UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Dominika HOLC
METAGENOMSKA ANALIZA MIKROBNIH ZDRUŽB SPONTANIH FERMENTACIJ ŽIVIL
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Dominika HOLC
METAGENOMSKA ANALIZA MIKROBNIH ZDRUŽB SPONTANIH FERMENTACIJ ŽIVIL
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
METAGENOMIC ANALYSIS OF MICROBIAL COMMUNITIES IN SPONTANEOUS FOOD FERMENTATIONS
B. SC. THESIS
Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Polono Jamnik.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Polona JAMNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: izr. prof. dr. Jana MUROVEC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum predstavitve: 2.9.2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 601.4:577.212.3:579.67:663.451(043.2)
KG mikrobne združbe, metagenomska analiza, spontano fermentirana živila AV HOLC, Dominika
SA JAMNIK, Polona (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN METAGENOMSKA ANALIZA MIKROBNIH ZDRUŽB SPONTANIH FERMENTACIJ ŽIVIL
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 19 str., 1 pregl., 40 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Pri raziskavi pestrih okoljskih ekosistemov so metagenomske analitske tehnike vseprisotne, do nedavnega pa se za mikrobiološko analizo živil zaradi domnevne majhne pestrosti in dobro vzpostavljenih tradicionalnih analitskih tehnik z gojenjem kultur na ploščah niso pogosto uporabljale. Spontano fermentirana živila zaradi svojega načina priprave vsebujejo pestro mikrobno združbo, ki prispeva k senzoričnim in funkcionalnim lastnostim takšnih živil, hkrati pa lahko predstavlja tudi potencialno varnostno tveganje. Številne metagenomske analize spontano fermentiranih živil so razkrile precejšno pestrost mikrobne združbe prisotne na živilih. Izkazalo se je, da imajo pogosto glavno vlogo v mikrobnih združbah prevladujoče različne vrste mlečnokislinskih bakterij, ki nad ostalimi prisotnimi mikroorganizmi izvajajo selekcijski pritisk s proizvedenimi produkti fermentacije. Metagenomske tehnike se lahko uspešno uporabljajo za namene preverjanja varnosti živil ter raziskovanja raznovrstnosti prisotne mikrobne združbe in njenega metabolnega potenciala. V pregledanih študijah so jih pogosto spremljali še ostali omski pristopi, ki so dopolnjevali rezultate študij, saj za vrednotenje kakovosti, varnosti in funkcionalnosti živil metagenomska analiza sama po sebi ne da dovolj informacij.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 601.4:577.212.3:579.67:663.451(043.2)
CX microbial communities, metagenomic analysis, spontaneously fermented food AU HOLC, Dominika
AA JAMNIK, Polona (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI METAGENOMIC ANALYSIS OF MICROBIAL COMMUNITIES IN SPONTANEOUS FOOD FERMENTATIONS
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 19 p., 1 tab., 40 ref.
LA sl AL sl/en
AB Metagenomic analysis is ubiquitous in the study of diverse environmental ecosystems, but has until recently not been widely used for microbial analysis of foods because of the presumed low diversity and well-established traditional culture-dependent methods.
Spontaneously fermented foods, due to the method of their preparation, contain a diverse microbial community which contributes to the sensory and functional properties of such foods and can at the same time pose a potential safety risk. Numerous metagenomic analyses of spontaneously fermented foods have revealed the diversity of the microbial community present in food. It has been shown that different types of lactic acid bacteria often predominate in microbial communities and often apply selective pressure on other present microorganisms with produced fermentation products.
Metagenomic analytical techniques can be successfully used to evaluate food safety and investigate the diversity of the present microbial community and its metabolic potential.
Metagenomic techniques in reviewed studies have often been accompanied by other omic approaches to acquire additional information as metagenomics alone does not provide necessary information to evaluate food quality, safety and functionality.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VI
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI VI
1 UVOD 1
2 METAGENOMIKA IN MIKROBIOLOŠKA ANALIZA ŽIVIL 1
2.1 MIKROBIOLOŠKA ANALIZA ŽIVIL IN RAZVOJ METOD 1
2.2 TARČNA METAGENOMIKA ALI AMPLIKONSKA ANALIZA 2
2.3 NETARČNA ALI SHOTGUN METAGENOMIKA 2
2.4 (META) OMSKI PRISOTPI 3
3 SPONTANO FERMENTIRANA ŽIVILA 4
3.1 SPONTANO FERMENTIRANA ŽIVILA IN RAZNOVRSTNOST 4
3.2 SPONTANO FERMENTIRANA ŽIVILA IN VARNOST 4
4 PREGLED METAGENOMSKI ANALIZ SPONTANO FERMENTIRANIH ŽIVIL
5
4.1 FERMENTIRANA MLEČNA ŽIVILA 5
4.2 ALKOHOLNE PIJAČE 6
4.3 FERMENTIRANA ZELENJAVA 7
4.4 ČAJ IN KAKAV 9
4.5 FERMENTIRANA SOJINA ŽIVILA 10
4.6 FERMENTIRANI MORSKI IN MESNI IZDELKI 11
4.7 POVZETEK METAGENOMSKIH ANALIZ FERMENTIRANIH ŽIVIL 13
5 ZAKLJUČKI 14
6 VIRI 15
VI
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Povzetek prevladujočega/prevladujočih rodov ali vrst v nekaterih spontano fermentiranih živilih
13
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI Oznaka Obrazložitev
16S rRNA 16S ribosomalna ribonukleinska kislina
DGGE gelska elektroforeza z denaturacijskim gradientom (ang. denaturing gradient gel electrophoresis)
DNA deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxyribonucleic acid) GABA gama-aminobutanojska kislina (ang. gamma-aminobutyric acid) HTS visokozmogljivostno sekvenciranje (ang. high-throughput sequencing) ITS DNA regija med malo in veliko ribosomalno podenoto (ang. internal
transcribed spacer)
NGS sekvenciranje naslednje generacije (ang. next-generation sequencing) OTU operativna taksonomska enota (ang. operational taxonomic unit) PCR verižna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction) TGGE gelska elektroforeza s temperaturnim gradientom (ang. temperature
gradient gel electrophoresis)
T-RFLP polimorfizem dolžin terminalnih restrikcijskih fragmentov (ang.
terminal restriction fragment lenght polymorfism)
1 1 UVOD
Metagenomska analiza je preučevanje metagenoma (s sekvenciranjem) v vzorcu brez predhodnega gojenja mikroorganizmov/celic v laboratoriju. Tarčna metagenomika, ali t.i.
metagenetika, je analiza vzorcev s sekvenciranjem taksonomskih markerskih genov, kot sta gen za 16S ribosomalno ribonukleinsko kislino (ang. 16S ribosomal ribonucleic acid, 16S rRNA) za bakterije in regija med malo in veliko ribosomalno podenoto (ang. internal transcribed spacer, ITS) za glive, netarčna ali t.i. shotgun metagenomika pa sekvencira ves dedni material v vzorcu. Z razvojem tehnologij sekvenciranja naslednje generacije (ang. next-generation sequencing, NGS) je ta metoda postala cenovno dostopna in pogosteje uporabljena, predvsem za analizo raznovrstnosti vzorcev iz okolja. Analiza živilske mikrobne združbe je do nedavnega temeljila na metodah z gojenjem – predvsem v namen preverjanja varnosti živil (Kergourlay in sod., 2015).
Fermentirana živila so velik del tradicije, njihova priljubljenost pa stalno narašča, ne le zaradi njihovih senzoričnih lastnosti, temveč tudi njihovih zdravju koristnih u činkov. Kot taka so lahko vir probiotikov ali funkcionalnih sestavin. Metagenomska analiza fermentiranih živil lahko vodi v boljšo funkcionalno karakterizacijo živil in njihovo trajnostno pridobivanje (odprava mikrobioloških tveganj), prav tako pa v odkritje mikroorganizmov in metabolnih poti z biotehnološkim potencialom (Chen in sod., 2017).
Namen diplomskega dela je predstavitev metagenomike kot analitske tehnike in pregled raziskav na področju metagenomske analize spontano fermentiranih živil.
2 METAGENOMIKA IN MIKROBIOLOŠKA ANALIZA ŽIVIL 2.1 MIKROBIOLOŠKA ANALIZA ŽIVIL IN RAZVOJ METOD
Pri raziskavah pestrih ekosistemov kot so zrak, prst, voda, rastlinska in človeška mikrobiota (prebavni sistem, pljuča, koža), je uporaba metagenomike kot analitske tehnike vseprisotna, vendar se ta do nedavnega ni pogosto uporabljala za analizo mikrobne združbe živil, morda zaradi domnevno majhne biotske pestrosti v tem okolju, pa tudi zaradi vzpostavljenih in razmeroma učinkovitih tradicionalnih tehnik analize za regulacijo varnosti živil (metode odvisne od gojenja mikroorganizmov na ploščah) (Kergourlay in sod., 2015). Tradicionalne metode imajo nekatere pomanjkljivosti – z njimi lahko zaznamo le mikroorganizme, ki jih znamo oziroma zmoremo gojiti (ki jih lahko tudi ne identificiramo pravilno), te pa predstavljajo le majhen del dejansko prisotne mikrobne združbe v vzorcih (Giraffa in Neviani, 2001). V devetdesetih letih prejšnjega stoletja so se začele pojavljati od gojenja neodvisne metode za opisovanje mikrobnih združb, kot so: gelska elektroforeza z denaturacijskim gradientom (ang.
denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE), gelska elektroforeza s temperaturnim gradientom (ang. temperature gradient gel electrophoresis, TGGE), polimorfizem dolžin terminalnih restrikcijskih fragmentov (ang. terminal restriction fragment lenght polymorfism,
2
T-RFLP) in ostale metode, ki temeljijo na avtomatizirani verižni reakciji s polimerazo (ang.
polymerase chain reaction, PCR) in se še vedno uporabljajo za analiziranje vzorcev na podlagi analize gena za ribosomalno 16S rRNA (Kergourlay in sod., 2015). V poznem delu devetdesetih let prejšnjega stoletja je razvoj novih metod (recimo pirosekvenciranje) in razvoj komercialno dostopnih naprav oziroma tehnologije, ki temelji na teh metodah, opredelil NGS (Kergourlay in sod., 2015). NGS sekvenciranju (ki predstavlja drugo generacijo sekvenciranja, prvo generacijo sekvenciranja pa predstavlja sekvenciranje po Sangerju) se sedaj zaradi razvoja tretje generacije sekvenciranja (sekvenciranje ene molekule, ang. single-strand sekvenciranje) pogosto reče kar visokozmogljivostno sekvenciranje (ang. high-throughput sequencing, HTS) (Porter in Hajibabaei, 2018). Čeprav je uporaba teh tehnologij za analiza živilskih ekosistemov razmeroma nova in večina metagenomskih analiz živil temelji na amplikonski analizi oziroma t.i. metagenetiki, je razkrila večjo kompleksnost mikrobnih združb v živilskih vzorcih, kot je bilo predpostavljeno (Kergourlay in sod., 2015).
2.2 TARČNA METAGENOMIKA ALI AMPLIKONSKA ANALIZA
Amplikonska analiza oziroma tarčna metagenomika (ali pa tudi metagenetika) se izvaja s pomnoževanjem in sekvenciranjem taksonomsko razločevalnih označevalskih genov, kot je gen za 16S rRNA pri bakterijah in arhejah in ITS regija pri glivah, ki se lahko pomnožijo z univerzalnimi PCR oligonukleotidnimi začetniki (Chen in sod., 2017). Za gen za 16S rRNA je značilno 9 hipervariabilnih regij (V1-V9), ki skupaj s konstantnimi regijami ohranjajo funkcionalno strukturo molekule – konstantne regije služijo kot zaporedja za prileganje univerzalnih oligonukleotidnih začetnikov, variabilne pa kot taksonomski označevalci za identifikacijo mikroorganizmov. Običajno se v analizah vzorcev analizira kombinacija hipervariabilnih regij, da se zajame večja pestrost organizmov (Vargas-Albores in sod., 2019).
Po sekvenciranju sledi uporaba vrste bioinformacijskih orodij za razdeljevanje zaporedij v operativne taksonomske enote (ang. operational taxonomic unit, OTU), ki se nato primerjajo s podatki v podatkovnih zbirkah, za kar se lahko uporabijo bioinformacijske strategije (ang.
pipeline) dostopne v paketih tehnologij sekvenciranja ali pa odprtokodna programska oprema (Vargas-Albores in sod. 2019). Večina bioinformacijskih strategij sledi istemu zaporedju dejanj – očiščevalni proces, klastriranje oziroma razdeljevanje sekvenciranih zaporedij v operacijske taksonomske enote (OTU, ki se uporabijo tudi za določanje pojavnosti oziroma številčnosti vrst v vzorcu/vzorcih), določanje taksonomskih skupin in ocena oziroma določanje raznolikosti/raznovrstnosti (alfa in beta diverziteta) z različnimi indeksi v vzorcu/vzorcih (Vargas-Albores in sod., 2019).
2.3 NETARČNA ALI SHOTGUN METAGENOMIKA
Netarčna metagenomika je metoda netarčnega sekvenciranja vseh genomov prisotnih v vzorcu.
Tipična analiza z uporabo tarčne metagenomike je sestavljena iz petih korakov: zbiranje, procesiranje in sekvenciranje vzorcev, predprocesiranje sekvenčnih odčitkov, analiza sekvence
3
za določanje taksonomskih in funkcionalnih lastnosti, statistična in biološka analiza; validacija (Quince in sod., 2017). Po izolaciji deoksiribonukleinske kisline (ang. deoxyribonucleic acid, DNA) iz vzorca se pripravi knjižnica, DNA se fragmentira in na konce fragmentov se ligirajo adapterske sekvence (kratki specifični oligonukelotidi, ki vsebujejo mesta za vezavo PCR oligonukleotidnih začetnikov za sledeči korak pomnoževanja fragmentov preden se jih sekvencira, lahko pa tudi barcode zaporedje za razločevanje vzorcev, če jih hkrati sekvenciramo več) (Martin in sod., 2018). Sledi sekvenciranje in kontrola kakovosti odčitkov, ki se jih lahko nato sestavi v kontige (de novo assembly) in genome, lahko pa se jih samo neposredno mapira na gene in genome dostopne na podatkovnih zbirkah, s čimer lahko določimo profil vrst in metabolnih poti prisotnih v vzorcu (Quince in sod., 2017). Med kontrolo kakovosti odčitkov se odstranijo podvojene regije in predvidene kontaminacije vzorca (Martin in sod., 2018).
Netarčna metagenomika lahko poleg prokarionstkih in evakrionstkih vrst v vzorcu razkrije tudi prisotnost virusov, kot recimo v analizah živil, ki so jih izvedli Jung in sod. (2011) in Park in sod. (2011).
2.4 (META)OMSKI PRISTOPI
V kolikor nam tarčna in netarčna metagenomika podata informacije o prisotnih vrstah in genih (in s tem opis potencialnih metabolnih poti), imata tudi nekaj pomanjkljivosti – pri tarčni metagenomiki lahko pride do pojava t.i. PCR bias (PCR pristranskosti) – zaradi večje afinitete vezave oligonukleotidnih začetnikov na zaporedja določenih taksonomskih skupin, kot recimo v analizi spontane fermentacije vina, ki so jo izvedli Sternes in sod. (2017), lahko pa se zaradi temu nasprotujočega pojava (slaba afiniteta vezave oligonukleotidnih začetnikov) določenih prisotnih mikroorganizmov pri analizi vzorca sploh ne zaznamo, kot v analizi varnosti fermentiranega mlečnega izdelka nunu, ki so jo izvedli Walsh in sod. (2017). Netarčna metagenomika nekatere izmed pomanjkljivosti odpravi, vendar s to metodo ne moremo opisati aktivno prepisujočih se oziroma aktivno izraženih genov, ki bi omogočali točnejši vpogled v dogajanje v vzorcu – za to uporabimo metodo imenovano metatranskriptomika, s katero se analizira v vzorcu prisotno RNA (Chen in sod., 2017). Metaproteomika je analiza vseh v vzorcu prisotnih proteinov v času odvzema vzorca, njihove strukture in funkcije, s čimer analiziramo dejansko sintezo proteinov in tako poznamo ključne proteine v proizvodnji metabolitov, vendar je zelo odvisna od uspešnosti ekstrakcijskih in separacijskih tehnik uporabljenih v študiji (Vaccalluzzo in sod., 2020). Metabolomika je analiza majhnih hlapnih ali nehlapnih molekul v vzorcu, kar nam predstavi fiziološko stanje mikroorganizmov v vzorcu in njihovih odzivov na okolje (Vaccalluzzo in sod., 2020). Skupaj nam omski pristopi omogočajo boljši vpogled v mikrobne združbe prisotne v vzorcu, v njihove vloge v ekosistemski niši in njihove interakcije.
4 3 SPONTANO FERMENTIRANA ŽIVILA
3.1 SPONTANO FERMENTIRANA ŽIVILA IN RAZNOVRSTNOST
Tradicionalno fermentirana živila so se razvila kot način konzerviranja hrane (zmanjšana možnost kontaminacije zaradi nastanka organskih kislin, alkoholov, bakteriocinov ipd.) in so definirana z nadzorovano mikrobno rastjo in pretvorbo komponent, kar spremeni lastnosti živila (nove teksture in arome). Fermentacije živil lahko delimo po glavnem produktu (alkohol, mlečna kislina, ocetna kislina, propionska kislina…) ali pa po substratu. Obstaja veliko različnih vrst fermentiranih živil in vsaka kultura uživa vsaj eno izmed njih – v prehrani po svetu so vseprisotna. Proizvaja se jih lahko s spontano fermentacijo (fermentacijo izvajajo mikroorganizmi, ki so prisotni v substratu ali v okolju), z metodo fermentiranja s preostankom prejšnjega produkta, ali pa z dodatkom starterske kulture – inokuluma (to se pogosteje pojavlja na industrijski ravni, predvsem na Zahodu). Nekatera spontano fermentirana živila imajo pogosto res le nekaj dominantnih prisotnih taksonov, vendar je pogosta razlika v prisotnih sevih, populacijski dinamiki, raznovrstnosti vrst in številčnem razmerju med vrstami, zaradi različnih substratov, obdelave živila, bližnjega okolja in možnih virov kontaminacije pri proizvodnji živila. Že majhna razlika v pestrosti in številčnosti lahko opazno vpliva na potek fermentacije ter spremeni kakovost in senzorične lastnosti živila (Marco in sod., 2017).
3.2 SPONTANO FERMENTIRANA ŽIVILA IN VARNOST
Spontana fermentacija je odvisna od mikroorganizmov prisotnih v substratu in okolju – postopki zato običajno ne vključujejo sterilizacije in aseptičnega dela, prav tako je takšna fermentacija običajno odprt proces, tradicionalni postopki pa se tudi manj ukvarjajo s vprašanjem varnosti živila. Zaradi tega imajo spontano fermentirana živila večjo verjetnost, da so kontaminirane s patogenimi mikroorganizmi, kot so jih zaznali v analizah nekaterih fermentiranih živil (Walsh in sod., 2017; Wang in Shao, 2018). Prav tako raznolikost njihovih mikrobnih združb pomeni različno kakovost fermentacije in s tem konzerviranja živil, kvar kot posledica prisotnosti kvarljivcev pa pomeni izgubo živila. Z uporabo metod, kot sta metagenetika in metagenomika, lahko identificiramo kvarljivce in patogene mikroorganizme, ter analiziramo sestavo in interakcije mikrobne združbe med potekom fermentacije in shranjevanja, optimiziramo parametre teh procesov, ter tako izboljšamo kakovost živil (senzorične lastnosti) in zmanjšamo mikrobiološko tveganje proizvodnje tovrstnih živil (Kergourlay in sod., 2015).
5
4 PREGLED METAGENOMSKIH ANALIZ SPONTANO FERMENTIRANIH ŽIVIL 4.1 FERMENTIRANA MLEČNA ŽIVILA
Proizvodnja kefirja poteka z uporabo kefirnih zrn. V metagenetski študiji so Korsak in sod.
(2015) določili nekaj glavnih bakterijskih vrst prisotnih v vzorcih kefirja in kefirnih zrn, ki so jih analizirali, in sicer: Lactobacillus kefiranofaciens, Lactococcus lactis (cremoris), Gluconobacter frateurii, Lactobacillus kefiri, Acetobacter orientalis in Acetobacter lovaniensis. Določili so tudi 3 glavne prisotne vrste gliv: Naumovozyma spp., Kluyveromyves marxianus in Kazachstania khefir. V enem izmed vzorcev zrn in kefirja je bila opazna razlika v deležu nekaterih vrst – v primerjavi z ostalimi so vsebovala veliko višji delež bakterij vrst Lactococcus lactis in Leuconostoc mesenteroides – zrna so od ostalih bila tudi manjša, njihov produkt (kefir) pa je imel nižji pH, kar je verjetno bil posledica manjšega deleža bakterij Lactobacillus kefiranofaciens.
Walsh in sod. (2017) so izvedli metagenetsko in metagenomsko analizo varnosti fermentiranega mlečnega napitka iz Gane, imenovanega nunu in pridelanega iz surovega kravjega mleka, ki je razkrila, da so izmed prisotnih mikroorganizmov v večini vzorcev bile prevladujoče bakterije iz rodu Streptococcus (vrsta Streptococcus infatarius), pri enem izmed njih pa iz rodu Lactococcus (Lactoccocus lactis). V vseh vzorcih so zaznali prisotnost rodu Staphylococcus. V nekaterih vzorcih so zaznali rodova Macrococcus in Enterococcus, v določenih pa je bilo možno zaznati tudi visok delež enterobakterij, prisotne so bile vrste Enterobacter cloacae, Escherichia coli (eden izmed odkritih sevov je proizvajalec enterotoksinov) in Klebsiella pneumoniae (ki je niso zaznali z amplikonsko analizo, le z metagenomsko). Večina metagenoma je bila povezana z metabolizmom ogljikovih hidratov, nukleinskih kislin in proteinov, vendar je bilo prisotno tudi veliko število genov, povezanih s horizontalnim genskim prenosom in virulenco (zaporedja fagov in profagov, transpozonski elementi, geni za ohranjanje plazmidov, geni za beta-laktamaze, geni odpornosti na polimiksin in meticilin …), ki se večinoma povezujejo z bakterijami Enterobacteria, ki imajo različen izvor kontaminacije (Walsh in sod., 2017).
Fermentacija v siru se običajno začne z mlečnokislinskimi bakterijami, prisotne mikrobne združbe pa so lahko tako inokulum, kot mikroorganizmi, ki izvirajo is surovih substratov, ki v kasnejših fazah fermentacije prevladujejo (Kergourlay in sod., 2015). V analizi površine sira so Wolfe in sod. (2014) odkrili prevladujočih 14 bakterijskih in 10 glivnih rodov, večina izmed odkritih vrst ni bila starterskih kultur, vključno z nekaterimi vrstami, ki jih v živilih še niso odkrili, katerih vloga je zaenkrat še nepojasnjena, kot sta recimo rodova Yaniella in Nocardiopsis, močno prisotne so bile halotolerantne bakterije (rodovi Vibrio, Halomonas, Pseudiakteromonas in različne gama-proteobakterije), ki se jih običajno najde v morskih okoljih (Wolfe in sod., 2014). Večje razlike med mikrobnimi združbami površine sira je bilo možno povezati z načinom priprave sira in ne z geografsko lokacijo ali obdelavo in izvorom mleka. Prav tako so pomembni okoljski parametri, kot je vlažnost, ki se je izkazala kot najboljši
6
pokazatelj mikrobne sestave površine sira, gliva Galactomyces in štirje rodovi iz debla Proteobacteia so bolj prisotni v vlažnih pogojih, rodovi Scopulariopsis, Aspergillus, Actinobacteria in Staphylococcus pa so bolj prisotni na suhih površinah. Za pojav nekaterih vrst pa je bila pomembna sama sestava mikrobne združbe – oziroma prisotnost drugih vrst (Wolfe in sod, 2014). Analiza trdih sirov (Wolfe in sod., 2014), ki se spirajo s slanico, je pokazala prisotnost genov iz metabolnih poti produkcije metionina in cisteina ter hlapnih aromatičnih spojin, kot je metanetiol. Prav tako so bili prisotni geni za razgradnjo valina, levcina in izolevcina, razpadni produkti siru dajo zatohlo aromo. Ugotovitev študije sira Wolfe in sod. (2014) je, da imajo prav neinokulirane vrste ključno vlogo v mikrobni združbi površine sira. Escobar-Zepeda in sod. (2016) so v raziskavi sira Cotija (spontana fermentacija surovega mleka z dodatkom soli) ugotovili, da so tri vrste predstavljale večino mikrobne združbe, in sicer; Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides in Weissella paramesenteroides, precej prisotnih pa je bilo tudi nekaj vrst iz rodov Aerococcus, Enterococcus, Lactococcus in Staphylococcus, v vzorcih so odkrili tudi večje število halotolerantnih in halofilnih bakterij (rodova Alkalibacterium in Marinilactibacillus, vrsta Tetragenococcus halophilus), pa tudi majhen delež potencialno patogene vrste Escherichia coli ter rodov Klebsiella, Enterobacter, Campylobacter, ki so verjetno vir identificiranih genov povezanih z bakteriocini in bakteriocidno odpornostjo.
4.2 ALKOHOLNE PIJAČE
Metagenomska analiza poteka spontane fermentacije mošta med različnimi fazami fermentacije, ki so jo izvedli Sternes in sod. (2017) je pokazala, da je v različnih fazah bilo možno zaznati precejšno pestrost (ki vpliva na hitrost fermentacije – najbolj pestri vzorci fermentirajo najpočasneje zaradi počasnejše vzpostavitve glavne fermentativne mikrobne združbe) pred začetkom fermentacije, mikrobna združba pa se je nato spremenila tako, da jo je večinoma sestavljala Saccharomyces cerevisiae. Pred fermentacijo so tako bili prisotni rodovi Metschnikowia (vrsta Metschnikowia pulcherrima), Hanseniaspora (vrste H. uvarum, H.
opunitae, H. osmophila, H. vineae, H. guiliermondii), Rhodotorula, Cladosporium, Aureobasidium in bakterijski rodovi Acetobacter, Curtobacterium, Lactobacillus in Oeunococcus (Oenococcus oeni), v vzorcih so zaznali tudi rastlinske patogene (Pseudomonas syringae in Tatumella ptyseos), ki pa se med fermentacijo niso ohranili (Sternes in sod., 2017).
V metagenetski analizi malolaktične fermentacije mošta, ki so jo izvedli Berbegal in sod.
(2019), primerjava inokuliranega in neinokuliranega mošta je pokazala, da malolaktični bakterijski konzorcij sestavljajo mlečnokislinske bakterije iz rodov Oenococcus, Lactobacillus in Lactococcus. V neinokuliranih vzorcih so bile prisotne bakterije iz rodov Acetobacter in Gluconobacter (nastanek ocetne kisline), ki pa jih v inokuliranih vzorcih ni bilo veliko, domnevno zaradi selekcijskega pritiska, ki ga je izvajala S. cerevisiae, upad deleža rodov kvarljivcev pa je povzročilo povišanje deleža prisotnosti rodu Oenococcus, ki je pomemben za malolaktično fermentacijo, koinokulacija s temi vrstami lahko izboljša končni produkt.
7
Zanimivo je, da so v vzorcih z analizo zaznali tudi prisotnost cianobakterij, vendar so ti odčitki verjetno kloroplasti grozdnih celic Vitis vinifera (Berbegal in sod., 2019).
Pri metagenetski analizi raznovrstnosti mikrobne združbe pri proizvodnji korejskega riževega piva (makgeolli), narejenega iz poparjenega riža, ki so jo izvedli Jung in sod. (2012) so v analiziranih vzorcih pri fermentaciji sodelovale kvasovke in bakterije (kvasovke so pri fermentaciji v vzorcih imele prevladujočo vlogo): v komercialnih vzorcih je prevladovala kvasovka S. cerevisiae (ki je bila prevladujoča vrsta kvasovk tudi pri tradicionalni pridelavi) in bakterije iz rodu Lactobacillus, v vzorcih iz tradicionalne pridelave pa so bile hkrati s S.
cerevisiae prisotne tudi kvasovke iz rodov Pichia in Sacchromycopsis in bakterije iz rodov Pediococcus, Weisella, Enterococcus in Lactococcus.
Tradicionalna kitajska riževa vina se proizvajajo s saharifikacijo in fermentacijo riža z uporabo starterske kulture, ki je mešanica mnogih mikroorganizmov (prisotnih v okolju in v substratu).
Metagenetska analiza raznolikosti različnih starter kultur, ki so jo izvedli Chen in sod. (2021) je kot dominante bakterije razkrila rodove Pantonea (potencialni patogen in proizvajalec rumenega pigmenta), Pediococcus, Lactobacillus, Acetobacter, Leuconostoc, Weissella, Bacillus, Lactococcus in Ochrobactrum, kot dominante rodove gliv pa Rhizopus, Candida, Aspergillus, Mucor, Bullera, Wickerhamomyces, Pichia, Gibellulopsis, Phaeoacremonium in Devriesia. Xie in sod. (2013) pa so pokazali, da med fermentacijo in procesiranjem tradicionalnega kitajskega riževega vina zavzemajo največji delež bakterijske populacije rodovi Saccharopolyspora, Bacillus in Staphylococcus. V isti analizi so opazili, da se je mikrobna združba spreminjala med fermentacijo – na začetku so bile prisotne bakterije iz prsti (deblo Actinobacteria), nato pa so prevladale bakterije pomembne za fermentacijo (debli Firmicutes in Proteobacteria), precej očitna pa je bila tudi razlika v metabolizmu – med fermentacijo (v nekoliko kasnejšem obdobju) se je povečal delež genov za metabolizem in transport aminokislin in nukleotidov, zmanjšal pa se je delež genov povezanih s sekundarnim metabolizmom in obrambnimi mehanizmi. Zaradi tradicionalnega procesa proizvajanja kitajskega riževega vina ali pa kitajskih žganj se lahko v tradicionalnih alkoholnih pijačah pojavijo tudi bakterije iz rodu Streptomyces, ki sintetizirajo geozmin (nekatere izmed njih), ki povzroča neprijeten oziroma nezaželen okus po zemlji, vendar so Zhi in sod. (2016) ugotovili, da bi lahko prisotnost določenih sevov bakterij iz rodu Bacillus odpravila takšno težavo, saj so lahko z njimi izvajali biokontrolo.
4.3 FERMENTIRANA ZELENJAVA
V študiji so Einson in sod. (2018) analizirali mikrobno združbo fermentiranega zelja in površine proizvodnega obrata, da bi ugotovili od kod izvirajo mikrobne vrste v produktu. Prevladujoči rodovi med fermentacijo zelja so bili Lactobacillus, Lactococcus in Leuconostoc – najpogostejše vrste so bile Lactobacillus lactis lactis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus rhamnosus in Lactobacillus brevis, katerih delež je med samo fermentacijo postopoma upadel. V fermentacijskih procesih je bilo možno zaznati tudi bakterije iz družin
8
Streptococcaceae in Propionibacteriaceae, katerih izvor je moč pripisati človeku. Družine Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae in Comamonadaceae, najdene v tej raziskavi, so izvirale iz surove zelenjave in so kot take bile prisotne predvsem v delih proizvodnega obrata, kjer se ravna s surovo zelenjavo (Einson in sod., 2018).
Park in sod. (2011) so analizirali viruse prisotne na kislem zelju (samo viruse z dvojnovijačno DNA (ang. double-stranded DNA, dsDNA) viruse, saj uporabljena tehnologija amplificira samo te), kot najbolj prisotna družina virusov se je izkazala družina Siphoviridae, prisotna pa je bila tudi družina Myoviridae. Gostiteljske vrste za prisotne viruse so bile iz rodov Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Bacillus.
Kimči je tradicionalno korejsko živilo, ki se pripravi s fermentiranjem soljene zelenjave z različnimi začimbami. Obstaja mnogo različnih vrst glede na zelenjavo, ki se uporabi v pripravi, vendar lahko definiramo splošno delitev na običajni in vodeni kimči (Jeong in sod., 2013a). V metagenomski analizi raznovrstnosti in metabolnega potenciala mikrobne združbe v kimčiju, ki so jo opravili Jung in sod. (2011), so avtorji izpostavili, da so imele glavno vlogo pri fermentaciji kimčija heterofermentativne mlečnokislinske bakterije, ki v procesu fermentacije metabolizirajo monosaharide, oligosaharide in polisaharide in proizvajajo mlečno kislino (pa tudi ostale produkte kot sta acetion in butandiol) – delež genov za omenjene metabolne poti se je v analiziranih vzorcih med potekom fermentacije precej povečal. V metagenomskih analizah kimčija so bili prevladujoči bakterijski rodovi Lactobacillus, Leuconostoc in Weissella (Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus sakei, Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Weissella cibaria…), populacija so je med potekom fermentacije precej spreminjala, vendar je na koncu fermentacije kot najbolj pogost rod ostal Leuconostoc, tako v običajnem kot vodenem kimčiju (Jung in sod., 2011; Jeong in sod., 2013a; Lee in sod., 2017). V analizi spreminjanja mikrobne združbe med fermentacijo vodenega kimčija, ki so jo opravili Jeong in sod. (2013a), so bile v vzorcih prisotne tudi kvasovke iz rodov Saccharomyces in Candida, ki pa so imele s prisotnimi bakterijami antagonistične interakcije. V analizi na kimčiju prisotnih virusov, ki so jo opravili Park in sod. (2011) so najbolj prisotni virusi iz družine Podoviridae, prisotni pa so tudi virusi iz družine Phyconaviridae, ki so najbrž morskega izvora, prisotnost bakteriofagov v vzorcih pa je pokazala tudi analiza kimčija, ki so jo izvedli Jung in sod. (2011), saj so bile v metagenomu prisotne CRISPR sekvence in geni za proteine virusne kapside. Na sestavo mikrobne združbe lahko vpliva kislost, temperatura, prisotnost bakteriofagov in predvsem slanost, saj so v nasprotju s pričakovanji komercialni vzorci kimčija v analizi, ki so jo izvedli Lee in sod. (2017) pokazali večjo mikrobno pestrost, kot domače pripravljeni vzorci, saj se komercialno proizveden kimchi zaradi preference kupcev manj soli (Lee in sod., 2017). Jeong in sod. (2013b) so v svoji analizi pokazali, da je eden izmed dejavnikov, ki vpliva na mikrobno združbo tudi dodatek rdeče paprike v prahu, ki je v tej analizi močno koreliral s prisotnostjo rodu Weissella v kimčiju in počasnejšim procesom fermentacije.
9
Pao cai je kitajsko fermentirano zelje, ki se fermentira z dodatkom slanice. Primerjava vzorcev, ki sta jih v izvedeni študiji Wang in Shao (2018) najprej sterilizirala, nato pa fermentacijo izvedla na dveh različnih lokacijah, da bi primerjala vpliv lokalne mikrobne združbe na fermentacijo živila in vsebnost nitrita, je pokazala, da je najpogostejši rod v vzorcih bil Lactobacillus (najpogostejša vrsta Lactobacillus curvatus). Severni in južni (različna kraja fermentacije) pao cai pa sta se precej razlikovala v mikrobni združbi na nivoju rodov, prav tako pa tudi na nivoju vrst – predvsem deležu prisotnosti pri vrstah Lactobacillus fermentum in Lactobacillus delbrueckii. V vzorcih so našli nekaj genov, povezanih z redukcijo nitrita – ti korelirajo z rodovoma Lactobacillus in Weissella (ki sta v večjem deležu bila prisotna v južnih vzorcih), v južnih vzorcih pa je tudi več prisotnega rodu Acetobacter s probiotičnim potencialom. Analiza je razkrila tudi prisotnost patogenih bakterij iz rodov Escherichia- Shigella in Morganella (ta rodova sta bila bolj prisotna v severnih vzorcih).
4.4 ČAJ IN KAKAV
Pri metagenomski analizi fermentacije kakavovih zrn so kot prevladujoče prisotne vrste določili Lactobacillus fermentum, Acetobacter pasterianus, Hanseniaspora uvarum, Hanseniaspora opunitae, Saccharomyces cerevisiae, prisotne pa so bile tudi Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Oenococcus oeni… (Illeghems in sod., 2012; Illeghems in sod., 2015). Rekonstrukcija metabolizma mlečnokislinskih bakterij je pokazala gene za asimilacijo mnogih ogljikovih hidratov, kot so saharoza, fruktoza, manitol, citrat, večinoma povezanih s heterolaktično potjo in produkti heterofermetativne vrste Lactobacillus plantarum, prisotnih je bilo tudi nekaj genov za peptidaze in aminotransferaze, povezane s produkcijo arom, pa tudi geni sinteze serina, metionina in arginina (Illeghems in sod., 2015). Bakterije iz velike družine Enterobacteriacaeae (rodovi Panteia, Serratia, Erwinia) so v analiziranih kakavovih zrnih prispevali gene za mešano kislinsko fermentacijo, glukoneogenezo in predvidoma gene za bakteriocine in odpornost na antibiotike, ki so jih odkrili v vzorcih (Illeghems in sod., 2015).
Ocetnokislinske bakterije v analiziranih zrnih so povezane s pretvorbo alkohola (Illeghems in sod., 2015). Za razgradnjo pektina na kakavovih zrnih so bile odgovorne najdene poligalakturanaze (družina Enterobacteriacaeae in rod Lactobacillus) in ena endopoligalakturonat liaza (pripada deblu Proteobacteria) (Illeghems in sod., 2015). Glavno vlogo pri procesiranju kakavovih zrn imata heterofermetativna vrsta Lactobacillus fermentum in etanoloksidirajoča vrsta Acetobacter pasteurianus (Illeghems in sod., 2015).
Pu-erh/puer je temni čaj iz Yunnan province na Kitajskem. Prevladujoče bakterije, ki so jih našli v vzorcih v analizah, so bile iz debel Proteobacteria, Actinobacteria in Firmicutes (družine Bacillaceae, Comamonadaceae, Pseudoalteromonadacae, Pseudomonadaceae, Phyllobacteriaceae, Vibrionaceae), prisotni rodovi gliv pa so bili Yarrowia, Saccharomyces, Rasasonia, Thermomyces in predvsem Aspergillus (Lyu in sod., 2013; Zhao in sod., 2019).
Fermentacija poteka v anoksičnih pogojih, zato je bilo v analiziranih vzorcih prisotnih precej
10
genov za oksidativni in ozmotski stres; prisotni pa so bili tudi geni za metabolne poti sekundarnega metabolizma – metabolizem terpenoidov, poliketidov in ostalih sekundarnih metabolitov: odkrite sekvence so povezane s sintezo kafeina, flavonoida, tropana, piperidina, ki se povezujejo z okusom in aromo tega čaja (Lyu in sod., 2013).
Kombuča je fermentiran sladkan čajni napitek. V metagenomskih analizah so odkrili, da so bile v vzorcih prisotne bakterije iz družine Acetobacteriaceae, predvsem iz rodov Komagataeibacter in Acetobacter, najbolj pogosto prisotni pa sta bili vrsti Komagataeibacter xylinus in Komagataeibacter rhaeticus (Marsh in sod., 2014; Arıkan in sod., 2020; Villarreal-Soto in sod., 2020). V vzorcih so se prevladujoče populacije gliv precej razlikovale, vendar je v analizah kot ena izmed prevladujočih vrst bila zaznana vrsta Zygosaccharomyces bailii (Marsh in sod., 2014; Arıkan in sod., 2020; Villarreal-Soto in sod., 2020). V analizi metagenoma kombuče, ki so jo opravili Arıkan in sod. (2020) so odkrili prisotnost operonov celuloze sintaze (rod Komagateibacter), ki povzročajo nastanek celulozne membrane oziroma biofilma, ki je značilen za kombučo (se uporablja tudi kot starterska kultura pri nekaterih fermentacijah kombuče), genom vrste Komagataeibacter rhaeticus pa je vseboval gene za biosintezo B1, B7 in B12, ki bi jih lahko ostali prisotni mikroorganizmi (Zygosaccharomyces bailii) porabili za rast (Arıkan in sod., 2020). V metagenomu so bili prisotni tudi geni za biosintezo gama- aminobutanojske kisline (ang. gamma-aminobutyric acid, GABA), predvidoma iz genoma Zygosaccharomyces bailii, geni za biosintezo terpenov (značilen vonj), na plazmidni DNA pa so našli tudi gene iz družine baker-vezavnih proteinov, ki bi lahko pojasnili bioabsorbtivno lastnost kombuče (Arıkan in sod., 2020).
4.5 FERMENTIRANA SOJINA ŽIVILA
Eden izmed poznanih tradicionalno fermentiranih sojinih izdelkov, ki se uporablja v proizvodnji živil, kot so daijiang, miso, doenjangin thua-nao, je daijiang-meju (zorjene sojine kocke). Metagenomska anliza, ki so jo izvedli Xie in sod. (2019) je razkrila kot najbolj prisotna rodova Enterobacter in Enterococcus, v velikem številu pa tudi prisotnost rodov Leuconostoc, Lactobacillus, Rhizopus, Geotrichum, Citrobacter, Penicillium, Leclercia. Dodatno so v vzorcih zaznali tudi prisotnost potencialnih patogenih mikroorganizmov – rodovi Escherichia, Staphylococcus in Salmonella. Ena izmed ugotovitev analize je tudi, da naj bi bili z glikolizo povezani encimi tisti, ki najbolj prispevajo k okusu tega izdelka.
Metagenetska analiza dveh tipov (tip Mucor in tip Aspergillus) fermentiranega produkta douchi (fermentirana črna sojina zrna, za izdelavo koji-kulture), ki so jo izvedli He in sod. (2019) je pokazala, da so se vzorci teh dveh tipov živila ujemali v več kot polovici prisotnih rodov – prevladujoči so bili rodovi Aspergillus, Candida (naj bi bil ključen rod za razvoj okusa), Meyerozyma in Lecenicillium (zadnja dva rodova sta najbolj prisotna na začetku bioprocesa, rod Candida pa na koncu bioprocesa). Na začetku bioprocesa je mikrobna združba prisotna v tipu Mucor vsebovala višji delež rodu Aspergillus, kot tip Aspergillus, čeprav je ta delež proti koncu bioprocesa upadel, tako da se je izenačil z deležem prisotnim v mikrobni združbi tipa
11
Aspergillus. Sam tip Mucor je imel tudi bolj pestro mikrobno združbo, kar se povezuje tudi z večjo prisotnostjo aminokislin in maščobnih kislin (He in sod., 2019).
V analizi šestmesečnega bioprocesa nastanka tradicionalne kitajske sojine omake, ki so jo izvedli Sulaiman in sod. (2014), so v mikrobni združbi na začetku prevladovale bakterije iz rodov Weissella, Lactobacillus in Leuconostoc, po drugem mesecu pa so jih začele nadomeščati in v končnem delu bioprocesa nadomestile kvasovke iz rodu Candida. Rekonstrukcija metagenoma v isti študiji je pokazala prisotnost genov povezanih z glikolizo, ciklom citronske kisline in pentozafosfatno potjo, gene za metabolne poti za produkcijo arom: metabolizem arginina, prolina, alanina, aspartata in glutamata. Metabolni potencial mikrobne združbe v slanici tradicionalne sojine omake pa je razkril tudi gen za citokrom bd kompleks (proces oksidativne fosforilacije), povezan z višjo afiniteto do kisika v anoksičnih pogojih; ter poti povezane z detoksifikacijo formaldehida pri bakterijah.
4.6 FERMENTIRANI MORSKI IN MESNI IZDELKI
Neinokulirane fermentirane klobase, ki so jih analizirali Ferrocino in sod. (2018) med vzorci kažejo precejšnjo raznolikost prisotnih vrst in deležev, med najbolj številčnimi identificiranimi vrstami so Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Staphylococcus xylosus, Leuconostoc sp., Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis in tudi rodovi Acinetobacter, Pseudomonas in Propionibacterium. V analizi metagenom in volatom neinokuliranih klobas primerjajo z inokuliranimi klobasami – metabolne poti, ki so jih našli v inokuliranih vzorcih v bolj zgodnji časovni fazi, so se v neinokuliranih vzorcih pojavile kasneje med potekom fermentacije (počasnejša rast mikroorganizmov), prisotnost mlečnokislinskih bakterij (L. lactis, L. brevis in L. citreum) v neinokuliranih klobasah pa se je povezovala s prisotnostjo estrov, kar vpliva na senzorične lastnosti, ki so v bile članku bolje ocenjene kot v primeru inokuliranih klobas (Ferrocino in sod., 2018).
Mikrobiota fermentiranih morskih izdelkov je zelo odvisna od mikrobnih združb prisotnih na sestavinah, naključno prisotnih vrstah in selekcijskih pogojih, sama fermentacija je manj nadzorovana kot pri mlečnih izdelkih in vinu, vendar je vseeno možno opaziti pomembno vlogo mlečnokislinskih bakterij, še posebej mlečnokislinskih bakterij iz rodu Lactobacillus (Kergourlay in sod., 2015).
Moderni japonski sushi izvira iz tradicionalne japonske jedi imenovane kaburezushi (fermentiranje z dodatkom kaljenega riža – kot slad) in ta iz njegovega predhodnika imenovanega narezushi (fermentacija soljenih rib in kuhanega riža za več kot 4 tedne). Analiza jedi narezushi, ki so jo opravili Kiyohara in sod. (2012), je kot najbolj prisotni rod izpostavila Lactobacillus, ostali prevladujoči rodovi pa so bili tudi Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Pseudomonas in Clostridium; v začetni fazi sta bili prevladujoči vrsti Lactobacillus brevis in Lactobacillus plantarum, ki sta vztrajali tudi med celotnim procesom fermentacije (in sta kot heterofermentativna mikrorganizma morda vir v vzorcih zaznane
12
mlečne in ocetne kisline, čeprav bi vir ocetne kisline lahko bil tudi kis, s katerim se ribe spirajo), ob koncu fermentacije pa Lactobacillus sakei in Pediococcus ethanolidurans. Koyanagi in sod.
(2013) so analizirali kaburazushi, ki poda podobne rezultate kot metage netska analiza narezushija – mikroorganizmi s pomembno vlogo pri fermentaciji so bile vrste iz rodu Lactobacillus, a šele v končnih fazah fermentacije (prevladujoča je bila vrsta Lactobacillus sakei), na začetku pa sta prevladovala rodova Staphylococcus in Bacillus, ki ju je nato v veliki meri nadomestil rod Lactobacillus (s svojo rastjo in produkti fermentacije je zavrl rast ostalih bakterij).
Fermentirana korejska morska hrana se imenuje jeotgal, deli pa se na več različnih vrst, glede na to katera morska živalska vrsta se soli in fermentira. Saeu-jeot je jed iz majhnih fermentiranih morskih škampov vrste Acetes japonicus. Lee in sod. (2014) so raziskovali vpliv temperature pri kateri poteka fermentacija, da bi ugotovili katera je najbolj primerna za produkcijo varne in kakovostne tovrstne jedi. Začetna mikrobna združba na vzorcih saeu-jeota je bila sestavljena iz rodov Pseudoalteromonas, Photobacterium, Vibrio, Aliivibrio in Enterovibrio, ki so prisotni na škampih (za vrste iz nekaterih naštetih rodov poznamo potencialno patogene seve), zaradi visoke slanosti pa je številčnost teh rodov upadla, raznovrstnost mikrobne združbe pa se je posledično povečala. Hitrost upada številčnosti je bila odvisna od temperature – pri najnižji preizkušani temperaturi (10 °C) je do upada prišlo najkasneje, kar nakazuje, da to morda ni najbolj primerna temperatura fermentacije, za najbolj primerno se je v tej študiji izkazala temperatura 15 °C. Po upadu so bili prevladujoči rodovi v mikrobni združbi sledeči:
Psychrobacter, Staphylococcus in Alkalibacillus, ob koncu fermentacije pa je bil to rod Halanaerobium. Prisotnost tega rodu se povezuje z metabolizmom glukoze in glicerola, ter produkcijo acetata, butirata in metilaminov, ki niso zaželeni v živilu, zato je fermentacijo priporočljivo ustaviti po upadu številčnosti rodov potencialnih patogenov in preden bakterije iz rodu Halanaerobium začnejo proizvajati neželene produkte (Lee in sod., 2014). Park in sod.
(2011) so pri analizi dsDNA virusov v fermentiranih škampih zaznali prisotnost virusov iz družine Siphoviridae in družine Phyconaviridae, ki najbrž izvirajo iz morja, saj okužujejo tudi fitoplankton.
13
4.7 POVZETEK METAGENOMSKIH ANALIZ FERMENTIRANIH ŽIVIL
Preglednica 1: Povzetek prevladujočega/prevladujočih rodov ali vrst v nekaterih spontano fermentiranih živilih
Fermentirano živilo Prevladujoč rod/vrsta Vir/referenca
Kefir Lactobacillus kefiranofaciens Korsak in sod. (2015)
Nunu Streptococcus infantarius, Lactococcus lactis Walsh in sod. (2017) Sir Cotija Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides,
Weissella paramesenteroides
Escobar-Zepeda in sod.
(2016)
Vino S. cerevisiae, Oenococcus oeni Berbegal in sod. (2019)
Riževo vino Saccharopolyspora, Bacillus, Staphylococcus Xie in sod. (2013) Kislo zelje Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc Einson in sod. (2018)
Kimči Lactobacillus, Leuconostoc, Weissella
Jung in sod. (2011), Jeong in sod. (2013a), Lee in sod. (2017)
Pao cai Lactobacillus curvatus Wang in Shao (2018)
Kakavova zrna Lactobacillus fermentum, Acetobacter pasterianus Illeghems in sod. (2015)
Kombuča Komagataeibacter, Acetobacter, Zygosaccharomyces bailii
Marsh in sod. (2014), Arıkan in sod. (2020), Villarreal-Soto in sod.(2020)
Daijiang-meju Enterobacter, Enterococcus Xie in sod. (2019)
Douchi Aspergillus, Candida He in sod. (2019)
Sojina omaka Weissella, Lactobacillus, Leuconostoc, Candida Sulaiman in sod. (2014) Fermentirane
klobase
Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Staphylococcus
xylosus, Leuconostoc sp. Ferrocino in sod. (2018)
Narezushi Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum Kiyohara in sod. (2012)
Kaburazushi Lactobacillus sakei Koyanagi in sod. (2013)
V preglednici 1 so povzeti rezultati metagenomskih analiz nekaterih spontano fermentiranih živil, iz katerih je razvidno, da so v večini naštetih živil prevladujoče vrste oziroma rodovi, ki spadajo med mlečnokislinske bakterije.
14 5 ZAKLJUČKI
Naraščajoče število raziskav fermentiranih živil z metagenomskimi analitskimi tehnikami prinaša nova in bolj točna znanja o sestavi prisotnih mikrobnih združb, v primerjavi s tradicionalnimi metodami gojenja, vendar tudi te metode niso brez svojih pomanjkljivosti.
Tarčna metagenomika nam sestavo mikrobne združbe lahko uspešno predstavi na nivoju rodu, lahko pa tudi na nivoju posameznih vrst, kar je odvisno od dolžine odčitkov, izbranih tarčnih regij označevalcev in kakovosti referenčnih zbirk. Vendar je možnost pojava PCR bias (pristranskosti), ki nam lahko izkrivlja sliko številčnosti oziroma razmerij prisotnih mikroorganizmov v vzorcih. Prav tako lahko zaradi neprileganja univerzalnih oligonukleutidnih začetnikov, izbire napačnih genov za pomnoževanje in pomanjkanja označevalnih genov pri vrsti nekaterih prisotnih mikroorganizmov sploh ne zaznamo. Netarčna metagenomika je korak dalje k boljšemu razumevanju, saj jo lahko uporabljamo tako za taksonomsko kot funkcionalno identifikacijo, vendar ne izraža dejanskega aktivnega stanja mikrobne združbe, njihovih odzivov na stanje okolja in njihovih interakcij, temveč je le približek, saj v bistvu zajema tudi DNA mrtvih celic (prav tako lahko pride do PCR biasa, odvisno od adapterjev, ki se jih uporabi pri izdelavi knjižnice) (Quince in sod., 2017;
Vaccalluzzo in sod., 2020). Kljub temu se lahko v analizi živil metagenetika in metagenomika uporabljata v različne namene, med drugim tudi za analizo varnosti živil. Večina analiz, katerih rezultati so opisani v pregledu, je poleg metagenomske analize, vsebovala še dodatne analize vzorcev, ki so rezultate metagenomske analize lahko povezale s stanjem živila, naj je to bila analiza volatoma (hlapnih snovi), metaboloma, proteoma ali statistična analiza parametrov analiziranih fermentiranih živil. Metaomski pristopi omogočajo veliko boljši vpogled v analizo mikrobnih združb, njihovih odzivov na okolje, vlog in medsebojnih interakcij, zato za prihodnost predstavljajo boljšo perspektivo poglobljenega vpogleda v delovanje mikrobnih združb v vzorcih (Chen in sod., 2017). Pregled področja fermentiranih živil razkrije precejšno raznolikost oziroma pestrost mikrobnih združb fermentiranih živil na začetku fermentacije, ki imajo lahko tudi vlogo pri ustvarjanju arome, v kasnejših fazah pa diverziteta upade in v mikrobni združbi prevladujejo le določeni rodovi (zaradi selekcijskih pritiskov, ki so običajno posledica same fermentacije – varnost živil pred kvarom), v kateri običajno prevladujejo različne mlečnokislinske bakterije ali ocetnokislinske bakterije ali kvasovke. Te so lahko neprecenljiv genetski vir mnogih funkcionalnih genov z različnimi vlogami, od arome do antibiotičnih in zdravju koristnih učinkov, kot take imajo različen potencial uporabe – recimo bakteriocini odkriti v nekaterih študijah. Metaomski pristopi so torej trenutno najbolj perspektivni pristopi, vendar lahko njihovo učinkovitost, tako kot učinkovitost samih metagenomskih študij, omeji pomanjkljivost referenčnih podatkovnih zbirk – nekatere analize vzorcev vsebujejo odčitke, ki se ne ujemajo oziroma prilegajo na noben referenčni vzorec, saj je to morda odčitek še neodkrite vrste, ali pa preprosto vrste, ki jim še niso sekvencirali ali delno sekvencirali genoma, vrsta, za katero nimamo reference. Podobno se lahko zgodi tudi z v vzorcu zaznanimi proteini in metaboliti. Pogosti so tudi referenčni podatki, ki še nimajo anotirane funkcije. Kljub tem omejitvam so zaradi hitrega razvoja tehnologij sekvenciranja in tehnologij
15
za analizo proteinov in metabolitov ter bioinformacijskih in statističnih orodij za interpretacijo in anotacijo rezultatov, metagenomski in metaomski pristopi uporabna metoda za funkcionalno karakterizacijo fermentiranih živil in številne druge aplikacije (Chen in sod., 2017).
6 VIRI
Arıkan M., Mitchell A. L., Finn R. D., Gürel F. 2020. Microbial composition of Kombucha determined using amplicon sequencing and shotgun metagenomics. Journal of Food Science, 85, 2: 455-464
Berbegal C., Borruso L., Fragasso M., Tufariello M., Russo P., Brusetti L., Spano G., Capozzi V. 2019. A Metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentation in wine. International Journal of Molecular Sciences, 20, 16: 3980, doi: 10.3390/ijms20163980: 22 str.
Chen G., Chen C., Lei Z. 2017. Meta-omics insights in the microbial community profiling and functional characterisation of fermented foods. Trends in Food Science & Technology, 65: 23-31
Chen L., Ren L., Li D., Ma X. 2021. Analysis of microbiomes in three tradiotional starters and volatile components in Chinese rice wines. Food Science and Biotechnology, 30:
87-96
Einson J. E., Rani A., You X., Rodriguez A. A., Randell C. L., Barnaba T., Mammel M. K., Kotewicz M. L., Elkins C. A., Sela D. A. 2018. A vegetable fermentation facility hosts distinct microbiomes reflecting the production environment. Applied and
Environmental Microbiology, 84, 22: e01680-18, doi: 10.1128/AEM.01680-18: 17 str.
Escobar-Zepeda A., Sanchez-Flores A., Quirasco Baruch M. 2016. Metagenomic analysis of a Mexican ripened cheese reveals a unique complex microbiota. Food Microbiology, 57:
116-127
Ferrocino I., Bellio A., Giordano M., Macori G., Romano A., Rantsiou K., Decastelli L., Cocolin L., Elkins C. A. 2018. Shotgun metagenomics and volatilome profile of the microbiota of fermented sausages. Applied and Environmental Microbiology, 84, 3:
e02120-17, doi: 10.1128/AEM.02120-17: 14 str.
Giraffa G., Neviani E. 2001. DNA-based, culture-independent strategies for evaluating microbial communities in food-associated ecosystems. Internationa Journal of Food Microbiology, 67, 1-2: 19-34
16
He B., Li H., Hu Z., Zhang Y., Sun M., Qiu S., Zeng B. 2019. Difference in microbial community and taste compounds between Mucor-type and Aspergillus-type Douchi during koji-making. Food Research International, 121: 136-143
Illeghems K., Weckx S., De Vuyst L. 2015. Applying meta-pathway analysis through metagenomics to identify the functional properties of the major bacterial communities of a single spontaneous cocoa bean fermentation process sample. Food Microbiology, 50: 54-63
Illeghems K., De Vuyst L., Papalexandratou Z., Weckx S. 2012. Phylogenetic analysis of a spontaneous cocoa bean fermentation metagenome reveals new insights into its bacterial and fungal community diversity. PLOS ONE, 7, 5: e38040, doi:
10.1371/journa.pone.0038040: 11 str.
Jeong S. H., Jung J. Y., Lee S. H., Jin H. M., Jeon C.O. 2013a. Microbial succession and metabolic changes during the fermentation of dongchimi, traditional Korean watery kimchi. International Journal of Food Microbiology, 164, 1: 46-53
Jeong S. H., Lee H. J., Jung J. Y., Lee S. H., Seo H.-Y., Park W.-S., Jeon C.O. 2013b. Effects of red peper powder on microbial communities and metabolites during kimchi
fermentation. International Journal of Food Microbiology, 160,3: 252-259
Jung J. Y., Lee S. H., Kim J. M., Park M. S., Bae J.-W., Hahn Y., Madsen E. L., Jeon C. O.
2011. Metagenomic analysis of Kimchi, a traditional Korean fermented food. Applied and Environmental Microbiology, 77, 7: 2264-2274
Jung M.-J., Nam Y.-D., Roh S.W., Bae J.-W. 2012. Unexpected convergence of fungal and bacterial communities during fermentation of traditional Korean alcoholic beverages inoculated with various natural starters. Food Microbiology, 30, 1: 112-123
Kergourlay G., Taminiau B., Daube G., Champonier Vergès M.-C. 2015. Metagenomic insights into the dynamics of microbial communities in food. International Journal of Food Microbiology, 213: 31-39
Kiyohara M., Koyanagi T., Matsui H., Yamamoto K., Take H., Katsuyama Y., Tsuji A., Miyamae H., Kondo T., Nakamura S., Katayama T., Kumagai H. 2012. Changes in microbiota population during fermentation of Narezushi as revealed by pyrosequencing analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 76, 1: 48-52
Korsak N., Taminiau B., Leclercq M., Nezer C., Crevecoeur S., Ferauche C., Detry E., Delcenserie V., Daube G. 2015. Short communication: Evaluation of the microbiota of
17
kefir samples using metagenetic analysis targeting the 16S and 26S ribosomal DNA fragments. Journal of Dairy Science, 98, 6: 3684-3689
Koyanagi T., Nakagawa A., Kiyohara M., Matsui H., Yamamoto K., Barla F., Take H., Katsuyama Y., Tsuji A., Shijimaya M., Nakamura S., Minami H., Enomoto T.,
Katayama T., Kumagai H. 2013. Pyrosequencing analysis of microbiota in Kaburazushi, a traditional medieval sushi in Japan. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 77, 10: 2125-2130
Lee M., Song J. H., Jung M. Y., Lee S. H., Chang J. Y. 2017. Large-scale targeted
metagenomics analysis of bacterial ecological changes in 88 kimchi samples during fermentation. Food Microbiology, 66: 173-183
Lee S. H., Jung J. Y., Jeon C. O. 2014. Effects of temperature on microbial succesion and metabolite change during saeu-jeot fermentation. Food Microbiology, 38: 16-25
Lyu C., Chen C., Ge F., Liu D., Zhao S., Chen D. 2013. A preliminary metagenomic study of puer tea during pile fermentation. Journal of the Science of Food and Agriculture, 9 3, 13: 3165-3174
Marco M. L., Heeney D., Binda S., Cifelli C. J., Cotter P. D., Foligné B., Gänzle M., Kort R., Pasin G., Pihlanto A., Smid E. J., Hutkins R. 2017. Health benefits of fermented foods:
microbiota and beyond. Current Opinion in Biotechnology, 44: 94-102
Marsh A. J., O'Sullivan O., Hill C., Ross R. P., Cotter P. D. 2014. Sequence-based analysis of the bacterial and fungal compositions of multiple kombucha (tea fungus) samples. Food Microbiology, 38: 171-178
Martin T. C., Visconti A., Spector T. D., Falchi M. 2018. Conducting metagenomic studies in microbiology and clinical research. Applied Microbiology and Biotechnology, 102:
8629-8646
Park E.-J., Kim K.-H., Abell G. C. J., Kim M.-S., Roh S. W., Bae J.-W. 2011. Metagenomic analysis of the viral communities in fermented foods. Applied and Environmental Microbiology, 77, 4: 1284-1291
Porter T. M., Hajibabaei M. 2018. Scaling up: A guide to high-throughput genomic approaches for biodiversity analysis. Molecular Ecology, 27, 2: 313-338 Quince C., Walker A. W., Simpson J. T., Loman N. J, Segata N. 2017. Shotgun
metagenomics, from sampling to analysis. Nature Biotechnology, 35: 833-844
18
Sternes P. R., Lee D., Kutyna D. R., Borneman A. R. 2017. A combined meta-barcoding and shotgun metagenomic analysis of spontaneous wine fermentation. GigaScience, 6, 7:
gix040, doi: 10.1093/gigascience/gix040: 10 str.
Sulaiman J., Gan H. M., Yin W. F. Chan K.G. 2014. Microbial succession and the functional potential during the fermentation of Chinese soy sauce brine. Frontiers in Microbiology, 5: 556, doi: 10.3389/fmicb.2014.00556: 9 str.
Vaccalluzzo A., Pino A., Russo N., De Angelis M., Caggia C., Randazzo C. L. 2020.
FoodOmics as a new frontier to reveal microbial community and metabolic processes occuring on table olives fermentation. Food Microbiology, 92: 103606, doi:
10.1016/j.fm.2020.103606: 14 str.
Vargas-Albores F., Martínez-Córdova L. R., Martínez-Porchas M., Calderón K., Lago-Lestón A. 2019. Functional metagenomics: a tool to gain knowledge for agronomic and
veterinary sciences. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 35, 1: 69 -91 Villarreal-Soto S. A., Bouajila J., Pace M., Leech J., Cotter P. D., Souchard J.-P., Taillandier
P., Beaufort S. 2020. Metabolome-microbiome signatures in the fermented beverage, Kombucha. International Journal of Food Microbiology, 333: 108778, doi:
10.1016/j.ijfoodmicro.2020.108778: 13 str.
Walsh A. M., Crispie F., Daari K., O'Sullivan O., Martin J. C., Arthur C. T., Claesson M. J., Scott K. P., Cotter P. D., Drake H. L. 2017. Strain-level metagenomic analysis of the fermented dairy beverage Nunu highlights potential food safety risks. Applied and Environmental Microbiology, 83, 16: e01144-17, doi: 10.1128/AEM.01144-17: 13 str.
Wang Z. Shao Y. 2018. Effects of microbial diversity on nitrite concentration in pao cai, a naturally fermented cabbage product from China. Food Microbiology, 72: 185-192 Wolfe B. E., Button J. E., Santarelli M., Dutton R.J. 2014. Cheese rind communities provide
tractable systems for in situ and in vitro studies of microbial diversity. Cell, 158, 2: 422- 433
Xie G., Wang L., Gao Q., Yu W., Hong X., Zhao L., Zou H. 2013 Microbial community structure in fermetation process of Shaoxing rice wine by Illumina-based metagenomic sequencing. Science of Food and Agriculture, 93, 12: 3121-3125
Xie M., Wu J., An F., Yue X., Tao D., Wu R., Lee Y. 2019. An integrated
metagenomic/metaproteomic investigation of microbiota in daijiang-meju, a traditional fermented soybean product in northeast China. Food Research International, 115: 414- 424
19
Zhao M., Su X. Q., Nian B., Chen L. J., Zhang D. L., Duan S. M., Wang L. Y., Shi X. Y., Jiang B., Jiang W. W., Lv C. Y., Wang D. P., Shi Y., Xiao Y., Wu J.-L., Pan Y. H., Ma Y. 2019. integrated meta-omics approaches to understand the microbiome of
spontaneous fermentation of traditional Chinese Pu erh tea. mSystems, 4, 6: e00680-19, doi: 10.1128/mSystems.00680-19: 17 str.
Zhi Y., Wu Q., Du H., Xu Y. 2016. Biocontrol of geosmin-producing Streptomyces spp. by two Bacillus strains from Chinese liquor. International Journal of Food Microbiology, 231: 1-9
