UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Ida SIMONČIČ
UPORABA ZAŠČITNE STARTERSKE KULTURE ZA IZDELAVO SIRA IZ SUROVEGA SENENEGA
MLEKA
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Ida SIMONČIČ
UPORABA ZAŠČITNE STARTERSKE KULTURE ZA IZDELAVO SIRA IZ SUROVEGA SENENEGA MLEKA
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo
USE OF A PROTECTIVE STARTER CULTURE FOR CHEESE PRODUCTION FROM RAW HAY MILK
M. SC. THESIS
Master Study Programmes: Field Food Science and Technology
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Živilstvo. Delo je bilo opravljeno v Mlekarni Celeia in na Biotehniški fakulteti, Oddelku za zootehniko, Katedri za mlekarstvo.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala izr. prof. dr.
Andrejo Čanžek Majhenič in za recenzentko prof. dr. Leo Demšar.
Mentorica: izr. prof. dr. Andreja ČANŽEK MAJHENIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Recenzentka: prof. dr. Lea DEMŠAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik:
Član:
Član:
Datum zagovora:
Ida Simončič
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 637.33:637.12:579.67(043)=163.6
KG seneno mleko, surovo mleko, siri iz surovega senenega mleka, zaščitna kultura, mikrobiota sira, primerjava sirov
AV SIMONČIČ, Ida, dipl. inž. živ. in preh. (UN)
SA ČANŽEK MAJHENIČ, Andreja (mentorica), DEMŠAR, Lea (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021
IN UPORABA ZAŠČITNE STARTERSKE KULTURE ZA IZDELAVO SIRA IZ SUROVEGA SENENEGA MLEKA
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo) OP VIII, 46 str., 12 sl., 11 pregl., 2 pril., 24 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Na slovenskem trgu je vedno večje povpraševanje po izdelkih iz senenega mleka.
Zato se je največja slovenska mlekarna odločila za proizvodnjo sira iz surovega senenega mleka. Namen magistrske naloge je bil določiti mikrobiološko in sestavo osnovnih hranilnih snovi surovega senenega mleka ter njegovo uporabnost kot surovine za izdelavo sira. Ko smo določili mikrobiološko in kemijsko kakovost surovega senenega mleka, smo ga uporabili za izdelavo poltrdega tipa sira z uporabo komercialne starterske kulture. Dva dni kasneje smo poskus ponovili z novo serijo surovega senenega mleka, le da smo tokrat izdelali poltrd tip sira s kombinacijo starterske in zaščitne kulture, ki proizvaja nizin. Enak protokol sirjenja smo izvedli vsak mesec v trajanju 12ih mesecev, od junija 2018 do maja 2019, v mlekarni Celeia v Arji vasi. Poleg analiz surovega senenega mleka smo opravili tudi mikrobiološke, kemijske in senzorične analize sirov. Mikrobiološko kakovost sirov smo spremljali v skladu s smernicami za mikrobiološko varnost sirov iz surovega mleka z uporabo klasičnih mikrobioloških tehnik cepljenja na trda gojišča. Ker smo sirili skozi celo leto, smo tako spremljali tudi morebitni vpliv letnega časa na mikrobiološko kakovost surovega mleka in sirov. Rezultati so pokazali, da so tako vse serije surovega senenega mleko kot vsi siri (starterska kultura, starterska + zaščitna kultura) skozi vse leto izpolnjevali kriterije mikrobiološke kakovosti, podane v mikrobioloških smernicah za surovo mleko in sire iz surovega mleka. Analizo sestave osnovnih hranljivih snovi sirov smo izvedli po znanih in standardiziranih metodah. Izvedli smo tudi senzorično analizo sirov z 20-točkovnim sistemom. Ocene sirov (skrajšan analitičen test) so variirale od 18 do 12 točk.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 637.33:637.12:579.67(043)=163.6
CX hay milk, raw milk, cheeses made from raw hay milk, protective culture, cheese microbiota, comparison of cheeses
AU SIMONČIČ, Ida
AA ČANŽEK MAJHENIČ, Andreja (supervisor), DEMŠAR, Lea (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2021
TI USE OF A PROTECTIVE STARTER CULTURE FOR CHEESE PRODUCTION FROM RAW HAY MILK
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Food Science and Technology) NO VIII, 46 p., 12 s., 11 tab., 2 ann., 24 ref.
LA sl Al sl/en
AB Due to increasing interest for dairy products made from hay milk on the Slovenian market, the largest Slovenian dairy plant has decided to manufacture cheese from raw hay milk. The main goal of the master's thesis was to determine the microbiological and chemical quality of raw hay milk and its applicability as raw material for cheese production. After determining the microbiological and chemical quality of raw hay milk, same batch of milk was used for production of semi-hard type of cheese, using a commercial starter culture. Two days later, the experiment was repeated, but with a new batch of raw hay milk, and this time a semi-hard type of cheese was produced with a combination of starter and protective culture that produces nisin. The same cheesemaking protocol was accomplished every month and lasted 12 months, from June 2018 to May 2019, at the Celeia Dairy plant in Arja vas. Besides analysing raw hay milk, microbiological, chemical, and sensorial analyses of cheeses were performed as well. Microbiological quality of cheese was monitored in accordance with the guidelines for microbiological safety of raw milk cheeses with classical pour-plate microbiological techniques. As cheese-making was carried out throughout the year, the possible impact of the seasons on the microbiological quality of raw milk and cheeses was monitored as well. Results revealed that raw hay milk and both cheeses (starter culture, starter + protective culture) complied with the microbiological guidelines throughout the year. Chemical analyses of cheeses were performed according to known standardised methods. We also performed a sensory analysis of cheeses with a 20-point system. Sensorial evaluation (a short analysis test) of cheesees ranged from 18 to 12 points.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO SLIK VII
KAZALO PREGLEDNIC VIII
KAZALO PRILOG IX
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X
1 UVOD 1
1.1 NAMEN NALOGE 1
1.2 DELOVNE HIPOTEZE 1
2 PREGLED OBJAV 2
2.2 SUROVO MLEKO 2
2.2.1 Uživanje surovega mleka 2
2.3 MIKROBIOLOŠKA VARNOST ŽIVIL – SUROVO MLEKO, SIRI IZ
SUROVEGA MLEKA 2
2.3.1 Mikrobiološka kakovost surovega mleka 3
2.3.1.1 Patogeni mikroorganizmi v surovem mleku 4
2.3.1.2 Izbruhi okužb, povezani z uživanjem surovega mleka 5 2.3.2 Mikrobiološka kakovost sirov iz surovega mleka 6 2.3.2.1 Psihrotrofni mikroorganizmi v sirih iz surovega mleka 6
2.3.2.2 Mikroorganizmi v sirih iz surovega mleka 7
2.3.2.3 Patogeni mikroorganizmi v sirih iz surovega mleka 7 2.3.2.4 Mikrobiološke smernice za sire iz surovega mleka v preteklosti 8 2.3.2.5 Izbruhi okužb, povezani z uživanjem sirov iz surovega mleka 9
2.4 SENZORIČNA KAKOVOST SIROV IZ SUROVEGA MLEKA 10
2.5 SENENO MLEKO 10
2.5.1 Zgodovinsko ozadje prireje senenega mleka 10 2.5.2 Definicija in zakonodaja senenega mleka 10
2.5.3 Sestava senenega mleka 12
2.5.4 Mikrobiota senenega mleka 12
2.6 SIRI IZ SUROVEGA SENENEGA MLEKA 13
2.6.1 Bakterijski patogeni, povezani s siri iz surovega senenega mleka 13
2.7 ZAŠČITNE KULTURE 13
2.7.1 Bakteriocinogene bakterije 13
2.7.1.1 Nizin 14
3 MATERIAL IN METODE 16
3.1 POTEK EKSPERIMENTALNEGA DELA 16
3.2 OPIS EKSPERIMENTALNEGA DELA 17
3.3 MATERIALI 17
3.3.1 Mleko 17
3.3.2 Starterske kulture 17
3.3.3 Zaščitna kultura 18
3.3.4 Sirišče 18
3.3.5 CaCl2 18
3.3.6 Slanica 18
3.3.7 Hranljiva gojišča 18
3.3.8 Raztopine za razredčevanje in dodatki 20
3.3.9 Hitri test za določanje prisotnosti zaviralnih snovi 20
3.4 METODE 20
3.4.1 Tehnološki postopek izdelave sira iz surovega senenega mleka 20 3.4.2 Vzorčenje surovega senenega mleka in sirov 21
3.4.3 Analize surovega senenega mleka 22
3.4.3.1 Kemijske analize in hitri test na prisotnost zaviralnih snovi 22
3.4.3.2 Mikrobiološke analize 22
3.4.4 Analize sirov 25
3.4.4.1 Kemijske analize 25
3.4.4.2 Mikrobiološke analize 26
3.4.4.3 Senzorična analiza 27
3.4.4.4 Statistična analiza podatkov 27
3.5 LABORATORIJSKA IN DRUGA OPREMA 27
3.5.1 Sirarska oprema 28
4 REZULTATI 29
4.1 ANALIZE VZORCEV SUROVEGA SENENEGA MLEKA 29
4.2 ANALIZE SIROV 31
4.2.1 Mikrobiološke analize 31
4.2.2 Kemijske analize 35
4.2.3 Senzorična analiza sirov, zorenih 90 dni 37
5 RAZPRAVA 39
5.1 KEMIJSKE ANALIZE MLEKA 39
5.2 HIGIENSKA IN MIKROBIOLOŠKA KAKOVOST MLEKA 39
5.3 MIKROBIOLOŠKA ANALIZA SIROV, ZORENIH 90 DNI 40
5.4 OPREDELITEV SIROV PO TIPU 41
5.5 SENZORIČNA OCENA SIROV 41
6 SKLEPI 42
7 POVZETEK 43
8 VIRI 44
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO SLIK
Slika 1: Shema dela ... 16
Slika 2: Nacepljene plošče z različnimi gojišči in vzorci ... 19
Slika 3: Sirarska oblikovala ... 28
Slika 4: Siri med stiskanjem ... 28
Slika 5: Vsebnost (g/100 g) določenih kemijskih parametrov in skupno število mikroorganizmov (SŠMO)(log KE/mL) v surovem senenem mleku v času poskusa (junij 2018 – maj 2019) ... 29
Slika 6: Sestava mikrobne populacije surovega senenega mleka v času poskusa (junij 2018 – maj 2019) ... 31
Slika 7: Velikost populacij nekaterih skupin MO v sirih po stiskanju ... 32
Slika 8: Velikost populacij nekaterih skupin MO v sirih po soljenju v slanici ... 32
Slika 9: Velikost populacij nekaterih skupin MO v sirih po 90-ih dneh zorenja ... 33
Slika 10: Velikost populacij nekaterih skupin MO v sirih po stiskanju, po soljenju in po 90-dnevnem zorenju ... 34
Slika 11: Siri iz surovega senenega mleka, zoreni 90 dni, pripravljeni za senzorično analizo ... 37
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Smernice za mikrobiološko varnost surovega mleka (Rupel in sod.,
2019) ... 3 Preglednica 2: Smernice za mikrobiološko varnost pri poltrdih, trdih sirih iz surovega mleka ... 3 Preglednica 3: Temperaturna shema dogrevanja in sušenja sirnega zrna ... 21 Preglednica 4: Odnos do kisika ter čas in temperatura inkubacije za določanje
posameznih skupin ... 24 Preglednica 5: Senzorične lastnosti in točkovno vrednotenje posamezne lastnosti ... 27 Preglednica 6: Higienska kakovost surovega senenega mleka v času poskusa (junij
2018 – maj 2019) ... 30 Preglednica 7: Vsebnost maščobe in suhe snovi ter izračun % mm/SS v sirih, zorenih 90 dni ... 35 Preglednica 8: Vsebnost maščobe in vode ter izračun % vode v nemastni snovi sirov, zorenih 90 dni ... 36 Preglednica 9: Odstotek beljakovin v sirih, zorenih 90 dni ... 37 Preglednica 10: Rezultati senzorične ocene sirov ... 38 Preglednica 11: Primerjava vsebnosti beljakovin in maščobe po mesecih s
slovenskim povprečjem 2018/2019 (SURS, 2020) ... 39 Preglednica 12: Priporočila standarda za delitev sirov po konsistenci (CODEX
STAN 283-1978, 1978) ... 41
KAZALO PRILOG Priloga A: Rezultati mikrobioloških analiz
Priloga B: Rezultati senzorične analize sirov, zorenih 90 dni.
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
B. Brucella
C. Campylobacter
E. Escherichia
EFSA Evropska agencija za varnost hrane (ang. European Food Safety Authority)
EU Evropska unija (ang. European Union)
KE kolonijska enota
L. Listeria
Lact. Lactococcus
M. Mycobacterium
MKB mlečnokislinske bakterije
mm mlečna maščoba
MO mikroorganizem
S. Staphylococcus
SC somatske celice
SK starterska kultura
sp. vrsta (ena znotraj istega rodu); (ang. Species affinis)
spp. vrste (dve ali več vrst znotraj istega rodu); (ang. species pluralis)
SS suha snov
SSBM suha snov brez maščobe
SŠMO skupno število mikroorganizmov subsp. podvrsta (ang. subspecies) ŠSC število somatskih celic
TBEV virus klopnega meningoencefalitisa (ang. tick-borne encephalitis virus) VTEC/STEC enakovredni oznaki za E. coli, ki proizvaja vero (cito) toksine oz. Šiga
toksin (ang. shiga toxin-producing E. coli)
YOPI mladi, starejši, nosečnice, osebe z oslabljenim imunskim sistemom (ang.
young, old, pregnant, immunocompromised)
z označba serije sira, kateremu je bila dodana zaščitna kultura ZDA Združene države Amerike
ZOP zaščitena označba porekla
ZK zaščitna kultura
ZTP zajamčena tradicionalna posebnost ZKPŽ zaščiteni kmetijski pridelki in živila
1 UVOD
V zadnjem času je seneno mleko vedno bolj prepoznavno pri nas in v svetu. Seneno mleko je mleko molznih živali, ki se jim ne krmi silaže, ampak se poleti pasejo ali dobijo svežo krmo v hlev, zimski obroki pa temeljijo na senu. Po potrebi so obroki dopolnjeni s svežimi ali posušenimi žiti, krmnimi stročnicami, oljnicami in beljakovinskimi koncentrati. Vse to in predvsem ugodna maščobno-kislinska sestava v zadnjem času povečujeta zanimanje za prirejo in predelavo senenega mleka v mlečne izdelke, predvsem v sire. Pri izdelavi sirov iz surovega ali toplotno obdelanega mleka konvencionalne reje je velika nevarnost tako imenovanega poznega napihovanja sirov, ki je posledica delovanja klostridijev, katerih glavni vir sta silaža in zemlja. Sir iz senenega mleka predstavlja veliko manjše tveganje za prisotnost teh bakterij in posledično poznega napihovanja sirov. Ker je želja po mlečnih izdelkih iz senenega mleka vse bolj prisotna tudi na slovenskem trgu, se je največja slovenska mlekarna odločila za poskus predelave surovega senenega mleka v sir. Pri tem pa je spremljanje mikrobiološke ustreznosti surovega mleka in nato sira skladno s smernicami za mlečne izdelke iz surovega mleka nujno potreben ukrep za zagotavljanje varnih izdelkov in zaščite potrošnika. Poleg tega je prireja senenega mleka skrbno nadzorovana in njegova kakovost, tudi mikrobiološka, zelo visoka, kar ponuja možnost predelave mleka v sir brez toplotne obdelave. Vse to pa ne izključuje kontrole mikrobiološke ustreznosti tako surovine kot izdelka.
1.1 NAMEN NALOGE
Naš namen je bil ugotoviti mikrobiološko in kemijsko sliko surovega senenega mleka kot surovine. Iz iste surovine smo izdelali poltrd tip sira z uporabo komercialne starterske kulture ter poltrd tip sira s kombinacijo komercialne in zaščitne starterske kulture, ki proizvaja nizin.
Med zorenjem smo pri obeh sirih spremljali mikrobiološko sliko skladno s smernicami za mikrobiološko varnost sirov iz surovega mleka in ugotavljali pozitiven vpliv zaščitne starterske kulture. Sirjenje smo izvajali skozi vse leto in tako spremljali tudi vpliv letnega časa na mikrobiološko sliko surovine in sirov. Prav tako smo izvajali senzorično analizo sirov z 20-točkovnim sistemom.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE Naše delovne hipoteze so bile:
• surovo seneno mleko bo ustrezne mikrobiološke kakovosti,
• siri, izdelani samo z dodatkom komercialne starterske kulture, bodo ustrezali smernicam mikrobiološke varnosti sirov iz surovega mleka,
• siri, izdelani z dodatkom komercialne in zaščitne starterske kulture, bodo prav tako ustrezali smernicam mikrobiološke varnosti sirov iz surovega mleka, kjer bo zaščitna starterska kultura v primeru mikrobiološkega odmika surovine od smernic mikrobiološke varnosti nudila dodatno zaščito v siru.
2 PREGLED OBJAV 2.2 SUROVO MLEKO
Surovo mleko, namenjeno za prehrano ljudi, mora izpolnjevati zahteve splošne živilske zakonodaje in biti brez patogenih mikroorganizmov (EFSA Panel on Biological Hazards, 2015).
Po definiciji, ki jo navaja Uredba (ES) št. 853/2004 (2004), surovo mleko pomeni mleko, pridobljeno z izločanjem mlečnih žlez farmsko gojenih živali, ki ni segreto na več kot 40 °C ali obdelano po drugem postopku z enakim učinkom. Nosilci živilske dejavnosti morajo izvajati postopke, s katerimi zagotovijo, da surovo mleko izpolnjuje naslednja merila za surovo kravje mleko:
• število kolonij pri 30 °C (na mL): ≤ 100 000,
• število somatskih celic (na mL): ≤ 400 000.
2.2.1 Uživanje surovega mleka
Zanimanje potrošnikov za uživanje surovega mleka v EU narašča, zato pridelovalci iščejo nove prodajne poti surovega mleka, predvsem preko interneta in mlekomatov. Uživanje surovega mleka ni splošno razširjeno, ampak je njegovo uživanje omejeno predvsem na specifične skupine ljudi (npr. presnojedci), ki menijo, da ima surovo mleko določene prednosti pred toplotno obdelanim kot npr. višjo prehransko vrednost, manjšo alergenost, boljši okus. Zaradi takega prepričanja surovo mleko pogosto uživajo ljudje s posebnimi prehranskimi potrebami oz. željami ali ljudje z oslabljenim imunskim sistemom (EFSA Panel on Biological Hazards, 2015), čeprav je ravno pri teh ljudeh potrebna dodatna previdnost pri uživanju surovega mleka predvsem zaradi mikrobiološke varnosti.
2.3 MIKROBIOLOŠKA VARNOST ŽIVIL – SUROVO MLEKO, SIRI IZ SUROVEGA MLEKA
V Sloveniji imamo priporočila za mikrobiološko varnost živil. Ta so podana v Smernicah za mikrobiološko varnost živil, ki so namenjena končnemu potrošniku (Rupel in sod., 2019) in v Poglavju 3 obravnavajo področje Mleka in mlečnih izdelkov. Znotraj teh najdemo tudi mikrobiološka priporočila za surovo mleko, kar prikazuje preglednica 1, medtem ko preglednica 2 prikazuje mikrobiološka priporočila za poltrde in trde sire, izdelane iz surovega mleka (Rupel in sod., 2019).
Preglednica 1: Smernice za mikrobiološko varnost surovega mleka (Rupel in sod., 2019) Surovo mleko
Mikroorganizmi Plan vzorčenja Kriterij
n c
Salmonella spp. 5 0 Ni najdeno v 25 mL
Listeria monocytogenes 5 0 Ni najdeno v 25 mL
Campylobacter spp. 5 0 Ni najdeno v 25 mL
VTEC 5 0 Ni najdeno v 25 mL
Koagulaza pozitivni stafilokoki in Staphylococcus
aureus 5 2 m = 102 KE/mL
M = 5x102 KE/mL
Domnevni Bacillus cereus 5 1 m = 103 KE/mL
M = 104 KE/mL
Enterobakterije 5 0 m/M = 10 KE/mL
Sulfit reducirajoči klostridiji 5 2 m = 10 KE/mL
M = 102 KE/mL
Aerobne mezofilne bakterije 5 0 M = 105 KE/mL
Preglednica 2: Smernice za mikrobiološko varnost pri poltrdih, trdih sirih iz surovega mleka (Rupel in sod., 2019)
Poltrdi siri, trdi sir iz surovega mleka
Mikroorganizmi Plan vzorčenja Kriterij
n c
Salmonella spp. 5 0 Ni najdeno v 25 g
Listeria monocytogenes 5 0 Ni najdeno v 25 g
Koagulaza pozitivni stafilokoki in Staphylococcus
aureus 5 2 m = 104 KE/g
M = 105 KE/g
Escherichia coli 5 2 m = 102 KE/g
M = 103 KE/g
Sulfit reducirajoči klostridiji 5 1 m = 10 KE/g
M = 102 KE/g Legenda za preglednici 1 in 2:
n = število vzorčnih enot, ki sestavljajo vzorec;
c = število vzorčnih enot, kjer je število bakterij lahko med »m« in »M«, pri čemer vzorec velja za sprejemljivega, če je število bakterij v drugih vzorčnih enotah »m« ali manj;
m = mejna vrednost, pod katero se vse rezultate šteje za zadovoljive;
M = mejna dopustna vrednost, nad katero se rezultati ne štejejo več za zadovoljive.
Če en sam rezultat preseže to vrednost, je vzorec nezadovoljiv (Rupel in sod., 2019).
2.3.1 Mikrobiološka kakovost surovega mleka
V surovem mleku od mikroorganizmov (MO) prevladujejo bakterije. Med njimi je največ mlečnokislinskih bakterij (MKB) iz rodov Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus in Enterococcus z najbolj zastopanimi mezofilnimi in termofilnimi koki, v manjšem obsegu pa so prisotni mezofilni in termofilni laktobacili (Giello in sod., 2017).
Zaradi intenzivnega in doslednega hlajenja surovega mleka pa pomemben del njegove mikrobne populacije predstavljajo tudi ne-MKB, predvsem po Gramu negativni psihrotrofni MO iz rodu Pseudomonas (Quigley in sod., 2013).
2.3.1.1 Patogeni mikroorganizmi v surovem mleku
Zaradi pestre sestave hranil ter njihovih ugodnih vsebnosti in razmerij ima mleko visoko prehransko vrednost, ki je ugodna ne samo za novorojenega sesalca ali v humane namene, ampak tudi za razvoj MO, vključno s patogenimi. Zato je zelo pomembna ocena tveganja uživanja surovega mleka, saj je surovo mleko lahko okuženo s patogenimi MO, ki vanj lahko pridejo neposredno preko obolele živali ali posredno zaradi kontaminacije z MO med molžo in njegovim nadaljnjim rokovanjem (EFSA Panel on Biological Hazards, 2015).
Na splošno lahko pride do okužb surovega mleka s patogenimi MO na dva načina:
• prvi način je po endogeni poti, kjer se mleko okuži neposredno preko krvi (sistemska okužba) ali preko obolele in okužene mlečne žleze, ob pojavu mastitisa;
• drugi pa je po eksogeni poti, torej preko zunanjih dejavnikov, od katerih je v večji meri odvisna tudi preostala mikrobiota surovega mleka. Med zunanje dejavnike okužbe prištevamo fekalije, zunanjost vimena, kožo, okolico, sezonske spremembe, zunanji in notranji sistem za krmljenje živali, geografsko lego hleva, način nastilja, molže, vodo za napajanje in pranje, zrak v molzišču in nenazadnje molznike oz.
ljudi, ki so v stiku z živalmi in mlekom (Verraes in sod., 2015; Giello in sod., 2017;
Fretin in sod., 2017).
Za lažje prepoznavanje mikrobioloških nevarnosti, povezanih z uživanjem surovega mleka, je Evropska unija (EU) pripravila seznam mikrobioloških nevarnosti zaradi uživanja surovega mleka različnih vrst mlečnih živali. Tako seznam opisuje mikrobiološke nevarnosti, ki se z mlekom lahko prenesejo na človeka in o katerih so poročali pri kravah, ovcah in kozah, kobilah in oslicah ter pri kamelah. Med mikrobiološke nevarnosti, ki se opredeljujejo kot potencialno prenosljive z mlekom in ki so hkrati prisotne v populacijah mlečnih živali v EU, se prištevajo bakterije (EFSA Panel on Biological Hazards, 2015;
Verraes in sod., 2015):
• Campylobacter spp. (termofilna),
• Salmonella spp.,
• Escherichia coli, ki proizvaja toksin šiga (STEC),
• Bacillus cereus,
• Brucella abortus,
• Brucella melitensis,
• Listeria monocytogenes,
• Mycobacterium bovis,
• Staphylococcus aureus,
• Yersinia enterocolitica,
• Yersinia pseudotuberculosis,
• Corynebacterium spp.,
• Streptococcus suis subsp. zooepidemicus,
• virus klopnega meningoencefalitisa (TBEV)
• parazit Toxoplasma gondii in
• parazit Cryptosporidium parvum.
Velikost populacij Listeria monocytogenes in S. aureus močno naraste v mleku, če ima krava subklinični oz. klinični mastitis (Verraes in sod., 2015).
2.3.1.2 Izbruhi okužb, povezani z uživanjem surovega mleka
Dandanes so potrošniki vse bolj ozaveščeni o kakovosti živil in vse jasnejše so njihove zahteve po uživanju čim manj predelanih, naravnih in lokalnih živil. Med taka živila zagotovo spada tudi surovo mleko, ki je slovenskemu potrošniku dostopno preko mlekomatov ali neposredno na malih gospodarstvih.
Uživanje surovega mleka je načeloma zdravju neškodljivo, če je mleko pridobljeno od zdravih živali in ob upoštevanju vseh pravil dobre higienske prakse, vključno z ustreznim hlajenjem. V tem primeru je mikrobiološka obremenjenost surovega mleka zelo nizka, od nekaj sto pa do nekaj tisoč MO/mL, kjer načeloma prevladujejo MKB. Ker pa vseeno obstaja možnost okužbe mleka s patogenimi MO, bodisi na račun pomanjkljivega rokovanja z mlekom ali vnetja mlečne žleze, je zaradi mikrobiološkega tveganja priporočljivo surovo mleko pred zauživanjem toplotno obdelati/prekuhati, posebej če gre za uživanje mleka pri občutljivejših skupinah ljudi, kot je npr. skupina, ki jo predstavljajo mladi, starejši, nosečnice in osebe z oslabljenim imunskim sistemom (YOPI). Takoj po molži je pomembno hitro in dosledno hlajenje mleka na temperaturo pod 6 °C, prav tako je temperatura mleka v mlekomatih običajno pod 4 °C, kar pomeni, da je pomembno vzdrževanje hladne verige.
Vendar pa obstaja velika možnost, da se hladna veriga prekine, in sicer se lahko prekine že na poti med kmetijo in mlekomatom ali pa na poti od mlekomata oz. kmetije do končnega zaužitja. V eni od študij v Italiji so ugotovili, da nihanje temperature mleka v oskrbovalni verigi od kmetije do potrošnika lahko povzroči razmnoževanje patogenih bakterij Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium in STEC O157:H7 (EFSA Panel on Biological Hazards, 2015).
Med leti 2007 in 2012 je bilo v EU prijavljenih 27 izbruhov okužb, povezanih z uživanjem surovega mleka. Od tega naj bi jih večino, kar 21, povzročile bakterije iz rodu Campylobacter, v glavnem predstavniki vrste C. jejuni, eno Salmonella Typhimurium, dve STEC in tri TBEV. Štirje od 27 izbruhov so bili posledica uživanja surovega kozjega mleka, preostalo je bilo pripisano surovemu kravjemu mleku. Ni pa bilo v tem obdobju poročil o pojavu okužb, povezanih z uživanjem surovega mleka, ki bi jih povzročila Listeria monocytogenes (EFSA Panel on Biological Hazards, 2015).
V Sloveniji so bili leta 2012 zabeleženi trije primeri okužbe s TBEV na Koroškem, povezani z uživanjem surovega kozjega mleka (Hudopisk in sod., 2013).
Glede na nedavna poročila o izbruhih okužb, povezanih z uživanjem surovega mleka, predstavljajo glavno mikrobiološko tveganje STEC, Salmonella spp. in Campylobacter spp.
Gre za patogene MO, ki so vsepovsod razširjeni in jih zaradi tega pogosto najdemo pri živalih za prirejo mleka in posledično v njihovem mleku na celotnem področju EU, kar so pokazali rezultati analiz vzorcev surovega mleka. Na podlagi izsledkov analiz o njegovi razširjenosti v EU in prisotnosti v surovem mleku je bil tudi TBEV ocenjen kot eden glavnih mikrobioloških tveganj uživanja surovega mleka. V preteklosti sta bila tudi B. melitensis in M. bovis v primerjavi z drugimi patogeni manj pogosta povzročitelja okužb, povezanih z
uživanjem surovega mleka. Čeprav bi ju lahko še vedno prištevali med glavne povzročitelje izbruhov, pa na podlagi epidemioloških programov nadzora v Evropi trenutno ne upravičujeta nadaljnje podrobnejše obravnave za analizo ocene tveganja (EFSA Panel on Biological Hazards, 2015).
Pri kravah, obolelih za tuberkulozo, sta najpogostejši poti okužbe mleka preko izločanja bakterijskih celic M. bovis v mleko, ali pa se mleko okuži preko iztrebkov živali. V ZDA so izbruh okužbe s tuberkulozo pri ljudeh povezali z uživanjem mehkega sira iz surovega mleka, ki je bilo okuženo z bakterijo M. bovis (Yoon in sod., 2016).
2.3.2 Mikrobiološka kakovost sirov iz surovega mleka
Ker zanimanje potrošnikov za uživanje sirov iz surovega mleka iz dneva v dan narašča, se temu primerno širi tudi trg. Skladno s tem pa je pričakovati, da bo v prihodnosti ena najpomembnejših lastnosti teh sirov njihova mikrobiološka kakovost, ki bo zagotavljala mikrobiološko varne sire. Sire iz surovega mleka običajno poseljuje zelo raznolika mikrobna populacija, znotraj katere navadno prevladujejo koristne MKB, ki s svojim protimikrobnim delovanjem nudijo izdelku mikrobiološko zaščito. Tako se na prvi pogled lahko zdi, da so siri, izdelani iz surovega mleka, mikrobiološko varnejši od sirov, izdelanih iz toplotno obdelanega mleka, vendar je ta mikrobiološka zaščita le delna (Yoon in sod., 2016).
V sirih iz surovega mleka ima glavni vpliv na oblikovanje arome mikrobiota surovega mleka. Zato je toplotna obdelava nezaželena, saj izniči vlogo naravne mikrobiote in encimov (Fretin in sod., 2017; Yoon in sod., 2016).
Siri iz surovega mleka vsebujejo večje količine hlapnih spojin, kot so karboksilne kisline, estri in alkoholi, kar vpliva na okus in aromo. Odvisno od sestave mleka ima lahko sir iz surovega mleka tudi drugačno teksturo. To je predvsem odvisno od sestave mikrobiote, letnega časa ter samega procesa sirjenja (Yoon in sod., 2016).
2.3.2.1 Psihrotrofni mikroorganizmi v sirih iz surovega mleka
Tako kot pri izdelavi vseh vrst mlečnih izdelkov je tudi pri izdelavi sirov izjemno pomembna kakovost osnovne surovine, torej mleka, še posebej, če izdelujemo sire iz surovega mleka.
Ker je hlajenje mleka zelo pomembno, se mleko takoj po molži ohladi na temperaturo pod 6 °C in se ga pri tej T hrani do predelave. Nizke temperature zavirajo rast in razmnoževanje MO, ne glede ali gre za tehnološko koristne, kvarljivce ali celo patogene MO. Velik problem pri tem pa predstavljajo v mleku t.i. psihrotrofni MO, kot so Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. in Enterobacteriaceae, ki so sicer večinoma mezofilni MO, a so sposobni razmnoževanja pri nizkih temperaturah mleka. To razmnoževanje je sicer upočasnjeno, a s prehodom z enodnevnega zbiranja mleka na dvo-dnevno zbiranje imajo ti MO dovolj časa, da njihovo število v surovem mleku vseeno precej naraste. Zato psihrotrofni MO pogosto postanejo prevladujoča mikrobiota (predvsem rod Pseudomonas) surovega mleka med hladnim skladiščenjem. Ti MO proizvajajo termostabilne hidrolitične encime, kot so proteaze in lipaze, ki povzročajo napake ter kvar mleka in mlečnih izdelkov (Yoon in sod., 2016). Velik delež proteolitičnih in lipolitičnih MO že v mleku povzroči nekontrolirano razgradnjo beljakovin in maščob, kar ima za posledico nastanek kratkih peptidov ter razvoj
napak v konsistenci in okusu sirov. Večja je izguba kazeinov v sirotko, manjši je izplen sirov; v siru so prisotni grenki, pekoči, žarki okusi, med zorenjem sirov se ne razvije ustrezna tekstura.
2.3.2.2 Mikroorganizmi v sirih iz surovega mleka
V sveže namolženem mleku zdravih krav je le nekaj 100 do nekaj 1000 MO na mililiter mleka, in to mleko lahko imenujemo »tehnično« sterilno mleko. To začetno mikrobioto mleka sestavljajo predvsem MKB, ki so naravni poseljevalci mlečne žleze in med molžo preidejo v mleko. Na nadaljnje oblikovanje mikrobiote surovega mleka vpliva kombinacija več dejavnikov, kot so sezonske spremembe, stopnja higiene na kmetijskem gospodarstvu, prehrana živali in učinkovitost hlajenja. Mikrobiota mleka vpliva na končno kakovost sira, ki pa jo sooblikujeta tudi tip sira in pogoji med sirjenjem (Giello in sod., 2017).
Toplotna obdelava mleka vpliva tudi na sestavo mikrobiote sira med zorenjem. Tako je na površini sira iz toplotno obdelanega mleka več po Gramu pozitivnih in katalaza-pozitivnih MO ter manj kvasovk in plesni kot pri siru iz surovega mleka (Verraes in sod., 2015; Fretin in sod., 2017).
V sirih iz surovega mleka lahko najdemo tudi za človeka nevarnejše MO. Med človeku najnevarnejše MO, ki jih lahko najdemo v surovem mleku in nato v sirih, spadajo Listeria monocytogenes, VTEC, Salmonella, S. aureus in Campylobacter. Zato je priporočljivo, v kolikor dvomimo o mikrobiološki kakovosti mleka za sir, da mleko pred izdelavo sira toplotno obdelamo (Verraes in sod., 2015).
2.3.2.3 Patogeni mikroorganizmi v sirih iz surovega mleka
Čeprav toplotna obdelava mleka neselektivno uniči vegetativne oblike večine tehnološko koristnih kot tudi patogenih bakterij, pa lahko sir iz toplotno obdelanega mleka vsebuje spore, npr. spore klostridijev. V vsakem primeru je potrebno biti pozoren na higieno okolja in delavcev ne glede na to, ali je bilo mleko pred sirjenjem toplotno obdelano ali ne (Yoon in sod., 2016).
Tehnološki postopek izdelave sira vključuje tudi fazo soljenja, ki najpogosteje poteka v slanici. Soljenje ima vrsto pozitivnih učinkov na sir, saj sodeluje pri oblikovanju okusa, znižuje vodno aktivnost, ki tako postane neugodna za preživetje ali rast MO, hkrati ima sama po sebi protimikroben učinek (Verraes in sod., 2015).
Med zorenjem sirov pride do biokemijskih sprememb, predvsem proteolize in lipolize, kar vodi do oblikovanja značilne konsistence sira. Zelo pomemben dejavnik med zorenjem sirov je temperatura. Višje temperature lahko skrajšajo čas zorenja, a hkrati omogočajo rast škodljivih bakterij. Zato lahko s skrbno izbrano temperaturo zelo omejimo rast neželenih bakterij, ki lahko povzročajo kvar sirov ter izbruhe bolezni, povezane z uživanjem mikrobiološko neustreznih sirov, in hkrati zagotovimo ustrezen potek zorenja sirov (Yoon in sod., 2016).
Nekatere študije so ugotavljale tudi vpliv časa zorenja na mikrobiološko kakovost sirov iz surovega mleka. V določenih primerih je 60-dnevno zorenje izboljšalo mikrobiološko kakovost sirov iz surovega mleka, kar so v svoji študiji preverjali Brooks in sod. (2012).
Ugotovili so, da je med 60-dnevnim zorenjem 41-ih vzorcev sirov iz surovega mleka prišlo do zmanjšanja populacije patogenih MO, vključujoč E. coli O157:H7, L. monocytogenes, Salmonella in Campylobacter. Nasprotno pa druge študije ugotavljajo, da tudi 270-dnevno zorenje ne izboljša mikrobiološke kakovosti sirov iz surovega mleka. Kakorkoli, na morebitno izboljšanje mikrobiološke kakovosti sirov iz surovega mleka med zorenjem vsekakor vpliva veliko dejavnikov, kot je npr. tip sira, prisotne mikrobne vrste ter začetna velikost populacij kontaminantov (Yoon in sod., 2016).
Verraes in sod. (2015) so zaključili, da lahko pri izdelavi trdih sirov iz surovega mleka nekatere bakterije, kot so Salmonella, Listeria monocytogenes, S. aureus in Mycobacterium avium, sicer preživijo, a ne rastejo več. Medtem se lahko velikost populacije E. coli med izdelavo sira lahko poveča predvsem zaradi slabe higiene.
Med zorenjem trdih sirov lahko pride do zmanjšanja velikosti populacij različnih patogenov, kot so Salmonella, E. coli, Listeria monocytogenes in Mycobacterium avium, vendar je njihovo prisotnost še vedno moč zaznati. Med zorenjem poltrdih sirov poleg prej naštetih MO lahko preživi tudi S. aureus. Med zorenjem mehkih sirov pa najpogosteje preživijo E.
coli, Listeria monocytogenes in Brucella spp. (Verraes in sod., 2015).
Med siri imajo poltrdi oz. mehki tipi sirov, kot so gorgonzola, brie in kamamber relativno visoko vodno aktivnost, v območju od 0,97 do 0,99, in nizko kislost. Poleg tega je temperatura zorenja teh sirov navadno nekoliko višja, kar je tudi bolj ugodno za rast patogenih bakterij. Pri teh ugodnih pogojih se faza prilagajanja in generacijski čas bakterijske rasti skrajšata, kar povzroči povečanje števila bakterijskih celic. Zato je veliko večja verjetnost slabše mikrobiološke kakovosti pri mehkih tipih sirov (Yoon in sod., 2016).
Na splošno pogoji izdelave in skladiščenja mlečnih izdelkov iz surovega mleka pogojujejo aktivnosti MO, ki so prisotni v surovem mleku, tako tehnološko pomembnih kot patogenih, ki vplivajo na njihovo rast, preživetje ali odmrtje. Rast MKB zmanjšuje možnosti rasti patogenov, po eni strani s kompeticijo in na drugi strani s protimikrobnimi metaboliti, npr.
mlečno kislino, ki znižuje vrednost pH (Verraes in sod., 2015).
2.3.2.4 Mikrobiološke smernice za sire iz surovega mleka v preteklosti
V ZDA je prepovedana meddržavna maloprodaja in distribucija surovega mleka, številne zvezne države pa prepovedujejo kakršnokoli maloprodajo surovega mleka. Nasprotno je po vsej ZDA dovoljena prodaja sirov iz nepasteriziranega mleka, a le pod pogojem, da so siri skladiščeni v skladu z zveznimi smernicami. Slednje, prvotno sprejete že leta 1950, so navajale, in to velja še danes, da se nepasterizirano mleko lahko uporablja za izdelavo sirov pod pogojem, da so nato ti siri shranjeni vsaj 60 dni pri temperaturi, ki ni nižja od 1,7 °C.
To pravilo naj bi temeljilo na predpostavki, da patogeni MO sčasoma odmrejo zaradi nizke vrednosti pH, nizke vodne aktivnosti, visoke koncentracije soli in tekmovalnega okolja v siru (Brooks in sod., 2012).
Od začetka izvajanja teh smernic v ZDA pred več kot 60 leti so bili siri iz surovega mleka le občasno povezani z boleznimi, ki jih povzročajo živila (Brooks in sod., 2012).
2.3.2.5 Izbruhi okužb, povezani z uživanjem sirov iz surovega mleka
Mnenja potrošnikov o mikrobiološki varnosti sirov iz surovega mleka so deljena, saj nekateri menijo, da so siri iz surovega mleka ob primerjavi s siri iz toplotno obdelanega mleka mikrobiološko bolj sporni, medtem ko spet drugi menijo ravno nasprotno. Čeprav je bilo opravljenih veliko raziskav na temo mikrobiološke kakovosti in varnosti sirov iz surovega mleka, je to vprašanje še vedno nedorečeno (Yoon in sod., 2016).
Študije mikrobiološke varnosti sirov iz surovega oz. toploto obdelanega mleka dajejo različne rezultate. Ko so v eni od takih raziskav analizirali sire iz surovega mleka krav, ovc in koz s kmetij, so ugotovili zelo nizko pojavnost bakterijskih patogenov, kot so S. aureus, Salmonella in E. coli O157: H7, kar kaže, da je sir iz surovega mleka lahko tudi mikrobiološko varen. Nadalje so obsežne raziskave zorenih sirov iz surovega mleka pokazale, da je bil samo en vzorec sira od 181 analiziranih okužen z Listeria monocytogenes ter da v nobenem od 1819 vzorcev sirov, odvzetih v Evropi in Združenem kraljestvu, niso potrdili prisotnosti salmonele. Po drugi strani so v Nemčiji v letih 2006-2007 poročali o številnih izbruhih okužb z listerijo, ki jih je povzročilo uživanje sirov, izdelanih iz pasteriziranega mleka. Zato ni mogoče trditi, da so siri iz pasteriziranega mleka mikrobiološko varnejši kot sir iz surovega mleka (Yoon in sod., 2016).
Po nekaterih podatkih naj bi bile enterohemoragični E. coli in Listeria monocytogenes ter S.
aureus in Salmonella spp. najpogosteje prisotne patogene bakterije v sirih iz surovega mleka.
Hkrati številne študije poročajo, da naj bi uživanje sirov iz pasteriziranega mleka povzročilo celo več izbruhov bolezni v primerjavi s siri iz surovega mleka. Po drugi strani pa rezultati nekaterih raziskav v sirih iz surovega mleka niso potrdili prisotnosti patogenih bakterij oz.
minimalno število le-teh vključno z Listeria monocytogenes. Kot že rečeno, je mikrobiološka varnost sirov iz surovega mleka še vedno zelo kontroverzna tema (Yoon in sod., 2016).
Nekatere raziskave so pokazale, da naj bi bila prisotnost posameznih skupin patogenih MO vseeno povezana s dejstvom, da gre za sire iz surovega ali pasteriziranega mleka, medtem ko lahko nekatere patogene MO najdemo v obeh skupinah sirov (Yoon in sod., 2016). Med take patogene bakterije prištevamo:
• Listeria monocytogenes,
• Salmonella,
• S. aureus.
V sirih iz surovega mleka so medtem našli predvsem naslednje patogene bakterije:
• Brucella melitensis,
• Campylobacter spp.,
• Coxiella burnetii,
• E. coli O157:H7,
• Streptococcus spp.,
• Mycobacterium bovis.
V sirih iz pasteriziranega mleka so kljub toplotni obdelavi našli sporogeno bakterijo Clostridium spp.
2.4 SENZORIČNA KAKOVOST SIROV IZ SUROVEGA MLEKA
Izdelava sirov iz surovega ali pasteriziranega mleka se odraža tudi v specifičnih senzoričnih lastnostih, značilnih za ene ali druge sire. Zato so doprinos surovega mleka na oblikovanje senzoričnih lastnosti sirov iz surovega mleka ovrednotili s poskusi, kjer je bila edina spremenljivka toplotna obdelava mleka, v nadaljevanju pa so bili siri izdelani s popolnoma enakim tehnološkim postopkom. Neodvisno od vrste sira izkazujejo siri iz surovega mleka pestrejši aromatični profil ter intenzivnejši okus, pogosto so pikantni, kiselkasti, z noto po žarkem in po živalih. Zaradi pestrejše mikrobne populacije in s tem povečane encimske aktivnosti siri iz surovega mleka tudi intenzivneje in hitreje zorijo, vse to pa oblikuje njihove značilne senzorične lastnosti. Te značilne senzorične lastnosti so posledica hitrejšega in obsežnejšega razvoja mikrobiote v surovem mleku, različnih poti proteolize, obsežnejše lipolize ter na splošno večjega obsega tvorbe hlapnih komponent. Z vidika konsistence so razlike med siri iz surovega mleka in siri iz toplotno obdelanega mleka manj očitne, saj je oblikovanje konsistence sirov odvisno predvsem od vsebnosti ostale vezane vode, ravnotežja kalcija ter primarne proteolize na račun nemikrobnih encimov in precej manj od aktivnosti mikrobite surovega mleka. Na splošno imajo siri iz surovega mleka nekoliko bolj čvrsto in zrnato ter manj elastično in gumijasto konsistenco, kar je verjetno posledica večje zrelosti sirov v času konzumne zrelosti. Zato je opredelitev optimalne konzumne zrelosti sirov iz surovega mleka veliko zahtevnejše kot pri sirih iz toplotno obdelanega mleka (Bachmann in sod., 2011).
2.5 SENENO MLEKO
2.5.1 Zgodovinsko ozadje prireje senenega mleka
Za prirejo senenega mleka bi lahko rekli, da je stara prav toliko, kot je stara udomačitev molznih živali, ko je človek prešel iz nabiralca v izdelovalca hrane, torej okoli 10.000 let.
To je tudi obdobje, ko je človek »izdelal« prve mlečne izdelke, npr. posamezne vrste fermentiranega mleka in prve sire. Spoznal je, da na tak način preoblikuje hitro pokvarljivo surovino, to je mleko, v bolj obstojne izdelke in to je bil tudi povod za začetek in razvoj izdelave mlečnih izdelkov.
Že okoli leta 1900 so bili pripravljeni predpisi za brezsilažno mleko, primerno za izdelavo trdih tipov sira in na podlagi teh so bili v Avstriji okoli leta 1950 sprejeti predpisi v zveznih deželah Vorarlberg, Tirolska in Salzburg. Do leta 1993 je bila prepovedana uporaba silaže, da bi ohranili seneno mleko za sirarne, kjer proizvajajo sire iz surovega mleka (Izvedbena uredba komisije EU 2016/304, 2016).
2.5.2 Definicija in zakonodaja senenega mleka
Po definiciji je seneno mleko mleko molznic, ki jim ne krmimo silaže, pač pa krmo ali svežo travo. Obroke lahko sestavljajo tudi žita in tropine (Izvedbena uredba komisije EU 2016/304, 2016).
Seneno mleko je vpisano v register zajamčenih tradicionalnih posebnosti (ZTP), ki je ena od shem kakovosti, opisujoč zaščitene kmetijske pridelke in živila (ZKPŽ) na področju celotne EU, torej tudi v Sloveniji (IKC, 2012).
Bistvena razlika med senenim in nesenenim mlekom je v prehrani molznih živali, kjer je v prehrani molznih živali za prirejo senenega mleka prepovedana fermentirana krma oz. silaža.
Poleg tega velja še vrsta dodatnih prepovedi oz. omejitev, kot je npr. prepovedana uporaba živali in krmil, ki so v skladu z veljavno zakonodajo opredeljeni kot „gensko spremenjeni“.
Z industrializacijo in napredkom kmetijstva se je proizvodnja silaže (fermentirane krme) od šestdesetih let prejšnjega stoletja zaradi mehanizacije zelo razmahnila in izpodrinila kmetijstvo, ki je temeljilo na uporabi sveže krme in sena (Izvedbena uredba komisije EU 2016/304, 2016).
Izvedbena uredba komisije (EU) 2016/304 (2016) zelo natančno predpisuje merila, ki morajo biti izpolnjena za prirejo senenega mleka in obsegajo: dovoljena in prepovedana krmila, pogoje gnojenja, uporabo kemičnih pomožnih snovi, okoliščine prepovedi dobave senenega mleka, prepoved gensko spremenjenih živali in krmil in druge določbe. Prvi dve področji uredbe komisije (EU) 2016/304 sta razdeljeni na:
➢ Dovoljena krmila:
živali se v glavnem krmijo s svežo travo, metuljnicami in zelišči v obdobju zelene krme ter s senom v zimskem obdobju,
kot dopolnilna voluminozna krma se štejejo in so dopustni tudi: zelena oljna ogrščica, zelena koruza, zelena rž in krmna pesa, peleti iz sena, lucerne in koruze ter podobna krmila,
voluminozna krma mora v letnem obroku predstavljati vsaj 75 % suhe snovi,
v svoji konvencionalni tržni obliki ter v mešanicah z mineralnimi snovmi, na primer otrobi, peleti itd., se lahko uporabljajo tudi naslednja žita: pšenica, ječmen, oves, tritikala, rž in koruza,
v krmnem obroku se lahko uporabljajo tudi konjski bob, navadni grah, bel volčji bob, plodovi oljnic in moka oz. pogača, pridobljena z ekstrakcijo.
➢ Prepovedana krmila:
Prepoved krmljenja s silažo (fermentirano krmo), vlažnim senom ali fermentiranim senom,
prepoved krmljenja s stranskimi proizvodi pivovarn, destilarn in stiskalnic sadja ter z drugimi stranskimi proizvodi živilsko predelovalne industrije, na primer mokrimi pivskimi tropinami ali mokro pulpo – izjema: posušena pulpa in melasa kot stranski proizvod proizvodnje sladkorja in posušena beljakovinska krma, pridobljena pri predelovanju žit,
prepoved krmljenja mater z namočenimi krmili,
prepoved krmljenja s krmili živalskega izvora (mleko, sirotka, mesno-kostna moka itd.), razen krmljenja mladih živalih z mlekom in sirotko,
prepoved krmljenja z vrtnimi odpadki, odpadlim sadjem, krompirjem in sečnino.
Uporaba sena in silaže za krmo krav molznic je zelo razširjena, čeprav ostaja veliko odprtih vprašanj o vplivu silaže na kemijske, fizikalne, mikrobiološke in tehnološke značilnosti mleka, ki ga predelujemo v sire, predvsem tiste, ki nosijo oznako najvišje kakovosti, in sicer
zaščiteno označbo porekla (ZOP), kjer je uporaba silaže omejena ali, še pogosteje, prepovedana (Giello in sod., 2017).
2.5.3 Sestava senenega mleka
Sestava krmnih obrokov molznic do določene mere vpliva na sestavo mleka, kar se kaže predvsem v sestavi maščobnih kislin ter v manjšem obsegu tudi v raznolikosti prisotne populacije MKB. Toplotna obdelava mleka naj bi izenačila razlike v okusu med senenim in nesenenim mlekom zaradi izenačenja mikrobiote (Fretin in sod., 2017).
Na nemški univerzi kmetijskih znanosti so s študijo potrdili, da seneno mleko vsebuje približno dvakrat več omega-3 maščobnih kislin in prav tako konjugirane linolne kisline kot konvencionalno mleko. Omega-3 maščobne kisline so esencialne in jih naše telo ne more proizvesti, so pa nujno potrebne za normalno delovanje našega telesa, zato jih moramo vnesti s hrano (Ginzinger, 2012).
2.5.4 Mikrobiota senenega mleka
Mikrobioto surovega mleka oblikuje preplet več dejavnikov, kot so sezonske spremembe, notranji ali zunanji pašni sistem krmljenja živali, geografska lega kmetije, način stelje ter postopki molže (Giello in sod., 2017). Vidimo torej, da poleg vrste sira, ki ga izdelujemo, in posameznih parametrov tehnološkega postopka (delno posnemanje, toplotna obdelava, vrsta starterske kulture, čas in temperatura zakisanja, pogoji zorenja) na končno kakovost sira vplivajo tudi pogoji prireje mleka.
Tako so Giello in sod. (2017) v svoji študiji med drugim ugotavljali vpliv krmljenja živali s senom ali silažo na dinamiko mikrobne populacije od mleka preko posameznih faz tehnološkega postopka izdelave sira do konzumno zrelega sira. Na podlagi rezultatov analize 16S rRNA genoma mikrobnih združb silažnega in senenega mleka se je izkazalo, da sta v obeh vrstah mleka prisotni vrsti Streptococcus thermophilus in Lactococcus lactis, ki pa v senenem mleku skupaj s Pseudomonas spp. predstavljajo prevladujoče vrste, medtem ko sta v silažnem mleku prevladujoča Lactococcus lactis in Acinetobacter spp.
Za Pseudomonas spp. so ugotovili, da je njegova vsebnost tako v senenem kot silažnem mleku zelo nihala, od 2,62 % do 35,57 %, medtem ko so v manjših deležih pod 5 % v obeh vrstah mleka potrdili še prisotnost Acinetobacter johnsonii, Corynebacterium spp. in Pseudomonas fragi ter približno 8 % Lactococcus raffinolactis. V obeh vrstah mleka je zaradi intenzivnega hlajenja mleka Acinetobacter spp. sčasoma postala prevladujoča mikrobna populacija (Giello in sod, 2017). Rezultati nakazujejo, da bistvene razlike v mikrobni sestavi senenega in silažnega mleka pravzaprav ni.
Kljub temu da so vzorci surovega senenega ali silažnega mleka za izdelavo kačkavalja v primerjavi z drugimi vzorci (kisava, koagulum, sirnina, siri ob različnih časih zorenja) izkazovali največjo mikrobno raznolikost na ravni rodu in vrst, pa Giello in sod. (2017) zaključujejo, da ta taksonomska raznolikost najverjetneje ni posledica različne krme, torej sena ali silaže, ampak kvečjemu vpliva okolja.
Velikost populacije Listeria monocytogenes lahko zelo naraste v silaži slabe kakovosti, kar je izrazito predvsem v žepih silaže, kjer fermentacija rastlinskega materiala z MKB ne poteka pravilno in vrednost pH ostane previsoka, kar je ugodno za rast Listeria monocytogenes. Po zaužitju lahko le-ta preide skozi prebavni trakt živali, ne da bi pri tem izzvala okužbo. Tveganje kontaminacije mleka z Listeria monocytogenes preko fekalij se še poveča, če imamo živali v navezi v hlevu in jih krmimo s silažo (EFSA Panel on Biological Hazards, 2015).
2.6 SIRI IZ SUROVEGA SENENEGA MLEKA
Izdelava sirov iz surovega mleka je zanimiva predvsem zato, ker se v teh sirih razvije precej bolj polna, intenzivna in značilna aroma v primerjavi s siri iz pasteriziranega mleka, kar velja tudi za sire iz senenega surovega oz. toplotno obdelanega mleka. Hkrati pa se z uporabo senenega mleka močno zmanjša morebitna prisotnost spor klostridijev, katerih glavni vir je silaža in so v sirarstvu glavni povzročitelji nezaželenega poznega napihovanja sirov.
Nastanek intenzivnejše arome pripisujejo delovanju primarne mikrobiote, v kateri prevladujejo Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., in Enterococcus spp.
(Yoon in sod., 2016).
Ena od možnih razlag za oblikovanje intenzivnejših in različnih arom v sirih iz surovega senenega mleka so intenzivnejše lipolitične in oksidativne spremembe mlečne maščobe zaradi delovanja pestre nativne mikrobiote (Fretin in sod., 2017).
2.6.1 Bakterijski patogeni, povezani s siri iz surovega senenega mleka
Med patogene MO, ki jih najpogosteje najdemo v sirih iz surovega senenega mleka, prištevamo (Yoon in sod., 2016):
• Enterohemoragično E. coli,
• Salmonella enterica,
• Listeria monocytogenes,
• Campylobacter jejuni in coli,
• Staphylococcus aureus.
2.7 ZAŠČITNE KULTURE
Za sire iz surovega mleka je značilna pestra mikrobna združba, v kateri pa prevladujejo MKB z laktokoki, laktobacili in enterokoki, ki s svojim protimikrobnim delovanjem učinkovito zavirajo patogene MO. Poleg bakteriocinov imajo protimikroben učinek še organske kisline, etanol, diacetil in vodikov peroksid. Slednji povzroča oksidativni stres, ki zavira rast S.
aureus in drugih patogenih bakterij (Yoon in sod., 2016).
2.7.1 Bakteriocinogene bakterije
Bakteriocini so ribosomsko sintetizirane protimikrobne snovi proteinske narave, katerih protimikrobno delovanje je običajno usmerjeno proti bakterijam, sorodnim bakteriji proizvajalki bakteriocina. Opisanih je tudi vedno več širokospektralnih bakteriocinov,
katerih protimikrobno delovanje je usmerjeno tudi proti nesorodnim bakterijskim vrstam in celo proti po Gramu negativnim bakterijam (Yoon in sod., 2016).
Na podlagi njihovih struktur in načinov delovanja lahko bakteriocine razvrstimo v tri skupine (Yoon in sod., 2016):
• razred I: lantibiotiki (nizini A, Z in Q, ki jih proizvajajo vrste Lactococcus lactis),
• razred II: majhni in proti toploti odporni ne-lantibiotiki (bakteriocini, ki ne vsebujejo lantionina in so razdeljeni v podskupine IIa, IIb, IIc in IId),
• razred III: veliki, za toploto občutljivi bakteriocini.
Bakteriocini podskupine IIa so t.i. »pediocinom podobni« bakteriocini, ki so izredno protimikrobno učinkoviti proti listerijam, zato jih pogosto imenujemo tudi protilisterijski bakteriocini.
Ker so MKB naravno prisotne v surovem mleku in v sirih iz surovega mleka in ker mnoge med njimi proizvajajo bakteriocine, številne študije poročajo o naravno prisotnih bakteriocinih v surovem mleku in siru, ki s svojim protimikrobnim delovanjem prispevajo k nadzoru oz. inhibiciji morebiti prisotnih patogenih MO. Posebna skupina med tehnološko pomembnimi MKB so zagotovo bakterije rodu Enterococcus, ki so po eni strani pomembni tehnološki MO, saj posebej pomembno vlogo odigrajo pri oblikovanju značilnih senzoričnih lastnosti tradicionalnih sirov ter so hkrati znani proizvajalci bakteriocinov. Po drugi strani je za te bakterije značilno, da pogosto nosijo genske zapise za virulentne dejavnike in odpornost proti antibiotikom na prenosljivih genskih elementih. Zato je včasih res težko sklepati o mikrobiološki varnosti izolatov, prisotnih v siru iz surovega mleka (Yoon in sod., 2016).
2.7.1.1 Nizin
Nizin je bakteriocin, ki se po svojih lastnostih razvršča v razred I med lantibiotike.
Proizvajajo ga sevi Lactococcus lactis subsp. lactis. Protimikrobni učinek nizina so opisali okoli leta 1929, ko so različne raziskovalne skupine opisale pojav, da sevi Lactococcus lactis proizvajajo snov, ki zavira rast drugih MO v siru. Že po dvajsetih letih so nizin uspešno uporabili v švicarskih vrstah sirov, da bi preprečili pozno napihovanje sirov, ki ga povzročajo klostridiji. Prvi komercialni pripravek za nizin je bil na voljo leta 1957 (Schneider in sod., 2011).
Bakteriocin nizin je policikličen protimikroben peptid, ki ga sestavlja 34 aminokislinskih ostankov, vključno z neobičajnimi aminokislinami, kot sta lantionin in metillantionin. Zaradi te strukture se nizin razvršča med lantibiotike tipa α (Schneider in sod., 2011).
Leta 1991 so odkrili naravno različico nizina, ki ga proizvaja sev Lact. lactis NIZO 22186, in ga poimenovali nizin Z. Pokazalo se je, da se struktura nizina Z razlikuje od nizina samo na položaju 27, kjer je histidin nadomeščen z asparaginom. Nizin je bil nato preimenovan v nizin A. Leta 2003 je bila opisana še ena različica, ki pa so jo poimenovali nizin Q. Uporaba nizina kot konzervansa je dovoljena za zoren in topljen sir v koncentraciji 12,5 mg/kg.
Vendar je lahko prisoten tudi v nekaterih vrstah sirov kot rezultat naravnih fermentacijskih procesov (Schneider in sod., 2011).
Ugotovili so, da je nizin protimikrobno učinkovit proti rasti in tvorbi biofilmov sevov S.
aureus, ki so jih osamili iz surovega mleka in sirov. Druga raziskovalna skupina je iz surovega mleka uspešno osamila avtohtoni sev Lact. lactis, ki proizvaja nizin A, in ugotovila, da dodatek te kulture preprečuje rast koagulaza pozitivnih S. aureus v tradicionalnem grškem siru graviera. Lact. lactis subsp. cremoris, ki proizvaja nizin A, je kot dodatek k termiziranemu mleku popolnoma zavrl rast Listeria monocytogenes (Yoon in sod., 2016).
3 MATERIAL IN METODE
3.1 POTEK EKSPERIMENTALNEGA DELA
Potek praktičnega dela magistrske naloge prikazuje slika 1.
Slika 1: Shema dela
Mikrobiološke analize za določanje:
sulfit reducirajočih klostridijev, mezofilnih kokov, mezofilnih laktobacilov, stafilokokov (S. aureus, S.
saprophiticus), E. coli, koliformnih MO
Kemijske analize:
- s klasičnimi metodami:
% mlečne maščobe % suhe snovi % soli
- z aparatom Foodscan:
% beljakovin - izračun
% mlečne maščobe v suhi:
snovi
% vode v nemastni snovi Senzorična
analiza Surovo seneno
mleko
Dodatek sirišča
Rezanje koaguluma ter oblikovanje in sušenje sirnega zrna
Oblikovanje sirnine in stiskanje
Soljenje sirov v slanici
Zorenje sirov 90 dni Temperiranje mleka na 32 °C
Vzorec surovega senenega mleka
Vzorec sirnine po stiskanju
Vzorec sira po soljenju v slanici
Vzorec zrelega sira
Kemijske analize vsebnost maščobe, vsebnost beljakovin, vsebnost laktoze;
izračun suhe snovi brez maščobe
Mikrobiološko-higienske analize
SŠMO,
število somatskih celic, hitri test na prisotnost zaviralnih snovi
Mikrobiološke analize Listeria monocytogenes
Salmonella spp.
Dodatek starterske kulture + zaščitne kulture
(SK+ZK)
TEHNOLOŠKI POSTOPEK IZDELAVE SIRA ANALIZE
Dodatek starterske kulture (SK)
3.2 OPIS EKSPERIMENTALNEGA DELA
Poskus je potekal od junija 2018 do maja 2019 v mlekarni Celeia. V tem obdobju smo dvakrat mesečno izpeljali sirjenje surovega senenega mleka, in sicer smo sirili najprej z dodatkom komercialne starterske kulture (SK), dva dni kasneje pa z dodatkom starterske in zaščitne kulture (SK+ZK). Kot prikazuje slika 1, smo surovo seneno mleko (okoli 200 L) po sprejemu v mlekarno najprej analizirali. Z instrumentalnimi analizami smo ugotavljali njegovo kemijsko (vsebnost maščobe, beljakovin, laktoze, suhe snovi ter suhe snovi brez maščobe) in mikrobiološko-higiensko kakovost (skupno število mikroorganizmov, število somatskih celic, prisotnost zaviralnih snovi).
Mleko smo nato segreli na 32 °C, dodali CaCl2 ter SK (sirjenje 1) oz. SK+ZK (sirjenje 2) in sirišče. Po usirjenju mleka smo začeli z obdelavo koaguluma, kjer smo izdelali sirno zrno ustrezne velikosti ter ga dogreli in sušili do ustrezne klenosti. Osušena sirna zrna smo prenesli v oblikovala, sledilo je stiskanje sirnine in nato soljenje v slanici. Po soljenju smo sire osušili in jih prenesli v zorilnico, kjer so pri 12 °C in pri 85 % vlagi zoreli 90 dni. Med zorenjem smo sire negovali tako, da smo jih redno obračali vsak ponedeljek, sredo in petek.
Po potrebi smo jih obrisali z vlažno krpo ali oprali s slanico. Ker smo sire izdelovali iz surovega mleka, smo v mleku v nekaterih vmesnih fazah izdelave sira ter v končnem siru s klasičnimi tehnikami nacepljanja na gojišča določali še E. coli in koliformne bakterije, sulfit reducirajoče klostridije, mezofilne koke, mezofilne laktobacile, stafilokoke, Listeria monocytogenes in Salmonela spp. S kemijskimi analizami smo zrelim sirom določili vsebnost maščobe, suhe snovi, soli ter izračunali vsebnost maščobe v suhi snovi, na koncu pa smo jih še senzorično analizirali z 20-točkovno lestvico.
3.3 MATERIALI
Za izvedbo eksperimentalnega dela smo potrebovali:
3.3.1 Mleko
Za izdelavo sirov smo uporabili surovo seneno mleko s kmetije Martine in Klemna Podpečana iz Zavrha pri Galiciji. Na kmetiji redijo lisasto pasmo krav. Uporabili smo mleko dveh jutranjih in dveh večernih molž.
3.3.2 Starterske kulture
Poskus smo začeli s startersko kulturo DCC-260 (Chr. Hansen, Danska), ki je mešanica naslednjih termofilnih in mezofilnih MKB: Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp.
diacetylactis, Lactobacillus helveticus in Streptococcus thermophilus.
Po šestih mesecih smo poskus nadaljevali s kulturo Choozit AlpD (Danisco), sestavljeno iz Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus in Lactobacillus lactis.
3.3.3 Zaščitna kultura
Pri vsakem drugem sirjenju smo poleg starterske kulture uporabili še zaščitno startersko kulturo DVS® BS-10 (Chr. Hansen, Danska), ki jo sestavlja O mezofilna bakterija iz rodu Lactococcus, ki proizvaja bakteriocin nizin. Tako je kultura BS-10 učinkovita tudi proti po Gramu pozitivnim bakterijam iz rodov Bacillus in Clostridium, proizvajalec pa jo priporoča predvsem v sirarstvu za preprečevanje poznega napihovanja sirov.
Vse kulture smo dodajali po priporočilih proizvajalcev.
3.3.4 Sirišče
V poskusu smo uporabljali tekoče sirišče HANNILASE XP 200, ki smo ga dodajali skladno z navodili proizvajalca (Chr. Hansen, Danska), kar pomeni, da smo na 10 L mleka dodali 2,5 mL tekočega sirišča.
3.3.5 CaCl2
CaCl2 smo dodajali v obliki pripravka kalgan, ki ga Mlekarna Celeia uporablja pri redni proizvodnji sirov. CaCl2 se dodaja v sirarstvu takrat, ko izdelujemo sire iz pasteriziranega mleka, saj s toplotno obdelavo mleka izgubljamo topno obliko kalcija, ki pa je nujno potreben za oblikovanje 3-dimenzionalne para-kapa-kazeinske mreže.
3.3.6 Slanica
V poskusu smo uporabljali slanico, ki jo Mlekarna Celeia uporablja pri redni proizvodnji sirov.
3.3.7 Hranljiva gojišča
Hranljiva gojišča, ki smo jih uporabljali pri delu, so bila:
• Gojišče TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine)
Trdo hranljivo gojišče smo pripravili po navodilih proizvajalca (Merck KGaA, Nemčija). Natehtali smo 19,5 g dehidriranega gojišča in ga raztopili v 500 mL destilirane vode z mešanjem in segrevanjem. Avtoklavirali smo 15 minut pri 121 °C.
Ko se je gojišče ohladilo na približno 50 °C, smo dodali 5 mL 4 % raztopine cikloserina in premešali. S tem gojiščem smo ugotavljali število kolonijskih enot sulfit reducirajočih klostridijev.
• Gojišče M17
Trdo hranljivo gojišče smo pripravili po navodilih proizvajalca (Merck KGaA, Nemčija). Natehtali smo 27,5 g dehidriranega gojišča in ga raztopili v 500 mL destilirane vode z mešanjem in segrevanjem ter ga avtoklavirali 15 minut pri 121 °C.
S tem gojiščem smo ugotavljali število kolonijskih enot skupnih mezofilnih kokov (laktokokov in enterokokov).
• Gojišče MRS
Trdo hranljivo gojišče smo pripravili po navodilih proizvajalca (Sigma-Aldrich, ZDA). Natehtali smo 34,1 g dehidriranega gojišča in ga raztopili v 500 mL destilirane vode z mešanjem in segrevanjem. Avtoklavirali smo 15 minut pri 121 °C. S tem gojiščem smo ugotavljali število kolonijskih enot skupnih mezofilnih laktobacilov.
• Gojišče CHROMagar Staph aureus
Trdo hranljivo gojišče smo pripravili po navodilih proizvajalca (CHROMagar, Francija). Natehtali smo 82,5 g dehidriranega gojišča in ga raztopili v 500 mL destilirane vode z mešanjem. Avtoklavirali smo 5 minut pri 110 °C. Nato smo ga ohladili do okoli 45 °C in razlili v sterilne petrijeve plošče. S tem gojiščem smo ugotavljali število kolonijskih enot stafilokokov (S. aureus, S. saprophiticus).
• 3M petrifilm E.coli/coliform count plate
Petrifilni so komercialno pripravljeni za neposredno mikrobiološko analizo, zato pri petrifilmih ni potrebne predhodne priprave gojišča. Na njih smo ugotavljali število kolonijskih enot E. coli in koliformnih mikroorganizmov.
• Določanje Listeria monocytogenes in Salmonela sp.
Obe bakteriji določamo v treh korakih. Prvi korak je obogatitev vzorca, drugi je izolacija s selektivnimi gojišči, tretji korak pa je identifikacija oz. potrditev z različnimi testi.
Prisotnost listerij in salmonel so v vzorcih mleka in sirov preverjali na Inštitutu za mlekarstvo in probiotike na Oddelku za zootehniko Biotehniške fakultete v Domžalah.
Slika 2: Nacepljene plošče z različnimi gojišči in vzorci
3.3.8 Raztopine za razredčevanje in dodatki
• Ringerjeva raztopina ¼ jakosti
Ringerjevo raztopino smo uporabljali za razredčevanje vzorcev mleka in sirov po Kochu, pripravili in sterilizirali (15 min pri 121 °C) pa smo jo po navodilih proizvajalca (Merck).
• Raztopina dikalijevega hidrogenfosfata (K2HPO4)
Za pripravo primarnih razredčitev vzorcev sira smo uporabljali raztopino dikalijevega hidrogenfosfata. Raztopino smo pripravili po navodilih proizvajalca (Kemika, Zagreb) ter sterilizirali pri 121 °C za 15 min.
• Raztopina cikloserina
Raztopino cikloserina (Sigma-Aldrich) smo potrebovali pri pripravi gojišča TSC.
Natehtali smo 0,24 g ter ga homogeno zmešali s 6 mL destilirane vode. Ker smo raztopino cikloserina dodajali v sterilna gojišča, smo morali raztopljeni cikloserin sterilizirati. To smo storili s filtracijo preko filtrov Millipore z velikostjo por v membrani 0,22 μm v aseptičnih pogojih in tako dobili sterilno 4 % raztopino cikloserina.
• Raztopina kalcijevega klorida
V mleko smo dodajali tudi kalcijev klorid (kalgan) v prahu v razmerju 2 g/10 L mleka. Natehtali smo ustrezno količino kalgana v posodi in raztopili v približno 1 dL vode in nato celotno raztopino dodali mleku v sirarskem kotlu.
3.3.9 Hitri test za določanje prisotnosti zaviralnih snovi
Uporabljali smo hitri test Twin sensor (Unisensor, KIT 020), ki vsebuje mikrotitrsko ploščico s protitelesi in receptorji, ter merilni listič. S testom smo ugotavljali prisotnost tetraciklinov in betalaktamskih antibiotikov v mleku pred sprejemom.
3.4 METODE
Pri praktičnem delu magistrske naloge smo uporabili različne analize in metode, s katerimi smo ugotavljali mikrobiološko in kemijsko kakovost surovega senenega mleka ter mikrobiološko, kemijsko in senzorično kakovost sirov iz surovega senenega mleka, ki smo ga tudi sami izdelovali.
3.4.1 Tehnološki postopek izdelave sira iz surovega senenega mleka
Izdelava sira je potekala v Mlekarni Celeia v njihovem oddelku kletne sirarne. Po sprejemu približno 200 L surovega senenega mleka smo najprej opravili osnovne analize kemijske in higienske kakovosti ter podrobnejše analize mikrobiološke ustreznosti. Opravili smo tudi nujni hitri test na prisotnost zaviralnih snovi ter mleko po negativnem rezultatu prečrpali v sirarski kotel. Nato smo mleko segreli na 32 °C, dodali 2 g/10 L mleka CaCl2 (kalgan), ki smo ga predhodno raztopili v vodi, ter SK oz. SK+ZK po navodilih proizvajalca. Ker smo imeli manj mleka, kot ga proizvajalec priporoča na enoto pakiranja SK, smo vsebino vrečke
