KEMIJSKO INŽENIRSTVO Gabriela Kalčikova

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Katja Turk

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

KEMIJSKO INŽENIRSTVO

Kvantifikacija biofilma na mikroplastiki

DIPLOMSKO DELO

Katja Turk

M

ENTOR

: doc. dr. Gabriela Kalčikova

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Katja Turk sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Kvantifikacija biofilma na mikroplastiki.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr.

Gabriele Kalčikove;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 20.8.2021 Podpis avtorja:

KATJA TURK

Digitally signed by KATJA TURK

DN: c=SI, o=ACNLB, o=NLB, ou=Fizicne osebe, cn=KATJA TURK,

serialNumber=8748609100 Date: 2021.08.23 19:50:27 +02'00'

(6)

(7)

Iskreno bi se rada zahvalila mentorici dr. Gabrieli Kalčíkovi ter delovni mentorici Uli Rozman za vso pomoč pri izvedbi eksperimentov in pisanju diplomskega dela. Izkazali sta se za neverjetno angažirani in odzivni, sodelovati z njima pa mi je bilo v veliko v

veselje.

Iz srca hvala tudi družini in prijateljem, ki so mi ves čas stali ob strani.

(8)

(9)

Kvantifikacija biofilma na mikroplastiki Povzetek:

Plastika je postala nepogrešljiv material v našem življenju. Tempo, ki ga diktira svetovna proizvodnja presega naše sposobnosti za odgovorno ravnanje s plastičnimi odpadki, ki pri tem nastajajo. Tako vsakodnevno v naravo zaidejo ogromne količine plastike. Ta razpada na manjše delce, ki jim pravimo mikroplastika. Mikroplastika je v naravnem okolju podvržena številnim fizikalnim in kemijskim dejavnikom, poleg tega pa tako prihaja v stik s prisotnimi mikroorganizmi v okolju. Le-ti na površini mikroplastike tvorijo biofilm, ki še dodatno vpliva na njeno obnašanje v okolju. Delcem, na katerih se naselijo mikroorganizmi, se poveča gostota, kar vpliva na njihovo porazdelitev v vodnem okolju, ter biodostopnost za druge organizme. Prisotnost biofilma vpliva tudi na kroženje nutrientov, strupenost in interakcije z onesnaževali, ki so prisotni v vodi. V okviru eksperimentalnega dela diplomske naloge smo mikroplastiko izpostavili površinski vodi iz okolja in vrednotili razvoj biofilma na njeni površini ter spremembe v lastnostih mikroplastike. Ugotovili smo, da se na njej hitro razvija biofilm. Aktivnost biofilma smo dokazali z določanjem aktivnosti encimov ureaz, fotosintetskega pigmenta klorofila in ekstrahiranih zunajceličnih polimernih snovi. Mikroplastiki se je v 12 tednih izpostavljenosti površinski vodipovečala gostota, poleg tega pa je bil biofilm odgovoren tudi za njeno aglomeracijo.

Ključne besede: biofilm, mikroplastika, vodni ekosistem

(10)

Quantification of biofilm on microplastics Abstract:

Plastic has become an indispensable material in our lives. The pace dictated by global production exceeds our ability to responsibly handle generated plastic waste. Therefore, enormous amounts of plastics end up in our environment every day, where they break down into smaller particles called microplastics. By entering the environment, microplastics are subject to a number of physical and chemical factors. They also encounter microorganisms, which form a biofilm on a particle surface and further affect behavior of microplastics. The density of particles then increases after biofouling, affecting their distribution in the aquatic environment and their bioavailability to other organisms. The presence of biofilm also affects nutrient flow, toxicity, and interactions with contaminants present in water. In experimental part of the thesis, we exposed microplastics to surface water and evaluated the development of biofilm on its surface, as well as changes in the properties of microplastics. Results showed that living microorganisms can easily colonized microplastics. The viability of the biofilm was demonstrated by the measurement of activity of the urease enzymes, by the determination of the photosynthetic pigment (i.e. chlorophyll) and by analysis of extracted extracellular polymeric substances. After 12 weeks of aging in surface water, the density of microplastics increased and particles started to agglomerate as a consequence of biofilm formation.

Keywords: aquatic ecosystems, biofilm, microplastics

(11)

Kazalo

1 Pregled literature ... 1

1.1 Mikroplastika ... 1

1.1.1 Usoda mikroplastike v okolju ... 3

1.1.2 Potencialne nevarnosti mikroplastike v okolju ... 3

1.2 Biofilm ... 4

1.3 Tvorba biofilma na mikroplastiki ... 7

1.3.1 Vpliv biofilma na porazdelitev mikroplastike v vodnem okolju ... 8

1.3.2 Vpliv biofilma na interakcije mikroplastike z organizmi ... 9

1.3.3 Vpliv biofilma na adsorpcijo onesnaževal... 9

1.3.4 Vpliv na kroženje nutrientov ... 10

1.3.5 Mikroorganizmi na mikroplastiki ... 10

1.3.6. Vpliv biofilma na razgradnjo mikroplastike ... 11

2 Namen dela ... 13

3 Materiali in metode ... 15

3.1 Določanje količine biomase na delcih z razklopom ... 16

3.2 Določanje količine klorofila a in b ... 16

3.3 Določanje količine zunajceličnih polimernih snovi ... 18

3.4 Določanje aktivnosti encimov ureaz... 19

3.5 Določanje gostote ... 21

3.5.1 Določanje gostote etanola glede na vodo ... 21

3.5.2 Določanje gostote vzorca... 22

3.6 Mikroskopiranje in štetje delcev... 22

4 Rezultati in razprava ... 23

4.1 Količina biomase na mikroplastiki ... 23

4.2 Količina klorofila a in b ... 23

4.3 Količina zunajceličnih polimernih snovi ... 24

4.4 Aktivnost encimov ureaz ... 25

(12)

4.5 Gostota mikroplastike ... 26

4.6 Število delcev na maso ... 26

5 Sklepne ugotovitve ... 29

6 Literatura ... 31

(13)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

BFR bromirane snovi, ki zavirajo gorenje EDTA etilendiamintetraocetna kislina EPS zunajcelične polimerne snovi MP surova mikroplastika

MPB mikrooplastika z razvitim biofilmom UV ultra-vijolična (svetloba)

(14)

(15)

Katja Turk: Kvantifikacija biofilma na mikroplastiki

1 Pregled literature

1.1 Mikroplastika

Človeštvo že več kot stoletje pozna sintetične polimerne materiale, ki jim pravimo plastika [1]. Globalna proizvodnja plastike zadnjih 65 letih narašča z eksponentno hitrostjo, plastika pa je zaradi svoje nizke cene in trpežnosti postala nepogrešljiva v vsakodnevnem življenju [2,3]. Njena široka uporaba se odraža tudi v ogromni količini plastičnih odpadkov, ki pristanejo na odlagališčih in v okolju. Do leta 2015 naj bi se v okolju akumuliralo kar 4900 milijonov ton plastičnih odpadkov [2,4].

V okolje zaide plastika najrazličnejših oblik in velikosti. Delcem plastike manjšim od 1 mm pravimo mikroplastika, ki jo lahko najdemo povsod na planetu [5,6]. Njena koncentracija v okolju se močno razlikuje glede na posamezno območje. V najbolj onesnaženih delih morja lahko vrednost doseže tudi več tisoč delcev na kubični meter morske vode [5,7]. Mikroplastiko glede na izvor delimo na primarno in sekundarno. Med primarno mikroplastiko sodijo predvsem abrazivni mikrodelci v kozmetiki in industrijski peleti, ki so v obliki manjših delcev namensko proizvedeni v industriji. Sekundarna mikroplastika nastane s fragmentacijo večjih kosov plastike, npr. pri abraziji gum, razpadanju odpadne plastične embalaže ali pri sproščanju vlaken iz sintetičnih oblačil (slika 1) [4,5]. Čeprav vlakna ter mikroplastika iz kozmetičnih izdelkov prihajajo z odpadno vodo na komunalne čistilne naprave, ki so sposobne odstraniti do 98 % mikroplastike, je količina mikroplastike, ki jo izpustimo v okolje, še zmeraj zelo visoka [5]. V raziskavi na Škotskem so ocenili, da je na izhodu iz čistilne naprave dnevno v okolje izpuščenih kar 65 milijonov delcev mikroplastike [8].

Večina študij, s katerimi so do sedaj preučevali učinek mikroplastike in njeno usodo v naravi, je v svojih raziskavah uporabljala enako velike sferične delce, ki se zelo razlikujejo od tistih najdenih v naravi. V realnosti so delci zelo različnih oblik in velikosti, ki se s staranjem še dodatno spreminjajo [5,9]. Raznolikost delcev plastike je prikazana na sliki 2. Njihova površina je pogosto hrapava, sestava pa se močno razlikuje glede na tip polimera. Prav zaradi tako heterogenih lastnosti je mikroplastika izredno komplekno onesnaževalo [5].

(16)

(17)

1.1.1 Usoda mikroplastike v okolju

Čeprav plastiko pojmujemo kot obstojen material, se le-ta v naravi stara, spreminja fizikalne in kemijske lastnosti ter interagira z različnimi organizmi [2,18]. Mikroplastika začne v naravnem okolju izgubljati fizikalno-kemijske lastnosti. Tak primer je preperevanje, ki zaradi različnih mehanizmov povzroči razpad delcev ter vpliva na spremembe v njihovih lastnostih [9]. Najpogosteje se spremembe začnejo zaradi vpliva UV žarkov, ki tvorijo radikale in tako povzročijo razpad polimernih verig. Na enak način plastika razpada tudi pod vplivom povišane temperature, kar se v naravi pojavlja redkeje.

Pomembno vlogo igrata tudi mehanski stres, abrazija z drugimi delci in prisotnost oksidantov [2,19]. Vidne spremembe površine lahko vodijo v povečevanje razpok ter nadaljnji razkroj, kar še dodatno povečahrapavost in specifično površino delcev ter tako vpliva na njihove sorpcijske lastnosti [2,5,9]. Biorazgradnja, ki jo opravljajo mikroorganizmi, je omejena le na velikost oligomernih verig in lahko nastopi šele po predhodni abiotski razgradnji [2]. Očitno je torej, da je staranje plastike posledica številnih zunanjih dejavnikov [19]. Hitrost staranja in posledično razpad mikroplastike pa sta poleg okoljskih razmer močno odvisna tudi od vrste polimerov [2].

Zaradi okoljskih dejavnikov se s časom spremeni tudi topografija površine in kristaliničnost delcev, saj se zaradi trganja verig omogoči preureditev in ponovna kristalizacija polimernih verig [2,9]. Ena od posledic fragmentacije je tudi oksidacija polimerne verige, kar dodatno vpliva na površinske lastnosti delca. Oksidacija vodi do spremembe v obarvanosti delca. Cepitev verig in oksidacija vplivata tudi na upadanje molekulske mase in tvorbo številnih oksigeniranih produktov, kot so acetofenon, benzojska kislina in benzaldehid. S kisikom bogate skupine, ki se tvorijo na površini, povečujejo hidrofilnost, polarnost in povzročijo spremembo v naboju delca. To se odraža v spremenjenih interakcijah med mikroplastiko in drugimi onesnaževali. Sorpcija se lahko glede na naravo interakcij poveča (Cr, Co, Cu, Cd, Pb, Sr, Cs…) ali zmanjša (hidrofobne organske komponente) [2].

1.1.2 Potencialne nevarnosti mikroplastike v okolju

1.1.2.1 Adsorpcija onesnaževal

Plastika, ki zaide v okolje, pride v kontakt s številnimi organskimi in anorganskimi snovmi, med katerimi so tudi druga onesnaževala antropogenega izvora [5]. Zaradi staranja se povečuje specifična površina delcev, zaradi česar se mikroplastiki dodatno

(18)

4

izboljša sposobnost adsorpcije [2]. Posebno problematična je mikroplastika v odpadnih vodah, ki lahko vsebujejo visoke koncentracije onesnaževal z afiniteto do mikroplastike.

Vezava onesnaževal na površino je predpogoj za njihov transport in nadaljnjo distribucijo v naravnem okolju [5]. Tako vezana onesnaževala so lahko strupena in predstavljajo potencialno nevarnost za organizme [18]. V kolikšni meri se bodo onesnaževala iz mikroplastike izluževala in vplivala na organizme, je predvsem odvisno od koncentracije adsorbiranih snovi ter okoljskih pogojev [2].

1.1.2.2 Izluževanje aditivov

Poleg onesnaževal, ki so se na površino vezala naknadno, predstavlja velik problem tudi izluževanje snovi, ki jih dodajajo plastiki za doseganje želenih lastnosti (npr.

antioksidanti, stabilizatorji in plastifikatorji). Le-te so pomešane med polimerne komponente in se med procesom preperevanja pogosto sproščajo v okolje. Med snovmi, ki so jih pretekle študije zaznale pri izluževanju iz mikroplastike so bisfenol A, ftalati, kovine in bromirani zaviralci gorenja (BFR), za katere je bilo dokazano, da so kancerogeni in hormonski motilci. Koncentracija aditivov, ki se izločijo v okolje, je odvisna od zunanjih pogojev (prisotnost kisika, prisotnost UV svetlobe, temperatura in pH) ter lastnosti samega polimera in aditivov [2].

1.1.2.3 Mehanski vplivi

Mikroplastika, ki zaide v naravno okolje, predstavlja potencialno nevarnost za številne organizme, ki mikroplastiko zaužijejo. Stopnja nevarnosti je odvisna od tega, kako hitro organizem zaužije delec in kako hitro ga je sposoben iz telesa izločiti. V telesu organizma lahko pride do poškodb zaradi mehanskih vplivov delcev, pri čimer ima ključno vlogo velikost delca. V splošnem so majhni delci bolj problematični, saj jih organizmi lažje zaužijejo, izločijo pa jih težje. Poleg tega je od velikosti odvisno, kakšna bo porazdelitev mikroplastike v tkivu. Manjši delci so bili na primer najdeni v škrgah, črevesju in jetrih zebric (Danio rerio), medtem ko se večji delci v jetrih niso pojavljali [2].

1.2 Biofilm

V naravnem okolju se mikroorganizmi pojavljajo v prosto plavajoči planktonski obliki ali pa v obliki na površino pritrjenih kolonij. Kateri način pojavljanja v naravi bo za določeno vrsto organizmov prevladoval, je močno odvisno od organizma, njegove velikosti ter načina prehranjevanja [20,21,22]. Pritrjevanje in vgrajevanje celic mikroorganizmov v matrico v splošnem ustvarja ugodne življenjske pogoje. V takih združbahse namreč pojavlja kar 99 % vseh mikroorganizmov na Zemlji [21]. Pritrjene

(19)

združbe poleg bakterij sestavljajo tudi druge vrste organizmov kot so alge, glive in praživali. Imenujemo jih biofilm [20, 23].

Biofilm nastane s številnimi interakcijami med površino in celicami, kar vodi do tvorbe organizirane strukture [21,24]. Takoj ob vstopu v okolje se na površino mikroplastike vežejo anorganske in organske molekule, ki privlačijo mikroorganizme [19]. Pritrditev mikroorganizmov se začne z reverzibilnim delovanjem elektrostatičnih sil [21]. Sledi pritrjevanje z gibljivimi organeli, kot so flagele in fimbrije, čemur pravimo ireverzibilna pritrditev [20,21,25]. Celice se nato začnejo deliti in tvorijo mikrobne kolonije. Sočasno se odvija proces izločanja zunajceličnih polimernih snovi (angl. extracellular polymeric substances (EPS)) [20]. EPS je pretežno sestavljen iz polisaharidov, vsebuje pa tudi komponente proteinov, nukleinskih kislin, lipidov in huminskih substratov. EPS zapolni medcelični prostor, skrbi za komunikacijo med celicami, ščiti pred zunanjim stresom in dehidracijo ter tvori strukturo biofilma. Sestava EPS se razlikuje glede na tip mikroorganizma, starost združbe in zunanje dejavnike [22].

Stopnja kolonizacije je odvisna od prisotnosti stimulantov iz okolice in se zato kot posledica številnih faktorjev močno spreminja [21,22,25]. S stališča lastnosti materialov koloniziranih površin na pritrjevanje vpliva topografija površine, naboj, površinska energija, hidrofobnost in elektrostatske interakcije [9]. Bolj kot je površina groba, raje se bodo organizmi tam naseljevali. Vdolbinice in razpoke predstavljajo bolj varna območja, poleg tega pa povečujejo specifično površino. Znano je, da organizmom bolj ustrezajo hidrofobne in nepolarne površine, a se zahvaljujoč različnim komponentam EPS lahko naseljujejo tudi na hidrofilne površine. Pomembno vlogo imajo tudi zunajcelični organeli [21,22].

Rast biofilma spremlja vrsta kompleksnih procesov, ki so regulirani s povratnimi mehanizmi. Najbolj znan mehanizem regulacije je sistem zaznavanja celične gostote (angl. Quorum sensing), ki poleg medcelične komunikacije regulira tudi izražanje specifičnih genov [21,22]. Preko produkcije, izločanja in detekcije signalnih molekul poteka nabor informacij, ki vplivajo na gostoto celic v populaciji, na količino proizvedenega EPS in strukturo biofilma [22,25]. Poleg tega je rast močno odvisna tudi od zunanjih dejavnikov, med katere sodijo temperatura okolice, količina svetlobe ter prisotnost hranil. Debelina biofilma ni enolično določena. Združbalahko na površini tvori en sam sloj ali pa se pojavlja v obliki debele polimerne matrice z vgrajenimi celicami.

Slednjo najpogosteje najdemo v obliki stebra ali gobi podobni strukturi, v kateri so celice povezane z zapleteno mrežo kanalov [26].

(20)

6

Lastnosti biofilma so zelo specifične in pričajo o tem, da ne gre le za skupek planktonskih celic pritrjenih na površino. Celice v biofilmu so 500-krat bolj odporne na antibiotike in se fenotipsko razlikujejo od planktonskih sorodnic. Znotraj kompleksne mikrobiološke združbe se ustvari poseben mikroprostor s primitivnim homeostatskim in metabolnim sistemom, kar celicam omogoča številne prednosti [24]. Biofilm deluje kot zbiralnica naravnih snovi, kot so ogljik, nitrat in fosfat, ter tako omogoča vir hranil za rast in razvoj celic. Poleg tega celice ščiti pred številnimi zunanjimi dejavniki, ki bi bili zanje lahko usodni [26]. Deluje kot prepreka, ki upočasnjuje penetracijo številnih kemikalij, robustna polimerna struktura pa prenaša mehanske obremenitve in ščiti pred plenilci [25,26].

Znotraj biofilma se ustvarijo pogoji, kjer si celice lahko privoščijo mirovanje. Takrat se metabolni procesi upočasnijo, celice pa na ta način preživijo v sicer zanje smrtonosnih pogojih [25]. Prednost tvorbe biofilma je tudi sposobnost disperzije. Celice biofilma tako niso doživljenjsko vezane na določeno območje. Kot posledica različnih dejavnikov se lahko le-te odcepijo od kolonije in se razpršijo v okolje. Cikel, ki vključuje pritrjevanje, rast in disperzijo biofilma je prikazan na sliki 3. Del kolonije se lahko odcepi od matičnega biofilma in sicer pasivno (kot posledica zunanjih mehanskih dejavnikov) ali aktivno (kot posledica genetsko programiranega odziva) [25,26]. S pomočjo tokov vodnega okolja se celice prenesejo na še nenaseljena območja. Razvoj nove kolonije lahko povzroči že ena sama celica [26]. Če so pogoji dobri, se celice navadno naselijo blizu, v primeru pomanjkanja hrane pa potujejo na oddaljene lokacije [25].

(21)

(22)

8

spreminjati lastnosti mikroplastike, kar vpliva na njeno nadaljnje obnašanje v okolju [2,5,19].

Slika 4: Delec mikroplastike z razvitim biofimom [5].

1.3.1 Vpliv biofilma na porazdelitev mikroplastike v vodnem okolju

Zaradi pritrjevanja mikroorganizmov se masa delca povečuje. Sintetičnim polimerom, ki v splošnem veljajo za ploven material, se tako poveča gostota, kar sčasoma vodi do potopa delcev [5,9,21]. Manjši delci z razpokami in posledično večjo specifično površino nudijo več prostora za rast mikroorganizmov in zato hitreje dosežejo kritično gostoto, pri kateri potonejo [9]. Mikroplastika se zato ne zadržuje le na gladini, ampak se porazdeli po celotnem volumnu, kar na koncu vodi do posedanja na dno in vgraditve v sedimente [5,9].

Kot posledica tvorbe EPS se poveča medsebojno združevanje delcev v heteroagregate. Ti poleg mikrobioloških združb in sintetičnih polimernih delcev vsebujejo tudi druge delce, ki se nahajajo v bližini mikroplastike [9]. V laboratoriju so opazili, da se v roku enega meseca število delcev zaradi agregacije prepolovi, na račun tega pa se poveča velikost enega delca [5].

(23)

1.3.2 Vpliv biofilma na interakcije mikroplastike z organizmi

Delci, preraščeni z biofilmom, lahko zakrijejo sintetično notranjost, s čimer se močno poveča možnost, da jih vodneživali zamenjajo s hrano [5]. Poleg tega dajo organizmi pri zaužitju prednost delcem z višjimi hranilnimi vrednostmi, med katere se brez težav uvršča tudi mikroplastika z biofilmom [9]. Večja distribucija v okolju vodi do povečane biodostopnosti mikroplastike za različne organizme, torej lahko mikroplastiko z biofilmom zaužijejo tudi živali, ki se gibljejo v srednjem in spodnjem delu rek, jezer in morja [5]. Po drugi strani pa se s časom velikost mikroplastike zaradi tvorbe biofilma in agregacije povečuje, kar lahko določenim manjšim organizmom onemogoči, da bi delce zaužili [2].

Rezultati strupenostnih testov zaenkrat še niso pokazali negativnih učinkov mikroplastike z biofilmom na organizme. Testi so bili opravljeni z zebricami (Danio rerio) in vodnimi bolhami (Daphnia magna). Pri njih ni bilo mogoče prepoznati inhibicije ali celo smrti organizma [19]. Pri primerjavi vpliva surove mikroplastike in mikroplastike z biofilmom na vodno rastlino pa so opazili, da surova mikroplastika negativno vpliva na rast korenin, medtem ko mikroplastika z razvitim biofilmom korenin ne poškoduje. To je posledica tega, da prisotnost biofilma spremeni obliko ter zmanjša sposobnost abrazije delcev in deluje kot zaščitna plast, ki naredi površino delca bolj gladko [19].

1.3.3 Vpliv biofilma na adsorpcijo onesnaževal

Interakcija biofilma z okolico se kaže tudi preko adsorpcije drugih onesnaževal [5].

Biofilm preko spremembe fizikalnih lastnosti površine vpliva na sorpcijske lastnosti mikroplastike. Prisotnost mikroorganizmov na površini mikroplastike namreč poveča heterogenost delcev in zmanjša hidrofobnost površine. Poleg tega se afiniteta do onesnaževal spremeni že zaradi biofilma in proizvodnje EPS [2]. Vpliv biofilma na vezavo kovin so preučevali preko adsorbirane količine srebra v primeru surove in starane mikroplastike, na kateri se je v roku štirih tednov ustvaril biofilm. Zaznali so precejšnjo razliko v koncentraciji srebra, vezanega na površino obeh vzorcev. V primeru starane mikroplastike je bila ta precej višja, interakcije med bakterijskimi združbami in kovino pa so bile šibkejše, zato se je kasneje srebro v večji meri tudi desorbiralo s površine.

Podatke so pridobili preko merjenja količine srebrovih ionov izluženih v določen medij [5]. Interakcije med kovino in biofilmom so zaznali tudi v primeru kroma, svinca, kadmija in kobalta [2]. Biofilm ima torej pomembno vlogo pri sorpcijskih lastnostnostih mikroplastike, kar je potrebno upoštevati pri diskusiji o sorpcijski kapaciteti mikroplastike [5].

(24)

10

Plasti mikroorganizmov na površini vplivajo na transport snovi med vodnim medijem in mikroplastiko. V primeru hidrofobnih organskih onesnaževal biofilm spremeni sorpcijske lastnosti delca mikroplastike, saj se organska onesanževala v manjši meri adsorbirajo na sintetični delec, če je ta preraščen z biofilmom [9]. Poleg tega se lahko nekatera dobro odporna onesnaževala zadržijo na površini delca, saj biofilm deluje kot prepreka, ki upočasni transport onesnaževal med vodnim medijem in delcem plastike [2,9]. Difuzijski koeficient se lahko zmanjša za štiri velikostne rede. V tem času mikroplastiko z biofilmom in adsorbiranimi onesnaževali tokovi raznesejo na druga območja, kjer se čez čas izločijo v vodo. Onesnaževala lahko služijo tudi kot vir ogljika, s čemer se rast mikroorganizmov še poveča.

Ko večji organizmi zaužijejo mikroplastiko z biofilmom in akumuliranimi onesnaževali, se lahko onesnaževala izlužijo znotraj organizma. Prisotnost biofilma na mikroplastiki lahko vodi do povečanega vnosa mikroplastike v organizem, s tem pa do lažjega prenosa onesnaževal v njegovo telo [9].

1.3.4 Vpliv na kroženje nutrientov

Tvorba biofilma na mikroplastiki povečuje heterotrofno aktivnost, kar vodi do sprememb v kroženju snovi in vpliva na naravne procese. Pri testiranju vzorca vode z mikroplastiko z razvitim biofilmom in vzorca vode brez nje so bile zaznane spremembe v količini dušika in fosforja v vodi tekom daljšega časovnega intervala. Aerobni pogoji in prisotnost biofilma so omogočili pospešeno nitrifikacijo v sistemu. Količina dušika je naraščala, pri fosforju pa je bilo ravno obratno. Naraščanje količine dušika lahko po eni strani pripišemo sproščanjudušika iz biofilma, po drugi strani pa vezavi iz zraka. Za katerega od procesov gre, je odvisno od razvitosti biofilma in pogojev, v katerih se nahaja [23].

1.3.5 Mikroorganizmi na mikroplastiki

Plastisfera predstavlja posebno življenjsko okolje, kjer so se razvile združbe, drugačne od tistih, ki jih najdemo v naravni okolici. Le-te so navadno drugačne po sestavi in na splošno manj raznolike [9]. V naravi večino biomase predstavljajo alge, katerih sestava se razlikuje glede na vrsto površine, na kateri se oblikuje združba. Večina rodov alg se pojavlja le v naravnem okolju, nekatere so bile zaznane tako na mikroplastiki kot na naravnih delcih, druge pa močno prevladujejo samo na mikroplastiki [23]. Tako imenovana alfa raznolikost, ki se nanaša na raznolikost vrst na lokalni ravni, močno upade pri tvorbi biofilma na umetni površini v primerjavi z naravno. V primeru tvorbe biofilma na umetni površini je raznolikost vrst, enakomernost njihove porazdelitve in količinska zastopanost manjša. Prav tako se spremenijo metabolne poti [28]. Lastnosti združbe so

(25)

odvisne od prostorskih faktorjev, letnih časov in samega polimera [9,28]. Na površino delcev se lahko pritrdijo tudi patogeni mikroorganizmi, kar omogoča njihov transport po okolju [9,23,28]. Prisotnost številnih bakterij, gliv in alg pa ni vedno negativna. Na mikroplastiki so zaznali mikroorganizme, ki so sposobni razgraditi in presnoviti celo sintetične polimere. Tak primer so bakterije iz rodu Pseudomonas, ki odpirajo možnosti za učinkovito bioremediacijo mikroplastike [29].

1.3.6. Vpliv biofilma na razgradnjo mikroplastike

Površina plastike, podvržena preperevanju, je zaradi spremenjenih fizikalnih in kemijskih lastnosti bolj dovzetna za pritrjevanje mikroorganizmov. Po drugi strani pa biofilm vpliva na abiotske procese staranja. Plast mikroorganizmov zmanjšuje fotodegradacijo preko senčenja UV žarkov in povečuje gostoto, ki povzroča usedanje delcev. V tem primeru ima mikrobiološka aktivnost še večji pomen. Procesi, ki so povezani z biofilmom na mikroplastiki in potekajo tekom staranja so: akumulacija organizmov na površini, razgradnja plastifikatorjev, razkroj glavne polimerne verige, hidratacija in penetracija organizmov v strukturo polimera. Biorazgradnjo do manjših enot omogočajo eksoencimi, ki jih sproščajo mikroorganizmi znotraj biofilma. Te manjše enote (npr. dimeri in monomeri) lahko prodrejo skozi celično membrano mikroorganizmov in postanejo vir ogljika. V procesu mineralizacije v celici tako nastajajo CO2, H2O in/ali CH4 [9].

(26)

(27)

2 Namen dela

Številne raziskave so pokazale, da mikroplastika takoj po vstopu v okolje interagira z mikroorganizmi, ki na njeni površini tvorijo biofilm. Večina raziskav temelji na identifikaciji mikroorganizmov, v okviru moje diplomske naloge pa smo se osredotočili na možnosti kvantifikacije razvitega biofilma na površini mikroplastike. Zanimalo nas je, v kolikšni meri se mikroorganizmi pritrjujejo na sintetične delce in kako to vpliva na njihovo razporeditev v vodi. Ovrednotili smo količino nastalega klorofila, zunajceličnih polimernih snovi ter aktivnost ureaz, s katerimi smo potrdili, da so mikroorganizmi znotraj biofilma živi.Določili smo tudi razliko v gostoti surove in starane mikroplastike ter število delcev na maso mikroplastike.

(28)

(29)

3 Materiali in metode

V okviru praktičnega dela diplomske naloge smo se osredotočili na razvoj biofilma na mikroplastiki pri laboratorijskih pogojih. Za vzorec mikroplastike smo uporabili polietilenske delce ekstrahirane iz kozmetičnih produktov (MP) (Slika 5) [19]. Vzorec površinske vode smo zajeli iz potoka Glinščica na lokaciji pred fakulteto od novembra 2020 do januarja 2021.

Pripravili smo erlenmajerice s koncentracijo mikroplastike v površinski vodi 5 g/L, jih pokrili z bombažnim zamaškov in postavili na stresalnik pri hitrosti mešanja 125 rpm.

Nad erlenmajericami smo z lučjo regulirali ponavljajoče cikle 16 ur svetlobe (intenziteta svetlobe 1200-1300 lx) in 8 ur teme. Mikroorganizmi prisotni v vzorcu površinske vode so na delcih s časomzačeli tvoriti biofilm. Vsak teden smo mikroplastiko odfiltrirali in ji dodali vedno znova zajeto svežo vodo, s čimer smo vnesli nove mikroorganizme, ki so nadaljevali z gradnjo biofilma.

Po 12 tednih smo vsebino erlenmajeric prefiltrirali skozi filtrirni papir črni trak (Slika 6) ter jo rahlo osušili s papirnato brisačko. Mikroplastiko z biofilmom (MPB) smo uporabili za analize določanja količine biomase na delcih, klorofila, EPS in aktivnosti ureaz ter gostote in števila delcev na maso.

Slika 5: Delci surove mikroplastike. Slika 6: Filtracija delcev mikroplastike z razvitim biofilmom skozi filtrirni papir črni trak.

(30)

16

3.1 Določanje količine biomase na delcih z razklopom

Količino biomase, ki se je v 12 tednih razvila na mikroplastiki, smo določili z uporabo Fentonove oksidacije, ki nima vpliva na polietilensko mikroplastiko, hkrati pa razgradi nastali biofilm na njeni površini [30]. Vzorec pred razklopom predstavlja skupno maso biofilma in mikroplastike, po razklopu pa zgolj maso mikroplastike. Za razklop smo pripravili tudi slepi vzorec s surovo mikroplastiko (MP), ki je potrdil, da Fentonova oksidacija ne vpliva na maso MP.

Za eksperiment smo v stekleno epruveto zatehtali približno 50 mg MPB (točno maso smo si zapisali) ter ji dodali 2 mL predhodno pripravljene raztopine Fe²⁺ ionov s koncentracijo 15 mg/mL (pripravili smo jo iz 0,75 g trdnega FeSO4·7H²O, ki smo ga raztopili v 50 mL bučki z deionizirano vodo ter mu naknadno dodali še 0,3 mL koncentrirane H2SO4). Po dodatku Fe²⁺ ionov smo vzorcu po kapljicah dodali še 2 mL 30 % H2O2. Počakali smo, da reakcija poteče in po 1 uri vsebino epruvete prefiltrirali skozi polikarbonatni filtrirni papir z velikostjo por 0,45 μm, ki smo ga nato še dodatno uro sušili na zraku. Razlika med maso vzorca pred in po razklopu nam je omogočila določitev količine biofilma (enačba /1/), delež bioflma pa smo izračunali po enačbi /2/ [31].

𝑚(𝐵) = 𝑚(𝑀𝑃𝐵) − 𝑚(𝑀𝑃) /1/

%(𝐵) =_{𝑚(𝑀𝑃𝐵)}^𝑚(𝐵) × 100% /2/

m(B) masa biofilma (g)

m(MPB) masa mikroplastike z biofilmom (g) m(MP) masa mikroplastike (g)

%(B) delež biofilma glede na maso celotnega vzorca MPB (%)

3.2 Določanje količine klorofila a in b

Biofilm gradijo celice alg, ki so avtotrofi, torej organizmi, ki so se sposobni sami oskrbovati s hrano. V procesu fotosinteze vodo in ogljikov dioksid s sončno energijo pretvarjajo v sladkorje, ki predstavljajo hrano za rast in razvoj organizma. Kot stranski produkt nastaja kisik, ki se sprošča nazaj v okolico. Celoten proces fotosinteze poteka v kloroplastih, majhnih organelih v celici. Za črpanje energije iz okolice je zaslužen pigment imenovan klorofil. V naravi poznamo celo paleto pigmentnih molekul, ki imajo sposobnost absorpcije svetlobe specifične valovne dolžine. Klorofil je med njimi edinstven, saj omogoča absorpcijo energije, ki jo avtotrofne celice uporabijo za gradnjo tkiv. [32] Pri določanju fotosintetske pigmente delimo na glavni pigment klorofil a in pomožni pigment klorofil b [33].

(31)

V terilnico smo zatehtali 50 mg MPB ter dodali 0,7 mL hladnega 96 % etanola. Zaradi občutljivosti fotosintetskega pigmenta na svetlobo smo delce trli v temnem prostoru. S trenjem MPB v etanolu smo iz biofilma ekstrahirali fotosintetski pigment. Vse skupaj smo prelili v epico ter terilni pribor sprali z 1,4 mL etanola. Epico smo za 24 ur postavili v zamrzovalnik, kjer smo poskrbeli za pogoje s čim manj svetlobe. Za primerjavo smo pripravili tudi kontrolo (MP brez biofilma).

Po enodnevni inkubaciji v temi smo izmerili absorbance pri valovnih dolžinah 664,2 nm in 648,6 nm. Za slepi vzorec smo uporabili raztopino etanola brez vzorca. Po enačbah /3/

in /4/ smo iz izmerjenih absorbanc izračunali koncentracijo klorofila a in b. Maso biofilma smo izračunali preko deleža biofilma v odvisnosti od celotne mase vzorca (enačba /5/). Specifično koncentracijo klorofilov, ki nam predstavlja razmerje med količino klorofila in biofilmapa smo izračunali z enačbama /6/ in /7/ [34,35].

𝑐(𝑎) = 13,36 × 𝐴^664,2− 5,19 × 𝐴^648,6 /3/

𝑐(𝑏) = 27,43 × 𝐴^648,6− 8,12 × 𝐴^664,2 /4/

𝑚(𝐵) = 𝑚(𝑀𝑃𝐵) ×_{100 %}^%(𝐵) /5/

𝑐(𝑠𝑝𝑒𝑐. 𝑎) = 𝑐(𝑎) ×^{𝑉(𝑒𝑡.)}_𝑚(𝐵) /6/

𝑐(𝑠𝑝𝑒𝑐. 𝑏) = 𝑐(𝑏) ×^{𝑉(𝑒𝑡.)}_m(B) /7/

c(a) koncentracija klorofila a (mg/L)

A664,2 absorbanca pri valovni dolžini 664,2 nm (/) A648,6 absorbanca pri valovni dolžini 648,6 nm (/) c(b) koncentracija klorofila b (mg/L)

m(B) masa biofilma (g)

m(MPB) masa mikroplastike z biofilmom (g)

%(B) delež biofilma (%)

c(spec.a) specifična koncentracija klorofila a (mg/gbiofilma) V(et.) volumen etanola (L)

c(spec.b) specifična koncentracija klorofila b (mg/gbiofilma)

(32)

18

3.3 Določanje količine zunajceličnih polimernih snovi

Celice med tvorbo mikrobiotske kolonije izločajo metabolične produkte, ki se akumulirajo na površini celic [20,36]. Te zunajcelične polimerne snovi (EPS) igrajo vlogo zaščite pred nevarnostmi v okolici ter služijo kot zaloga hranil in energije v obdobju pomanjkanja le-teh [36].

Komponente EPS lahko ekstrahiramo fizikalno ali kemijsko. Fizikalno ekstrakcijo izvedemo s centrifugiranjem, ultrazvokom ali segrevanjem, medtem ko je v primeru kemijske prisotna uporaba različnih kemikalij kot so etanol, formaldehid, različne baze, EDTA ali smole za ionsko izmenjavo. Izbira metode ekstrakcije odločilno vpliva na način kasnejše kvantifikacije [36,37].

Prvi korak pri določanju EPS je bila priprava umeritvene krivulje. Enačba premice, ki jo izrišemo med danimi točkami, kaže odvisnost med izmerjeno absorbanco in koncentracijo določenega sladkorja. V ta namen smo izbrali glukozo. V petih epruvetah smo z redčenjem pripravili raztopine različnih koncentracij glukoze: 80 mg/L, 40 mg/L, 20 mg/L, 10 mg/L in 5 mg/L. 1 mL posamezne raztopine smo dodali 0,5 mL 6 % fenola in 2,5 mL koncentrirane H²SO⁴. Kislino smo dodajali previdno po kapljicah in nato vse skupaj dobro premešali. Po približno uri ohlajanja smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini 490 nm [38,39].

Za ekstrakcijo EPS iz biofilma smo v epruveto zatehtali 50 mg MPB in jo razredčili s 3 mL deionizirane vode. Za kontrolo smo namesto MPB uporabili MP. Ekstrakcijo smo dosegli fizikalno s povišanjem temperature na 80 °C za 30 minut. Po segrevanju smo vzorec prefiltrirali in tako odstranili preostalo plastiko. 1 mL filtrata smo na enak način kot pri pripravi umeritvene krivulje dodali 0,5 mL 6 % fenola in 2,5 mL koncentrirane H2SO4, počakali, da se mešanica ohladi, ter izmerili absorbanco pri 490 nm. Količino EPS smo izračunali preko umeritvene krivulje po enačbi /8/, količino biofilmapa po enačbi /9/ iz mase biofilma (enačba /5/). Razmerje med količino EPS in količino biofilma nam poda specifično koncentracijo EPS (enačba /10/) [38,39].

(33)

𝑐(𝐸𝑃𝑆) = _0,0147^𝐴⁴⁹⁰ /8/

𝑐(𝐵) = _{𝑉(𝑣𝑧.)}^𝑚(𝐵) /9/

𝑐(𝑠𝑝. 𝐸𝑃𝑆) = ^{𝑐(𝐸𝑃𝑆)}_𝑐(𝐵) /10/

c(EPS) koncentracija EPS (mg/L)

A490 absorbanca pri valovni dolžini 490 nm (/) c(B) koncentracija biofilma (mg/L)

m(B) masa biofilma (g) V(vz.) volumen vzorca (L)

c(sp.EPS) specifična koncentracija EPS (mg/gbiofilma)

3.4 Določanje aktivnosti encimov ureaz

Ureaze so metaloencimi z nikljem. Vsebujejo veliko število podenot in imajo visoko molekulsko maso, najdemo pa jih v bakterijah, rastlinah, algah, glivah in prsti. Ne glede na izvor, ki vpliva na njihov strukturo, je vsem ureazam skupna kataliza hidrolitske reakcije sečnine [40].

Aktivnost ureaz določimo posredno, ko spektrofotometrično določimo količino nastalega amonijaka. Z dodatkom ustreznih reagentov, ki jih uporabljamo pri določanju amonijevega dušika, se v alkalnem mediju amonijak pretvori v spojino rumeno-zelene barve [41].

Eksperiment smo začeli s pripravo umeritvene krivulje iz standarda NH4+ z začetno koncentracijo 10 mg/L. Z redčenjem z Milli-Q vodo smo pripravili raztopine koncentracij: 5,0 mg/L, 2,5 mg/L, 1,25 mg/L, 0,625 mg/L in 0,3125 mg/L. Slepi vzorec je vseboval le Milli-Q vodo. 2 mL posamezne raztopine smo dodali po 300 µL reagenta A in 300 µL reagenta B ter vzorce inkubirali pri sobni temperaturi. Po eni uri inkubacije smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini 655 nm. Reagent A smo pripravili iz 130 g natrijevega salicitata (C7H5O3Na) in 130 g natrijevega citrata dihidrata (C6H5O7Na3·2 H2O), ki smo ju raztopili v 950 mL deionizirane vode. Po dodatku 0,970 g natrijevega pentacianoferata (III) dihidrata (Fe(CN)5NONa·2 H2O) smo raztopino z deionizirano vodo dopolnili do 1000 mL. Reagent B smo pripravili z raztapljanjem 32 g NaOH v 500 mL deionizirane vode. Ko se je raztopina ohladila, smo dodali še 2 g dikloroizocianurata dihidrata (C3Cl2N3NaO3·2 H2O) in z deionizirano vodo dopolnili do 1000 mL [41].

(34)

20

Pri pripravi vzorca smo v štiri epruvete zatehtali po 50 mg MPB. Trem paralelkam, smo dodali 100 µL vodne raztopine sečnine s koncentracijo 2 g/L, četrtipa smo dodali 100 µL Milli-Q vode. Slednja nam je služila za referenco. Za primerjavo smo pripravili tudi kontrolo z MP. Vzorce smo nato 2 uri inkubirali pri 37 °C. Po inkubaciji smo 100 µL 0,08 M vodne raztopine sečnine dodali še kontroli ter hidrolizo v vseh epruvetah nemudoma zaustavili z dodatkom 2 mL KCl/HCl raztopine (1 M KCl in 0,01 M HCl). Po 30 minutah mešanja s hitrostjo 160 rpm smo vzorce prefiltrirali skozi filtrirni papir z velikostjo por 0,45 μm in tako odstranili MP. 0,5 mL filtrata smo z Milli-Q vodo razredčili na 2 mL ter mu dodali po 300 µLreagenta A in 300 µLl reagenta B. Sledila je enourna inkubacija pri sobni temperaturi ter merjenje absorbance pri 655 nm. Slepi vzorec je vseboval 2 mL Milli-Q vode, 300 µL reagenta A in 300 µL reagenta B, ki smo ga uporabili za umeritev spektrofotometra [41].

Koncentracijo hidroliziranega dušika smo izračunali z uporabo umeritvene krivulje (enačba /11/). Iz mase biofilma, ki smo jo izračunali z enačbo /5/, smo po enačbi /12/

izračunali koncentracijo biofilma. Količino hidroliziranega dušika v biofilmu smo z upoštevanjem redčitev izračunali po enačbi /13/. Pri merjenju absorbance smo prisotnost dušika zaznali tudi v kontrolnem vzorcu MPB brez dodatka sečnine, zato smo od dobljene koncentracije hidroliziranega dušika za posamezno paralelko odšteli koncentracijo hidroliziranega dušika v kontrolnem vzorcu (enačba /14/) [41].

𝑐(𝑁) = _0,6183^𝐴⁶⁵⁵ /11/

𝑐(𝐵) = _{𝑉(𝑣𝑧.)}^𝑚(𝐵) /12/

𝑐(𝑁/𝐵) = _𝑐(𝐵)×^𝑐(𝑁)0,5 2

/13/

𝑐(𝑁/𝐵 ∗) = 𝑐(𝑁/𝐵) − 𝑐(𝑘𝑜𝑛𝑡. ) /14/

c(N) koncentracija hidroliziranega dušika iz umeritvene krivulje (mg/L) A655 absorbanca pri valovni dolžini 655 nm (/)

c(B) koncentracija biofilma (g/L) m(B) masa biofilma (g)

V(vz.) volumen vzorca (L)

c(N/B) koncentracija hidroliziranega dušika v biofilmu (mghidrol.N/gbiofilma)

c(N/B*) dejanska koncentracija hidroliziranega dušika v biofilmu (mghidrol.N/gbiofilma)

c(kont.) koncentracija hidroliziranega dušika v kontrolnem vzorcu (mghidrol.N/gbiofilma)

(35)

3.5 Določanje g ostote

Polietilen spada med najbolj splošno razširjene polimerne materiale in ga v obliki raznovrstnih embalaž srečujemo na vsakem koraku. Množica monomernih enot etilena se lahko na različne načine povezuje v večje molekule, kar vpliva tudi na gostoto samega materiala. Gostota polietilena se giblje med 0,857 g/cm³in 0,975 g/cm³ [42]

Za vrednotenje sprememb v gostoti zaradi nastalega biofilma smo določili gostoto MP in MPB s piknometrom po standardni ISO metodi ISO 1183-1:2019 [43]. Najprej smo določili gostoto etanola, ki smo ga uporabljali pri določanju gostote mikroplastike, nato pa še gostoti vzorcev MP in MPB. Za določitev gostote mikroplastike smo morali izbrati tekočino z nižjo gostoto od gostote polietilenskih delcev. Voda za to ni bila primerna, saj zaradi višje gostote mikroplastika plava na njeni gladini.

3.5.1 Določanje gostote etanola glede na vodo

Etanol smo uporabljali kot tekočino za kasnejšo določitev gostote MP in MPB. Ker je bilo na embalaži navedeno le območje gostot, smo glede na vodo določili točno vrednost.

V ta namen smo najprej zatehtali maso praznega piknometra in ga napolnili etanolom, ga stehtali ter nato postopek ponovili še z vodo. Po enačbi /15/ smo izračunali maso etanola in vode v piknometru. Relativna gostota etanola proti vodi predstavlja razmerje njunih gostot. Ker sta bila volumna kapljevin v piknometru enaka, lahko predpostavimo, da je razmerje gostot enako razmerju mas. Po enačbi /16/ smo tako izračunali gostoto etanola [43].

𝑚(𝑘) = 𝑚(𝑝 + 𝑘) − 𝑚(𝑝) /15/

𝜌(𝑟𝑒𝑙. 𝑒𝑡. ) = ^{𝜌(𝑒𝑡.)}_𝜌(𝑣.) = ^{𝑚(𝑒𝑡.)}_𝑚(𝑣.) /16/

m(k) masa kapljevine (g)

m(p+k) masa piknometra in kapljevine (g) m(p) masa piknometra (g)

𝜌(rel.et.) relativna gostota etanola (/) 𝜌(et.) gostota etanola (g/mL) 𝜌(v.) gostota vode (g/mL) m(et.) masa etanola (g) m(v.) masa vode (g)

(36)

22

3.5.2 Določanje gostote vzorca

Pri določitvi gostote MP in MPB smo prav tako najprej stehtali prazen piknometer. V piknometer smo stresli vzorec mikroplastike, odčitali maso, ga do vrha napolnili z etanolom in ga stehtali. Piknometer smo nato očistili, ga napolnili z etanolom ter ponovno odčitali maso. Maso vzorca smo dobili z računanjem razlike med maso piknometra z vzorcem in maso praznega piknometra (enačba /17/), maso etanola z volumnom enakim volumnu vzorca pa smo izračunali po enačbi /18/. Iz enačbe /19/, s katero primerjamo lastnosti etanola in mikroplastike enakih volumnov, smo izrazili gostoto vzorca MP in MPB [43].

𝑚(𝑣𝑧. ) = 𝑚(𝑝 + 𝑣𝑧. ) − 𝑚 (𝑝) /17/

𝑚(𝑒𝑡. ) = 𝑚(𝑝 + 𝑒𝑡. ) + 𝑚(𝑣𝑧. ) − 𝑚(𝑝 + 𝑣𝑧. +𝑒𝑡. ) /18/

𝜌(𝑟𝑒𝑙. 𝑣𝑧. ) =^{𝜌(𝑣𝑧.)}_{𝜌(𝑒𝑡.)}= ^{𝑚(𝑣𝑧.)}_{𝑚(𝑒𝑡.)} /19/

m(vz.) masa vzorca (g)

m(p+vz.) masa piknometra z vzorcem (g) m(p) masa praznega piknometra (g) m(et.) masa etanola (g)

m(p+et.) masa piknometra z etanolom (g)

m(p+vz.+et.) masa piknometra z vzorcem in etanolom (g) 𝜌(rel.vz.) relativna gostota vzorca glede na etanol (/) 𝜌(vz.) gostota vzorca (g/mL)

𝜌(et.) gostota etanola (g/mL)

3.6 Mikroskopiranje in štetje delcev

Za ugotavljanje števila delcev na maso mikroplastike smo vnaprej stehtano količino MP in MPB razporedili na milimetrski papir. Opazovano površino smo razdelili na 25 manjših polj, delce pa šteli ločeno v vsakem polju posebej. Vzorce smo opazovali pod Motic Stereo-zoom-mikroskopom SMZ-171_TLED. Na podlagi določene mase in števila delcev smo za lažjo primerjavo izračunali število delcev na mg vzorca.

(37)

4 Rezultati in razprava

Mikroplastiko smo starali v vodi iz potoka pod laboratorijskimi pogoji 12 tednov in analizirali lastnosti nastalega biofilma (količina klorofila, EPS in aktivnost ureaz) ter vpliv staranja na lastnosti mikroplastike. Pri določanju količine biomase na mikroplastiki, določanju klorofilov, zunajceličnih polimernih snovi in aktivnosti ureaz smo pripravili tudi kontrolo s surovo mikroplastiko, s čimer smo potrdil, da sama mikroplastika ne vpliva na določevanje teh parametrov.

4.1 Količina biomase na mikroplastiki

Po enačbi /2/ smo izračunali delež biofilma, ki je predstavljen v tabeli 1.

Tabela 1: Meritve in izračuni za določanje količine biofilma na mikroplastiki.

Vzorec m(MPB) [g] m(MP) [g] m(B) [g] %(B) [%]

vzorec 1 0,0545 0,0369 0,0176 32,3

vzorec 2 0,0665 0,0438 0,0227 34,1

vzorec 3 0,0547 0,0375 0,0172 31,4

V vzorcu mikroplastike z biofilmom, ki se je s tedensko menjavo vode in vnosom novih mikroorganizmov razvijal 12 tednov, so celice biofilma predstavljale tretjino celotne mase vzorca (tabela 1). Podatek o povprečni vrednosti razmerja med maso biofilma in celotno maso vzorca (32,6 ± 1,4 %) nam je pri nadaljnjih analizah omogočil ovrednotenje mase biofilma.

4.2 K oličina klorofila a in b

Iz biofilma smo uspešno ekstrahirali fotosintetski pigment klorofil, ki je pokazatelj prisotnosti alg in cianobakterij v mikrobiotski združbi. Alge v procesu fotosinteze porabljajo CO2 in tako zvišujejo pH v biofilmu, nastali O2 pa je pomemben za rast in

razvoj drugih mikroorganizmov biofilma [23]. Specifična koncentracija klorofila a je bila 0,660 ± 0,050 mg/g biofilma (graf 1), medtem ko je koncentracija klorofila a pridobljena v

literaturi, kjer so merili prisotnost klorofila v biomasi na umetnih površinah, 23 mg/g suhe biomase [44]. Velika razlika med vrednostma je posledica razlike med maso sveže in suhe biomase. Seveda je potrebno upoštevati tudi, da na količino klorofila močno vplivajo zunanji pogoji, kot so na primer intenziteta svetlobe, prisotnost hranil in medij, v katerem se biofilm razvija [45]. Specifična koncentracija klorofila b je bila še nižja in je znašala 0,241 ± 0,026 mg/g biofilma (graf 1).

(38)

24

Graf 1: Specifična koncentracija klorofila a in b.

4.3 Količina zunajceličnih polimernih snovi

Za določanje količine EPS smo iz glukoze pripravili umeritveno krivuljo (graf 2).

Graf 2: Umeritvena krivulja glede na glukozo.

S fizikalno ekstrakcijo smo uspešno ločili EPS od MPB in izmerili koncentracijo EPS v treh paralelkah (tabela 2). V povprečju je v biofilmu prisotnih 0,467 ± 0,076 mg/g EPS.

Celice v biofilmih z višjo koncentracijo EPS so bolj nagnjene k medsebojni koheziji, količina EPS pa vpliva tudi na vrsto mikroorganizmov ter način, na katerega začnejo z

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

klorofil a klorofil b

c(spec.) [mg/g]

y = 0,0149x R² = 0,9974

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

A(490)[/]

c(EPS) [mg/L]

klorofil a klorofil b

(39)

naseljevanjem površine. Sloj EPS se namreč tvori že v prvih minutah po vstopu v okolje.

Celice v okolici površine najprej izločijo EPS, medtem ko se same začnejo pritrjevati šele čez nekaj dni [46].

Tabela 2: Koncentracije EPS in biofilma v posameznem vzorcu.

Vzorec A490 [/] c(EPS) [mg/l] c(B) [g/l] c(spec.EPS) [mg/g]

vzorec 1 0,0435 2,919 5,513 0,530

vzorec 2 0,0298 2,000 5,242 0,382

vzorec 3 0,0433 2,906 5,949 0,489

4.4 Aktivnost encimov ureaz

Za določanje aktivnosti ureaz smo najprej pripravili umeritveno krivuljo s standardno raztopino NH4+ ionov (graf 3), preko katere smo lahko za biofilm določili aktivnost ureaz z določanjem hidroliziranega dušika.

Graf 3: Umeritvena krivulja glede na standard NH4+.

Z določanjem aktivnosti ureaz smo dokazali, da je biofilm skupek živih mikroorganizmov. Vsebuje namreč naravno prisotne encime ureaze, ki v procesu hidrolitske reakcije sečnine katalizirajo razgradnjo amonijevega dušika. Koncentracija hidroliziranega dušika, preko katerega se odraža aktivnost ureaz, je v povprečju znašala 1,98 ± 0,20 mg/g (tabela 3).

y = 0,6183x R² = 0,9964

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

0 1 2 3 4 5 6

A (655) [/]

c(NH4+) [mg/L]c(NH₄⁺) [mg/L]

(40)

26

Tabela 3: Koncentracija hidroliziranega dušika in biofilma za posamezen vzorec.

Vzorec A(655) [/] c(N) [mg/L] c(B) [g/L] c(N/B) [mg/g]

c(N/B*) [mg/g]

vzorec 1 2,9261 4,7325 7,4725 2,5333 2,155

vzorec 2 2,8325 4,5811 8,5600 2,1407 1,762

vzorec 3 3,1328 5,0668 8,4202 2,4070 2,029

kontrola 0,4519 0,7309 7,7261 0,3784 ø

4.5 Gostota mikroplastike

S standardno metodo ISO smo s primerjavo z vodo izmerili gostoto etanola, ki je znašala 0,808 g/mL. Po pričakovanju se je gostota delcev v 12-tedenskem obdobju rasti mikrobiotske združbe na površini mikroplastike povečala. Surovi mikroplastiki smo izmerili gostoto 0,88 g/mL (tabela 4), kar ustreza gostoti polietilena iz literature [42].

Tabela 4: Gostota surove mikroplastike ter mikoplastike z biofilmom.

𝜌[g/mL]

MP 0,88

MPB 0,95

Z nalaganjem biofilma se je v 12 tednih gostota povečala na 0,95 g/mL (tabela 4), kar pa ni bilo dovolj, da bi delci potonili. Masa delcev se torej ne povečuje tako hitro, da bi njihova gostota že kmalu po vstopu v naravno okolje presegla 1 g/mL [17]. Kot kaže se delci še precej dolgo zadržujejo na gladini in so zato bolj izpostavljeni UV žarkom, kar ugodno vpliva na rast biofilma. Poleg tega imajo na plavajoče delce večji vpliv tudi rečni in morski tokovi, ki lahko mikroplastiko v času, ko se ta zadržuje na gladini, raznesejo daleč naokoli.

4.6 Število delcev na maso

Rezultat štetja delcev smo podali v obliki števila delcev na gram mikroplastike. Število delcev z razvitim biofilmom je za 0,73-krat manjše od števila delcev surove mikroplastike (tabela 5).

Tabela 5: Število delcev na mg mikroplastike.

Št.del/mg

MP 68

MPB 50

(41)

V primeru MPB je del mase predstavljal biofilm, poleg tega pa je biofilm med seboj povezal več zrn mikroplastike. Kot posledica agregacije se zmanjšalo število delcev v vzorcu. Biofilm, ki se je razvil na površini mikroplastike, je lepo viden že pod stereo mikropskopom (slika 7), saj ga večinoma gradijo celice alg, ki so velike in zeleno obarvane. Za opazovanje bakterijskih celic, bi morali MPB opazovati z elektronskim mikroskopom.

Slika 7: Delec mikroplastike z razvitim biofilmom viden z Motic Stereo-zoom- mikroskopom SMZ-171_TLED.

(42)

(43)

5 Sklepne ugotovitve

V okviru diplomske naloge smo pri laboratorijskih pogojih 12 tednov starali mikroplastiko. V tem obdobju se je na njeni površini tvoril biofilm, ki je predstavljal tretjino celotne mase vzorca.

V biofilmu smo določili prisotnost fotosintetskega pigmenta klorofila a in b, s čimer smo dokazali prisotnost avtotrofnih organizmov v njem. V našem primeru so to bile alge, ki so bile zaradi velikosti in zelene barve dobro vidne pod stereo mikroskopom.

Prav tako govori o živosti biofilma dejstvo, da smo iz biofilma uspešno ekstrahirali EPS. EPS deluje kot matrica, v katero so vgrajene celice mikroorganizmov, ter kot zaloga hranil, poleg tega pa ščiti mikroorganizme pred škodljivimi vplivi iz okolja. Količina EPS vpliva na stopnjo kohezije med celicami, ter na vrsto mikroorganizmov in njihovega načina pritrjevanja. Sposobnost živih organizmov za tvorbo mikrobiotske združbe na mikroplastiki smo dokazali tudi z določanjem koncentracije hidroliziranega dušika.

Prisotnost dušika je posledica aktivnosti naravno prisotnih encimov ureaz, ki katalizirajo hidrolitsko reakcijo sečnine do amonijaka.

S pritrjevanjem mikroorganizmov na površino mikroplastike pa se spremenijo tudi lastnosti mikroplastike. S povečanjem mase biofilma na delcih se je povečala njihova gostota, a ne dovolj, da bi ta presegla gostoto vode in bi se delci posedli. Plavajoči delci predstavljajo večjo nevarnost, saj so bolj izpostavljeni UV žarkom ter so bolj dovzetni za transport z rečnimi in morskimi tokovi. Rast biofilma na površini vpliva tudi na število delcev na gram mikroplastike. Delno lahko to pripišemo večji gostoti mikroplastike z biofilmom v primerjavi s surovo mikroplastiko, delno pa sposobnosti biofilma, da poveže in spoji več zrn mikroplastike v enoten delec.

(44)

(45)

6 Literatura

[1] History and Future of Plastics. Science History Institute.

https://www.sciencehistory.org/the-history-and-future-of-plastics (pridobljeno 5. apr.

2020).

[2] P. Liu, X. Zhan, X. Wu, J. Li, H. Wang, S. Gao: Effect of weathering on environmental behavior of microplastics: Properties, sorption and potential risks.

Chemosphere, 2020, 242, 1-12.

[3] Plastic Pollution. Our World in Data. https://ourworldindata.org/plastic-pollution (pridobljeno 5. apr. 2020).

[4] Microplastics. Britannica. https://www.britannica.com/technology/microplastic (pridobljeno 5. apr. 2020).

[5] G. Kalčikova, T. Skalar, G. Marolt, A. Jemec Kokalj: An environmental concentration of aged microplastics with adsorbed silver significantly affects aquatic organisms. Water Research, 2019, 175, 1-9.

[6] N. B. Hartmann, T. Hüffer, R. C. Thompson, M. Hassellöv, A. Verschoor, A. E.

Daugaard, S. Rist, T. Karlsson, N. Brennholt, M. Cole, M. P. Herrling, M. C. Hess, N. P.

Ivleva, A. L. Lusher, M. Wagner: Response to the letter to the editor on Are we speaking the same language? Recommendations for a definition and categorization framework for plastic debris. Environmental Science & Technology. 2019, 53, 1039-1047.

[7] S. Rezania, J. Park, M. F. Md Din, S. M. Taib, A. Talaiekhozani, K. Kumar Yadav, H. Kamyab: Microplastics pollution in different aquatic environments and biota: A review of recent studies. Marine Pollution Bulletin. 2018, 133, 191-208.

[8] World Health Organisation Report Says Water is Full of Microplastics. Triplej.

https://www.abc.net.au/triplej/programs/hack/world-health-organisation-report-says- water-full-microplastics/11436168 (pridobljeno 16. apr. 2020).

[9] C. D. Rummel, A. Jahnke, E. Gorokhova, D. Kühnel, M. Schmitt-Jansen: Impact of Biofilm Formation on the Fate and Potential Effects of Microplastic in the Aquatic Environment. Environ. Sci. Technol. Lett., 2017, 4, 258-267.

(46)

32

[10] Slika viri mikroplastike https://royalsociety.org/topics- policy/projects/microplastics-in-freshwater-and-soils/ (pridobljeno 8. apr. 2021)

[11] Slika viri mikroplastike – mikrovlakna https://www.patagonia.com/stories/teaming- up-to-get-to-the-bottom-of-microfiber-pollution/story-71999.html (pridobljeno 8. apr.

2021)

[12] Slika viri mikroplastike – kozmetika https://www.newscientist.com/article/2092135- uk-closer-to-banning-cosmetic-microbeads-that-clog-up-its-seas/ (pridobljeno 8. apr.

2021)

[13] Slika viri mikroplastike – oblačila

https://www.expertreviews.co.uk/clothing/1409909/30-of-the-best-online-clothes- shops-our-pick-of-the-most-fashionable-stores-to-suit (pridobljeno 8. apr. 2021)

[14] Slika viri mikroplastike – embalaža https://www.afrik21.africa/en/mali-invitation- for-projects-on-plastic-bottle-recycling-launched/ (pridobljeno 8. apr. 2021)

[15] Slika viri mikroplastike – peleti https://www.123rf.com/photo_68678567_colorful- industrial-plastic-pellets.html (pridobljeno 8. apr. 2021)

[16] Slika viri mikroplastike – pnevmatike

https://www.moneycontrol.com/news/business/economy/govt-considering-import- restrictions-on-tyres-5103211.html (pridobljeno 8. apr. 2021)

[17] Slika mikroplastika na petrijevki https://journals.openedition.org/factsreports/5290 (pridobljeno 4. apr. 2020)

[18] Plastic pollution. Coastal Care. https://plastic-pollution.org/ (pridobljeno 8. apr.

2020).

[19] A. Jemec Kokalj, D. Kuehnel, B. Puntar, A. Žgajnar Gotvajn, G. Kalčikova: An exploratory ecotoxicity study of primary microplastics versus aged in natural waters and wastewaters. Environmental Pollution, 2019, 254, 1-8.

[20] H. Yasuda: Bacterial Biofilms and Infectious Diseases. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 1996, 8, 409-417.

[21] M. R. Parsek, T. Tolker-Nielsen: Pattern formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Current Opinion in Microbiology. 2008, 11, 560-566.

(47)

[22] B. Vu, M. Chen, R. J. Crawford, E.P. Ivanova: Bacterial Extracellular Polysaccharides Involved in Biofilm Formation. Molecules, 2009, 14, 2535-2554.

[23] X. Chen, X. Chen, Y. Zao, X. Xiong, C. Wu: Effects of microplastic biofilm on nutrient cycling in simulated freshwater systems. Science of the Total Environment, 2020, 719, 1-7.

[24] J.W. Costerton, Z. Lewandowski, D. E. Caldwell, D. R. Korber, H. Lappin-Scott:

Microbial biofilms. Annu. Rev. Microbiol. 1995, 49, 711-745.

[25] T. K. Wood, S. H. Hong, Q. Ma: Engineering biofilm formation and dispersal.

Trends Biotehnol. 2011, 29, 87-94.

[26] M. E. Shirtliff, J. T. Mader, A. K. Camper: Molecular Interactions in Biofilms.

Chemistry & Biology. 2020, 9, 859-871.

[27] Slika cikel biofilma https://journals.openedition.org/factsreports/5290 (pridobljeno 12. apr. 2020)

[28] L. Miao, P. Wang, J. Hou, Y. Yaou, Z. Liu, S. Liu, T. Li: Distinct community structure and microbial functions of biofilms colonizing microplastics. Science of the Total Environment, 2021, 650, 2395-2402.

[29]R. A. Wilkes, L. Aristilde: Degradation and metabolism of synthetic plastics and associated products by Pseudomonas sp.: capabilities and challenges. Journal of Applied Microbiology. 2017, 123, 582-593.

[30] H. Prosen , I. Kralj Cigić: Navodila za vaje pri predmetu kemijska analiza živil.

Ljubljana: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 2006, str. 16-17.

[31] J. C. Prata, J. P. da Costa, A.V. Girão, I. Lopes, A. C. Duarte, T. Rocha-Santos:2019.

Identifying a quick and efficient method of removing organic matter without damaging microplastic samples. Sci. Total Environ. 2019, 686, 131–139.

[32] Chlorophyll. National Geographic.

https://www.nationalgeographic.org/encyclopedia/chlorophyll/ (pridobljeno 15. mar.

2021).

[33] A. Žgajnar Gotvajn, G. Kalčikova, J. Zagorc-Končan: Ekotoksikološki praktikum.

Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 2014.

(48)

34

[34] H. K. Lichtenthaler: Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Academic Press. 1987, 148, 350-382.

[35] G. Kalčíková, M. Zupančič, A. Jemec, A. Žgajnar Gotvajn: The impact of humic acid on chromium phytoextraction by aquatic macrophyte Lemna minor. Chemosphere.

2016, 147, 311–317.

[36] H. Liu, H. H. P. Fang: Extraction of extracellular polymeric substances (eps) of sludges. Journal of Biotechnology. 2002, 95, 249-256.

[37] T. Zhang, H. H. P. Fang: Quantification of extracellular polymeric substances in biofilms by confocal laser scanning microscopy. Biotechnology Letters. 2001, 23, 405- 409.

[38] M. Dubois, K. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, F. Smith: A colorimetric method for the determination of sugars. Nature. 1951, 168, 167.

[39] S. Li, P. Wang, C. Zhang, X. Zhou, Z. Yin, T. Hu, D. Hu, C. Liu, L. Zhu: Influence of polystyrene microplastics on the growth, photosynthetic efficiency and aggregation of freshwater microalgae Chlamydomonas reinhardtii. Sci. Total Environ. 2020, 714, 136767.

[40] B. Krajewska, R. van Eldrik, M. Brindell: Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetc studies of jack bean urease. Implocation fort he catalytic mechanism.

J Biol Inorg Chem. 2012, 17, 1123-1134.

[41] X. Liu, M. Zhang, Z. Li, C. Zhang, C. Wan, Y. Zhang, D. J. Lee: Inhibition of urease activity by humic acid extracted from sludge fermentation liquid. Bioresour. Technol.

2019, 290, 1-6.

[42] Density & Molecular weight in Polyethylene. Plastic Technology.

https://www.ptonline.com/articles/density-molecular-weight-in-polyethylene (pridobljeno 21. mar. 2021).

[43] ISO 1183-1:2019: Plasics Methods for determining the density of non-cellular plastics. ISO. https://www.iso.org/standard/74990.html (pridobljeno 21. mar. 2021) [44] S. Görs, R. Schumann, N. Häubner, U. Karsten: Fungal and algal biomass in biofilms on artificial surfaces quantified by ergosterol and chlorophyll a as biomarkers.

International Biodeterioration & Biodegradation. 2007, 50-59.

(49)

[45] K. Katam, D. Bhattacharyya: Improving the performance of activated sludge process with integrated algal biofilm for domestic wastewater treatment: System behavior during the start-up phase. Bioresource Technology Reports, 2021, 13, 1-9.

[46] F. Lagarde, O. Olivier, M. Zanella, P.Daniel, S. Hiard, A. Caruso: Microplastic interactions with freshwater microalgae: Hetero-aggregation and changes in plastic density appear strongly dependent on polymer type. Environmental Pollution. 2016, 215, 331-339.