BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Tadej PUSTOVRH
VSEBNOST LIPOFILNIH ANTIOKSIDANTOV V NEKATERIH TRAVNIŠKIH RASTLINAH
DIPLOMSKO DELO
Visokošolski strokovni študij – 1. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Tadej PUSTOVRH
VSEBNOST LIPOFILNIH ANTIOKSIDANTOV V NEKATERIH TRAVNIŠKIH RASTLINAH
DIPLOMSKO DELO
Visokošolski strokovni študij – 1. stopnja
CONTENT OF LIPOPHILIC ANTIOXIDANTS IN SELECTED GRASSLAND PLANTS
B. SC. THESIS
Professional Study Programmes
Ljubljana, 2021
Diplomsko delo je zaključek Visokošolskega strokovnega študija Kmetijstvo – agronomija in hortikultura – 1. stopnja. Delo je bilo opravljeno na Katedri za aplikativno botaniko, ekologijo, fiziologijo rastlin in informatiko.
Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorico diplomskega dela imenovala doc. dr. Heleno Šircelj.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: doc. dr. Zalika ČREPINŠEK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Helena ŠIRCELJ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Jure ČOP
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum zagovora:
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Dv1
DK UDK 635.924:547.9(043.2)
KG antioksidanti, karotenoidi, tokoferoli, klorofili, užitne divje rastline, užitne travniške rastline
AV PUSTOVRH, Tadej
SA ŠIRCELJ, Helena (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Visokošolski strokovni študijski program prve stopnje Kmetijstvo – agronomija in hortikultura
LI 2021
IN VSEBNOST LIPOFILNIH ANTIOKSIDANTOV V NEKATERIH TRAVNIŠKIH RASTLINAH
TD Diplomsko delo (Visokošolski strokovni študij – 1. stopnja) OP IX, 43 str., 11 pregl., 18 sl., 62 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V raziskavi smo določili vsebnost bioaktivnih snovi v sedmih različnih vrstah samoniklih travniških rastlin: navadni rman (Achillea millefolium L.), navadna česnovka (Alliaria petiolata Cav. & Grande), mehki osat (Cirsium oleraceum (L.) Scop.), navadni jajčar (Leontodon hispidus L.), veliki trpotec (Plantago major L.), navadna črnoglavka (Prunella vulgaris L.) in dišeča vijolica (Viola odorata L.).
Rastlinski material smo nabrali v spomladanskem času, v enakih vremenskih razmerah, v razvojni fazi, v kateri te rastline nabirajo za prehrano. Izmerili smo vsebnost klorofilov a in b, tokoferolov in in karotenoidov: -karoten, - karoten, lutein, neoksantin, violaksantin, anteraksantin in zeaksantin. Vzorce smo analizirali s pomočjo visokoločljivostne tekočinske kromatografije (HPLC).
Največjo povprečno vrednost skupnega klorofila in največjo povprečno vrednost karotenoidov smo izmerili v navadni česnovki, največjo povprečno vrednost skupnih tokoferolov pa v velikem trpotcu. Za boljšo predstavo o vsebnosti bioaktivnih snovi v preučevanih rastlinah smo primerjali naše rezultate z literaturnimi podatki za te rastline in za zelenjavo, ki jo uživamo na enak način (mladi listi).
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Dv1
DC UDC 635.924:547.9(043.2)
CX Antioxidants, carotenoids, tocopherols, chlorophylls, edible wild plants, edible grassland plant species
AU PUSTOVRH, Tadej
AA ŠIRCELJ, Helena (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Professional Study Programme in Agriculture - Agronomy and Horticulture
PY 2021
TI CONTENT OF LIPOPHILIC ANTIOXIDANTS IN SELECTED GRASSLAND PLANTS
DT B. Sc. Thesis (Professional Study Programmes) NO IX, 43 p., 11 tab., 18 fig., 62 ref.
LA sl AL sl/en
AB The aim of this study was to determine lipophilic antioxidants content in seven grassland plant species: Yarrow (Achillea millefolium L.), garlic mustard (Alliaria petiolata Cav. & Grande), cabbage thistle (Cirsium oleraceum (L.) Scop.), rough hawkbit (Leontodon hispidus L.), broadleaf plantain (Plantago major L.), common selfheal (Prunella vulgaris L.) and sweet violet (Viola odorata L.). Plant material was all harvested in spring, at same weather conditions, at developmental stage that is prefered from forager and consumer's standpoint. Chlorophyll a and b, tocopherols ( and and carotenoids: lutein, neoxanthin, violaxanthin, antheraxanthin and zeaxanthin contents, were determined quantitatively. Analysis was conducted with a high performance liquid chromatography (HPLC) method.
The highest average value of total chlorophyll and carotenoid contents was measured in garlic mustard, the highest average value of total tocopherol was measured in broadleaf plantain. To get a better perception of the bioactive compounds amount in studied plants, we compared results from our study to the ones from the literature for the same plant species and for other species that are being consumed in the same way as those from our study (leafy greens).
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III KEY WORDS DOCUMENTATION IV KAZALO VSEBINE V KAZALO SLIK VII KAZALO PREGLEDNIC VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI IX
1 UVOD ...1
1.1 NAMEN RAZISKAVE... ....1
1.2 DELOVNA HIPOTEZA... 1
2 PREGLED OBJAV...2
2.1 POMEN SAMONIKLIH RASTLIN... 2
2.2 UŽITNE TRAVNIŠKE RASTLINE...3
2.2.1 Pregled uporabe travniških rastlin v prehrani ...3
2.2.2 Navadna česnovka (Alliaria petiolata Cav. & Grande) ...4
2.2.3 Navadni jajčar, otavčič (Leontodon hispidus L.) ...6
2.2.4 Mehki osat (Cirsium oleraceum (L.) Scop.) ...7
2.2.5 Veliki trpotec (Plantago major L.) ...8
2.2.6 Dišeča vijolica (Viola odorata L.) ...9
2.2.7 Navadni rman (Achillea millefolium L.) ... 10
2.2.8 Navadna črnoglavka (Prunella vulgaris L.) ... 12
2.3 BIOAKTIVNE SNOVI... 13
2.3.1 Klorofili ... 13
2.3.2 Karotenoidi ... 14
2.3.3 Tokoferoli ... 16
3 MATERIAL IN METODE DELA ... 19
3.1 MATERIAL... 19
3.2 METODE DELA... 19
3.2.1 Nabiranje rastlinskega materiala ... 19
3.2.2 Shranjevanje vzorcev ... 20
3.2.3 Priprava vzorcev na analizo ... 21
3.2.4 Analiza bioaktivnih snovi ... 21
3.2.5 Obdelava rezultatov ... 23
4 REZULTATI... 24
4.1 VSEBNOST VODE V RASTLINAH... 24
4.2 PADAVINE...24
4.3 KLOROFIL... 25
4.4 KAROTENOIDI...27
4.5 TOKOFEROLI... 29
5 RAZPRAVA ... 31
5.1 VSEBNOST VODE V VZORCIH...31
5.2 PIGMENTI 32 5.2.1 Klorofili ... 32
5.2.2 Karotenoidi ... 33
5.3 TOKOFEROLI... 34
6 SKLEPI ... 37
7 POVZETEK ... 38
8 VIRI ... 39
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Navadna česnovka... 5
Slika 2: Navadni jajčar, otavčič ... 6
Slika 3: Mehki osat ... 7
Slika 4: Veliki trpotec ... 9
Slika 5: Dišeča vijolica... 10
Slika 6: Navadni rman ... 11
Slika 7: Navadna črnoglavka ... 12
Slika 8: Strukturni prikaz molekul klorofila a (levo) in klorofila b (desno) (Chen in Blankenship, 2011)... 13
Slika 9: Strukturni prikaz molekul karotenoidov: -karoten (A), zeaksantin (B), - karoten (C), anteraksantin (D), lutein (E), violaksantin (F), neoksantin (G) (Chen in Croft, 2018) ... 16
Slika 10: Strukturni formuli -tokoferola (A) in -tokoferola (B) (Brody, 1999) ... 17
Slika 11: Nabiranje vzorcev v pvc vrečke in shranjevanje v hladilno torbo. Vsaka vrečka je predstavljala en vzorec ... 20
Slika 12: Mletje liofiliziranega rastlinskega materiala v vodno hlajenem mlinčku ... 20
Slika 13: a – Tehtanje vzorcev, b – shranjevanje zmletega liofiliziranega materiala v prahovke, c – odmerjanje količine vzorca za ekstrakcijo, d – homogeniziranje suspenzije vzorca in ohlajenega acetona pri visokih vrtljajih, e – homogeniziran vzorec po usedanju trdnih delcev, pripravljen za odvzem supernatanta ... 21
Slika 14: Priprava vzorcev za HPLC analizo. a – viala, polnjena z vzorcem, b – 40 vzorcev na držalu za viale, c – naprava HPLC za analizo plastidnih pigmentov ... 22
Slika 15: Pregled količine padavin pred nabiranjem vzorcev (ARSO, 2021) ... 24
Slika 16: Kromatogram pigmentov pri navadnem jajčarju. 1 – neoksantin, 2 – violaksantin, 3 – anteraksantin, 4 – lutein, 5 – klorofil b, 6 klorofil a, 7 – - karoten ... 25
Slika 17: Povprečna vsebnost lipofilnih antioksidantov v preučevanih vzorcih ... 27
Slika 18: Kromatogram tokoferolov in pri navadnem jajčarju. 1 – -tokoferol, 2 – -tokoferol ... 29
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Uporabni organi travniških rastlin in njihov način uporabe v prehrani (viri: Sanchez-Mata in Tardio, 2016 [1]; Grlić, 1992 [2]; Černe, 1992 [3]) ... 3 Preglednica 2: Vsebnost skupnega klorofila v nekaterih travniških in gojenih
rastlinah v mg/100 g SV ... 14 Preglednica 3: Vsebnosti karotenoidov v nekaterih travniških in gojenih rastlinah v
mg/100 g SV (vira: 1 - Šircelj in sod., 2018, 2 – Šircelj, 2013) ... 15 Preglednica 4: Vsebnost tokoferolov in ter skupnih tokoferolov v nekaterih
travniških rastlinah in gojenih kulturnih rastlinah (solata in špinača).
Podatki so podani v mg/100 g SV ... 18 Preglednica 5: Vsebnost vode v nabranem rastlinskem materialu ... 24 Preglednica 6: Vsebnost klorofila a in b v vzorcih v mg/100 g SV ter njuno
razmerje ... 26 Preglednica 7: Vsebnost karotenoidov v vzorcih izbranih rastlin v mg/100 g SV ... 28 Preglednica 8: Delež ksantofilov in beta karotena glede na skupno vsebnost
karotenoidov (v %) ... 28 Preglednica 9: Vsebnost tokoferolov v vzorcih izbranih rastlin v mg/100 g SV ... 30 Preglednica 10: Potrebe po sveži listnati zelenjavi za zadostitev dnevnih potreb
odrasle osebe (19 - 65 let) po vitaminu A ... 34 Preglednica 11: Potrebe po sveži listnati zelenjavi za zadostitev dnevnih potreb
odrasle osebe po vitaminu E ... 35
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI SV Sveža masa
SM Suha masa
HPLC Visokoločljivostna tekočinska kromatografija
1 UVOD
Samonikle rastline so bile glavni vir hrane ljudem v preteklosti, ko so se preživljali še z nabiralništvom in lovom. Ko se je človek trajno naselil in začel načrtno gojiti (danes kulturne) rastline, je nabiralništvo sčasoma postopno opustil. Danes ponovno pridobiva na popularnosti, k čemur je pripomoglo enostavnejše širjenje informacij, nov način življenja, pa tudi tehnološki razvoj, saj lahko danes ugotovimo natančno kemično sestavo rastlin, ki je pri samoniklih rastlinah pogosto bogatejša kot pri gojenih kulturnih rastlinah, kar jih dela še posebej zanimive. Danes tako znanost samoniklim rastlinam ponovno odpira vrata in nam koristno popestri vsakdanji jedilnik, ki z intenziviranjem proizvodnje hrane s stališča bioaktivnih snovi lahko izgublja prehransko vrednost. Med užitnimi samoniklimi rastlinami, ki jih navaja različna bolj ali manj strokovna nabiralniška literatura, je tudi veliko travniških rastlin. Uporaba travniških rastlin za prehrano je ponavadi s stališča onesnaženosti s pesticidi bolj varna kot uporaba njivskih plevelov. Enciklopedija samoniklih užitnih rastlin (Grlić, 1992), ki je eden od najbolj strokovnih virov na področju nabiralništva pri nas, med drugim kot užitne navaja tudi naslednje travniške rastline:
navadni regrat (Taraxacum officinale L.), ozkolistni trpotec (Plantago lanceolata L.), navadna marjetica (Bellis perennis L.), navadna kislica (Rumex acetosa L.), perzijski jetičnik (Veronica persica L.), navadna česnovka (Alliaria petiolata Cav. & Grande), navadni otavčič (Leontodon hispidus L.), mehki osat (Cirsium oleraceum (L.) Scop.), navadni rman (Achillea millefolium L.) in veliki trpotec (Plantago major L.). Nekatere med njimi so bile v zadnjih letih že predmet podrobnejših biokemičnih raziskav, še veliko pa je takih, ki nanje še čakajo.
1.1 NAMEN RAZISKAVE
V raziskavi nas je zanimala vsebnost bioaktivnih snovi v sedmih različnih samoniklih vrstah travniških rastlin: navadni rman, navadna česnovka, mehki osat, navadni jajčar, veliki trpotec, navadna črnoglavka in dišeča vijolica. Cilj je bil ugotoviti vsebnost lipofilnih bioaktivnih snovi – klorofilov (a in b), karotenoidov (lutein, neoksantin, violaksantin, anteraksantin, zeaksantin, -in-karoten) in tokoferolov ( in – v preučevanih rastlinah.
1.2 DELOVNA HIPOTEZA
V naši raziskavi smo postavili hipotezo:
vsebnosti bioaktivnih snovi v listih oz. mladih poganjkih z listi se bodo razlikovale med vrstami
2 PREGLED OBJAV
2.1 POMEN SAMONIKLIH RASTLIN
Številne divjerastoče oz. samonikle rastline so bogate z vitamini, drugimi bioaktivnimi snovmi in hranili, kar jih zlasti danes dela zanimive. Že globoko v zgodovini so naši daljni predniki poznali te rastline in njihovo uporabo vpeli v svojo tradicijo. Bile so vir hrane in (zavedajoč se ali ne) tudi vir pomembnih bioaktivnih snovi, ki so dobro vplivale na njihovo počutje in zdravje. V zgodovini so bile samonikle rastline pogosto del preživetja, danes pa so v razvitih predelih sveta vse bolj znane kot promotorji zdravja (Ghanam in sod., 2015).
V mestih je življenjski tempo hiter in pogosto zdravju ni najbolj naklonjen. Prebivalci mest pa se v zadnjem času vse bolj zavedajo, da pot do zdravja in dobrega počutja sestavlja tudi zdrav življenjski slog – rekreacija in zdrava prehrana sta tako ključni. Vse bolj se uveljavlja tako imenovana zdrava hrana, v zadnjem času se vse bolj uveljavlja ekološko pridelana hrana, pa tudi sezonske samonikle rastline. Te postajajo vse pomembnejše na področju uživanja bioaktivnih snovi in življenja v sožitju z naravo, s katero so prebivalci mest izgubili stik (Dogan, 2016).
Prehranske navade in s tem sestava dnevnih obrokov se spreminja in tudi na Balkanskem polotoku obsega vse več sezonskih divjih rastlin (Dogan, 2016). Zdi se, da so ljudje ponovno odkrili vrednost užitnih samoniklih rastlin, tako kot so prepoznali uporabnost zdravilnih samoniklih rastlin v medicinske namene. V razvitih mestih se jih pogosto uživa zaradi bogate biokemične sestave, v deželah, kjer vlada pomanjkanje, pa se jih nabira za preživetje (Sánchez-Mata in Tardío, 2016).
Užitne divje rastline lahko pomembno vplivajo na zdravje in počutje, uporabne pa so tudi pri običajnem prehranjevanju. Med drugim vsebujejo vitamine, ki jih človek sam ni sposoben sintetizirati. Zaradi vse večje prepoznavnosti koristnih bioaktivnih snovi jih vse pogosteje uporabljamo v kulinariki. Tudi aroma samoniklih rastlin je pogosto bistveno močnejša od gojenih rastlin, zato imajo v prestižnih restavracijah velikokrat prednost.
Pogosto so to nosilci Michelinovih zvezdic in turistične kmetije s tradicijo (Dogan, 2016;
Łuczaj in sod., 2012).
V ljudskem nabiralništvu se še danes nabirajo številne užitne samonikle vrste, mnoge med njimi se tudi širše tržijo, npr. navadni regrat (Taraxacum officinale L.), ozkolistni beluš (Asparagus acutifolius L.), borovnica (Vaccinium myrtillus L) (Sanchez-Mata in Tardio, 2016). Za Slovenijo Černe (1992) navaja 84 divjih rastlin, ki so se uporabljale kot zelenjava. Na tem spisku so med drugimi tudi tiste rastline, ki jih bomo analizirali v diplomski nalogi, z izjemo navadne črnoglavke in dišeče vijolice, ki na seznamu nista omenjeni.
2.2 UŽITNE TRAVNIŠKE RASTLINE
2.2.1 Pregled uporabe travniških rastlin v prehrani
Različne organe rastlin uporabljamo na različne načine. Najbolj pogoste načine uporabe užitnih organov nekaterih travniških rastlin v kulinariki smo zbrali v preglednici 1. Listi in zeleni poganjki, ki so nas zanimali v raziskavi, se uporabljajo sveži v omakah, juhah, kot priloga jedem, suhi pa za čaje, začimbe, pripravo pijač.
Preglednica 1: Uporabni organi travniških rastlin in njihov način uporabe v prehrani (viri: Sanchez-Mata in Tardio, 2016 [1]; Grlić, 1992 [2]; Černe, 1992 [3])
Rastlinska vrsta Uporabni del Način uporabe Vir
Galinsoga
parviflora mladi sveži listi solata, juhe, priloge [3]
Achillea
millefolium mladi sveži listi juhe, solate, omake, začimba
[1], [2], [3]
suhi listi in cvetovi čaj [2]
Alliaria petiolata mladi sveži listi in
vršički začimba, zamenjava česna, dodatek solatam [2]
mladi sveži listi začimba, dodatek pijačam [1]
posušeni listi čaj [2]
Rumex acetosa. mladi sveži listi juhe, priloge, začimba [3]
Rumex obtusifolius mladi sveži listi juhe, priloge [3]
Cirsium oleraceum mladi sveži listi dodatek enolončnicam [2], [3]
mlada stebla dodatek juham [1]
Geum urbanum mladi listi, korenika solata, juhe, priloge [3]
Leontodon
hispidus kuhani listi prizemne
rozete dodajanje enolončnicam, priloge [1], [2],
[3]
Plantago major mladi listi juhe, priloge [2], [3]
kuhani listi solate [2]
Oenothera biennis mladi listi, steblo,
korenika solata, juhe, priloge [3]
Filipendula
vulgaris mladi sveži listi,
korenika solata, juhe, priloge, dodatek pijačam,
začimba [3]
Prunella vulgaris mladi sveži listi zelenjava [2]
mladi kuhani listi špinača, solate, juhe [2]
Viola odorata cvetovi aromatiziranje sadnih solat, pudingov,
sladoledov [2]
cvetovi, listi, korenina čaj [1], [2]
Taraxacum
officinale solata, juhe, priloge solata, juhe, priloge [3]
Bellis perennis mladi sveži listi solate [3]
Iz preglednice 1 lahko razberemo, da se za prehrano ljudi največ uporabljajo sveži mladi ali posušeni listi in mladi poganjki rastlin. V manjšem obsegu se uporabljajo tudi podzemni deli rastlin in cvetovi. Bergant (2019) je v okviru svoje diplomske naloge o uporabi samoniklih rastlin na slovenskih kmetijah ugotovila, da ljudje največ nabirajo in uporabljajo čemaž (Allium ursinum L.), navadni regrat, veliko koprivo (Urtica dioica L.), navadni rman, pravo kamilico (Matricaria recutita L.), nekoliko manj pa ozkolistni trpotec in njivsko preslico (Equisetum arvense L.). Na slovenskih kmetijah se listi velike koprive, navadnega regrata, čemaža in navadnega rmana uporabljajo kot prevretek ali posušeni za čaj, cvetove prave kamilice uporabljajo za čaj, liste ozkolistnega trpotca in zelene poganjke njivske preslice pa za pripravo zdravil (Bergant, 2019).
2.2.2 Navadna česnovka (Alliaria petiolata Cav. & Grande)
Je dvoletna rastlina iz družine križnic (Brassicaceae). Fenotipsko se v drugem letu (slika 1) razlikuje od prvega. Ima do 1 m visoko steblo, ki je pokončno. Iz stebla izraščajo listi, ki so v zgornjem delu stebla kratkopecljati, spodaj pa dolgopecljati. So trikotne oblike in goli.
Ima grozdasto socvetje. Plodovi so luski, ki so do 7 cm dolgi. Raste na tleh, ki so bogata z dušikom, pogosto na robovih gozdov ali grmičevja (Martinčič in sod., 2010).
Za prehrano ljudi nabiramo mlade liste česnovke, ki imajo vonj in okus po česnu, ki ga zato lahko v kulinariki nadomestimo s česnovko. Liste česnovke uživajo surove ali kuhane.V Angliji in Franciji so liste navadne česnovke nekoč nabirali kot solato ali pa kot dodatek omakam, siru in krompirju. Japonci uporabljajo celotni nadzemni del rastline. Med daljšim kuhanjem izgubi svoj značilen vonj po česnu (Grlić, 1992). Jeseni in spomladi lahko izkopljemo korenine, ki so močna začimba za pečenke. Po okusu naj bi bile podobne hrenu (Fleischhauer in sod., 2007).
Navadna česnovka v listih vsebuje 150–200 mg vitamina C/100 g SV (sveže mase). V semenih vsebuje do 30 % olja, a se ga ne izkorišča (Grlić, 1992; Černe, 1992). Čaj iz listov naj bi čistil kri, čaj iz cvetoče rastline pa se uporablja za izkašljevanje, odvajanje glist in kot antiseptik. Obkladek iz česnovke naj bi pomagal pri celjenju ran (Blažević in Mastelić, 2008). V ljudskem zdravilstvu naj bi se listi in poganjki uporabljali proti črevesnim zajedavcem in uničevali bakterije, gnojne rane pa naj bi se povile s kašastim pripravkom, enako tudi pri pikih žuželk (Fleischhauer in sod., 2007).
Ker vsebuje eruka kislino, ki v kombinaciji še z dvema mononenasičenima maščobnima kislinama (nervonska in eikozenojska) povzroča kongestivno srčno popuščanje, nekateri viri ne priporočajo prepogostega uživanja te rastline. Občasno uživanje listov in mladih poganjkov naj ne bi bilo škodljivo, saj eruka kislina predstavlja samo 31 % vseh maščobnih kislin v njih, že sam delež teh pa je zelo majhen (Sanchez-Mata in Tardio, 2016).
Slika 1: Navadna česnovka
2.2.3 Navadni jajčar, otavčič (Leontodon hispidus L.)
Navadni otavčič, tudi navadni jajčar (slika 2), sodi med nebinovke (družina Asteraceae, poddružina Cichorioidae). Je 10–40 cm visoka rastlina. Vsebuje mleček. Vrsta je zelo raznolika in jo delijo na več podvrst, ki jih je pogosto težko razločiti. Listi so ponavadi podolgovati, spodnji listi tvorijo rozeto. So goli ali dlakavi, z gladkim ali nazobčanim listnim robom, lahko tudi globoko pernato deljenim. Iz rozete poganja eno ali več cvetnih stebel, ki nosijo socvetni košek. Listi prizemne rozete se uživajo do cvetenja. Uspeva na travnikih od nižin do subalpinskega pasu, v skalovju in svetlejših gozdovih, na vlažnih, hranljivih, apnenčastih in peščenih tleh. Rod Leontodon je po Evropi zelo razširjen (Grlić, 1992; Martinčič in sod., 2010).
Nabirajo se mladi listi, ki so mehkejši od regratovih. Uporablja se ga v solatah tako kot navadni regrat. Mlade liste se dodaja enolončnicam (Grlić, 1992).
Zidorn in Stuppner (2001) sta v listih navadnega jajčarja določila prisotnost flavonoidov (2,98 mg/g SM (suhe mase) luteolina), fenolnih kislin (klorogenična kislina 3,52 mg/g SM) in seskviterpenov (0,18–0,26 mg/g SM). Flavonoidi (nepravi vitamin P) in fenolne kisline ugodno vplivajo na človekovo zdravje. Ebrahimzadeh in sod. (2010) so odkrili močno antioksidativno in antihemolitično aktivnost v hidroalkoholnem ekstraktu navadnega jajčarja. Sposobnost vezave prostih kisikovih radikalov naj bi bila posledica velike vsebnosti fenolnih spojin in flavonoidov. Podatkov o vsebnosti vitaminov A, C in E v literaturi nismo zasledili.
Navadni jajčar vsebuje nekatere seskviterpenske laktone, ki so za družino Asteraceae sicer precej značilni. Imajo več škodljivih učinkov in delujejo antinutritivno. Zidorn in sod.
(1999) so te snovi preizkušali kot novo antitumorno citotoksično sredstvo in ugotovili, da res deluje antitumorno, vendar je učinek odvisen od količine.
Slika 2: Navadni jajčar, otavčič
2.2.4 Mehki osat (Cirsium oleraceum (L.) Scop.)
Mehki osat (slika 3) sodi med radičevke (družina Asteraceae, poddružina Cichorioidae).
Rastlina zraste do 1,5 m visoko. Steblo je ponavadi nerazvejano. Tvori pokončne koške (premer do 4 cm) s cvetovi rumenkaste barve. Listi so goli ali raztresenodlakavi. Spodnji listi so večinoma pernato deljeni, zgornji pa celi in nazobčani. Ovršni listi so rumenkastozeleni. Navadno cveti od junija do septembra, raste na vlažnih rastiščih ob rekah in potokih (Martinčič in sod., 2010).
Užitni so mladi listi, ki imajo okus po ohrovtu, Grlić (1992) pa navaja njihovo uporabo v enolončnicah. Starejši listi vsebujejo večje količine alkaloidov in saponinov, zaradi česar so neužitni (Grlić, 1992; Petauer, 1993).
V mehkem osatu so že analizirali flavonoide, fenolne kisline, tanine, sterole in triterpene (Nazaruk, 2008). Tudi čreslovine in eterično olje zasledimo v mehkem osatu, zlasti pa je zanimiv zaradi polisaharida inulina (polimer fruktoze) v koreninah. Te izkopavamo prvo leto od septembra do zime, uporabne pa so posušene in zmlete kot dodatek žitni moki (Fleischhauer in sod., 2007). Podatkov o vsebnosti vitaminov A, C in E nismo zasledili.
Borawska in sod. (2010) navajajo uporabo vodnih ekstraktov listov ali cvetov mehkega osata v ljudski medicini kot razkužilo na koži. Deluje na bakterije Bacillus subtilis in Staphylococcus aureus. Te so povzročitelj bolezenskih stanj, kot sta pljučnica in meningitis (Kluytmans in sod., 1997).
Slika 3: Mehki osat
2.2.5 Veliki trpotec (Plantago major L.)
Veliki trpotec (slika 4) je dvoletna rastlina in sodi v družino trpotčevk (Plantaginaceae).
Njegovo steblo je plitvo brazdasto, listi so širokojajčasti, celorobi. Vsi listi so v pritlični rozeti. Imajo 3 do 9 listnih žil. Njegovo socvetje je klas, cveti pa od julija do jeseni.
Uspeva na travnikih, pašnikih in stezah, po katerih se ne hodi veliko (Martinčič in sod., 2010).
Za uporabo nabiramo mlade liste pred razvojem cvetnega stebla od marca do junija (Grlić, 1992). V literaturi smo zasledili uporabo v kulinariki in tradicionalni medicini. V kulinariki se ga uporablja kot dodatek juham ali pa se ga meša z drugo listno zelenjavo. Pred uporabo je dobro odstraniti žilava vlakna (Grlić, 1992). V semenih je do 22 % olja, ki se lahko stiska med avgustom in oktobrom, seme pa je zelo primerna krma za ptice v kletkah (Petauer, 1993).
Adom in sod. (2017) so v velikem trpotcu določili flavonoide (luteolin, apigenin), alkaloide (plantagonin), terpenoide, derivate kofeinske kisline (plantamajozid in akteosid), glikozide, maščobne kisline in polisaharide. V svežih listih vsebuje še čreslovine, citronsko kislino, provitamin A (9–17 mg/100 g SV), vitamin C (35–45 mg/100 g SV), vitamin K in 460 mg/100 g SV kalija (Petauer, 1993). Zaradi antinutritivnih lastnosti alkaloidov ni priporočljivo nabiranje starejših listov (Grlić, 1992).
V tradicionalni medicini se uporabljajo ekstrakti trpotca, ki delujejo anestetično, antiviralno, protivnetno, antihistaminično, pomembno naj bi bilo zlasti delovanje proti tumorjem (Kobeasy in sod., 2011). V podrobni raziskavi protitumornega delovanja so ugotovili visoko učinkovitost inhibicije nastajanja rakavih celic z etanolnim ekstraktom iz listov velikega trpotca (74 % pri koncentraciji ekstrakta 100 µg/ml) in nekoliko manjšo pri ekstrakciji z vročo vodo (48,7 % pri koncentraciji ekstrakta 100 µg/ml). Tudi ekstrakti iz semen so pri enakih koncentracijah dosegali visok odstotek inhibicije rakavih celic (34,7 % in 31,6 %) (Kobeasy in sod., 2011). Zubair in sod. (2019) so raziskali protivnetni učinek listov velikega trpotca in njegov učinek na celjenje ran. Protivnetno delovanje lahko vpliva na hitrejše celjenje ran, hkrati pa vzpodbuja deljenje celic v tkivu. Med učinkovinami so polifenolne spojine, glavna med njimi hidroksicinaminska kislina. Amini in sod. (2011) so ugotovili hitrejše celjenje opeklin z uporabo ekstrakta iz suhih semen velikega trpotca pri podganah. 10 g prahu suhih semen so ekstrahirali s 500 ml destilirane vode, nato pa pripravek po Banmaryjevi metodi koncentrirali do volumna 20 ml ter ga zmešali z 20 ml Eucerin želatine. Tako koncentriran pripravek naj bi bil ustrezna zamenjava za antibiotik srebrov sulfadiazin, ki se pogosto uporablja v kremah za opekline.
Slika 4: Veliki trpotec
2.2.6 Dišeča vijolica (Viola odorata L.)
Dišeča vijolica (slika 5) je zelnata trajnica, ki sodi v družino vijoličevk (Violaceae). Njeni listi so ovaljni s srčastim dnom in izraščajo iz prizemne rozete. Imajo 1–5 cm dolge listne peclje in do 3,5 cm dolgo listno ploskev. Cvetovi so dišeči, venec vijoličast, redko bel.
Cveti od marca do maja. Raste v svetlih listopadnih gozdovih, ob brežinah potokov, ob grmovju. Širi se z dolgimi nadzemnimi pritlikami (Martinčič in sod., 2010).
Cvetovi dišeče vijolice so primerni za čaj, začinjenje juh in drugih jedi, listi pa se uporabljajo kot špinača. Na Japonskem cvetove macerirajo v krompirjevem žganju za pridobitev svojevrstne arome, uporabljajo pa tudi nastrgano korenino (Grlić, 1992).
Cvetovi se lahko uporabijo za odišavljanje sokov ali kisa ali pa se suhi uporabljajo za čaj.
Pražena korenika je lahko kavni nadomestek, iz zemlje se jo izkopava med novembrom in marcem (Fleischhauer in sod., 2007). Starejši viri, kot je Cilenšek (1892), navajajo, da so listi, cvetovi in korenina strupeni in povzročajo bruhanje, omotico, nemir in otožnost. Vonj cvetja v zaprtem prostoru lahko povzroči težave (Petauer, 1993).
Biokemijske raziskave so pokazale, da v zelenih delih vsebuje saponine, flavonoide, alkaloid violin, steroide, terpene, glikozide in grenčine, v cvetovih pa eterično olje. Zaradi vsebnosti antinutritivnih alkaloidov in saponinov ni priporočljivo uživanje starih listov vijolice ali čezmerno uživanje mladih listov (Janbaz in sod., 2015). Ti sicer vsebujejo do 250 mg vitamina C na 100 g SV (Petauer, 1993).
Slika 5: Dišeča vijolica
V tradicionalni uporabi dišeča vijolica slovi po lajšanju respiratornih, gastrointestinalnih in srčnožilnih bolezni (Janbaz in sod., 2015). Vsebuje nekatere flavonoide ki zmanjšujejo tesnobnost in prispevajo k zmanjšanju depresije (Karim in sod., 2018). Njena uporaba sega še na področje parfumerije, kjer naj bi bila pomembna podobno kot vrtnica in jasmin (Qin Cu in sod., 1992).
Dišeča violica ima svoj pomen tudi v prehrani živali. V različnih raziskavah so bili ugotovljeni pozitivni učinki na zdravje kuncev. Ob zaužitju dišeče vijolice se inhibira sproščanje Ca2+ ionov v medcelični prostor, kar v teščem črevesu (večji del tankega črevesa) povzroča umirjanje krčev. Blokerji Ca2+ kanalčkov so učinkoviti terapevtski agensi, ki se uporabljajo pri hiperaktivnih boleznih črevesja (Janbaz in sod., 2015).
2.2.7 Navadni rman (Achillea millefolium L.)
Navadni rman (slika 6) sodi v družino nebinovk (Asteraceae). Je trajna, 30–80 cm visoka rastlina, ki cveti čez vse poletje in jeseni. Steblo je dlakavo, iz njega izraščajo izmenično razporejeni podolgovati, dvojno ali trojno pernato deljeni listi. Venec jezičastih cvetov je rumenkasto bel. Je splošno razširjena rastlina (Grlić, 1992; Martinčič in sod., 2010).
Največkrat ga najdemo na travnikih in pašnikih ter na njivah kot plevel.
Za uporabo v prehrani nabiramo mlade liste, spomladi od februarja do junija, poleti ne, saj postane grenak. Grenčino lahko omilimo s poparjenjem z vrelo vodo. Zaradi vsebnosti eteričnih olj v mladih listih ga v Nemčiji dodajajo juham, siru in maslu. Uporablja se ga
tudi kot začimbo (Grlić, 1992). V Sloveniji naj bi se ga uporabljalo za pripravo čajev za blaženje želodčnih težav in za krepitev ženskih rodil (Bergant, 2019).
Sveži cvetovi vsebujejo od 0,07 do 0,1 % eteričnega olja, v katerem sta tudi mravljična in salicilna kislina (Petauer, 1993). Grlić (1992) in Petauer (1993) navajata vsebnost vitamina C spomladi v mladih listih, od 25–45 mg/100 g SV, navajata tudi 13 mg karotena/100 g SV. Starejše rastline niso užitne, saj vsebujejo grenke glikozide in čreslovine. V listih navadnega rmana so še fenolne spojine, terpeni, eterična olja in seskviterpeni (Ahmadi in sod., 2017; Ali in sod., 2017).
Eterična olja so zanimiva za kozmetično industrijo, kjer se rman uporablja za pridobitev azulena (Grlić, 1992). Ekstrakt iz listov, še zlasti pa cvetov naj bi deloval antioksidativno in antimikrobno. Antioksidativne lastnosti Ahmadi in sod. (2017) pripisujejo fenolnim spojinam v eteričnem olju (eugenol, timol), antimikrobne pa terpenom (eugenol, timol, karvon).
Tradicionalno se navadni rman uporablja pri blaženju vnetij, celjenju ran in krčih v prebavilih. Flavonoidi v navadnem rmanu (zlasti kvercetin, luteolin in apigenin) prispevajo k umiritvi krčev. Delujejo na enak način kot pri dišeči vijolici, torej inhibirajo pretok Ca2+
ionov in tako blažijo krče v tankem črevesu (Ali in sod., 2017). Lastnosti, ki mu jih pripisujejo, so protitumorno, antioksidativno, antiglivično delovanje in ščitenje jeter, predvsem zaradi svoje kemijske sestave iz seskviterpenov, eteričnih olj, fenolnih in drugih snovi (Ali in sod., 2017).
Slika 6: Navadni rman
2.2.8 Navadna črnoglavka (Prunella vulgaris L.)
Navadna črnoglavka (slika 7) je do 30 cm visoka trajnica, ki sodi v družino ustnatic (Lamiaceae). Njeni listi so celi, z obeh strani nekoliko dlakavi. Cvetovi so modrovijolični in do 1 cm dolgi. Cveti od junija do septembra. Vegetativno se zelo uspešno razmnožuje s pritlikami in je zato nadležen travniški plevel. Poleg travnikov so njena rastišča še svetli gozdovi, ob poteh, godijo ji tla z majhno vsebnostjo apna. Pogosto raste v večjih skupinah.
Od ostalih ustnatic se razlikuje po tem, da nima izrazitega vonja (Grlić, 1992; Martinčič in sod., 2010).
V prehrani se uporabljajo mladi listi, ki se jih nabira preden rastlina zacveti. Uporabljajo jih v solati, med drugo zelenjavo in v juhah (Grlić, 1992).
V listih in steblih vsebuje 25–50 mg vitamina C in 13 mg karotenov/100 g SV (Grlić, 1992) ter triterpene (ursolna kislina, oleanolna kislina), fenolne spojine (rožmarinska kislina), flavonoide, tanine, kofeinsko kislino in eterična olja (Chen in sod., 2012).
Podatkov za vitamin E v literaturi nismo zasledili.
Ekstrakte navadne črnoglavke se v tradicionalni medicini uporablja za blaženje hiperglikemije, anafilaktičnega šoka in proti vnetjem. Delovali naj bi tudi antiglivično in kot hepatoprotektiv (ščitenje jeter pred oksidacijo) (Chen in sod., 2012). V tradicionalni medicini naj bi se navadna črnoglavka uporabljala za lajšanje pljučnih obolenj (Grlić, 1992).
Slika 7: Navadna črnoglavka
2.3 BIOAKTIVNE SNOVI
Bioaktivne snovi so sestavine hrane, ki niso nujno potrebne za izpolnitev osnovnih človeških prehranskih potreb, ugodno pa vplivajo na zdravje človeka (Bergquist in sod., 2007). V nadaljevanju bodo predstavljeni lipofilni antoksidanti - bioaktivne snovi, ki smo jih v okviru raziskave analizirali v izbranih užitnih rastlinah.
2.3.1 Klorofili
Klorofil je barvilo, ki ga najdemo v vseh zelenih delih rastlin. Molekula klorofila je sestavljena iz štirih pirolovih obročev, na katere je v sredini vezan atom magnezija. Je najpomembnejši pigment v procesu fotosinteze. V višjih rastlinah je v dveh oblikah (slika 8), klorofil a, ki je modrozelen, in klorofil b, ki je rumenozelen. Vrhove maksimalne absorpcije svetlobe imata pri različnih valovnih dolžinah (Ravnik, 1991).
Slika 8: Strukturni prikaz molekul klorofila a (levo) in klorofila b (desno) (Chen in Blankenship, 2011)
Klorofil je zelo zanimiv tudi za človeka. Hsu in sod. (2013) navajajo klorofil a in b ter njune derivate (npr. feofitin) kot antioksidativno aktivne. Porfirinski obroči naj bi imeli sposobnost vezave planarnih cikličnih rakotvornih molekul, ki ob vezavi v bioloških sistemih izgubijo svojo rakotvorno sposobnost.
Li in sod. (2019) so ugotovili vpliv klorofila na zmanjšanje telesne mase ob visokokalorični prehrani in na večjo toleranco na povečano koncentracijo glukoze v krvi.
Pri testih, ki so jih izvedli na miših, so ugotovili 18,87 % zmanjšanje telesne mase pri miših, ki so uživale koncentriran klorofilni ekstrakt iz špinače sočasno z visokokalorično dieto.
Številne raziskave vsebnosti klorofila v samoniklih in gojenih rastlinah so že bile opravljene. V preglednici 2 so predstavljene količine klorofila v rastlinah iz sorodnih raziskav. Razberemo lahko da je med predstavljenimi rastlinami najbogatejša velika kopriva (Urtica dioica) s 164 mg/100 g SV, najskromnejša pa solata z od 1,9 do 4,2 mg/100 g SV. Od gojenih rastlin je poleg solate predstavljena še špinača (Spinacia oleracea), ki vsebuje od 80 do 130 mg/100 g SV skupnega klorofila.
Preglednica 2: Vsebnost skupnega klorofila v nekaterih travniških in gojenih rastlinah v mg/100 g SV Rastlinska vrsta Skupni klorofil
[mg/100g SV] Vir
Urtica dioica 164 Ozola in sod., 2019
Cichorium intybus 134,2 Šircelj in sod., 2018 Aegopodium podagraria 127,2 Šircelj, 2013
Spinacia oleracea 80 - (110) - 130 Bohn in sod., 2006; Šircelj in sod., 2018; Khachik in sod., 1986
Taraxacum officinale 75 - 97,1 Šircelj in sod., 2018; Ozola in sod., 2019 Plantago laneolata 67,8 Šircelj in sod., 2018
Stellaria media 42 Ozola in sod., 2019
Galinsoga parviflora 34,6 Šircelj in sod., 2018
Lactuca sativa 1,9 - 4,2 Bohn in sod., 2006; Šircelj in sod., 2018
Klorofil je v določenih okoliščinah labilna molekula. Postopki priprave rastlin za prehrano lahko povzročijo razpad klorofila. Bohn in sod. (2006) navajajo spremembe v biokemijski sestavi špinače pri sekljanju, kuhanju listov in obdelavi z vodno paro. Sekljanje v kombinaciji s kuhanjem in obdelavo s paro povzroči razpad klorofila bolj od sekljanja samega, med posameznimi obdelavami pa ga najbolj degradira sekljanje sámo. Prav tako klorofil razpada pri zamrzovanju sveže zelenjave (v raziskavi 35 %) zaradi poškodb celičnih membran ob zamrzovanju in sproščanja encima klorofilaza (Bohn in sod., 2006).
V sorodni študiji so ugotovili podobne podatke. Khachik in sod. (1986) so ugotovili zmanjšanje vsebnosti klorofila v ohrovtu in brstičnem ohrovtu pri kuhanju za 37–39 %.
2.3.2 Karotenoidi
Karotenoidi so tetraterpeni, ki jih delimo na oranžno-rdeče karotene in rumene ksantofile.
Med karoteni najdemo npr. α-karoten in -karoten, med ksantofili pa lutein, violaksantin, kriptoksantin in zeaksantin (Vodnik, 2012). Poznanih je več kot 600 karotenoidov, v kloroplastih pa se pojavljajo le naslednji karotenoidi: β-karoten, lutein, neoksantin, violaksantin, anteraksantin in zeaksantin in včasih α-karoten (Šircelj, 2008). V preglednici 3 smo zbrali podatke o vsebnosti karotenoidov v rastlinah iz sorodnih študij. Največ luteina so izmerili v navadni regačici (Aegopodium podagraria L.), in sicer 11,45 mg/100 g SV, najmanj pa v solati (Lactuca sativa), le 0,59 mg/100 g SV. Solata je vsebovala tudi najmanj ostalih karotenoidov med vsemi zbranimi rastlinami. Največ neoksantina je
vsebovala navadna regačica (4,36 mg/100 g SV), največ violaksantina špinača (8,34 mg/100 g SV), največ anteraksantina pa navadni regrat, 1,35 mg/100 g SV.
Preglednica 3: Vsebnosti karotenoidov v nekaterih travniških in gojenih rastlinah v mg/100 g SV (vira: 1 - Šircelj in sod., 2018, 2 – Šircelj, 2013)
Rastlinska vrsta Lutein Neoksantin Violaksantin Anteraksantin karoten Vir
Cichorium intybus 5,09 1,17 1,61 0,46 5,12 1
Galinsoga parviflora 3,61 1,11 1,99 0 2,33 1
Plantago lanceolata 6,73 1,1 2,2 0,24 4,15 1
Taraxacum officinale 7,15 3,04 5,47 1,35 6,16 1
Aegopodium podagraria 11,45 4,36 6,58 0,65 11,15 2
Lactuca sativa 0,59 0,15 0,49 0 0,36 1
Spinacia oleracea 7,99 4,32 8,34 0,23 5,64 1
Karotenoidi so močni antioksidanti, ki ščitijo membranske lipide pred oksidacijo. Nase vežejo škodljive proste kisikove radikale in ščitijo celice pred oksidativnim stresom (Stahl in Sies, 2005).
Karoteni (α-karoten, -karoten) so predhodniki vitamina A, ki preprečuje fotooksidativne poškodbe kože in oči (Stahl in Sies, 2005). V človeškem telesu ti karoteni vežejo superoksiradikal O2-, hidroksilni radikal OH in singletni kisik 1O2) in tako preprečujejo poškodbe zaradi oksidativnega stresa (Mezzomo in Ferreira, 2016). Dnevno odrasla oseba potrebuje približno 2 mg vitamina A, nekoliko več pozimi ali ob uživanju alkohola (Ihan, 2001).
Neoksantin tako kot drugi lipofilni antioksidanti zmanjšuje količino prostih kisikovih radikalov v svoji okolici in preprečuje oksidativne poškodbe celičnih membran in proteinov, hkrati pa inducira programirano celično smrt rakavih celic, kar so ugotovili v primeru raka na prostati (Singh in sod., 2007).
Violaksantin, anteraksantin in zeaksantin so pigmenti, ki se med seboj pretvarjajo glede na jakost svetlobe in potrebo po zaščiti fotosinteznega aparata pred poškodbami zaradi premočnega sončnega sevanja. Te pretvorbe jih združujejo v ksantofilni cikel (Latowski in sod., 2011; Giossi in sod., 2020). Za človeka so pomembni kot antioksidanti, saj vežejo proste kisikove radikale in tako preprečujejo oksidativni stres (Latowski in sod., 2011), ki lahko vodi v hitrejše staranje, večje tveganje za razvoj rakavih obolenj, srčnožilnih bolezni, poškodbe jeter in Parkinsonove bolezni (Shankar in Mehendale, 2014). Zeaksantin sodeluje tudi pri preprečevanju starostne degeneracije rumene pege (Mezzomo in Ferreira, 2016), ki je najpogostejši vzrok za poslabšanje vida ali celo slepoto po petinšestdesetem letu (Sevšek in sod., 2004).
Na zaviranje starostne degeneracije rumene pege vpliva tudi ksantofil lutein, ki je za ljudi pomemben predvsem za zaščito oči pred UV žarki (Ozawa in Sasaki, 2014). Obenem je tudi tisti karotenoid, ki ga je v zelenih delih rastlin ponavadi največ (Šircelj, 2008). Lutein (kot tudi zeaksantin) ima absorpcijski vrh pri 446 nm. Njegova sposobnost absorpcije v modrem, še posebno pa v UV delu spektra ščiti rumeno pego pred prostimi kisikovimi radikali in z absorpcijo z energijo nabitih fotonov krajših valovnih dolžin preprečuje poškodbe očesne mrežnice. Lutein in zeaksantin tudi inhibirata acetilholinesterazo, s tem pa se poveča koncentracija nevrotransmiterja acetilholina. Posledica tega je boljša aktivacija mišic okoli oči, zaradi česar je oko manj utrujeno in se bolje prilagaja na spremembe svetlobe v okolju (Ghanam in sod., 2015).
Na sliki 9 so prikazane molekule karotenoidov, ki smo jih določali v naših vzorcih.
Slika 9: Strukturni prikaz molekul karotenoidov: -karoten (A), zeaksantin (B), -karoten (C), anteraksantin (D), lutein (E), violaksantin (F), neoksantin (G) (Chen in Croft, 2018)
2.3.3 Tokoferoli
Tokoferoli so lipofilne molekule, znane tudi kot komponente vitamina E. Vir vitamina E so sveža zelenjava, oreščki in rastlinska olja (Lagouri, 2015). Največ (količinsko) jih najdemo v temnozelenih delih rastlin (Šircelj in sod., 2010), saj nastajajo v kloroplastih (Munné- Bosch, 2007). V listih in drugih zelenih delih rastlin je največ tokoferola, ki v tilakoidni membrani skrbi za prestrezanje prostih kisikovih radikalov in tako ščiti lipide, proteine in celotni fotosistem pred oksidacijo, zlasti pred O2- in hidroksilnimi radikali (OH) (Munné-
Bosch, 2005). Tokoferol je prevladujoč tokoferol v semenih mnogih rastlinskih vrst (Fritsche in sod., 2017).
Tokoferol je najbolj pogosta oblika vitamina E v našem telesu. Štirje tokoferoli () zastopajo 4 od 8 oblik vitamina E. Med njimi je -tokoferol (slika 10) primarna in najbolj aktivna komponenta vitamina E. Poleg tokoferolov z nasičeno stransko verigo imajo aktivnost vitamina E tudi tokotrienoli z nenasičeno stransko verigo (Lagouri, 2015).
Učinki tokoferola na človeka se pokažejo ob njegovem pomanjkanju. Mišice oslabijo, zmanjša se njihova masa, pri miših so ugotovili, da avitaminoza vitamina E povzroča neplodnost samic, pri samcih pa zakrnelost testisov (Ihan, 2001). Znana je tudi povezava vsebnosti tokoferola s stanjem kože človeka. Njegova koncentracija v koži se ob izpostavljenosti ozonu (O3) ali UV sevanju zmanjša, prav tako se manjša s staranjem (Lagouri, 2015). Posledice hipervitaminoze vitamina E niso znane, potrebni dnevni vnos za odraslega človeka med 25 in 51 leti pa znaša 14 mg (Fritsche in sod., 2017). V preglednici 4 smo zbrali podatke iz sorodnih študij (Šircelj, 2013; Šircelj in sod., 2018) o vsebnosti tokoferolov v nekaterih rastlinah, ki jih uporabljamo za prehrano na enak način kot rastline iz naše raziskave. Ugotovili so da ima največjo vsebnost - in -tokoferola navadna regačica (3,48 in 0,11 mg/100 g SV). Cikorija (Cichorium intybus) je vsebovala nekoliko manj -tokoferola (3,28 mg/100 g SV) kot navadna regačica, a več kot preostale rastline iz teh raziskav. V solati so izmerili samo 0,21 mg -tokoferola/100 g SV.
Slika 10: Strukturni formuli -tokoferola (A) in -tokoferola (B) (Brody, 1999)
Preglednica 4: Vsebnost tokoferolov in ter skupnih tokoferolov v nekaterih travniških rastlinah in gojenih kulturnih rastlinah (solata in špinača). Podatki so podani v mg/100 g SV
Rastlinska vrsta tokoferol tokoferol Skupni tokoferol Vir
Cichorium intybus 3,28 0 3,28 Šircelj in sod., 2018
Galinsoga parviflora 0,51 0 0,51 Šircelj in sod., 2018
Plantago lanceolata 2,84 0 2,84 Šircelj in sod., 2018
Taraxacum officinale 2,85 0 2,85 Šircelj in sod., 2018
Aegopodium podagraria 3,48 0,11 3,59 Šircelj, 2013
Lactuca sativa 0,21 0,02 0,23 Šircelj in sod., 2018
Spinacia oleracea 1,61 0,03 1,64 Šircelj in sod., 2018
3 MATERIAL IN METODE DELA 3.1 MATERIAL
Za raziskavo smo nabrali rastline v vegetativni fazi, v kateri običajno nabiramo te rastline za prehrano. Vključene so bile vrste:
navadna česnovka
navadni jajčar, otavčič
mehki osat
veliki trpotec
dišeča vijolica
navadni rman
navadna črnoglavka
Nadzemne dele rastlin smo nabrali maja, ko so užitni deli rastlin še mehki in imajo všečno teksturo. Rastline so bile nabrane vedno dopoldne ob enakih vremenskih razmerah.
Nabrani so bili le deli, ki jih nabiramo za prehrano, z več naključno izbranih rastlin za en vzorec. Rastline so bile nabrane na različnih lokacijah (laboratorijsko polje BF v Ljubljani, Zasavje in Postojna). Vzorčeni so bili le deli rastlin, ki so bili zdravi, čisti in nepoškodovani, saj bi lahko poškodbe povzročile odziv rastline, ki bi vplival na njeno biokemično sestavo.
3.2 METODE DELA
3.2.1 Nabiranje rastlinskega materiala
Zelene dele rastlin (liste, mlade poganjke) smo nabirali v dopoldanskem času, ko se je rosa na rastlinah posušila in ko sonce še ni bilo na svojem dnevnem maksimumu. Nabrani deli so bili enakomerno osvetljeni in nabrani po rastlini. Listi so bili nabrani ročno, približno 25–30 g v plastično vrečko, ki je predstavljala en vzorec. Napolnjena zaprta vrečka je do prvega tehtanja in zamrzovanja čakala v temni hladilni torbi, kar je prikazano na sliki 11.
Slika 11: Nabiranje vzorcev v pvc vrečke in shranjevanje v hladilno torbo. Vsaka vrečka je predstavljala en vzorec
3.2.2 Shranjevanje vzorcev
Po tehtanju so bili vzorci shranjeni v papirnati vrečki v zmrzovalni skrinji pri temperaturi – 20 °C. Vzorce smo liofilizirali in jih do mletja spet shranili v skrinjo.
Slika 12: Mletje liofiliziranega rastlinskega materiala v vodno hlajenem mlinčku
3.2.3 Priprava vzorcev na analizo
Vzorce smo ponovno stehtali za pridobitev informacije o vsebnosti vlage (slika 13 a), nato smo jih zmleli v vodno hlajenem mlinčku (slika 12). Po vsakem vzorcu je bil mlinček temeljito očiščen rastlinskih ostankov prejšnjega vzorca, da ne bi bilo neželene navzkrižne kontaminacije vzorcev. Rastlinski prah smo shranili v rjavih prahovkah (slika 13 b), da svetloba ne bi vplivala na kloroplaste v vzorcu.
Slika 13: a – Tehtanje vzorcev, b – shranjevanje zmletega liofiliziranega materiala v prahovke, c – odmerjanje količine vzorca za ekstrakcijo, d – homogeniziranje suspenzije vzorca in ohlajenega acetona pri visokih vrtljajih, e – homogeniziran vzorec po usedanju trdnih delcev, pripravljen za odvzem supernatanta
Vsebnost vode v svežem rastlinskem materialu smo izračunali po pridobitvi podatkov o sveži in suhi masi vzorca po formuli (1).
% H2O = (msveže rastline – msuhe rastline) x 100 %/msveže rastline ... (1) 3.2.4 Analiza bioaktivnih snovi
Analiza plastidnih pigmentov
Pigmente smo ekstrahirali z ohlajenim acetonom (–20°C) po metodi, ki sta jo opisala Šircelj in Batič (2007). Celoten postopek je zaradi neobstojnosti kloroplastnih pigmentov na svetlobi potekal v zatemnjenem prostoru. V ekstraktih smo analizirali ksantofile (lutein, neoksantin, violaksantin, anteraksantin, zeaksantin), karotene (α-karoten, β-karoten) in klorofile (klorofil a, klorofil b).
Ekstrakte smo pripravljali tako, da smo na digitalni tehtnici zatehtali okoli 200 miligramov zmletega vzorca (slika 13 c) in ga prenesli v centrifugirko. V čašo smo natočili ledeno hladen aceton (–20°C) in ga v vsako centrifugirko odpipetirali 4 mililitre, tako da smo sprali tudi rastlinski prah z njenih sten. Vsak vzorec posebej smo premešali s kovinsko spatulo in ga takoj nato 30 sekund homogenizirali pri visokih vrtljajih (slika 13 e) s
homogenizatorjem T-25 Ultra-Turrax (slika 13 d). Homogenizaciji je sledil odvzem supernatanta iz centrifugirke z brizgo z nastavljeno iglo. Brizgi smo nato nastavili Minisart SRP 15 injekcijski filter prepustnosti delcev v velikosti do 0,2 µm in filtrat shranili v vzorčni steklenički rjave barve – zaradi občutljivosti kloroplastnih pigmentov na svetlobo (sliki 14 a in 14 b). Vzorci so bili nato analizirani s HPLC (Thermo Finnigan, San Jose, USA) s kolono Spherisorb S5 ODS–2 250 × 4,6 mm (slika 14 c). Mobilno fazo sta sestavljali dve topili (A in B). Topilo A so sestavljali acetonitril, metanol in bidestilirana voda v volumskem razmerju 100 : 10 : 5, topilo B pa aceton in acetilacetat v volumskem razmerju 2 : 1. Hitrost pretoka je znašala 1 ml/min, volumen injiciranja 20 µl. Celotna analiza enega vzorca je potekala 32 min. Linearni gradient je bil v 18 minutah od 10 % topila B do 75 % topila B, v naslednjih 7 minutah do 70 % topila B, v naslednjih 5 minutah pa na 100 % topila B – nato se je analizator vrnil nazaj na začetne pogoje. Kloroplastne pigmente smo zaznavali s pomočjo PDA detektorja pri valovni dolžini 440 nm.
Identificirali smo jih s primerjavo retenzijskih časov z eksternimi standardi. Uporabili smo standarde proizvajalca DHI Water & Environment.
Slika 14: Priprava vzorcev za HPLC analizo. a – viala, polnjena z vzorcem, b – 40 vzorcev na držalu za viale, c – naprava HPLC za analizo plastidnih pigmentov
Analiza tokoferola
Tokoferol smo določili na analizatorju HPLC Spectra-Physic z detektorjem Spectra System FL 2000 (Fermont, ZDA) in kolono Spherisorb S5 ODS-2 (250 × 4,6 mm), ekstrakt pa je bil pripravljen enako kot pri ekstrakciji pigmentov. Za mobilno fazo smo uporabili 100 % metanol, injiciran volumen vzorca je znašal 20 µl, analiza enega vzorca je potekala 30 min.
Tokoferole v vzorcih smo zaznavali fluorometrično (ekscitacija 295 nm, emisija 325 nm), identificirali smo jih s primerjavo retenzijskih časov z eksternimi standardi (Sigma- Aldrich, Steinheim, Nemčija). Določali smo tokoferole in po metodi, ki so jo opisali Tausz in sod. (2003).
3.2.5 Obdelava rezultatov
Rezultate smo obdelali s programom Microsoft Excel 2010. Izračunali smo povprečne vrednosti koncentracije posamezne bioaktivne snovi za vsako izbrano rastlino, in sicer iz po 6 vzorcev navadnega rmana, mehkega osata, velikega trpotca in navadne črnoglavke, sedmih vzorcev dišeče vijolice, devetih vzorcev navadnega jajčarja in dvanajstih vzorcev navadne česnovke. V tabelah smo podali povprečno vrednost, maksimalno in minimalno vrednost za posamezno snov za vsako rastlino.
4 REZULTATI
4.1 VSEBNOST VODE V RASTLINAH
V rastlinah smo določili delež vlage, ta je v rastlinah znašal od 58,0 do 75,6 %. Iz preglednice 5 je razvidno, da sta največ vlage vsebovali navadna črnoglavka in navadni jajčar, najmanj pa navadna česnovka in navadni rman.
Preglednica 5: Vsebnost vode v nabranem rastlinskem materialu Rastlinska vrsta Vsebnost vode [%]
Achillea millefolium 59,6 Alliaria petiolata 58,0 Cirsium oleraceum 67,2 Leontodon hispidus 74,1
Plantago major 62,3
Prunella vulgaris 75,6
Viola odorata 67,3
4.2 PADAVINE
Iz arhiva na portalu ARSO smo pridobili podatke o padavinah pred nabiranjem rastlin.
Slika 15 prikazuje količino padavin, ki je bila zabeležena na naših lokacijah. V Postojni je v 17 dneh pred nabiranjem padlo 60,2 mm padavin, v Ljubljani 12,5 mm in na Kalu pri Krmelju 9,9 mm.
Slika 15: Pregled količine padavin pred nabiranjem vzorcev (ARSO, 2021)
4.3 KLOROFIL
V okviru raziskave smo v vzorcih določili klorofil a in b. Primer kromatograma analize klorofila in karotenoidov v naših vzorcih je prikazan na sliki 16.
Slika 16: Kromatogram pigmentov pri navadnem jajčarju. 1 – neoksantin, 2 – violaksantin, 3 – anteraksantin, 4 – lutein, 5 – klorofil b, 6 klorofil a, 7 – -karoten
V preglednici 6 so prikazani rezultati analize klorofila v izbranih vrstah rastlin. Iz preglednice je razvidno, da so preučevane rastline vsebovale od 80,9 do 209,0 mg klorofila a na 100 g SV in od 32,3 do 116,2 mg klorofila b na 100 g SV. Povprečne vrednosti pa so znašale za klorofil a od 98,0 do 180,1 mg/100 g SV, za klorofila b pa od 45,6 do 89,2 mg/100 g SV. Razmerje med klorofiloma a in b znaša od 1,9 (navadna črnoglavka) do 2,5 (navadni rman). Prikazano je v preglednici 6.
Preglednica 6: Vsebnost klorofila a in b v vzorcih v mg/100 g SV ter njuno razmerje
Rastlinska vrsta Vrednost Klorofil a Klorofil b a : b
Achillea millefolium
Povprečje 158,10 64,62 2,45
Max 171,30 74,50 2,30
Min 146,30 54,13 2,70
Alliaria petiolata
Povprečje 180,11 89,24 2,02
Max 208,97 116,24 1,80
Min 155,55 71,40 2,18
Cirsium oleraceum
Povprečje 141,81 69,15 2,05
Max 150,61 74,11 2,03
Min 134,86 58,42 2,31
Leontodon hispidus
Povprečje 97,99 45,61 2,15
Max 106,20 52,39 2,03
Min 80,89 32,33 2,50
Plantago major
Povprečje 137,57 58,53 2,35
Max 153,37 64,93 2,36
Min 130,96 52,80 2,48
Prunella vulgaris
Povprečje 110,66 57,93 1,91
Max 115,51 61,87 1,87
Min 108,76 55,63 1,95
Viola odorata
Povprečje 132,53 60,93 2,18
Max 149,10 74,30 2,01
Min 117,65 49,92 2,36
V navadni česnovki smo izmerili od 113,5 do 162,6 mg skupnega klorofila na 100 g SV s povprečno vrednostjo 269,4 mg/100 g SV. V navadnem rmanu smo izmerili od 200,4 do 245,8 mg skupnega klorofila na 100 g SV, s povprečno vrednostjo 222,7 mg/100 g SV, v mehkem osatu od 193,3 do 224,7 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 211,0 mg/100 g SV, v velikem trpotcu od 183,8 do 218,3 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 196,1 mg/100 g SV, v dišeči vijolici od 167,6 do 223,4 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 193,5 mg/100 g SV, v navadni črnoglavki od 164,4 do 177,4 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 168,6 mg/100 g SV, v navadnem jajčarju pa smo ga izmerili od 113,2 do 158,6 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 143,6 mg/100 g SV.
Slika 17: Povprečna vsebnost lipofilnih antioksidantov v preučevanih vzorcih
4.4 KAROTENOIDI
V izbranih rastlinah smo določili naslednje karotenoide: ksantofile lutein, neoksantin, violaksantin, anteraksantin, od karotenov pa le -karoten. Zeaksantina in -karotena nismo zaznali pri nobenem vzorcu, zato ju tudi nismo vključili v grafe in preglednice. Primer kromatograma s klorofili in z vsemi zaznanimi karotenoidi je prikazan na sliki 16.
Rezultati meritev količine karotenoidov v izbranih rastlinah so prikazani v preglednici 7. V vseh vzorcih je bilo največ luteina, najmanj pa anteraksantina.
Iz preglednice 7 lahko razberemo, da so rastline vsebovale od 12,7 do 42,5 mg luteina na 100 g SV, 4,7 do 14,6 mg neoksantina na 100 g SV, 4,7 do 19,3 mg violaksantina na 100 g SV, od 2,0 do 12,3 mg anteraksantina na 100 g SV in od 10,0 do 28,8 mg -karotena na 100 g SV. Povprečne vrednosti znašajo od 18,4 do 36,7 mg/100 g SV za lutein, 6,3 do 12,2 mg/100 g SV za neoksantin, 6,8 do 15,4 mg/100 g SV za violaksantin, od 2,7 do 7,8 mg/100 g SV za anteraksantin ter od 12,8 do 25,5 mg/100 g SV za -karoten.
Preglednica 7: Vsebnost karotenoidov v vzorcih izbranih rastlin v mg/100 g SV
Rastlinska vrsta Vrednost Lutein Neoksantin Violaksantin Anteraksantin -karoten Achillea millefolium
Povprečje 27,76 9,08 14,65 4,89 21,11
Max 33,03 10,73 19,26 9,17 25,31
Min 22,06 7,25 9,97 2,64 18,21
Alliaria petiolata
Povprečje 36,68 12,22 11,12 7,81 25,49
Max 42,54 14,64 15,63 12,34 28,76
Min 32,50 10,39 4,73 4,29 20,27
Cirsium oleraceum
Povprečje 27,58 10,39 15,42 2,74 20,12
Max 30,03 11,66 18,44 3,09 21,79
Min 23,84 9,02 13,89 2,54 18,16
Leontodon hispidus
Povprečje 18,38 6,30 8,34 3,67 12,80
Max 21,43 6,91 10,48 5,57 13,89
Min 12,65 4,71 5,49 1,98 10,01
Plantago major
Povprečje 27,70 8,53 9,91 3,86 17,05
Max 30,62 9,39 11,92 5,83 20,15
Min 24,83 7,69 8,07 2,18 15,09
Prunella vulgaris
Povprečje 25,22 9,11 6,84 2,88 15,17
Max 27,42 10,29 7,85 3,15 16,59
Min 23,97 8,27 6,35 2,66 14,16
Viola odorata
Povprečje 25,10 8,96 8,48 4,52 17,37
Max 31,48 11,83 10,71 6,12 21,37
Min 20,42 7,04 6,13 3,28 13,57
Preglednica 8: Delež ksantofilov in beta karotena glede na skupno vsebnost karotenoidov (v %) Rastlinska vrsta Lutein Neoksantin Violaksantin Anteraksantin -karoten
Achillea millefolium 35,8 11,7 18,9 6,3 27,2
Alliaria petiolata 39,3 13,1 11,9 8,4 27,3
Cirsium oleraceum 36,2 13,6 20,2 3,6 26,4
Leontodon hispidus 37,1 12,7 16,9 7,4 25,9
Plantago major 41,3 12,7 14,8 5,8 25,4
Prunella vulgaris 42,6 15,4 11,5 4,9 25,6
Viola odorata 39,0 13,9 13,2 7,0 27,0
V navadni česnovki smo izmerili od 72,2 do 113,9 mg skupnih karotenoidov na 100 g SV s povprečno vrednostjo 93,3 mg/100 g SV, v navadnem rmanu od 60,1 do 97,5 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 77,5, v mehkem osatu od 67,4 do 85,0 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 76,2 mg/100 g SV, v dišeči vijolici od 50,4 do 81,5 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 64,4 mg/100 g SV, v velikem trpotcu od 57,9 do 77,9 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 67,0 mg/100 g SV, v navadni črnoglavki od 55,4 do 65,3 mg/100 g SV s
povprečno vrednostjo 59,2 mg/100 g SV in v navadnem jajčarju od 34,8 do 58,3 mg/100 g SV s povprečno vrednostjo 49,5 mg/100 g SV.
Za boljšo predstavo o vsebnosti karotenoidov v rastlinah smo izračunali deleže posameznih karotenoidov glede na celotni spekter karotenoidov, določenih v okviru raziskave. Kot je razvidno iz preglednice 8 je največji delež karotenoidov predstavljal lutein (od 35,8 do 42,6 %). Naslednji po zastopanosti je bil -karoten, ki je predstavljal od 25,4 do 27,3 %.
Ostali karotenoidi (neoksantin, violaksantin in anteraksantin) so skupaj predstavljali od 18,8 do 31,2 % skupnih karotenoidov.
Na sliki 17 so prikazane povprečne vsebnosti skupnih klorofilov, karotenoidov in tokoferolov v rastlinah iz raziskave. Te so znašale od 143,6 do 269,35 mg/100 g SV za klorofil, od 49,5 do 93,3 mg/100 g SV za karotenoide in od 1,15 do 7,92 mg/100 g SV za tokoferole.
4.5 TOKOFEROLI
V okviru raziskave smo s HPLC iskali 3 tokoferole, ki se običajno pojavijo v zelenih delih rastlin: in v vzorcih smo zaznali samo prva dva. Prevladujoči je bil tokoferol, ki je predstavljal 91–99 % skupnih tokoferolov v vzorcih. Primer kromatograma, pridobljen z analizo tokoferolov, je prikazan na sliki 18.
Slika 18: Kromatogram tokoferolov in pri navadnem jajčarju. 1 – -tokoferol, 2 – -tokoferol
