UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE
Marja VREČKO
PREUČEVANJE POLIGENSKIH LASTNOSTI KVASOVKE Saccharomyces cerevisiae: ODPORNOST
PROTI OKSIDATIVNEMU STRESU
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MIKROBIOLOGIJE
Marja VREČKO
PREUČEVANJE POLIGENSKIH LASTNOSTI KVASOVKE Saccharomyces cerevisiae: ODPORNOST PROTI OKSIDATIVNEMU
STRESU
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Mikrobiologija
STUDY OF POLYGENIC TRAITS IN THE YEAST Saccharomyces cerevisiae: RESISTANCE TO OXIDATIVE STRESS
M. SC. THESIS
Master Study Programmes: Field Microbiology
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Mikrobiologija.
Delo je bilo opravljeno na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorja magistrskega dela imenovala prof. dr. Uroša Petroviča in za recenzenta izr. prof. dr. Cene Gostinčarja.
Mentor: prof. dr. Uroš PETROVIČ Recenzent: izr. prof. dr. Cene GOSTINČAR
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Neža ČADEŽ
Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za živilstvo
Mentor: prof. dr. Uroš PETROVIČ
Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za biologijo Recenzent: izr. prof. dr. Cene GOSTINČAR
Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za biologijo
Datum zagovora: 7.7.2021
Marja Vrečko
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 579.253.2:582.282.23(043)=163.6
KG kvasovke, Saccharomyces cerevisiae, poligenske lastnosti, oksidativni stres, iterativno križanje, industrijske lastnosti, izboljševanje fenotipa kvasovk AV VREČKO, Marja, dipl. mikrobiol. (UN)
SA PETROVIČ, Uroš (mentor), GOSTINČAR, Cene (recenzent) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij mikrobiologije LI 2021
IN PREUČEVANJE POLIGENSKIH LASTNOSTI KVASOVKE Saccharomyces cerevisiae: ODPORNOST PROTI OKSIDATIVNEMU STRESU
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija) OP IX, 51 str., 12 pregl.., 6 sl., 112 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Vsi organizmi z aerobnim metabolizmom so izpostavljeni kisiku in njegovim reaktivnim zvrstem (ROS), ki v organizmu povzročajo oksidativni stres. O njem govorimo takrat, ko so celični antioksidativni mehanizmi neuspešni pri odstranjevanju ROS in popravljanju škode, ki jo povzročijo v celici. Odpornost proti oksidativnem stresu je pri kvasovki Saccharomyces cerevisiae poligenska lastnost.
Izboljšana odpornosti proti oksidativnemu stresu je dobrodošla v industriji. Tam stremijo k uporabi čim robustnejših sevov, ki vzdržijo različne stresne pogoje in zaradi katerih so industrijski procesi stroškovno učinkovitejši. Za izboljšanje odpornosti smo želeli iterativno križati 3 seve kvasovke. Razporedili smo jih po odpornosti proti oksidativnemu stresu od najmanj do najbolj odpornega in najmanj odpornega kot prvega križali z sevom Y7092. Po križanju smo s selekcijo izbrali najuspešnejšo segreganto – t.i. zmagovalko in jo križali z naslednjim, odpornejšim sevom. Proces bi ponovili še dvakrat in tako premaknili izražen fenotip odpornosti proti oksidativnemu stresu v ekstrem. Po prvi iteraciji smo dobili zmagovalno segreganto, ki je bila odpornejša od obeh starševskih sevov pri oksidativnemu stresu, povzročenem z bakrovim (II) sulfatom. Pri stresu, povzročenem z vodikovim peroksidom, je bila odpornejša le od enega starša. Z iterativnim križanjem in selekcijo smo tako že v prvi iteraciji uspeli odpornost proti oksidativnemu stresu povečati nad raven obeh starševskih sevov.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 579.253.2:582.282.23(043)=163.6
CX yeasts, Saccharomyces cerevisiae, polygenic traits, oxidative stress, iterative crossing, industrial properties, improving yeast phenotype
AU VREČKO, Marja
AA PETROVIČ, Uroš (supervisor), GOSTINČAR, Cene (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study in Microbiology PY 2021
TI STUDY OF POLYGENIC TRAITS IN THE YEAST Saccharomyces cerevisiae:
RESISTANCE TO OXIDATIVE STRESS
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Microbiology) NO IX, 51 p., 12 tab., 6 fig., 112 ref.
LA sl AL sl/en
AB All organisms with aerobic metabolism are subjected to oxygen and its reactive species (ROS) that cause oxidative stress to the organism. Oxidative stress happens when all cellular antioxidative mechanisms are overwhelmed and cannot keep up with removing ROS from the cell or fix the damage ROS caused to the cell.
Resistance to oxidative stress is a polygenic trait in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Improved oxidative stress resistance is highly desirable in industry, where the use of robust strains, which can uphold different stressful conditions, is more cost-effective. We intended iterative crossing of 3 yeast strains. We arranged them from the least to the most resistant and crossed the least resistant strain with the SGA strain Y7092. After crossing we chose the most resistant segregant. We planned to repeat the process two more times to shift the expressed phenotype to a more extreme level. The chosen segregant after the first iteration was more resistant to oxidative stress, caused with copper (II) sulphate, than both parental strains. When exposed to stress, caused with hydrogen peroxide, the segregant was more resistant than one of the parental strains. Therefore, we have in just one iteration succeeded to move the level of resistance to oxidative stress to a higher degree compared to the parental strains used.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO SLIK VII
KAZALO PREGLEDNIC VIII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI IX
1 UVOD 1
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 SACCHAROMYCES CEREVISIAE 3
2.2 S. CEREVISIAE KOT MODELNI ORGANIZEM V MOLEKULARNIH
ŠTUDIJAH 3
2.3 CELIČNI CIKEL 5
2.3.1 Nespolno razmnoževanje 5
2.3.2 Spolno razmnoževanje 6
2.4 UMETNA EVOLUCIJA 7
2.4.1 Spolna hibridizacija 8
2.5 OKSIDATIVNI STRES 8
2.5.1 Nastanek ROS v celicah 9
2.5.2 Eksogeno povzročen oksidativni stres 9
2.5.3 Celični obrambni sistemi proti oksidativnemu stresu 10
2.5.3.1 Neencimski obrambni sistemi 10
2.5.3.2 Encimski obrambni sistemi 11
2.6 POLIGENSKE LASTNOSTI 12
2.6.1 Analize QTL 13
2.6.2 Metoda sintetičnega genetskega nabora 13
2.6.3 Princip iterativnega križanja 14
2.7 POLIGENSKE LASTNOSTI S. CEREVISIAE IN NJIHOV INDUSTRIJSKI
POTENCIAL 15
2.7.1 Učinkovitost fermentacije 15
2.7.2 Toleranca na etanol 15
2.7.3 Toleranca na nizke in visoke temperature 16
2.7.4 Organoleptične lastnosti 16
2.7.4.1 Hlapne žveplove spojine 16
2.7.4.2 Izboljšava biosinteze terpenoidov 17
3 MATERIAL IN METODE 18
3.1 MATERIAL 18
3.1.1 Mikroorganizmi 18
3.1.2 Kemikalije 18
3.1.3 Gojišča 19
3.1.4 Raztopine 20
3.1.5 Začetni oligonukleotidi 21
3.1.6 Encimi 21
3.2 METODE 22
3.2.1 Kapljični redčitveni test 22
3.2.2 Križanje sevov 23
3.2.3 Določitev diploidov 23
3.2.4 Agarozna gelska elektroforeza 25
3.2.5 Izolacija genomske DNA s pomočjo litijevega acetata 25
3.2.6 Sporulacija 25
3.2.7 Selekcija segregant v tekočem gojišču z dodanim bakrovim (II) sulfatom 26 3.2.8 Selekcija segregant na trdnem gojišču z dodanim bakrovim (II) sulfatom 26
3.2.9 Priprava trajnih kultur 27
4 REZULTATI 28
4.1 PREVERJANJE PARITVENIH TIPOV IZHODIŠČNIH SEVOV 28
4.2 ZAČETNI TESTI ODPORNOSTI PROTI OKSIDATIVNEMU STRESU 28
4.3 DOLOČANJE DIPLOIDNIH CELIC 30
4.4 SPORULACIJA 31
4.5 SELEKCIJA SEGREGANT V GOJIŠČU Z DODANIM STRESORJEM IN
IZBOR 'ZMAGOVALNE' SEGREGANTE 32
5 RAZPRAVA 36
6 SKLEPI 40
7 POVZETEK 41
8 VIRI 42
KAZALO SLIK
Slika 1: Kapljični redčitveni testi za testiranje starševskih sevov na trdnem gojišču YPD z dodanim bakrovim (II) sulfatom ... 28 Slika 2: Ponovljen redčitveni kapljični test s sevom AWRI na kontroli YPD in gojiščih
YPD z dodanim bakrovim (II) sulfatom. ... 29 Slika 3: Kapljični redčitveni testi za testiranje starševskih sevov na trdnem YPD gojišču z
dodanim vodikovim peroksidom. ... 30 Slika 4: Primer agaroznega gela s PCR pomnožki za določanje diploidnih celic. ... 31 Slika 5: Kapljični redčitveni test starševskih sevov in segregant na trdnem gojišču YPD z
dodanim bakrovim (II) sulfatom. ... 34 Slika 6: Kapljični redčitveni test starševskih sevov in segregant na trdnem YPD gojišču z
dodanim vodikovim peroksidom.. ... 34
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Uporabljeni sevi kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 18
Preglednica 2: Uporabljene kemikalije s proizvajalci ... 18
Preglednica 3: Uporabljena gojišča in njihova priprava ... 19
Preglednica 4: Uporabljene raztopine in njihova priprava ... 20
Preglednica 5: Uporabljeni začetni oligonukleotidi ... 21
Preglednica 6: Uporabljeni encimi s proizvajalci ... 21
Preglednica 7: Uporabljena laboratorijska oprema in aparature ... 21
Preglednica 8: Program priprave toplotno liziranih celic za uporabo kot matrico pomnoževanja v PCR na osnovi kolonije ... 24
Preglednica 9: Program za PCR pomnoževanje lokusa MAT pri S. cerevisiae ... 24
Preglednica 10: Reagenti, uporabljeni pri PCR pomnoževanju lokusa MAT pri S. cerevisiae ... 24
Preglednica 11: Vrstni red križanja kvasovk in pripadajoče oznake zmagovalnih segregant posameznih generacij ... 30
Preglednica 12: Gojišča za kapljične redčitvene teste in koncentracije stresorjev, ki smo jih uporabili ... 33
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ATP Adenozin trifosfat
bp Bazni par
BSA Obsežna analiza segregant (ang. bulk segregant analysis) dH2O Destilirana voda
DNA Deoksiribonukleinska kislina dNTP Deoksinukleotidi
GRAS (Organizmi) priznani kot varni (ang. generally recognized as safe) GSH Glutation
GSSG Glutation disulfid
HS Selekcijsko gojišče za analizo SGA
HTG Fenotip rasti pri visoki temperaturi (ang. high temperature growth) IJS Institut 'Jožef Stefan'
KAc Kalijev acetat kb Kilobaza MQ Ultra čista voda
OD600 Optična gostota pri valovni dolžini svetlobe 600 nm PCR Verižna reakcija s polimerazo
QTL Lokus kvantitativne lastnosti (ang. quantitative trait locus)
QTN Nukleotid kvantitativne lastnosti (ang. quantitative trait nucleotide) RNA Ribonukleinska kislina
ROS Reaktivne kisikove zvrsti ( ang. reacitve oxygen species) vrt./min Vrtljaji na minuto (ang. rotations per minute)
S-AEC Tializin
SGA Sintetični genetski nabor (ang. synthetic genetic array) SGD Saccharomyces Genome Database
SNP Polimorfizem posameznega nukleotida (ang. single nucleotide polymorphism) SOD Superoksid dismutaza
SPO ++ Sporulacijsko gojišče za kvasovke TBE Tris-borat-EDTA
YNB Osnovno gojišče za kvasovke z virom dušika YPD Bogato gojišče za kvasovke
1 UVOD
Kvasovka Saccharomyces cerevisiae je v življenje ljudi vpletena že od pradavnine naprej.
Njena vloga se je začela s proizvodnjo piva v Sumeriji 7000 let pr. n. št, sledila je proizvodnja vina v Asiriji 3500 let pr. n. št, in izdelovanje kruha v antičnem Rimu 100 let pr. n. št.
(Pretorius, 2000). Če so se vinarji zanašali predvsem na kvasovke, ki so bile naravno prisotne na grozdnih jagodah (Duina in sod., 2014), so pivovarji in peki seve kvasovk skrbno prenašali od šarže do šarže in skrbeli za čistost uporabljenih starterskih kultur (Enari, 1995).
Prav zaradi pivovarstva se je začela pot genetskih raziskav S. cerevisiae. Poleg Loiusa Pasteurja, ki je leta 1857 direktno povezal kvasovke z etanolno fermentacijo (Pasteur, 1858), so bili pomembni tudi pionirski poskusi, ki sta jih v 30-ih letih 20. stoletja v laboratoriju pivovarne Carlsberg izvedla Ojvind Winge in Carl Lindegren (Barnett, 2007). Pokazala sta, da se kvasovka razmnožuje spolno in odkrila sistem paritvenega tipa ter uvedla križanje kot genetsko metodo razvijanja in izboljševanja lastnosti S. cerevisiae (Enari, 1995).
Danes je S. cerevisiae eden izmed najpomembnejših mikroorganizmov, ki se uporablja v industriji. Poleg že tradicionalne vpletenosti v prehrambeno industrijo, se danes s pridom uporablja tudi pri proizvodnji bioetanola in rekombinantnih proteinov (Parapouli in sod., 2020). Pri uporabi v industriji mora mikroorganizem izpolnjevati določene kriterije, med katerimi je tudi učinkovita rast v preprostem gojišču, saj mora fermentacijski proces biti čim krajši in cenejši. Zaradi tega so v industriji zaželeni prototrofni sevi, torej sevi, ki lahko vršijo sintezo vseh za njih esencialnih hranil in katerim v fermentacijski medij ni potrebno dodajati rastnih faktorjev (Feldmann, 2012). V industrijskem okolju je S. cerevisiae večkrat izpostavljena za rast neugodnim pogojem, kar za celico predstavlja stres. Eden izmed pogostejših je oksidativni stres, ki ga povzročajo kisikove reaktivne zvrsti (ROS; Morano in sod., 2012). V celici povzročijo škodo, ki lahko vodi tudi v apoptozo, saj vpliva na pomembnejše celične komponente (DNA, lipide, proteine; Farrugia in sod., 2012). Dobra odpornost proti oksidativnemu stresu je torej zelo pomembna za samo preživetje celice v določenih razmerah, robustnost sevov pa je tudi zaželena lastnost v industriji.
Kot odgovor na oksidativni stres S. cerevisiae uporablja različne mehanizme (Jamieson, 1998). Na odpornost S. cerevisiae proti oksidativnem stresu vpliva več genov – odpornost je poligenska oziroma kvantitativna lastnost, ki jo lahko karakteriziramo z določevanjem lokusov kvantitativnih lastnosti (QTL; Swinnen in sod., 2012). S križanjem sevov, ki izražajo različne stopnje odpornosti proti oksidativnemu stresu in prek sporulacije nastalih diploidnih križancev lahko pridobimo veliko število genetsko različnih haploidov oziroma segregant.
Segregante zaradi mejotske rekombinacije izražajo različne kombinacije alelov, zato bodo tudi njihove sposobnosti preživetja v določenih okoljih različne. Ko segregante izpostavimo selekcijskemu pritisku, lahko preživijo le tiste, katerih kombinacije alelov omogočajo boljšo
odpornost proti oksidativnemu stresu. Z izbiro najodpornejših segregant iz vsake generacije iterativnega križanja dobimo populacijo segregant, ki imajo iskano lastnost bolj izraženo kot starševski sevi. V njih se vzročne alelne različice v QTL pojavljajo v višjih frekvencah.
Namen magistrske naloge je bil z iterativnim križanjem poleg segregant paritvenega tipa a neposredno izbrati tudi prototrofne seve. S križanjem genetsko različnih starševskih sevov običajne kvasovke Saccharomyces cerevisiae smo hoteli pridobiti segregante, ki bodo odpornejše proti oksidativnemu stresu v primerjavi s starševskimi sevi.
Pri delu smo si postavili sledeče hipoteze:
• Pričakujemo, da lahko s križanjem genetsko različnih starševskih sevov S. cerevisiae pridobimo proti oksidativnemu stresu bolj odporne segregante.
• Pričakujemo, da je poleg segregant paritvenega tipa a s selekcijo pri iterativnem križanju hkrati mogoče neposredno izbrati prototrofne seve.
2 PREGLED OBJAV
2.1 SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Saccharomyces cerevisiae je danes najbolj poznana in komercialno pomembna kvasovka. Je enocelični evkariontski organizem. Uvrščamo jo v kraljestvo Fungi, deblo Ascomycetes, razred Hemiascomycetes. Prave kvasovke so razvrščene v red Saccharomycetales (Schneiter, 2004). Prisotne so v veliko različnih naravnih habitatih, kot na primer na listih rastlin, v prsti, tudi puščavski, v slani vodi, v vinogradih in na površini kože (Greig in Leu, 2009). Le redko katera vrsta kvasovk je patogena, klasificirane so kot GRAS (ang. Generally Recognized As Safe) organizmi (Pretorius in sod., 2003).
Pred 80-imi leti je pomembnost kvasovk še narastla, saj so takrat začeli s pionirskimi genetskimi raziskavami v pivovarstvu, ki so pripomogle k oblikovanju genetike kvasovk v obliko, kot jo poznamo danes. Z medsebojnim križanjem različnih sevov so pivovarji poskušali izboljšati kakovost, okus in stabilnost končnega fermentiranega produkta (Gibbons in Rinker, 2015). Od takrat je S. cerevisiae postala ključni dejavnik v številnih industrijskih procesih, pri katerih uporabljamo fermentacijo. Še danes S. cerevisiae igra osrednjo vlogo pri proizvodnji in skladiščenju hrane prav zaradi svoje sposobnosti fermentiranja glukoze do etanola in ogljikovega dioksida (Schneiter, 2004). Poleg uporabe v prehrambeni industriji pa postaja vse bolj pomembna tudi v biotehnološki in farmacevtski industriji, kjer z njeno pomočjo proizvajajo etanol, organske kisline, aminokisline, encime (Nandy in Srivastava, 2018) in s pomočjo heterologne ekspresije tudi terapevtske proteine, kot so inzulin, cepivo za hepatitis in cepivo za človeški papilomavirus (Hou in sod., 2012).
Zaradi velike sposobnosti nadzorovanja in manipulacije celičnega cikla je S. cerevisiae postala najmočnejši enocelični evkariontski sistem v bioloških raziskavah, zato se danes v znanosti s pridom uporablja tudi kot modelni organizem v raznovrstnih bioloških raziskavah (Liti, 2015).
2.2 S. cerevisiae KOT MODELNI ORGANIZEM V MOLEKULARNIH ŠTUDIJAH Sredi 30-ih let prejšnjega stoletja je S. cerevisiae kot eksperimentalni organizem prvi uporabil genetik Herschel Lewis Roman, od takrat pa se je uveljavila kot dober sistem preučevanja organizacije struktur znotraj celice in osnovnih celičnih mehanizmov (Feldmann, 2012).
Kar je končno odlikovalo kvasovke S. cerevisiae kot vodilni modelni organizem, je preprostost, s katero premikamo gene iz in v celico. To naredimo s plazmidi ali z vstavljanjem v genom kvasovke. Genetiki lahko mutirajo ali manipulirajo gensko ekspresijo kvasovke S. cerevisiae in tako preučujejo fenotipske pojave. Po odkritju transformacije so
razvili veliko različnih podvajajočih se plazmidov in selektivnih označevalcev, ki so še pripomogli k t.i. ‘veličastni zmogljivosti genetike kvasovk’. Naravno prisotna mesta začetka podvajanja so bila prilagojena za izdelavo plazmidov, ki se podvojujejo znotraj celice kvasovke. Kloniranje genov avksotrofnih selektivnih označevalcev, ki zagotavljajo esencialne encime za rast ali odpornost proti snovem, ki sicer zavirajo rast, je vodilo do razvoja standardiziranih plazmidov. V primeru vstavljanja enot DNA, ki nimajo mesta za avtonomno podvojevanje, se mora transformirana DNA integrirati v genom kvasovke prek homologne rekombinacije. To je vodilo do razvoja 'dizajnerskih' delecijskih sevov, ki skupaj z dobro anotirano podatkovno zbirko genoma Saccharomyces cerevisiae (SGD) omogoča veliko fleksibilnost pri zasnovi eksperimentov (Goffeau in sod., 1996; Brachmann in sod., 1998; Cherry in sod., 2012).
S pomočjo mejoze in mitoze so znanstveniki uspeli kartirati genome kvasovk, ki jih je leta 1949 objavil Lindegren (Feldmann, 2012). Zaradi velike priljubljenosti S. cerevisiae je bil prav njen genom prvi evkariontski genom, ki je bil sekvenciran v celoti. Genom seva S288C so Goffeau in sodelavci uspeli sekvencirati leta 1996 (Goffeau et al,, 1996). Ta dosežek je bil pomemben za marsikaterega znanstvenika, saj smo z njim pridobili informacije o organizaciji genoma in evoluciji (Duina in sod., 2014). V tipični haploidni celici kvasovk je približno 12.000 kb genomske DNA razdeljene v 16 kromosomov, ki so posledica podvojitve celotnega predniškega genoma, ki je obsegal 8 kromosomov (Kellis in sod., 2004). Genom S. cerevisiae je sestavljen iz dobrih 6000 genov, od teh jih večina predstavlja protein-kodirajoče gene, ostali so protein-nekodirajoči geni. Gostota protein-kodirajočih genov je več kot petdesetkrat višja kot v človeškem genomu. To je posledica relativno majhnega števila genov z introni (Spingola in sod., 1999). Nekodirajoči geni vključujejo tiste, ki se prepisujejo v RNA molekule, vpletene v proces translacije, spajanje pred- informacijskih RNA molekul in tiste, ki olajšajo kemijske spremembe RNA molekul (Kavanaugh in Dietrich, 2009).
S. cerevisiae je stabilna v haploidni in diploidni obliki, zato je z njo lažje preučevati učinke raznih mutacij (Liti, 2015). Izoliramo lahko recesivne mutacije in jih izrazimo v haploidnih sevih ter izvedemo teste komplementacije v diploidnih celicah ter identificiramo vzročni gen oziroma vzročne gene za določeni fenotip (Sherman, 2002). Prav tako so nekatere celične strukture in vsi osnovni celični mehanizmi – kot so replikacija, rekombinacija in celična delitev – ohranjeni med kvasovkami in višjimi evkarionti, vključno s sesalci (Duina in sod., 2014).
Velika prednost S. cerevisiae je tudi dober nadzor nad razmnoževalnim ciklom in zmožnost preklapljanja med spolnim in nespolnim razmnoževanjem. Pod natančno nadzorovanimi pogoji v laboratoriju so mehanizmi življenjskega cikla S. cerevisiae med najbolje opisanimi med vsemi organizmi (Duina in sod., 2014).
2.3 CELIČNI CIKEL
Celice S. cerevisiae najdemo v diploidni ali haploidni obliki. Če je v okolju na voljo dovolj hranil, se lahko obe obliki nespolno razmnožujeta z mitozo. Poleg mitoze ima S. cerevisiae na voljo še druge razvojne možnosti, ki so v veliki večini vezane na signale, povezane z dostopnostjo hranil. Ob primanjkovanju hranil celice ne glede na število kromosomov preidejo v stacionarno fazo. Celice S. cerevisiae v stacionarni fazi so morfološko in biokemijsko različne od delečih se celic – ne brstijo, so bolj zaokrožene in vsebujejo veliko več založnih ogljikovih hidratov, kot sta trehaloza in glikogen. V primerjavi z brstečimi celicami so celice v stacionarni fazi bolj odporne na razne strese in neugodne pogoje v okolju (Dickinson in Schweizer, 2004).
2.3.1 Nespolno razmnoževanje
Nespolno razmnoževanje kvasovk z brstenjem je eden izmed najbolj poznanih pojavov v biologiji, ki ga lahko opazujemo že pod zelo preprostim mikroskopom (Dickinson in Schweizer, 2004). Celice se pod idealnimi laboratorijskimi pogoji v bogatem gojišču delijo hitro, vsakih 90 min. Delitev poteka z brstenjem manjših hčerinskih celic iz velike, materinske celice (Herskowitz, 1998).
Celični cikel delimo na dve glavni fazi. Na interfazo, ki je sestavljena iz treh stopenj (G1, S in G2) ter fazo M, v kateri se vrši mitoza. Faza M je prav tako razdeljena na več stopenj – na profazo, metafazo, anafazo in telofazo (Feldmann, 2012). Sosledje faz celičnega cikla kvasovk je: G1 – S – G2 – M – G1. Vmesni fazi G1 in G2 služita za pravilen potek celičnega cikla. V njiju potekajo kontrolne točke, ki regulirajo in nadzorujejo ustreznost več dejavnikov, kot so na primer velikost celice, oblika, poravnava delitvenega vretena in poškodbe DNA (Irons, 2009).
Interfaza se začne z vmesno fazo G1, ki služi kot prva od treh kontrolnih točk. Pred začetkom sinteze DNA lahko ob stradanju celica vstopi v spolni cikel, ali pa ob zadostni velikosti celice in primerni prisotnosti hranil vstopi v mitozo. V tem primeru po kontrolni točki v fazi G1 celica preide v fazo S, v kateri se začne sinteza DNA. Vsak kromosom je podvojen, da dobimo dve enaki sestrski kromatidi. Sledi prehod v vmesno fazo G2, v kateri mora celica prestati drugo kontrolno točko, na kateri se preveri ustreznost podvojene DNA (Feldmann, 2012). V primeru, da je DNA v celoti podvojena in nepoškodovana, celica vstopi v mitozo ali fazo M, v kateri se v procesu profaze DNA kondenzira, sledi metafaza, v kateri se kromosomi poravnajo na centru delitvenega vretena. Delitveno vreteno nastane med celičnim ciklom iz mikrotubulov, ki so povezani na enega izmed polov celice. Pred začetkom anafaze celica preide še zadnjo kontrolno točko, v kateri se preverja pravilno poravnavo kromosomov in nastanek delitvenega vretena. V anafazi se mikrotubuli pritrdijo na sestrske kromatide in jih povlečejo narazen, da je na vsakem polu celice ena kopija kromatide. Sledi
telofaza, v kateri se celica razdeli v dve manjši celici, ki sta haploidni, torej z enim setom kromosomov (Dickinson in Schweizer, 2004).
2.3.2 Spolno razmnoževanje
Haploidne celice kvasovk so lahko dveh različnih paritvenih tipov, a in α, ki sta določena z lokusom MAT na desnem kraku kromosoma III. Na lokusu je lahko en od dveh nehomolognih alelov – MATa ali MATα (Kanavanaugh in Dietrich, 2009). Haploidne celice paritvenega tipa a imajo alel MATa in izdelujejo faktor a, haploidne celice paritvenega tipa α pa imajo alel MATα in izdelujejo faktor α. Vsak tip celice ima na površini celice receptor za faktor nasprotnega paritvenega tipa. Pri celicah S. cerevisiae paritvenega tipa a le-tega zapisuje gen STE2 (Blumer in sod., 1988), pri celicah paritvenega tipa α pa gen STE3 (Hagen in sod., 1986). Faktorja aktivirata sintezo proteinov, ki so nujni za celično (Trueheart in sod., 1987) in jedrno fuzijo (Rose in sod., 1986). Paritveni sistem s faktorji sinhronizira celični cikel obeh paritvenih partnerjev in jima omogoča pravilen potek fuzije. Faktorja tudi zaustavita haploidno celico nasprotnega paritvenega tipa v fazi G1 celičnega cikla, tik pred začetkom sinteze DNA (Herskowitz, 1998).
Ko sta celici nasprotnega paritvenega tipa blizu ena drugi, zaznata gradient faktorja. Ob prisotnosti gradienta vsaka celica prek kemotropizma začne rasti proti izvoru gradienta faktorja. Vezava faktorja na ustrezni površinski receptor celice aktivira proteine G za nastanek brsta in odgovor na paritveni faktor. Haploidne celice ob prisotnosti celice nasprotnega paritvenega tipa prenehajo z deljenjem in začnejo z izdelovanjem zaokroženih izrastkov med njima. Oblika, ki jo tako dobimo, se v angleščini imenuje 'shmoo'. Ko sta izrastka dovolj velika, pride do celičnega stika in celične ter jedrne fuzije. Tako nastane diploidna celica (Dickinson in Schweizer, 2004).
2.3.2.1 Mejoza in sporulacija
Diploidne celice ob primanjkovanju dušika in v prisotnosti ne-fermentabilnega vira ogljika, kot je na primer acetat, vstopijo v mejozo in tvorijo spore (Dickinson in Schweizer, 2004).
Diploidne celice takrat izstopijo iz mitoze v fazi G1 in vstopijo v pred-mejotsko fazo S.
Izvedejo le en krog podvojitve DNA, ki ji sledi dolga profaza, v kateri se parijo homologni kromosomi, poteče tudi homologna rekombinacija (Engebrecht, 2003).
Homologna rekombinacija je proces, v katerem se izmenja genetska informacija med dvema podobnima ali enakima verigama dvoverižne DNA. V celici je največkrat uporabljena za popravljanje dvojnih prelomov DNA. Med mejozo z njo dobimo tudi nove kombinacije alelov, kar privede do izražanja različnih fenotipov, ki so kasneje podvrženi naravni selekciji. Sodeluje pri horizontalnem prenosu genov. Začne se s programiranimi dvojnimi prelomi DNA v eni od homolognih regij. Na drugem delu DNA se tvori D-zanka, v katero
vdre prekinjena veriga. Dobimo dvojno Holliday-evo križišče, na katerem poteče izmenjava genetskega materiala ali kromosomsko križanje (Owens in sod., 2018). Sledita dve ponovitvi segregacije DNA – mejoza I, ali redukcijska delitev, v kateri sestrske kromatide ostanejo povezane in se porazdelijo kot ena celota. Sledi mejoza II, ki poteka podobno kot mitoza – sestrski kromatidi se delita in razporedita na nasprotna pola celice (Engebrecht, 2003).
Pri nekaterih ostalih evkariontih mejozi II sledi proces celične diferenciacije, med katero se haploidna jedra zapakirajo v gamete, pri kvasovkah pa je mejoza združena s procesom sporulacije, po kateri dobimo štiri genetsko različne haploidne spore shranjene znotraj enega aska (Engebrecht, 2003). To pakiranje zahteva veliko sprememb v celični citoplazmi.
Najprej se štiri delitvena vretena, ki so prisotna v mejozi II, spremenijo tako, da postanejo mesta nastanka novih membranskih razdelkov ali prospornih membran (Moens, 1971). Te membrane se večajo, dokler niso dovolj velike, da objamejo nastajajoče haploidno jedro.
Med to fazo vstopijo v citoplazmatski prostor med celičnim ovojem in prosporno membrano tudi mitohondriji in drugi celični organeli. Po kariogenezi, ko dobimo sestrska jedra, vsaka prosporna membrana zaobjame posamezno jedro in ga loči od citoplazme materinske celice, ki ji sedaj rečemo ask. Pozne stopnje nastanka spor vključujejo sestavljanje stene spore okrog vsakega jedra (Coluccio in sod., 2004), zgoščevanje kromatina v jedru spore in regeneracijo določenih organelov (Suda in sod., 2007). Vse to se dogaja v citoplazmi aska.
Ko se stena spore sestavi, materinska celica okoli spor razpade in dobimo zrel tetrahedralni ask (Neiman, 2011).
Spore so na razne dejavnike okolja odpornejše kot celice v stacionarni fazi. Ko se pogoji okolja spremenijo v ugodnejše, spore kalijo in rastejo kot haploidne celice (Dickinson in Schweizer, 2004).
2.4 UMETNA EVOLUCIJA
V zadnjih dveh desetletjih so naravno raznolikost S. cerevisiae množično preučevali s ciljem razumevanja ekoloških in evolucijskih procesov. Odkrili so veliko genetskih variant, kar je omogočilo nastanek zbirk alelov, odgovornih za kompleksne lastnosti. Aleli predstavljajo genetski vir, iz katerega lahko pridobimo potencialne nove seve, ki ustrezajo zahtevam modernih industrijskih procesov, kjer velikokrat vladajo močno selektivni in zelo specifični pogoji (Cubillos, 2016). Iskanje novih genetskih variant v industriji omogoča natančno prilagajanje končnega produkta z, na primer, povečanjem privzema substratov za proizvodnjo sekundarnih metabolitov (Marsit in Dequin, 2015). Za uspešno fermentacijo potrebujemo fenotipe ali kombinacije fenotipov, ki so v naravi redko prisotni. Pri divjih kvasovkah so fiziološki odzivi usmerjeni predvsem v preživetje in razmnoževanje, medtem ko poskušamo v industrijskih fermentacijah doseči čim boljše izkoristke tehnoloških procesov (Steensels in sod., 2014). Prav s tem razlogom so se razvile razne tehnike za
umetno evolucijo kvasovk, ki bi bile bolj učinkovite v industrijskem okolju kot sevi, katerih selekcija je odvisna od naravnih okolij (Steensels in sod., 2014).
2.4.1 Spolna hibridizacija
Najbolj preprost in učinkovit način za načrtno povečevanje raznolikosti je križanje oziroma parjenje različnih sevov kvasovk. Drugo ime za to tehniko je tudi spolna hibridizacija in je v svojem principu zelo podobna selektivnemu gojenju (Steensels in sod., 2014). To se zelo pogosto uporablja v kmetijstvu, kjer kmetje že več tisoč let izbirajo pridelke z določenimi lastnostmi in jih križajo med seboj, da dobijo pridelke z izboljšanimi lastnostmi (Chambers in sod., 2009; Steensels in sod., 2012).
Razvoj tehnologije in vse boljše razumevanje fiziologije kvasovk, predvsem spolnega življenjskega cikla, je omogočilo bolj usmerjene pristope h križanju kvasovk. Takšno 'tarčno' križanje sevov, ki so predhodno izbrani na podlagi ustreznega fenotipa, se uporablja za združevanje različnih lastnosti izbranih starševskih sevov kvasovk s ciljem izboljšanja ene, velikokrat kompleksne lastnosti (Steensels in sod., 2014). S tem principom lahko izboljšamo lastnosti preko fenotipskih okvirov starševskih sevov, to je fenomen, imenovan heteroza ali hibridni vigor (Lippman in Zamir, 2007). Velika prednost spolne hibridizacije je tudi ta, da ni odvisna od rekombinantne DNA tehnologije, zato tako spremenjenih sevov ne prištevamo med gensko spremenjene organizme (Steensels in sod., 2014).
Če so potencialni starševski sevi heterotalični, jim lahko zaradi stabilnega haploidnega stanja preverimo izraženi fenotip in tako izberemo najboljše haploidne segregante za izvajanje hibridizacije. To tehniko sta opisala Lindegren in Lindegren (1943), danes ji pravimo križanje celica-celica. Kulture dveh izbranih haploidov enostavno zmešamo skupaj, da dobimo diploide, ki jih nadalje testiramo na preiskovano fenotipsko lastnost. Ker smo izbrana starševska seva že vnaprej fenotipizirali, imamo večje možnosti, da izoliramo hibrid z izboljšanim fenotipom glede na starševska seva (Lindegren, 1945).
2.5 OKSIDATIVNI STRES
Kisik je za dušikom po količini drugi plin v Zemljinem ozračju. Predstavlja 20,95 % Zemljine atmosfere (Lower, 2020). Molekularni kisik je v svojem osnovnem stanju relativno nereaktivna in neškodljiva molekula. Lahko pa se tudi delno reducira v reaktivne zvrsti kisika (ROS), ki so visoko reaktivne molekule (Morano in sod., 2012). ROS so toksične molekule, ki lahko hudo poškodujejo glavne celične komponente. Povzročajo modifikacije DNA, peroksidacijo lipidov in oksidacijo proteinov (Farrugia in sod., 2012). K ROS med drugim uvrščamo tudi visoko reaktivni molekuli peroksida in superoksidnega aniona, saj lahko vodita k nastanku še več reaktivnih zvrsti, predvsem ob prisotnosti kovinskih anionov (Jamieson, 1998).
Tako so vsi organizmi, ki imajo aerobni metabolizem, izpostavljeni kisiku in njegovim reaktivnim zvrstem, ki v organizmu povzročajo oksidativni stres (Jamieson, 1998). O oksidativnem stresu govorimo takrat, ko celični antioksidativni in preživetveni mehanizmi ne dohajajo nastajajoče količine ROS oziroma škode, ki jo te v celici povzročajo (Morano in sod., 2012).
Oksidativna škoda je velik problem tudi v industriji, saj oksidacija maščob in olj vodi v žarkost hrane, celice kvasovk, ki se uporabljajo pri pripravi kvašenih izdelkov in v pivovarstvu, pa so oksidativnemu stresu izpostavljene pri zamrzovanju in sušenju (Morano in sod., 2012).
2.5.1 Nastanek ROS v celicah
ROS v celici nastanejo zaradi neugodnih pogojev v okolju in stranskih reakcij normalnega aerobnega metabolizma. Ena takih reakcij je mitohondrijsko dihanje, ki je glavni vir ROS v evkariontskih celicah. ROS nastanejo med oksidativno fosforilacijo (Murphy, 2009), v kateri se za nastanek ATP elektroni prenašajo prek proteinskih kompleksov ali elektronske prenašalne verige do končnega akceptorja – molekularnega kisika, pri čemer nastane voda (Morano in sod., 2012). Izhajanje elektronov iz dihalne verige vodi do redukcije kisika, v celicah se tvorijo ROS. Drugi metabolni procesi, v katerih lahko nastanejo endogeni ROS, so odvisni od pogojev rasti (Murphy, 2009). Vključujejo razgradnjo maščobnih kislin v peroksisomu po poti β-oksidacije in oksidativno deaminacijo med rastjo na D-aminokislinah kot glavnem viru ogljika (Pollegioni in sod., 2007).
2.5.2 Eksogeno povzročen oksidativni stres
Celice se na ROS odzivajo prek za vrsto oksidanta specifičnih odzivov, zato noben oksidant ne more biti reprezentativen za odziv na oksidativen stres. Veliko študij kot modelni oksidant uporablja vodikov peroksid, odziv na oksidativen stres v celici pa sprožijo tudi superoksidni anioni, tiol-reaktivne spojine in ioni težkih kovin (Temple in sod., 2005). V magistrski nalogi smo kot glavni oksidant uporabili bakrov (II) sulfat, ter vodikov peroksid.
Vodikov peroksid je ubikvitarna molekula, ki nastaja kot stranski produkt aerobnega dihanja ter po izpostavljenosti raznim biološkim in okoljskim faktorjem. Celice lahko poškoduje prek oksidativnega stresa, hkrati pa igra pomembno vlogo tudi kot signalna molekula v uravnanju nekaterih bioloških procesov (Veal in sod., 2007). Vodikov peroksid se mora odstraniti iz celice, da se ta izogne Fentonovi in Haber-Weissovi reakciji, pri katerih nastajajo visoko reaktivni hidroksilni radikali, OH˙ (Morano in sod., 2012).
Nad nastankom celičnih ROS imajo velik vpliv redoks aktivne kovine, med katere spada tudi baker. Baker je eden izmed esencialnih elementov v sledovih. Je kofaktor pri številnih
encimih in celičnih procesih, med drugim sodeluje tudi pri privzemu železa. V visokih koncentracijah pa je za celico toksičen, saj inducira nastanek oksidativnega stresa tako, da katalizira Fentonovo reakcijo in pospeši nastanek radikalov OH˙. Eden izmed učinkov bakra pri S. cerevisiae je oksidativna škoda na lipidnih membranah (Shanmuganathan in sod., 2004).
2.5.3 Celični obrambni sistemi proti oksidativnemu stresu
Oksidativni stres je za celico hitro lahko smrtonosen. Prav zato imajo aerobni organizmi vrsto različnih mehanizmov, ki jim omogočajo zaščito svojih celičnih komponent in rast v okolju, bogatem s kisikom (Jamieson, 1998). S. cerevisiae za odgovor na oksidativni stres uporablja različne celične mehanizme, ki zagotovijo preživetje celice po izpostavljenosti oksidantom. Ti vključujejo obrambne mehanizme, ki odstranjujejo ROS, zmanjšajo hitrost njihovega nastajanja in popravljajo škodo, ki nastane zaradi njih (Morano in sod., 2012).
Pri S. cerevisiae obrambne sisteme za ohranjanje celičnega redoks stanja in zaščito celičnih komponent delimo na encimske in ne-encimske (Jamieson, 1998). Nekaj glavnih bomo opisali v nadaljevanju.
2.5.3.1 Neencimski obrambni sistemi
Neencimski obrambni sistemi so značilno sestavljeni iz majhnih molekul, ki so lahko vodotopne ali lipidotopne. Delujejo kot pobiralci kisikovih radikalov, jih oksidirajo in jih tako odstranijo iz raztopine (Jamieson, 1998).
• Glutation
Glutation (GSH) je eden izmed najbolj poznanih ne-encimskih obrambnih sistemov. Deluje kot pobiralec kisikovih radikalov (Marschler in sod., 1993). Ima redoks aktivno sulfhidrilno skupino, ki reagira z oksidanti, nastane reduciran GSH ali GSSG. GSH je najverjetneje najbolj številčen pobiralec ROS v celicah, zato je eden glavnih dejavnikov pri regulaciji redoks stanja celice (Morano in sod., 2012). GSH ni samo pobiralec ROS, ampak se lahko tudi konjugira na toksične elektrofilne spojine, konjugat se prek membranske črpalke izloči v vakuolo (Li in sod., 1997). V S. cerevisiae lahko GSH v pogojih stradanja služi tudi kot vir dušika in žvepla (Mehdi in sod., 1997).
• Metalotioneini
Metalitioneini so družina nizkomolekularnih proteinov, bogatih s cisteinom, ki imajo lastnosti antioksidantov in lahko nase vežejo večje število kovinskih ionov (Hammer, 1986).
Ti proteini so predvsem pomembni pri zaščiti pred škodljivimi učinki težkih kovin, kot je na
primer baker. Metalotioneine za detoksikacijo bakrovih ionov pri S. cerevisiae kodirata gena CUP1 in CRS5 (Culotta in sod., 1994). Gen CRS5 se izraža konstitutivno, ne glede na koncentracijo bakrovih ionov v okolju, medtem ko se gen CUP1 izraža ob povišanih koncentracijah bakrovih ionov (Wysocki in Tamàs, 2010). Za privzem bakrovih ionov v celico ima S. cerevisiae dva sistema, ki se med sabo razlikujeta v afiniteti za bakrove ione.
Njuno izražanje je prav tako odvisno od koncentracije bakrovih ionov v okolju (Feldmann, 2012).
2.5.3.2 Encimski obrambni sistemi
Ti obrambni sistemi vključujejo več encimov, ki so prisotni v različnih delih celice.
Odstranjujejo kisikove radikale in njihove produkte in/ali popravljajo škodo, povzročeno zaradi oksidativnega stresa (Jamieson, 1998).
• Katalaza
Katalaza je ubikvitaren encim, ki vsebuje hem in katalizira razpad vodikovega peroksida do O2 in H2O. S. cerevisiae ima dva takšna encima, katalazo A in katalazo T, ki ju kodirata gena CTA1 in CTT1 (Cohen in sod., 1988). Katalaza A se nahaja v peroksisomih, njena glavna fiziološka naloga je odstranjevanje vodikovega peroksida, ki nastane pri β-oksidaciji maščobnih kislin. Katalaza T se nahaja v citosolu, njena naloga pa je manj jasna, vendar vemo, da je izražanje gena CTT1 nadzorovano z oksidativnim in osmotskim stresom ter stradanjem (Ruis in sod., 1992). Sevi kvasovk, ki imajo okvarjena oba gena, so posebej občutljivi na vodikov peroksid v stacionarni fazi in niti enojne niti dvojne mutante z okvarjeno katalazo se niso sposobne odzvati na stres, povzročen z vodikovim peroksidom (Izawa in sod., 1996).
• Superoksid dismutaza
Superoksid dismutaze (SOD) pretvorijo superoksidni anion v vodikov peroksid, ki se nato reducira do vode s peroksidazami ali katalazami. SOD so pogosti antioksidanti, ki se med organizmi razlikujejo v celični lokaciji in kovinskem kofaktorju encima (Morano in sod., 2012).
S. cerevisiae ima dve znotrajcelični superoksid dismutazi. Ena, MnSOD, se nahaja v mitohondriju, kodira jo gen SOD2, druga, Cu/ZnSOD, pa deluje v citoplazmi, kodira jo gen SOD1 (Bermingham-McDonough in sod., 1988). Cu/ZnSOD je glavni encim, ki je vpleten v odstranjevanje superoksidnih anionov iz citoplazme in peroksisoma (Gralla in sod., 1991).
Fiziološka vloga MnSOD pa je zaščita mitohondrija pred superoksidi, ki se tvorijo med dihanjem in izpostavljenostjo etanolu (Jamieson in sod., 1994). Cu/ZnSOD naj bi bila prav
tako vpletena v zaščito celic proti superoksidnimi anioni, ki so posledica respiracije, hkrati pa igra tudi vlogo pri uravnavanju koncentracije bakra v celici (Culotta in sod., 1995).
2.6 POLIGENSKE LASTNOSTI
Fenotipska raznolikost med sevi kvasovk se lahko kategorizira kot kvalitativna ali kvantitativna. Kvalitativne ali tudi Mendlove lastnosti nadzoruje en lokus, ki ima diskretni učinek na fenotip. Velika večina lastnosti pa je kvantitativnih ali poligenskih (Botstein in Risch, 2003). Fenotipsko izražanje poligenskih lastnosti lahko deloma izmerimo in je porazdeljeno v obliki neprekinjene krivulje (Swinnen in sod., 2012a).
Kvantitativne lastnosti so tipično zapisane na več lokusih, ki jih imenujemo lokusi kvantitativnih lastnosti (QTL; ang. quantitative trait locus) (Abiola in sod., 2003). QTL predstavlja posamezni lokus, ki je odgovoren za specifični del fenotipskega izražanja poligenske lastnosti. QTL je lahko sestavljen iz enega samega gena ali pa je skupek tesno povezanih genov, ki doprinesejo k posamezni kvantitativni lastnosti (Mackay, 2001). Da lahko določimo, katera polimorfna mesta v genu, ki ustrezajo QTL, dejansko povzročijo razliko v izraženem fenotipu, moramo definirati nukleotide kvantitativnih lastnosti ali QTN (ang. quantitative trait nucleotide; Mackay, 2001).
Identifikacija genov, ki pripomorejo h kvantitativnim lastnostim, je zapletena. Razlog temu je kompleksna genetska struktura poligenskih lastnosti, ki jo narekujejo variabilen doprinos h QTL, genetske interakcije, genetska heterogenost in interakcije med geni in okoljem (Swinnen in sod., 2012a). Dolgo je veljalo, da so kvantitativne lastnosti odvisne od veliko različnih lokusov, pri katerem ima vsak lokus majhen efekt na samo lastnost. Kasneje so pokazali, da so kvantitativne lastnosti določene prek lokusov, ki variirajo v svojem doprinosu k lastnosti. Doprinos je lahko manjši – govorimo o manjšem QTL (ang. minor QTL) (Barton in Turelli, 1989) ali večji. V tem primeru govorimo o glavnem QTL (ang.
major QTL) (Risch, 2000).
Na strukturo poligenskih lastnosti imajo velik vpliv tudi genetske interakcije (Carlborg in Haley, 2004). To so interakcije med različnimi QTL, zaradi katerih fenotipske ekspresije poligenskih lastnosti ne moremo predvideti s preprosto vsoto vpliva posameznih QTL (Swinnen in sod., 2012a). Genetske interakcije so lahko sinergistične, kar pomeni, da je fenotip enega lokusa izboljšan z genotipom drugega lokusa, ali antagonistične, kjer se razlike med genotipoma na lokusu utišata zaradi prisotnosti genotipa na drugem lokusu. Lahko pa pripomorejo tudi k izražanju povsem novih fenotipov (Mackay, 2001).
Genetska heterogenost prav tako ovira preučevanje poligenskih lastnosti, saj so tukaj lahko za enak, neločljiv fenotip, odgovorne različne kombinacije genetskih determinant (Risch, 2000). Problematični so tudi odnosi med geni in okoljem, saj se lahko učinki določene
genske determinante na kvantitativno lastnost zelo razlikujejo glede na okolje, v katerem se organizem nahaja (Swinnen in sod., 2012a).
2.6.1 Analize QTL
Zaradi medsebojno odvisnih in kompleksnih interakcij med QTL je skoraj nemogoče identificirati vse vpletene QTL, če preučujemo vsak lokus posebej. Zato za identifikacijo QTL potrebujemo metodo, s katero jih lahko identificiramo skupinsko. Neposredna metoda za to je kartiranje QTL, ki ima za cilj simultano genomsko lokalizacijo vseh lokusov, ki so odgovorni za kvantitativno lastnost. Kartiranje QTL v S. cerevisiae se tipično izvaja s križanjem dveh sevov, ki se razlikujeta v poligenski lastnosti, ki nas zanima. Po parjenju sledi sporulacija diploidnega hibrida, s čimer dobimo haploidne segregante, ki so genetsko različne. Genetska raznolikost je posledica rekombinacije na kromoskem in intra- kromosomskem nivoju med mejozo in je povezana z variacijami v fenotipskem izražanju kvantitativne lastnosti (Swinnen in sod., 2012a). Identifikacija QTL ni koristna samo za določevanje vzročnih genov za določeno lastnost, uporabna je tudi pri vzreji organizmov z zaželenimi fenotipi. Veliko analiziranih QTL pri evkariontih je bilo uspešno prenesenih v industrijsko uporabo (Shomura in sod., 2008).
2.6.2 Metoda sintetičnega genetskega nabora
Pri obsežni analizi genetskih osnov visoko kompleksnih lastnosti potrebujemo za kartiranje QTL veliko populacijo. Ehenreich in sodelavci (2010) so za to razvili nadgradnjo metode BSA (ang. bulk segregant analysis), s katero lahko učinkovito kartiramo kompleksne lastnosti kvasovke. Metoda je sestavljena iz treh korakov. Najprej moramo doseči številčno populacijo segregant, nato te segregante izpostavimo fenotipizaciji, ki temelji na selekciji, da dobimo veliko število potomcev z ekstremnimi lastnostmi. Nazadnje v pridobljenem zbiru kvantitativno izmerimo frekvence alelov v genomu. Za pridobitev zbira segregant so uporabili metodo SGA (ang. synthetic genetic array), ki so jo Tong in sodelavci razvili leta 2001 (Tong in sod., 2001). Metoda SGA omogoča izbiranje le haploidnih celic paritvenega tipa a ob križanju starševskih sevov, pri katerih ima vsaj eden na promotor paritvenega tipa vezane genetske označevalce.
V našem primeru smo za izvedbo metode SGA uporabili za to primerno označen sev Y7092.
Ta ima izbrisan gen HIS3, zato so na STE2pr (promotor, specifičen za MATa) vezali označevalec iz kvasovke Saccharomyces pombe SpHIS5, ki kodira encim imidazolglicerol- fosfat dehidrogenazo in je vpleten v biosintezo aminokisline histidin. Nastala je genska kaseta STE2pr-Sp_his5, ki so jo integrirali v lokus CAN1 in tako povzročili delecijo gena.
Gen CAN1 kodira argininsko permeazo, ki poleg arginina iz gojišča omogoča privzem kanavanina, ki je za celico toksičen analog arginina. V genomu so naredili tudi delecijo gena LYP1, ki zapisuje lizinsko permeazo. Lizinska permeaza je membranski transportni protein
in mogoča privzem tializina, ki je toksičen analog lizina. Genotip seva Y7092 je MATα can1Δ::STE2pr-Sp_his5 lyp1Δ ura3Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 met15Δ0. Sev zaradi izbrisanega gena HIS3 pri križanju z drugim sevom in sporulaciji omogoča izolacijo haploidnih celic paritvenega tipa a. Diploidne in haploidne celice paritvenega tipa α v selekcijskem gojišču brez histidina ne rasejo zaradi izbrisanega gena HIS3, rast je omogočena le celicam tipa MATa, saj se s promotorjem STE2pr izraža delujoči gen Sp_HIS5. Označevalca can1Δ in lyp1Δ v kaseti preprečujeta privzem kanavanina in tializina iz gojišča, zato predstavljata dodatno selekcijo za haploidne celice ob dodatku v selekcijsko gojišče (Tong in Boone, 2006). Za izolacijo le haploidnih celic paritvenega tipa a z genotipom MATa can1Δ::STE2pr-Sp_his5 lyp1Δ his3Δ smo uporabili selekcijsko gojišče, ki vsebuje vse aminokisline razen histidina, arginina in lizina, dodana pa sta mu kanavanin in tializin.
2.6.3 Princip iterativnega križanja
Povratno križanje je tehnika genetske manipulacije, pogosto uporabljena tudi pri kvasovkah.
Prek povratnega križanja lahko natančno kartiramo QTL ali z vpeljevanjem tujega genetskega materiala izboljšamo izražanje preučevane značilnosti organizma ali fenotipa.
Strategija povratnega križanja vključuje introgresijo, kar pomeni, da prenesemo genski material starša donorja, navadno z boljšim izražanjem preučevane značilnosti, v genomsko ozadje starša odjemalca. Genski material je lahko gen ali lokus, za katerega sklepamo, da je vpleten v izražanje preučevanega fenotipa. Z zaporednimi križanji, v katerih potomce izbiramo glede na izboljšan fenotip, in s povratnim križanjem s staršem odjemalcem, zmanjšujemo delež tistega genomskega materiala iz starša donorja, ki ni odgovoren za izboljšanje preučevanega fenotipa. Z izbiranjem potomcev z ugodnim fenotipom zagotovimo, da se v potomcih ohrani le tisti izvorni genetski material donorja, ki je neposredno povezan z izboljšanim izražanjem preučevanega fenotipa (Hospital, 2005).
Iterativno križanje sevov S. cerevisiae, ki smo ga uporabili v magistrski nalogi, je izpeljanka povratnega križanja. Najprej razvrstimo uporabljene seve glede na izražen fenotip in tako tudi določimo vrstni red križanja. Ta je lahko od najmanj do najbolj odpornega seva ali obratno. Po prvotnem križanju in izboru segregante z želenim fenotipom to potem križamo s sevom, ki sledi glede na prvotni vrstni red. Med segregantami druge generacije izberemo tisto, ki najbolje izraža želen fenotip in jo križamo s staršem, ki je naslednji na vrsti. Proces ponavljamo, dokler ne pridobimo segregante s ciljnim fenotipom. S tem pristopom želimo v genomu segregant v največji meri zadržati alele, ki jih nosijo odpornejši starši in ki so najverjetneje odgovorni za izboljšan fenotip, ki nas zanima.
2.7 POLIGENSKE LASTNOSTI S. cerevisiae IN NJIHOV INDUSTRIJSKI POTENCIAL
V industriji je vse več poudarka na dobri toleranci sevov S. cerevisiae na stres, saj se te med fermentacijami soočajo z različnimi neugodnimi pogoji. Večina tehnoloških procesov se sooča s podobnimi težavami, in sicer z velikimi nihanji temperature oziroma izvajanju fermentacij pri temperaturah, ki za seve niso idealne, z visokimi koncentracijami etanola, ki so lahko za celico toksične, in zmanjšanim fermentativnim vigorjem (Marullo in sod., 2004).
Zaradi omenjenih pogojev se velikokrat zgodi, da se v celici poruši redoks ravnovesje, začnejo se tvoriti povečane količine ROS, ki lahko vodijo tudi do apoptoze (Qiu in sod., 2019). Prav zato se danes daje vse več poudarka izboljševanju robustnosti industrijskih sevov kvasovk, predvsem na področjih toplotne tolerance, tolerance na etanol ter odpornost proti oksidativnemu stresu (Swinnen in sod., 2012a). Robustni sevi so bolj stroškovno učinkoviti (Qiu in sod., 2019). Tehnološko so poleg odpornosti na stres pomembne tudi druge lastnosti, med drugimi enakomerna razpršenost celic v fermentacijskem mediju, visoki izkoristki v bioprocesih in proizvodnja specifičnih aromatskih spojin za doseganje želenih organoleptičnih lastnosti končnega produkta (Perlstein in sod., 2006). Vse to so primeri poligenskih lastnosti pri S. cerevisiae, ki so relativno pogoste in jih lahko s pridom izboljšamo za uporabo v želenih tehnoloških procesih (Swinnen in sod., 2012a). Spodaj so omenjene nekatere poligenske lastnosti, ki so pomembne za industrijo.
2.7.1 Učinkovitost fermentacije
Veliko alelnih variant vpliva na splošno hitrost fermentacije v različnih industrijskih kontekstih. Ena izmed pomem bnejših industrijskih lastnostih fermentirajočih kvasovk je dolžina faze lag, ki je lahko kritična za uspešno inokulacijo nesterilnih fermentacijskih brozg, moštov in pivin. Genetske determinante lag faze so bile delno razjasnjene v vinskih fermentacijah z izvedbo kartiranja QTL med dvema vinskima sevoma (Zimmer in sod., 2014). Identificirali so glavni QTL, ki pojasni pomembne razlike v trajanju faze lag. Vzrok fenotipskega razlikovanja je nastanek vzajemne premestitve v genu SSU1, ki kodira črpalko za sulfit. Velika kromosomska preureditev je povečala ekspresijo SSU1 v starševskem sevu GN, kateri dosega hitri začetek fermentacije v sintetičnem grozdnem soku, ki vsebuje SO2
(Pérez-Ortín in sod., 2002). Pleiotropski učinki teh preureditev so bili dokazani z iskanjem QTL, ki vzajemno delujejo s pogoji okolja (Peltier in sod., 2018). Glede na naravo grozdnega soka in količino prostega SO2 v mediju lahko preureditve, povezane z SSU1, vplivajo na nastanek SO2, dolžino lag faze in hitrost fermentacije.
2.7.2 Toleranca na etanol
Etanol, ki se akumulira med fermentacijo, negativno vpliva na bolj občutljive seve S.
cerevisiae in preprečuje zaključek fermentacije. Upočasnjene fermentacije negativno
vplivajo na donos etanola in mikrobiološko stabilnost pijač zaradi prisotnosti sladkorjev, ki niso povreli. Številne QTN, ki vplivajo na toleranco etanola, so identificirali s pomočjo reverzne genetike. Etanol ima na celice S. cerevisiae toksičen učinek, zato lahko odporne seve odkrijemo z inkubacijo v selektivnem gojišču z etanolom, v katerem lahko zraste le del populacije. S povečevanjem koncentracije etanola v turbidostatu so identificirali vzročne SNP (ang. single nucleotide polymorphism) v dveh genih(Avrahami-Moyal in sod., 2012).
Selektivni pritisk, ki so ga v študiji uporabili – do 8-odstotni etanol – pa je prenizek za razmere, s katerimi se kvasovke soočajo v industriji. Zato so kartiranja QTL uporabili za preučevanje toleranc pri koncentracijah etanola, podobnim tistim v industriji – do 20 odstotkov. Identificirali so pozitivne alele, ki so jih izolirali iz sevov za proizvodnjo pijače sake in bioetanola (Swinnen in sod., 2012b; Duitama in sod., 2014).
2.7.3 Toleranca na nizke in visoke temperature
V industrijskih procesih se velikokrat uporabljajo temperature, ki predstavljajo meje rasti S.
cerevisiae. V pekarski industriji je S. cerevisiae izpostavljena ekstremnim pogojem zaradi zamrzovanja in odmrzovanja. V prvih kvantitativnih študijah tolerance takšnih pogojev so se osredotočali na fenotip rasti pri visokih temperaturah HTG (ang. high temperature growth), kjer so merili velikost kolonij po 48-urni inkubacjii pri 41 °C(Steinmetz in sod., 2002). Analiza pomembnega QTL je identificirala tri gene, ki so pojasnili kvantitativno fenotipsko porazdelitev lastnosti med dvema sevoma kvasovk. Identifikacija vzročnih QTN je bila izvedena kasneje prek mestnospecifične mutageneze (Sinha in sod., 2006). Veliko študij je preučevalo temperaturno toleranco prek ocenjevanja kapacitete rasti. V industrijskih fermentacijah so pogosto škodljivi učinki visoke temperature združeni še z drugimi stresnimi pogoji, vključno z visokimi koncentracijami etanola(Mitsumasu in sod., 2014), prisotnostjo toksinov(Taherzadeh in sod., 2000) in pomanjkanja sterolov ali dušika (Bely in sod., 1990;
Marullo in sod., 2009).
2.7.4 Organoleptične lastnosti
Pri uporabi S. cerevisiae v prehrambeni industriji učinkovitost fermentacije ni edina pomembna tehnološka lastnost. Sevi so izbrani predvsem glede na njihov vpliv na sestavo organoleptičnih spojin (Peltier in sod., 2019).
2.7.4.1 Hlapne žveplove spojine
Hlapne žveplove spojine pomembno doprinesejo k okusu marsikaterega živila. Za molekule je značilna senzorna zaznava že pri nizkih koncentracijah in tudi majhne razlike med sevi pomembno vplivajo na kvaliteto končnega produkta. Med alkoholno fermentacijo S.
cerevisiae sprošča različne razrede hlapnih žveplovih spojin, ki so lahko narejene de novo ali preurejene iz prekurzorskih molekul (Swiegers in Pretorius, 2007).
Za identifikacijo genetskih variant, ki bi lahko zmanjšale nastanek H2S, so s presejanjem populacije, v kateri so povzročili mutacije s pomočjo etil metansulfonata, našli več alelov genov CYS4, MET6, MET5 in MET10, ki so zmanjšali nastanek H2S (Linderholm in sod., 2006; Cordente in sod., 2009; Linderholm in sod., 2010). Pri analizi genske povezanosti so odkrili naravne genetske variacije v poti, ki vključuje gene MET, ki močno uravnavajo nastanek H2S med alkoholno fermentacijo (Huang in sod., 2014). Eden izmed alelov v teh genih je tudi dokazano pospešil sintezo SO2 (Noble in sod., 2015). Zmanjšana proizvodnja H2S je torej povezana z visoko proizvodnjo SO2. Z vpeljavo primerne alelne variante prek strategije povratnega križanja so Blondin in sodelavci (2014) pokazali, da lahko izberemo vinske seve S. cerevisiae, ki izdelujejo manjše količine SO2.
2.7.4.2 Izboljšava biosinteze terpenoidov
Terpenoidi so širok razred naravnih molekul, ki se lahko uporabljajo kot antibiotiki in druga zdravila, njihovo sintezo lahko dosežemo prek metabolnega inženiringa. Uporabljajo se tudi zaradi njihovih značilnih arom in vonjev (Ajikumar in sod., 2008). Terpenoide lahko sintetiziramo s preusmeritvijo sterolne poti, ki je bila prvič klasificirana v S. cerevisiae.
Naravne genetske variante v poteh ergosterola so bile identificirane za večanje produkcije geraniola in linalola prek mutante puščajoče FDP sintaze (Chambon in sod., 1991). Ta alel so prek introgresije s povratnim križanjem vključili v genetsko ozadje vinskih kvasovk.
Pridobljen sev je imel dobro produkcijo terpenov in prijeten profil arom. Spreminjanje sintezne poti sterolov je vplivalo na etanolno toleranco, zaradi česar se lahko sev le omejeno uporabi pri proizvodnji vina (Javelot in sod., 1991).
3 MATERIAL IN METODE
3.1 MATERIAL
Spodaj so navedeni vsi mikroorganizmi, kemikalije, gojišča in laboratorijska oprema, ki smo jih uporabili tekom raziskovalnega dela.
3.1.1 Mikroorganizmi
Preglednica 1: Uporabljeni sevi kvasovke Saccharomyces cerevisiae
Sev Opis Genotip Vir
Y7092 Sev za analizo SGA MATα can1Δ::STE2pr-his5 lyp1 ura3 leu2 his3 met 15
Tong in Boone, 2007
CEN.PK Laboratorijski sev MATa Δhis3 Nijkamp in sod., 2012
SAKE Sev, uporabljen za
izdelavo pijače sake
MATα Δhis3 Liti in sod., 2009 AWRI 16311 Vinski sev iz Avstralije MATα Δhis3 Borneman in sod.,
2008
3.1.2 Kemikalije
Preglednica 2: Uporabljene kemikalije s proizvajalci
Kemikalija Proizvajalec
3-odstotni H2O2 Sigma
Absolutni etanol Carlo Erba
Adenin Alfa Aesar
Agar Sigma
Agaroza Sigma
Alanin Sigma
Arginin Sigma
Asparagin Sigma
Aspartat Sigma
Cistein Sigma
CuSO4 × 5H2O Riedel de Haën
dH2O Merck Milipore
dNTP Thermo Fischer Scientific
Elektroforezni nanašalni pufer Thermo Fischer
Etidijev bromid Sigma
Fenilalanin Serva
Se nadaljuje
1 v besedilu naveden kot sev AWRI
Nadaljevanje Preglednice 2
Kemikalija Proizvajalec
Glicerol Carlo Erba
Glicin Serva
Glukoza Sigma
Glutamin Serva
Glutaminska kislina Sigma
Histidin Sigma
Izolevcin Sigma
Kalijev acetat Sigma
Kanavanin Sigma
Kvasni ekstrakt Sigma
Levcin Serva
Lizin Sigma
Metionin Acros organics
MQ Merck Milipore
Pepton Sigma
Prolin Merck
Pufer za polimerazo Taq Thermo Fischer Scientific
S-AEC Sigma
Serin Sigma
Standardna DNA lestvica Thermo Fischer Scientific
Tirozin Sigma
Treonin Serva
Triptofan Serva
Uracil Sigma
Valin Fluka
YNB Formedium
3.1.3 Gojišča
Preglednica 3: Uporabljena gojišča in njihova priprava Gojišče Oblika Priprava
YPD Tekoče 10 g kvasni ekstrakt, 20 g pepton, 20 g glukoza, do 1 L dH2O YP 2 % KAc Tekoče 10 g kvasni ekstrakt, 20 g pepton, do 900 mL dH2O. Avtoklaviramo,
dodamo 100 mL 20–odstotnega kalijevega acetata, steriliziranega s filtracijo.
SPO++ Tekoče 0,5 g kvasni ekstrakt, 3 g kalijev acetat, do 200 mL dH2O.
Avtoklaviramo, dodamo 1,25 mL 40 – odstotne glukoze sterilizirane s filtracijo, 20 mL 10x AA Stock.
Se nadaljuje
Nadaljevanje Preglednice 3
Gojišče Oblika Priprava
HS Tekoče 6,7 g YNB, 1,416 g HS Drop Out Mix, do 871 mL dH2O. Avtoklaviramo, dodamo 50 mL 40 – odstotne glukoze sterilizirane s filtracijo, 41 mL leu (10 g/L), 24 mL ura (3,33 g/L), 8 mL met (10 g/L), 3 mL kanavanina (20 mg/mL) in 0,6 mL tializina (20 mg/mL)
HS + CuSO4 × 5H2O
Tekoče 6,7 g YNB, 1,416 g HS Drop Out Mix, do (871 – x) mL dH2O.
Avtoklaviramo, dodamo 50 mL 40 – odstotne glukoze sterilizirane s filtracijo, 41 mL leu (10 g/L), 24 mL ura (3,33 g/L), 8 mL met (10 g/L), 3 mL kanavanina (20 mg/mL), 0,6 mL tializina (20 mg/mL) in x mL CuSO4
× 5H2O (0,5 M). X je odvisen od želene končne koncentracije.
YPD Trdno 10 g kvasni ekstrakt, 20 g pepton, 20 g glukoza, 20 g agar, do 1 L dH2O YPD + H2O2 Trdno 10 g kvasni ekstrakt, 20 g pepton, 20 g glukoza, 20 g agar, do (1-x) L
dH2O, avtoklaviramo, dodamo x mL 30 – odstotnega H2O2. X je odvisen od želene končne koncentracije.
YPD + CuSO4 × 5H2O
Trdno 10 g kvasni ekstrakt, 20 g pepton, 20 g glukoza, 20 g agar, do (1-x) L dH2O, avtoklaviramo, dodamo x mL CuSO4 × 5H2O (0,5 M). X je odvisen od želene končne koncentracije.
HS Trdno 6,7 g YNB, 1,416 g HS Drop Out Mix, do 271 mL dH2O. Posebej 20 g agar, do 600 mL dH2O. Avtoklaviramo, v HS mešanico dodamo 50 mL 40 – odstotne glukoze sterilizirane s filtracijo, 41 mL leu (10 g/L), 24 mL ura (3,33 g/L), 8 mL met (10 g/L), 3 mL kanavanina (20 mg/mL) in 0,6 mL tializina (20 mg/mL). Oba dela zmešamo, razlijemo.
HS + CuSO4 × 5H2O
Trdno 6,7 g YNB, 1,416 g HS Drop Out Mix, do (271-x) mL dH2O. Posebej 20 g agar, do 600 mL dH2O. Avtoklaviramo, v HS mešanico dodamo 50 mL 40 – odstotne glukoze sterilizirane s filtracijo, 41 mL leu (10 g/L), 24 mL ura (3,33 g/L), 8 mL met (10 g/L), 3 mL kanavanina (20 mg/mL) in 0,6 mL tializina (20 mg/mL). Dodamo x mL CuSO4 × 5H2O (0,5 M). X je odvisen od želene končne koncentracije. Oba dela zmešamo, razlijemo.
3.1.4 Raztopine
Preglednica 4: Uporabljene raztopine in njihova priprava
Raztopina Priprava
10 × AA Stock 40 mg adenin hemisulfat, 40 mg uracil, 40 mg tirozin, 20 mg histidin, 20 mg levcin, 20 mg lizin, 20 mg triptofan, 20 mg metionin, 20 mg arginin, 100 mg fenilalanin, 250 mg treonin, do 100 mL dH2O, avtoklaviramo.
30 – odstotni glicerol 30 g glicerol, do 100 mL dH2O
70 – odstotni etanol 70 mL absolutni etanol, do 100 mL dH2O 40 – odstotna glukoza 40 g glukoza, do 100 mL dH2O
Se nadaljuje
Nadaljevanje Preglednice 4
Raztopina Priprava
HS Drop Out Mix 3 g adenin, 2 g alanin, 2 g asparagin, 2 g aspartat, 2 g cistein, 2 g glutamin, 2 g glutaminska kislina, 2 g glicin, 2 g inozitol, 2 g valin, 2 g izolevcin, 2 g fenilalanin, 2 g serin, 2 g prolin, 2 g treonin, 2 g triptofan, 2g tirozin.
5 × TBE pufer 54 g Tris, 27,5 g borova kislina, 20 mL 0,5 M EDTA, do 1 L MQ.
Litikaza (2000 U/mL) 1 mg litikaze, do 1 mL MQ
Tializin (20 mg/mL) 20 mg tializina, do 1 mL MQ
Kanavanin (20 mg/mL) 20 mg kanavanina, do 1 mL MQ
Levcin (10 g/l) 100 mg levcin, do 10 mL MQ
Metionin (10 g/l) 100 mg metionin, do 10 mL MQ
Uracil (3,33 g/l) 33,3 mg uracil, do 10 mL MQ
0,5 M CuSO4 12,48 g CuSO4 x 5H2O, do 100 mL MQ
Fiziološka raztopina 9 g NaCl, do 100 mL MQ
3.1.5 Začetni oligonukleotidi
Preglednica 5: Uporabljeni začetni oligonukleotidi
Oznaka Zaporedje
MAT_R AGTCACATCAAGATCGTTTATGG
MATalfa_F GCACGGAATATGGGACTACTTCG
MATa_F ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG
3.1.6 Encimi
Preglednica 6: Uporabljeni encimi s proizvajalci
Encim Proizvajalec
Polimeraza Taq Thermo Scientific
Litikaza Sigma
3.1.7 Laboratorijska oprema in aparature
Preglednica 7: Uporabljena laboratorijska oprema in aparature
Oprema Proizvajalec
Analizna tehtnica MC 210 P Sartorius
Avtoklav Kambič
Avtomatske pipete Eppendorf, Gilson
Se nadaljuje
