrb vzbujajoče rezultate, ki kažejo na odpornost mikroorganizmov proti antibiotikom v gospodinjstvih, ravno zaradi uporabe čistilnih sredstev s protibakterijskimi snovmi (Bloomfield, 2002; Giuliano, Rybak, 2015; Maillard et al., 2013; Sonbol et al., 2018).

Ustrezno in učinkovito čiščenje delovnih površin ter pripomočkov je torej bistvenega pomena pri zagotavljanju zdravega okolja in varnih živil za ljudi. V nasprotnem primeru pride do kolonizacije bakterij na površinah, kar vodi v razvoj biofilmov in pojav resnih okužb (Davies, 2003; Costerton et al., 1999). Pojav mikrobne odpornosti je torej globalna težava. Vendar je treba raziskati nov pristop k obvladovanju mikroorganizmov in odstranjevanju biofilmov s snovmi, ki ne povzročajo odpornosti. Naravne snovi so ena izmed potencialnih alternativ obvladovanja protimikrobne krize (Reddy et al., 2017).

Sodobni raziskovalci so velik potencial odkrili pri naravnih čistilnih sredstvih in protibakterijskih snoveh na osnovi ekstraktov snovi, eteričnih olj, hidrolatov, površinsko aktivnih snovi in kislin naravnega izvora. Prednosti uporabe teh snovi se kažejo z večjo učinkovitostjo in prisotnostjo teh snovi v naravi, širšim področjem delovanja, nižjo stopnjo odpornosti, večjo okoljsko in zdravstveno sprejemljivostjo ter večinoma nizko strupenostjo za sesalce (Fink, 2019; Sadekuzzman et al., 2015, Bassanetti et al., 2017; Bernal et al., 2018;

Kurinčič et al., 2016; Isman, 2000). Vendar se je še vseeno treba zavedati, da »bolj naravno«

ne pomeni vedno tudi »bolj varno«. Čeprav se za naravne izdelke pogosto domneva večja

(16)

varnost, so lahko leti tudi enako ali celo bolj toksični kot sintetične snovi (Karimi et al., 2015).

V magistrskem delu smo se posvetili raziskovanju protibakterijskega delovanja eteričnih olj, na osnovi katerih bi bila v prihodnosti mogoča implementacija naravnih čistilnih izdelkov.

Ovrednotili smo protibakterijsko učinkovitost eteričnega olja žajblja (Salvia officinalis), poprove mete (Mentha piperita) in timijana (Thymus vulgaris). Pri tem smo uporabili tri modelne organizme, in sicer Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus in Bacillus cereus.

1.1 Teoretična izhodišča

1.1.1 Biofilmi

Biofilmi so skupnosti bakterijskih celic, za katere sta značilni adhezija na trdne površine in izdelava eksopolisaharidnih snovi (EPS), ki obsegajo polisaharide, beljakovine, DNK in lipide, ki predstavljajo zaščitno plast bakterijam (Coughlan et al., 2016; Donlan, 2002).

Mikrobna adhezija na površine in posledično tvorba biofilma sta bili raziskani v številnih različnih okoljih, vključno z živimi tkivi (Simoes et al., 2010; Coughlan et al., 2016). Lahko se tvorijo na različnih površinah opreme (nerjaveče jeklo, steklo, guma, plastika, teflon) in tudi na živilih (sadje in zelenjava, mlečni izdelki, meso, morski sadeži, pivovarstvo) (Kerekes et al., 2015). Patogene bakterije in bakterije, ki lahko tvorijo EPS, predstavljajo pomembno težavo v zdravstveni in živilski industriji, saj bakterije kolonizirajo notranjost mešalnih rezervoarjev, posod in cevi, kar ogroža varnost in kakovost živil. Razlog za to je prav v tvorbi biofilma, ki omogoča bakterijam sposobnost preživetja v danem okolju in jih ščiti pred običajnimi postopki čiščenja ter tako predstavlja obstojen vir kontaminacije (Coughlan et al., 2016; Van Houdt, Michiels, 2010). Zato je potrebno raziskovanje novih strategij za zaviranje nastajanja biofilmov ali odstranjevanja že nastalih biofilmov (Coughlan et al., 2016). Začetna vezava bakterijskih celic na površino je ključnega pomena za nastanek biofilma (Palmer et al., 2007). Na kratko lahko tvorbo biofilma opredelimo kot sosledje faz:

adhezija celic (reverzibilna ali ireverzibilna), rast, zorenje in razpad (Chmielewski, Frank, 2003).

(17)

1.1.1.1 Modelni organizmi

1.1.1.1.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (v nadaljevanju S. aureus) so po Gramu pozitivne sferične bakterije, pogosto povezane v kratke verige ali grozde (FDA, 2012). Spadajo med aerobne in fakultativno anaerobne bakterije (Gnanamani et al., 2017). Debela celična stena iz peptidoglikana, ogljikovih hidratov in beljakovin zaradi svoje kompaktnosti in prožnosti deluje kot zaščitni sloj pred zunanjimi dejavniki in posledično omogoča lažje pripenjanje bakterij na površine (Delcour et al., 1999). Stafilokoki so ubikvitarni in jih je nemogoče odpraviti iz okolja. Številne od 32 vrst in podvrst rodu Staphylococcus najdemo v hrani zaradi okoljske, človeške in živalske kontaminacije (FDA, 2012). Bakterija je zelo razširjena v okolju – v tleh, vodi, zraku, odplakah, na različnih površinah in predmetih splošne uporabe.

Stafilokoki so prisotni tudi na sluznici in koži ljudi ter toplokrvnih živali. S. aureus spada med enega izmed najodpornejših nesporogenih povzročiteljev bolezni pri ljudeh (NIJZ, 2015). Leta je patogen in povzroča pooperativne okužbe ran, pljučnico, nosokomične infekcije in stafilokokne zastrupitve hrane. Pogosto kontaminirana živila so meso in mesni izdelki, perutnina, jajčni izdelki, mleko in mlečni izdelki, kremne rezine itd. Brez toplotne obdelave živil se pričakuje prisotnost S. aureusa v katerem koli živilu živalskega izvora, s katerim ravnajo ljudje. Nekatere vrste bakterije S. aureus proizvajajo toplotno obstojne enterotoksine, ki ostanejo biološko aktivni tudi po toplotni obdelavi in povzročajo gastroenteritis pri ljudeh (FDA, 2012).

1.1.1.1.2 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (v nadaljevanju P. aeruginosa) je ubikvitarna, Gram negativna aerobna bakterija z enim polarnim flagelom, ki ji omogoča lažje pripenjanje na površine.

(Todar, 2012). P. aeruginosa je nezahtevna bakterija glede pogojev rasti in visoko odporna proti fizikalnokemijskim vplivom. Bakterija spada med glavne povzročitelje bolnišničnih okužb dihal, urinarnega trakta in okužb ran (Golle et al., 2006; MullerPremru, 2002). V zunajbolnišničnem okolju povzroča okužbe kože in povrhnjih struktur oči (Golle et al., 2006). Zdravljenje omenjenih okužb se lahko oteži in podaljša predvsem zaradi odpornosti bakterije na protibakterijska zdravila (Strateva, Yordanov, 2009).

(18)

1.1.1.1.3 Bacillus cereus

Bacillus cereus (v nadaljevanju B. cereus) je Grampozitivna, fakultativno anaerobna bakterija, ki ji prisotnost flagela omogoča pripenjanje na površine, primerne za tvorbo biofilma (FDA, 2012; Houry et al., 2010). B. cereus tvori spore, ki so razširjene v zemlji in ekstremnih življenjskih okoljih (morski mulj, gejzirji, človeško in živalsko blato). Prisoten je tudi v vodi, mleku, stročnicah, žitaricah, rižu in drugih živilih. Bakterija tvori dva različna enterotoksina. Toplotno občutljiv enterotoksin povzroča diarealni sindrom v tankem črevesju, ki ga spremljajo trebušne bolečine, driska in krči. Pri emetičnem sindromu, ki ga povzroča toplotno stabilen enterotoksin, se pojavi bruhanje (NIJZ, 2013b).

1.1.1.1.4 Bacillus subtilis

Bacillus subtilis (v nadaljevanju B. subtilis) je ena izmed najznačilnejših Gram pozitivnih bakterij, ki se uporablja v laboratorijskih študijah kot modelni organizem. Prav tako kot B.

cereus ima tudi B. subtilis prisotne flagele, ki bakterijam omogočajo gibanje in pritrjevanje na površine (FreyreGonzalez et al., 2013; FDA, 2012). B. subtilis je nepatogena bakterijska vrsta, ki jo najdemo v tleh, zraku in vodi. Proizvaja številne biotehnološko koristne spojine in ima probiotično delovanje. V neugodnih pogojih bakterije tvorijo spore, ki jim omogočajo preživetje v danem okolju (Belcijan et al., 2019). Spore B. subtilisa se uporabljajo tudi kot biološke kontrole uspešnosti suhe sterilizacije (Komisija za preprečevanje bolnišničnih okužb v Kliničnem centru, 2000).

1.1.1.1.5 Escherichia coli

Escherichia coli (v nadaljevanju E. coli) je danes ena izmed najbolj preučevanih prokariontskih organizmov (Madigan et al., 2003). Uvrščamo jo v rod Escherichia, skupino Gammaproteobacteria in družino Enterobacteriaceae (Garrity et al., 2005). E. coli spada med Gramnegativne fakultativno anaerobne bakterije, ki so paličaste oblike, dolge 2 do 6 μm in široke 1 do 3 μm (Sušić, TomićParadžik, 2009). Prisotnost flagelov omogoča bakterijam lažjo pritrditev na površine (Friedlander et al., 2015). Bakterije so normalno prisotne v prebavnem traktu ljudi in živali. Izven črevesja sevi E. coli povzročajo obolenja, zato se uporablja kot kazalnik fekalnega onesnaženja (Visvalingam, Holley, 2013). Do

(19)

okužbe z E. coli najpogosteje pride prek kontaminirane vode ali živil (NIJZ, 2013a). Razlog za to je predvsem v navzkrižni kontaminaciji okuženih surovin ali površin, ki pridejo v stik z živili (Visvalingam, Holley 2013). Prenos je možen tudi neposredno prek kontaminiranih predmetov ali rok oseb (NIJZ, 2013a). Velika težava nastane, ko se bakterije pritrdijo na površino materialov za stik z živili oziroma na zdravstvene pripomočke in opremo ter tako vplivajo na kakovost in varnost živil oziroma zdravstvenih posegov (Simoes et al., 2010).

1.1.1.2 Bakterijska adhezija

Pod ugodnimi pogoji se bakterijske celice pričvrstijo in razmnožujejo na površini ter tako predstavljajo vir kontaminacije za material, ki pride v stik z njimi (Hori, Matsumoto 2010).

Adhezija bakterijskih celic je odvisna od fizikalne in kemične interakcije med mikroorganizmi in površino ter od razpoložljivosti hranil. Če je leteh dovolj, potem adhezija predstavlja prvi korak tvorbe biofilma (Hori, Matsumoto 2010; Ganesh Kumar, Anand 1998).

Adhezija poteka v dveh stopnjah – prvo stopnjo predstavlja reverzibilna adhezija, ki ji sledi ireverzibilna adhezija. Proces je lahko aktiven ali pasiven in je odvisen od bakterijske gibljivosti, transporta planktonskih celic z gravitacijo, difuzijo ali tokom tekočine (Ganesh Kumar, Anand 1998). Bakterijska adhezija na površine je odvisna od začetnega privlaka celic na površino, čemur sledi adsorpcija in nato pritrditev (Rijnaarts, 1995).

Bakterije lahko glede velikosti (od 0,5 do 2 μm) enačimo s koloidi. Posledično lahko adhezijo bakterij opišemo s teorijo DerjaguinLandauVerweyOverbeek (DLVO), ki temelji na interakciji koloidov s površino. Gre za ravnovesje med Coulombovimi (odbojnimi) in van der Waalsovimi silami (privlačnimi). Van der Waalsove sile so bližje površini močnejše in zato pride do nastanka ireverzibilne adhezije. V nasprotnem primeru Coulombove sile sorazmerno z oddaljenostjo od površine naraščajo, ob hkratnem padanju van der Waalsovih sil (Fink 2015; van der Mei et al., 1999).

Za začetni privlak je potrebna dovolj velika bližina bakterij in površine, da pride do primarne pritrditve, pri kateri sodelujejo elektrostatične, van der Waalsove in hidrofobne sile. Med začetnim stikom je prisotno Brownovo gibanje in stanje še ne doseže ireverzibilne adhezije.

Zato lahko v tem času bakterije preprosto odstranimo. V naslednjem koraku bakterije

(20)

dosežejo ireverzibilno adhezijo na površino, kar je ključni del tvorbe biofilma (Palmer et al., 2007; Jones, Isaacson, 1983).

Ko se bakterije približajo površini, morajo premagati energijsko oviro, da lahko vzpostavijo neposreden stik s površino (Habimana et al., 2014). Odbojne sile bakterijskim celicam preprečujejo neposreden stik, vendar do stika vseeno pride zaradi bakterijskih flagelov, fimbrijev, pilov in tvorbe ekspolisahardine plasti (Jones, Isaacson, 1983). Ko so si celice dovolj blizu s površino (< 5 nm), pride do delovanja različnih sil, ki privedejo celice do ireverzibilne vezave na določeno površino (Jenal, 2004). Za ireverzibilno adhezijo so odgovorne hidrofobne in dipoldipolne interakcije, kovalentne, ionske in vodikove vezi. Po tej fazi je odstranjevanje celic s površine veliko zahtevnejše (Marhsall et al., 1971).

1.1.1.3 Preprečevanje nastanka biofilma

Pri preventivi biofilmov je ključno preprečevanje začetne bakterijske adhezije. Leto najpogosteje preprečujemo z rednim čiščenjem in razkuževanjem površin z različnimi metodami (zaplinjevanje, elektrostatično razkuževanje, UVsevanje) in sredstvi (hipoklorova kislina, perocetna kislina, 7,5% vodikov peroksid) (Kchaou et al., 2020).

Trenutno so okoljsko najprimernejši fizikalni pristopi, kot so sprememba hrapavosti, hidrofobnosti ali električnega naboja površine, saj nimajo negativnega vpliva na okolje in ne povzročajo odpornosti mikroorganizmov (Bohinc et al., 2015). V zadnjem času v ospredje prihajajo nanotehnologija (nanodelci TiO2 preprečujejo bakterijsko adhezijo) in biološki pristopi preventive. Prav tako sprememba kemijske sestave površin, z vdelavo strupenih biocidov ali kemičnih funkcionalnih skupin, učinkovito preprečuje nastanek biofilma, vendar ta metoda negativno vpliva na ekosistem (Sadekuzzman et al., 2015; Wu et al., 2018).

Posebej priljubljeni so tudi bioaktivni premazi, ki s sproščanjem protibakterijskih učinkovin (vankomicin, amoksicilin, gentamicin) zavirajo bakterijsko adhezijo (Bazaka et al., 2012).

Zaradi porasta odpornih mikroorganizmov se preučujejo alternativna protibakterijska sredstva – srebrovi ioni, dušikov oksid, protibakterijski peptidi in naravne biocidne spojine širokega področja, kot npr. eterična olja (Bazaka et al., 2012). Zdravilne rastline so odličen vir bioaktivnih snovi, ki jim z drugo besedo rečemo fitokemikalije. Fitokemikalije (npr.

terpeni, polifenoli, flavonoidi itd.), ki so tudi sestavni del eteričnih olj, zavirajo rast bakterij, motijo presnovo, vplivajo na izražanje celičnih genov in na prenos celičnih signalov.

(21)

Fitokemični izdelki so strukturno raznoliki in imajo široko področje delovanja kot protibakterijski izdelki proti več mikroorganizmom v planktonskem stanju. Vse večje zanimanje za fitokemikalije kot sredstva za nadzor biofilma izvira iz nujne potrebe najti nove nadomestne in učinkovite protibakterijske snovi, ki bi premagale povečano odpornost bakterij na klasična protibakterijska zdravljenja ter tako pomagale rešiti glavni izziv v industrijskih in bolnišničnih okoljih: nastanek biofilma. Zaradi širokega področja protibakterijskega delovanja in njihovega zelenega statusa so fitokemikalije v scenarijih preprečevanja in nadzora biofilmov zanimiva alternativa običajnim antibiotikom (Andrade et al., 2020).

1.1.2 Eterična olja

Naeem in sodelavci (2018) eterična olja opisujejo kot biokemične produkte, nastale v citoplazemski tekočini, ki jih najdemo v medceličnem prostoru rastlin v obliki drobnih kapljic z močnim vonjem in visoko hlapnostjo.

Z drugimi besedami, to so kompleksne mešanice visoko hlapnih aromatičnih spojin, ki se sintetizirajo v več rastlinskih organih (Bakkali et al., 2008; Hyldgaard et al., 2012).

Predstavljajo manj kot 5 % suhe snovi rastline, vendar jih zaradi visoke hlapnosti vseeno preprosto ekstrahiramo iz različnih naravnih virov. Rastlinske žleze, ki izločajo eterično olje, najdemo v plodovih (klinčki), cvetovih (vrtnica, sivka), listih (timijan, žajbelj), semenih (kardamom), koreninah (ingver), lupini (citrusi), lubju (cimet), lesu (sandalovina), v nekaterih primerih celo po vseh delih rastline. Eterična olja varujejo rastline pred patogenimi mikroorganizmi, glivami, žuželkami in rastlinojedimi živalmi. Poleg tega imajo pomembno vlogo pri medsebojnem vplivu rastlin in živali na rast in razmnoževanje rastlin, s privabljanjem opraševalcev oziroma zaviranjem rasti kompetentnih rastlinskih vrst (Naeem et al., 2018; El Asbahani et al., 2015).

1.1.2.1 Pridobivanje

Eterična olja najpogosteje pridobivamo z naslednjimi tremi tradicionalnimi metodami: z vodno destilacijo, parno destilacijo oziroma kombinacijo obeh. Poleg tega uporabljamo tudi druge postopke, kot so maceracija, hidrodifuzija, hladno stiskanje, ekstrakcija s topili ali

(22)

superkritičnimi tekočinami, ultrazvočna ekstrakcija in ekstrakcija z mikrovalovi (Rios, 2015; El Asbahani et al., 2015). Pri postopkih pridobivanja eteričnega olja lahko uporabimo sveže (cvetovi so lahko samo sveži), delno dehidrirane ali posušene rastline (Rios, 2015).

1.1.2.2 Kemijska sestava

Pri sobni temperaturi so eterična olja brez barve do svetlo rumene barve, v primeru, ko so olja sveže destilirana. Poleg tega imajo običajno nizko gostoto, razen v primeru eteričnega olja cimeta in klinčka, ki sta gostejša od vode (Rios, 2015). V vodi so slabo topna, dobro se raztapljajo v maščobnih in organskih topilih, kot so etanol, dieteil eter, mešanice rastlinskih olj, maščob in voskov (Rios, 2015; ValdiviesoUgarte et al., 2019). Eterična olja so nestabilna, zato je potrebno ustrezno shranjevanje (v hladnem, temnem mestu v dobro zaprtih in temnih stekleničkah), saj v nasprotnem primeru pride do oksidacije in spremembe v kemijski sestavi (El Asbahani et al., 2015)

Eterična olja lahko vsebujejo od 20 vse do 100 različnih sekundarnih metabolitov, kar je razlog za široko področje biološkega delovanja. Glavne sestavine eteričnih olj predstavljajo terpeni, terpenoidi (derivati terpenov) in fenilpropanoidi (Raut, Karuppayil, 2014; Bakkali et al., 2008). Slednji so sicer redkeje prisotni, vendar so ključni dejavniki pri aromatičnem vonju, okusu in terapevtskih učinkih (Nagegowda, Dudareva, 2006). Poleg tega je prisotnih tudi nekaj aromatskih in alifatskih sestavin, za katere je značilna nizka molekulska teža.

Terpeni so izdelani iz kombinacij več enot 5ogljikovih baz, imenovanih izopren (C5H8).

Glavni terpeni so monoterpeni (C10) in seskviterpeni (C15) (Raut, Karuppayil, 2014; Bakkali et al., 2008). Poleg tega so prisotne številne druge molekule, kot so kisline, alkoholi, aldehidi, alifatski ogljikovodiki, aciklični estri itd. (Nazzaro et al., 2013).

Protibakterijske lastnosti eteričnih olj so v glavnem odvisne od njihovih kemičnih spojin in količine glavnih posameznih spojin. Te kemične spojine se izločajo z vrsto molekularnih interakcij pod določenimi stresnimi razmerami. Vsaka spojina lahko kaže drugačen mehanizem protibakterijskega delovanja, ki je odvisen od vrste kemične sestave v eteričnem olju (Tariq et al., 2019). Poleg tega eterična olja ne delujejo le na en tarčni organ oziroma funkcijo v celici, temveč je protibakterijsko delovanje posledica več vplivov na površino oziroma notranjost celice (Nazzaro et al., 2013).

(23)

1.1.2.3 Delovanje in uporaba

Skozi dolga leta uporabe so danes eterična olja postala sestavni del vsakdanjika. Trenutno je uveljavljenih že približno 3.000 eteričnih olj, približno desetina teh se uporablja v prehrambnih, sanitarnih, parfumskih in agronomskih industrijah ter tudi v zobozdravstvu in farmaciji (Tariq et al., 2019; Baser, Buchbauer, 2010). Sicer se eterična olja v farmaciji uporabljajo predvsem zaradi izboljšanja senzoričnih lastnosti farmacevtskih izdelkov (Naeem et al., 2018). Uporaba naravnih antimikrobnih spojin ni pomembna le za ohranjanje in izboljšanje senzoričnih lastnosti živil, temveč je pomembna tudi z vidika varovanja ljudi in rastlin pred boleznimi mikrobnega izvora (Baratta et al., 1997). V zadnjih letih je pomen eteričnih olj, kot biocidov in odganjalcev žuželk, privedel do podrobnejših raziskav inhibicije rasti patogenih mikroorganizmov z uporabo eteričnih olj (Baser, Buchbauer, 2010;

Davidson et al., 2005). Zaradi svojih vsestranskih terapevtskih lastnosti je uporaba eteričnih olj zelo razširjena, saj delujejo:

 antitusično (eterično olje evkaliptusa),

 protibakterijsko (eterično olje žajblja, klinčka, čajevca),

 dekongestivno (eterično olje poprove mete),

 karminativno (eterično olje janeža),

 protiglivično (eterično olje cimeta, limonske trave),

 protivirusno (eterično olje evkaliptusa, timijana),

 antimutageno (eterično olje kamilice),

 antidiabetično (eterično olje rožmarina),

 protivnetno (eterično olje evkaliptusa, rožmarina, sivke),

 antiprotozoalno (eterično olje origana),

 antioksidativno (eterično olje origana) (Raut, Karuppayil, 2014; Baser, Buchbauer, 2010).

Biološka aktivnost eteričnih olj je odvisna od njihove kemične sestave, ki jo določa genotip rastline. Nanjo močno vplivajo tudi geografsko poreklo, starost rastline, sezona žetve ter okoljski in agronomski dejavniki, kot so podnebje, vrsta tal, vpliv suše, obremenitve žuželk in mikroorganizmov itd. (Rota et al., 2003; Baser, Buchbauer, 2010; Franz et al., 2007).

Številne protibakterijske spojine so stalno prisotne v rastlini, druge se lahko sintetizirajo kot obrambni mehanizem pred patogeni (Nazzaro et al., 2013). Različne prisotne fitokemikalije,

(24)

natančneje terpenoidne sestavine, lahko z medsebojnim vplivom zmanjšajo ali povečajo protibakterijsko učinkovitost eteričnih olj. Protibakterijsko delovanje eteričnih olj ima močan učinek, saj lahko zavre rast bakterij (bakteriostatično) ali uniči bakterijske celice (baktericidno) (Tariq et al., 2019)

Mehanizem delovanja eteričnih olj je torej odvisen od kemične sestave in protibakterijske aktivnosti, zato ga ni mogoče preprosto posplošiti, saj nanj vpliva vrsta reakcij, vključno z lastnostmi bakterijske celice. Eterična olja vplivajo na različne celične strukture, zlasti na celično steno, celično membrano in citoplazmo ter posledično zavirajo rast bakterijskih celic in tudi tvorbo strupenih bakterijskih presnovkov. Lahko pride tudi do popolne spremembe morfologije celic, kar vodi v uničenje bakterijske celice. Nekateri znanstveniki navajajo, da ob tem ne pride do odpornosti mikroorganizmov (Ohno et al., 2003; Nazzaro et al., 2013).

Celična membrana je nujno potrebna za preživetje bakterij, saj vse celične funkcije potekajo ravno skozi celično membrano. Poleg tega predstavlja pregrado med zunanjim okoljem in citoplazmo ter omogoča transport presnovkov in ionov. Celična prepustnost, ki jo zagotavlja celična membrana, je nujno potrebna za zagotavljanje celičnih funkcij, vključno z zagotavljanjem celične energije, presnovo in transportom snovi. Prav tako je celična membrana potrebna za vzdrževanje tlaka v celici (Nazzaro et al., 2013).

Hidrofobna narava eteričnih olj omogoča difuzijo skozi fosfolipidni dvosloj celične membrane. Olja, bogata s fenoli, se lahko vključijo v fosfolipidni dvosloj bakterijske celice, kjer se vežejo na beljakovine in tako preprečijo normalno delovanje celičnih funkcij. Zaradi nezmožnosti ločevanja eteričnih olj od bakterijske celične membrane pride do motenj bakterijskih struktur znotraj celice (Tariq et al., 2019).

Mehanizmi delovanja eteričnih olj povzročijo destabilizacijo fosfolipidnega dvosloja, kar vodi do razgradnje celične stene, poškodbe celične membrane in koagulacije citoplazme, kar se kaže v večji prepustnosti bakterijske celice. Spojine eteričnih olj vplivajo tudi na beljakovine, prisotne v celični steni, ki sodelujejo pri transportu hranilnih snovi v celico in delujejo zaviralno na transport elektronov, ki je potreben za proizvodnjo energije.

Sprememba celičnega transporta in prepustnosti celične membrane lahko vodi do neravnovesja znotraj bakterijske celice, kar povzroči koagulacijo citoplazme, denaturacijo več encimov in celičnih beljakovin ter izgubo celičnih presnovkov in ionov. Trajna izguba ionov ali presnovkov zaradi izpostavljenosti eteričnim oljem ogrozi presnovo celice.

(25)

Protibakterijski učinek eteričnih olj je povezan tudi z zmanjšanjem membranskega potenciala, motnjami protonskih črpalk in izčrpanostjo ATP (adenozin trifosfat – vir celične energije). Ta sprememba lahko povzroči kaskadni učinek, kar povzroči prizadetost celičnih organelov in navsezadnje smrt bakterijske celice (Tariq et al., 2019). Torej je celična stena prva tarča protibakterijskega delovanja eteričnih olj. Eterična olja lahko protibakterijsko delujejo tudi z inhibicijo medceličnega signalnega mehanizma quorum sensing (QS) oziroma zaznavanja celične gostote, s katerim bakterije uravnavajo odziv na okoljske spremembe (Parsek, Greenberg, 2005; Yang, Givskov, 2015).

Zaradi številnih komponent, ki so prisotne v eteričnih oljih, protibakterijske aktivnosti ni mogoče pripisati le enemu mehanizmu. Vključenih je več različnih biokemičnih in strukturnih mehanizmov na več mestih znotraj celice in tudi na površini (Slika 1). Ti mehanizmi vključujejo kemijske spremembe celične membrane, citoplazme, encimov in beljakovin, ki lahko spremenijo celotno strukturo bakterijske celice. Ko so bakterijske celice izpostavljene subletalnim koncentracijam eteričnih olj oziroma drugim naravnim protibakterijskim sredstvom, kot odziv na stres tvorijo beljakovine, ki odpravijo celične poškodbe. V primeru višje koncentracije eteričnih olj niti omenjeni stresni odziv ne more preprečiti celične smrti (Tariq et al., 2019).

Slika 1: Mehanizmi delovanja in tarčna mesta eteričnih olj v bakterijski celici (Povzeto po Nazzaro et al., 2013).

(26)

Študije kažejo večje protibakterijske učinke eteričnih olj proti Gramu pozitivnim bakterijam.

Zunanja celična membrana po Gramu negativnih bakterij ima hidrofilne lastnosti, ki preprečujejo oziroma zmanjšajo prodiranje hidrofobnih sestavin eteričnih olj v bakterijsko celico. V nasprotju s tem eterična olja neposredno poškodujejo celično steno po Gramu pozitivnih bakterij, kar povzroči poškodbo celične membrane z blokado encimov in povečano prepustnostjo ionov (Nazzaro et al., 2013; Tariq et al., 2019).

1.1.2.4 Uporabljena eterična olja

1.1.2.4.1 Eterično olje žajblja

Žajbelj (Salvia ofiicinalis) je ena izmed najbolj znanih vrst rodu kaduljnic (Salvia), ki predstavljajo največji rod družine ustnatic (Lamiaceae). Žajbelj je sredozemski zimzeleni podgrm, z olesenelimi stebli, sivkastimi listi in modrim do vijoličnim cvetjem (Longaray Delamare et al., 2005; AbuDarwish et al., 2013; Raal et al., 2005). Eterično olje žajbljevih listov deluje karminativno, spazmolitično, adstringentno in navsezadnje protibakterijsko (Raal et al., 2005). Protibakterijske lastnosti žajblja so bile odkrite že pred desetletji, kar so poročali tudi v prejšnjih študijah. Ugotovili so, da obstaja povezava med kemično sestavo najpogostejših sestavin v eteričnem olju in protibakterijskim delovanjem (Longaray Delamare et al., 2005; Deans, Svoboda, 1990). Tudi ukrajinski raziskovalci so v 90. letih aktivne komponente žajbljevega eteričnega olja uvrstili med pomembnejše biološko aktivne snovi (Sur et al., 1990). Pattnaik in sodelavci (1997) so kasneje dokazali protibakterijsko delovanje kafre, alfatujona in 1,8cineola (Ben Khedher et al., 2017). To so potrdili tudi Longaray Delamare in sodelavci (2005), ki so analizirali vsebnost učinkovin žajbljevega eteričnega olja in ugotovili, da glavne učinkovine žajbljevega olja predstavljajo alfatujon, 1,8cineol, kafra, borneol in betapinen. Protibakterijske lastnosti so pripisali prisotnosti treh monoterpenov – tujonu, kafri in 1,8cineolu (AbuDarwish et al., 2013; Longaray Delamare et al., 2005). Variiranje vsebnosti aktivnih komponent in posledično protibakterijsko delovanje sta posledica različnega rastnega habitata med rastlinami. Študije kažejo, da imajo na sestavo olja vpliv tako okoljski dejavniki in rodovitnost tal kot tudi razvojna stopnja rastline in metoda ekstrakcije (Ben Khedher et al., 2017).

(27)

1.1.2.4.2 Eterično olje poprove mete

Poprovo meto (Mentha piperita) botanično uvrščamo v rod met (Mentha) in družino ustnatic (Lamiaceae) (Beigi et al., 2018). V tradicionalni medicini se pripravki iz različnih vrst mete uporabljajo že več kot 250 let (Saharkhiz et al., 2012). Kljub temu da poprova meta sicer prvotno izvira iz Sredozemlja, danes uspeva po vsem svetu (Iscan et al., 2002). Pridelujejo jo predvsem za pripravo eteričnega olja, ki je običajno namenjeno zunanji uporabi in kaže pomembne protivnetne, protibolečinske, spazmolitične, protialergijske, protivirusne, protibakterijske lastnosti in navsezadnje lastnosti proti nastanku biofilma (Buleandra et al., 2016; Iscan et al., 2002; Saharkhiz et al., 2012). Eterično olje poprove mete je eno izmed najpogosteje uporabljenih eteričnih olj, predvsem zaradi njegovih glavnih komponent – mentola in mentona (Saharkhiz et al., 2012). Kemična sestava eteričnega olja je odvisna od okoljskih in agronomskih dejavnikov, kot so prst, podnebje, geografske razlike, genetski dejavniki itd. (Buleandra et al., 2016). Iscan in sodelavci (2002) so v študiji primerjali vsebnost aktivnih komponent v štirih eteričnih oljih poprove mete. V vseh štirih primerih sta večino predstavljala mentol in menton, sledili pa so 1,8cineol, mentofuran, izomenton, pulegon in linalol. Reddy in sodelavci (2017) govorijo o učinkoviti protibakterijski aktivnosti eteričnega olja, ki jo pripisujejo predvsem prisotnosti metanola in mentona. Ena izmed glavnih značilnosti eteričnih olj je njihova hidrofobnost, kar omogoča njihovo integracijo v celično membrano. Leta je ključna za protibakterijsko delovanje mentola, kot najpoglavitnejše aktivne komponente eteričnega olja, ki s svojo zgradbo (vezana hidroksilna skupina na fenolnem obroču) moti citoplazemsko membrano (Saharkhiz et al., 2012).

1.1.2.4.3 Eterično olje timijana

Rod timijanov (Thymus) iz družine ustnatic (Lamiaceae) obsega več kot 315 vrst, med katere spada tudi navadni timijan (Thymus vulgaris), katerega najbolj znani sinonim v Sloveniji je materina dušica. Timijan je aromatičen podgrm z rjavimi, zavitimi stebli, podolgovatimi zelenosivimi listi in svetlo vijoličnimi cvetovi. Po svetu ga pridelujejo predvsem za kulinarične, kozmetične in medicinske namene. Sicer ima že v osnovi široko naravno razširjenost po vsem svetu. Timijanovo eterično olje in njegovi izvlečki spadajo med prvih deset naravnih izdelkov z dokazanim protibakterijskim, protiglivičnim in antioksidativnim delovanjem (Franz et al., 2007). Rota in sod. (2007) so izvedli kvalitativno in kvantitativno analizo eteričnih olj. V primeru navadnega timijana so rezultati pokazali prisotnost 47

(28)

komponent. Glavne komponente so predstavljali; timol, pcimen in karvakrol. Večino eteričnega olja so torej predstavljali fenoli. Shabnum in Wagay (2011) sta v svoji raziskavi ugotovila, da je prisotnih trideset komponent in najpoglavitnejše so: timol, gamaterpinen, pcimen, linalol, mircen, alfapinen, eugenol, karvakrol in alfatujen. Protibakterijsko delovanje je seveda odvisno od kemične sestave. Romunski raziskovalci so ugotovili, da je protibakterijsko delovanje timijanovega eteričnega olja najbolj povezano s prisotnostjo timola in gamaterpinena. Medtem pcimen ne kaže protibakterijske učinkovitosti pri samostojni uporabi, a kažejo se sinergijski učinki ob prisotnosti timola ali gamaterpinena (Boruga et al., 2014).

(29)

2 NAMEN

Namen magistrskega dela je analizirati protibakterijsko delovanje eteričnega olja žajblja, poprove mete in timijana na inhibicijo bakterijskih celic ter ovrednotiti potencial omenjenih eteričnih olj na preprečevanje nastanka biofilma.

Glavni cilji raziskave so:

 analizirati inhibicijski potencial eteričnih olj na izbranih bakterijskih sevih;

 ugotoviti, katero eterično olje je najučinkovitejše;

 ovrednotiti vpliv koncentracije eteričnih olj na zaviranje rasti in razmnoževanja bakterijskih celic v biofilmu.

2.1 Hipoteze

 Eterično olje žajblja je med analiziranimi najučinkovitejše pri preprečevanju nastanka biofilma.

 Višje koncentracije eteričnih olj so učinkovitejše od nižjih.

 Učinek delovanja eteričnih olj se razlikuje med posameznimi testnimi sevi.

(30)

3 METODE DELA

V okviru magistrskega dela smo preučili delovanje eteričnih olj proti nastanku biofilma in protibakterijsko delovanje na modelne organizme. Analizirali smo eterično olje žajblja (Salvia officinalis), timijana (Thymus vulgaris) in poprove mete (Mentha piperita), jim določili minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK) ter ovrednotili njihovo učinkovitost.

3.1 Modelni organizmi

V prvem koraku raziskave smo uporabili pet modelnih organizmov, s katerimi se pogosto analizirajo higienske neporozne površine v zdravstvu in živilski industriji, in sicer Escherichia coli ATCC 35218, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus cereus CCM 2010 in Bacillus subtilis WDCM 00003. V začetni stopnji smo vsem petim bakterijam določili MIK. MIK je definiran kot najnižja koncentracija preiskovane snovi, pri kateri je zaznan zaviralni učinek na modelni organizem (Andrews, 2001). Zaradi različne občutljivosti vseh petih bakterijskih sevov na izbrana eterična olja smo za nadaljnje raziskovanje izbrali tri seve, ki so v povprečju najodpornejši proti vsem trem eteričnim oljem, in sicer S. aureus, P. aeruginosa in B. cereus.

3.2 Priprava eteričnih olj

V magistrskem delu smo uporabili eterično olje poprove mete, žajblja in timijana. Eterična olja so pripravili na partnerski instituciji Fakultete za farmacijo v Sarajevu, BiH, v okviru projekta BIBA/1921005: Naravni ekstrakti za obvladovanje bakterijskih biofilmov v živilski industriji. Olja so pridobljena s parno destilacijo iz delov iz rastlin.

Destilacijsko aparaturo sestavljajo bučka za vodo, biomasna bučka, destilacijska glava, kondenzator in separator (lij ločnik). V biomasno bučko se dodajo rastlinski deli posamezne rastline. Para, ki nastane s segrevanjem vode v bučki, prehaja v biomasno bučko, kjer pride do izhlapevanja eteričnih olj in vodotopnih spojin iz rastline. Tok pare prehaja naprej skozi destilacijsko glavo, prek vodno hlajenega kondenzatorja, kjer se para utekočini in na koncu zbira v separatorju. V separatorju pride do fazne ločitve hidrofobnih eteričnih olj in vodotopnih rastlinskih spojin (Biorenewables Education Laboratory, 2011). Spodnja faza

(31)

vodotopnih spojin se odlije in ostane eterično olje določenih rastlin, ki smo ga uporabili v nadaljnjih fazah raziskave.

3.3 Priprava prekonočnih kultur

Prekonočne kulture modelnih organizmov (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus in Bacillus subtilis) smo pripravili iz bakterijskih kultur, shranjenih v laboratorijskih zbirkah Zdravstvene fakultete. Posamezno vrsto bakterij smo prenesli na hranilni agar in inkubirali pri 37 °C 24 ur.

Nato smo posamezne zrasle kulture prenesli v tekoče gojišče in ponovno inkubirali pri istih pogojih (Fink et al., 2017). 100 µL prekonočne kulture smo nato prenesli v 30 mL sterilnega navadnega bujona in tako dobili 1:300 razredčeno suspenzijo prekonočnih kultur.

3.4 Določitev minimalne inhibitorne koncentracije

Ključni podatek za nadaljnje raziskovalno delo predstavljajo MIK izbranih bakterijskih sevov.

Laboratorijski del določanja MIK, ki ga shematično prikazuje Slika 2: Shematični prikaz metode za določitev MIK, je potekal v aseptičnem območju. V vdolbine sterilne mikrotitrske plošče smo prenesli 100 µL v razmerju 1:300 razredčenih prekonočnih kultur in 100 µL eteričnega olja različnih koncentracij. Za redčenje eteričnega olja na ustrezne koncentracije smo uporabili 2,5% dimetil sulfoksid (v nadaljevanju DMSO), ki dokazano nima protibakterijskega delovanja. Negativno kontrolo je predstavljalo 100 µL fiziološke raztopine in 100 µL prekonočne kulture. Pozitivno kontrolo je v raziskavi predstavljal vodikov peroksid. Inkubacija je potekala v aerobnih pogojih, 24 ur pri temperaturi 37 °C (Kerekes et al., 2019). Po inkubaciji smo vizualno določili MIK – najnižja koncentracija eteričnega olja, pri kateri je bila suspenzija eteričnega olja in prekonočne kulture bistra (SIST EN ISO 207761:2020).

Na osnovi dobljenih rezultatov smo pripravili delovne raztopine eteričnih olj določenih koncentracij. Določevanje MIK je potekalo v dveh paralelkah.

(32)

Slika 2: Shematični prikaz metode za določitev MIK.

3.5 Ovrednotenje učinkovanja izbranih eteričnih olj proti nastanku biofilma

Učinkovitost posameznega eteričnega olja smo ovrednotili na osnovi količine biomase biofilma z metodo kristal vijolično, ki jo prikazuje Slika 3. Laboratorijski del raziskave je potekal v aseptičnem okolju. 100 µL v razmerju 1:300 razredčenih prekonočnih kultur in 100 µL eteričnega olja, treh različnih koncentracij, določenih na osnovi MIK posamezne bakterije (0,5 MIK, 1 MIK, 2 MIK), smo prenesli v sterilno mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami. Za redčenje eteričnega olja na ustrezne koncentracije smo uporabili 2,5 % DMSO. Kot negativno kontrolo smo v nekaj vdolbin dodali prekonočno kulturo, fiziološko raztopino in 2,5 % DMSO. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili bakterijsko kulturo in 5%vodikov peroksid. Inkubacija je potekala v aerobnih pogojih, 24 ur pri temperaturi 37 °C (Kerekes et al., 2019).

Modelni organizmi:

 Pseudomonas aeruginosa

 Staphylococcus aureus

 Bacillus cereus

Prekonočna kultura  redčitev 1:300  100 µL v mikrotitrsko ploščico

Testna eterična olja

 Žajbelj

 Timijan

 Poprova meta

Redčitev z 2,5 % DMSO  koncentracije od 0,05 – 25 mg/mL

 100 µL v mikrotitrsko ploščico

Inkubacija 24h / 37 °C MIK = najnižja koncentracija,

kjer ni vidne inhibicije

(33)

Slika 3: Shematični prikaz metode za ovrednotenje učinkovitosti delovanja eteričnih olj

proti biofilmom.

V naslednjem koraku smo z vakuumskim aspiratorjem (črpalko) odstranili vsebino mikrotitrskih ploščic, vanje dodali 200 μL fosfatnega pufra (v nadaljevanju PBS) in pufer odsesali. S tem smo odstranili morebitne ostanke eteričnih olj in planktonskih celic. Spiranje s pufrom smo ponovili trikrat. Nato je sledilo 5minutno obarvanje biomase z dodatkom 200 µL 0,2% barvila kristal vijolično. Odvečno barvilo smo sprali z 2 mL PBS pufra. Na koncu smo dodali 250 µL 96% etanola, s katerim smo ekstrahirali barvilo iz biomase, kot prikazuje Slika 4 (Fink et al., 2017; Kulaš, 2016).

Modelni organizmi:

 Pseudomonas aeruginosa

 Staphylococcus aureus

 Bacillus cereus

Prekonočna kultura  redčitev 1:300  100 µL v mikrotitrsko ploščico

Testna eterična olja

 Žajbelj

 Timijan

 Poprova meta

Redčitev z 2,5 % DMSO  koncentracije 0,5 MIK, 1 MIK, 2 MIK  100 µL v mikrotitrsko

Inkubacija 24h / 37 °C  spiranje s PBS  barvanje s kristal vijolično  merjenje

optične gostote biofilma

(34)

Slika 4: Ekstrahirano barvilo iz biomase posamezne bakterijske kulture.

Količino biomase smo določili na osnovi merjenja optične gostote barvila v 96% etanolu pri valovni dolžini 620 nm. Za meritev smo uporabili merilnik Infinite 200^® PRO microplate reader from Tecan, Austria (Fink et al., 2017; Kulaš, 2016). Vse analize so bile izvedene v petih paralelkah in treh ponovitvah.

Na osnovi dobljenih rezultatov smo ovrednotili učinkovitost eteričnih olj. Manjša optična gostota po izpostavljenosti eteričnim oljem relativno glede na kontrolo brez eteričnega olja je bila definirana kot učinkovitost.

3.6 Drugi materiali

Materiali in oprema, ki smo jih uporabili:

 bakterijske kulture (UL ZF),

 navadni bujon, Biolife, Italija,

(35)

 PBS (raztopina soli – 2,4 g KH2PO4, 14,4 g Na2HPO4, 80 g NaCl, 2 g KCl v 1 L destilirane vode),

 1% dimetil sulfoksid,

 96% etanol,

 0,2% kristal vijolično barvilo; Merck, Nemčija,

 stroj za pomivanje in dezinfekcijo, Steelco,

 avtoklav, Kambič,

 inkubator, Kambič,

 spiralec mikrotiterskih plošč Microplate 4 Strip Washer ELX50/8, Biotek,

 čitalec mikrotiterskih plošč Infinite 200® PRO Tecan, Austria,

 programsko orodje Image J 1.51,

 destilirana voda,

 laboratorijska oprema: gorilnik, pipete in nastavki za pipete, tehtnica, epruvete, sterilne erlenmajerice, aparatura za parno destilacijo, mikrotitrske plošče, mikrobiološka gojišča.

3.7 Statistična analiza

Rezultati laboratorijskih preiskav so bili analizirani s statistično analizo. Uporabili smo programsko orodje R (različica 4.1.0, Bell Laboratories). Z uporabo Studentovega ttesta smo analizirali razlike v povprečni vrednosti spremenljivk. Kot odvisne spremenljivke smo določili bakterijski sev in koncentracijo ter kot neodvisno količino biofilma brez

preiskovanih snovi. Mejo statistične značilnosti smo določili pri p < 0,05.

(36)

4 REZULTATI

V okviru magistrskega dela smo analizirali delovanje proti nastanku biofilma in protibakterijsko delovanje treh eteričnih olj na izbrane modelne organizme. V nadaljevanju so dobljeni rezultati prikazani z grafi in tabelami.

4.1 Določitev minimalne inhibitorne koncentracije

Rezultati v Tabeli 1 kažejo, da ima eterično olje timijana najnižji MIK, ki znaša 0,16 mg/mL v primeru P. aeruginose, S. aureusa in B. cereusa. Najvišji MIK smo ovrednotili pri eteričnem olju žajblja, in sicer pri P. aeruginosa in S. aureus, ki je znašal 50 mg/mL. Za nadaljnjo raziskavo smo kot modelne organizme uporabili tri seve, ki v povprečju med vsemi tremi analiziranimi eteričnimi olji kažejo najnižjo občutljivost (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923 in Bacillus cereus CCM 2010).

Tabela 1: Minimalne inhibitorne koncentracije eteričnih olj.

Bakterije

MIK (mg/mL)

Eterična olja Pozitivna

kontrola

Negativna kontrola Žajbelj Timijan Poprova

4.2 Ovrednotenje učinkovanja izbranih eteričnih olj proti nastanku biofilma

Na Slika 5 so prikazane optične gostote biofilma, po izpostavljenosti celic eteričnemu olju žajblja. Vidimo, da so razlike med 0,5 MIK, 1 MIK in 2 MIK skoraj neopazne. Največja razlika optične gostote v primerjavi s kontrolo je v primeru P. aeruginosa.

Slika 5: Optična gostota biofilmov P. aeruginosa, S. aureus in B. cereus pri različnih

minimalnih inhibitornih koncetracijah eteričnega olja žajblja.

Rezultati učinkovitosti proti nastanku biofilmov kažejo (Slika 6), da je eterično olje žajblja najučinkovitejše proti P. aeruginosi, saj že pri 0,5 MIK (25 mg/mL) dosežemo več kot 60

% zmanjšanja pritrjenih bakterijskih celic. V primeru B. cereusa eterično olje žajblja kaže na nizko učinkovitost proti biofilmom, saj prepreči nastanek biofilma v manjšem obsegu (4

%).

0 0,05 0,1 0,15 0,2

P. aeruginosa S. aureus B. cereus

Optična gostota (620 nm)

Eterično olje žajblja

Kontrola 0,5 MIK 1 MIK 2 MIK

(38)

Slika 6: Učinkovitost (%) eteričnega olja žajblja proti nastanku biofilma P. aeruginosa, S.

aureus in B. cereus.

S Slika 7 je razvidno, da eterično olje timijana najučinkoviteje prepreči nastanek biofilma P.

aeruginosa, medtem ko rezultati med posameznimi koncentracijami MIK ne kažejo bistvenih razlik.

Slika 7: Optična gostota biofilmov P. aeruginosa, S. aureus in B. cereus pri različnih

minimalnih inhibitornih koncetracijah eteričnega olja timijana.

Kot prikazuje Slika 8, eterično olje timijana že pri nizkih koncentracijah prepreči nastanek več kot 60 % biofilma P. aeruginosa. Razlike med učinkovitostjo različnih MIK niso

0 20 40 60 80 100

Učinkovitost[%]

Eterično olje žajblja

0,5 MIK 1 MIK 2 MIK

0 0,05 0,1 0,15 0,2

Eterično olje timijana

(39)

bistvene, razen pri B. cereusu, kjer je učinkovitost pri MIK 2 skoraj še enkrat večja kot pri MIK 0,5.

Slika 8: Učinkovitost (%) eteričnega olja timijana proti nastanku biofilma P. aeruginosa, S. aureus in B. cereus.

Rezultati izmerjenih optičnih gostot, prikazanih na Slika 9, kažejo na to, da med posameznimi MIK in tudi med modelnimi organizmi ni bistvenih razlik. Največja razlika je vidna v primeru P. aeruginose, kjer je optična gostota kontrole skoraj dvakrat večja od optičnih gostot posameznih MIK.

Slika 9: Optična gostota biofilmov P. aeruginosa, S. aureus in B. cereus pri različnih

minimalnih inhibitornih koncetracijah eteričnega olja poprove mete.

0 20 40 60 80 100

Učinkovitost [%]

Eterično olje timijana

0,5 MIK 1 MIK 2 MIK

0 0,05 0,1 0,15 0,2

Eterično olje poprove mete

(40)

Rezultati učinkovitosti eteričnega olja poprove mete proti nastanku biofilmov na Slika 10 kažejo minimalne razlike med posameznimi MIK in modelnimi organizmi. Eterično olje je najučinkovitejše proti nastanku biofilma P. aeruginosa.

Slika 10: Učinkovitost (%) eteričnega olja poprove mete proti nastanku biofilma P.

aeruginosa, S. aureus in B. cereus.

4.3 Statistična analiza

Rezultati statistične analize kažejo statistično značilno manjšo količino biofilma na površini ob dodatku eteričnega olja mete, timijana in žajblja pri vseh koncentracijah MIK v primerjavi s kontrolo (p < 0,001). V primeru biofilma S. aureus smo dokazali statistično značilno manjšo količino biofilma za večino eteričnih olj in koncentracij (p < 0,05), le v primeru 2 MIK žajblja tega ne moremo potrditi (p > 0,05). Za B. cereus smo dokazali statistično značilno manjšo količino biofilma za eterično olje mete in timijana pri vseh koncentracijah (p < 0,05), medtem ko za žajbelj statistično značilne razlike nismo dokazali (Tabela 2).

0 20 40 60 80 100

Učinkovitost [%]

Eterično olje poprove mete

0,5 MIK 1 MIK 2 MIK

(41)

Tabela 2: Prikaz rezultatov statistične analize optične gostote biofilma za posamezna eterična olja v odvisnosti od koncentracije eteričnih olj.

Pseudomonas aeruginosa

Meta Timijan Žajbelj

ttest pvrednost ttest pvrednost ttest pvrednost 0,5

MIK

6,9775 0,000934** 7,8528 0,001421* 9,7119 0,00002593**

1 MIK

7,1479 0,0008325** 7,5692 0,0002763* 8,3215 0,0001634**

2 MIK

7,4924 0,0006694** 8,1968 0,001207** 7,078 0,0008711**

Staphiloccocus aureus

MIK

3,3699 0,01989* 3,6443 0,01078* 2,435 0,04509*

1 MIK

3,0008 0,02398* 3,6125 0,008595* 3,0091 0,01969*

2 MIK

3,6909 0,007747* 3,5057 0,009917* 2,0403 0,09684#

Bacillus cereus

MIK

4,889 0,001774* 5,573 0,0005266**

0,41429

0,6911#

1 MIK

4,3257 0,01239* 8,5381 0,00002725**

0,75394

0,4725#

2 MIK

8,2887 0,000167** 8,9982 0,00001856** 1,4884 0,1872#

Legenda: * p < 0,05; ** p < 0,001; p > 0,05 # ni značilno

(42)

5 RAZPRAVA

Nezadostno in neustrezno čiščenje delovnih površin in pripomočkov privede do adhezije bakterij na površino ter predstavlja prvi korak kolonizacije bakterij in nastajanja biofilmov, ki vodijo do okužb in protibakterijske odpornosti na številnih področjih (Monina Klevens et al., 2007; Svetanova, 2006). Škodljivost dosedanjih pristopov preprečevanja in odstranjevanja biofilmov na okolje in zdravje ljudi je spodbudilo raziskovalce k iskanju varnejših in sprejemljivejših metod za zagotavljanje ustrezne higiene površin (Ha et al., 2015). Velik potencial predstavljajo eterična olja zaradi širokega področja delovanja, višje okoljske sprejemljivosti in nižje stopnje odpornosti (Bernal et al., 2018; Kurinčič et al.

2016).

V sklopu magistrskega dela smo si prizadevali raziskati učinkovanje proti nastanku biofilma in protibakterijski potencial eteričnih olj kot naravnih snovi, s katerimi bi lahko preprečili oziroma zmanjšali odpornost bakterij ob hkratnem zmanjšanju vpliva na okolje. Glede na to, da na učinkovanje proti nastanku biofilmov in na protibakterijsko delovanje eteričnih olj vpliva več aktivnih komponent, katerih koncentracija nam je neznana, smo primarno določili MIK. Kot vemo, so bakterijske celice v biofilmih odpornejše na zunanje stresorje (fizikalne metode, biocide, antibiotike) v primerjavi s planktonskimi celicami. Zato je pomembno, da rešitve iščemo na izvoru problema, torej pri preprečevanju bakterijske adhezije oziroma tvorbe biofilma (Wu et al., 2018).

5.1 Določitev minimalne inhibitorne koncentracije

Zanimalo nas je, katero eterično olje ima največji potencial zaviranja rasti bakterij. Glede na pridobljene rezultate o MIK posameznih eteričnih olj smo v nadaljevanju raziskave uporabili tri bakterijske seve, ki so v povprečju med analiziranimi eteričnimi olji najodpornejši. V prvem delu laboratorijskega dela se je izkazalo, da rast bakterijskih kultur najučinkoviteje zavira eterično olje timijana. V primerih vseh treh modelnih organizmov, s katerimi smo nadaljevali raziskavo, je MIK znašal 0,16 mg/mL. Timijanu je sledilo eterično olje poprove mete s srednjimi MIK, ki v povprečju (P. aeruginosa, S. aureus in B. cereus) znašajo 16,7 mg/mL in nazadnje eterično olje žajblja, katerega povprečni MIK znaša 41,7 mg/mL.