UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Meta BRKOPEC
PRIPRAVA RAZLIČNIH SEVOV KVASOVK VRSTE Saccharomyces cerevisiae ZA PEKO KRUHA
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Meta BRKOPEC
PRIPRAVA RAZLIČNIH SEVOV KVASOVK VRSTE Saccharomyces cerevisiae ZA PEKO KRUHA
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana
DIFFERENT Saccharomyces cerevisiae YEAST STRAINS PROPAGATION FOR BREADMAKING
B. SC. THESIS
Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition
Ljubljana, 2021
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Živilstvo in prehrana. Delo je bilo opravljeno v laboratorijih Oddelka za živilstvo, na Katedri za tehnologije rastlinskih živil in vino ter na Katedri za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil na Biotehniški fakulteti v Ljubljani.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za živilstvo je za mentorja diplomskega dela imenovala izr. prof. dr. Tomaža Požrla in za recenzentko prof. dr. Polono Jamnik.
Mentor: izr. prof. dr. Tomaž POŽRL
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Recenzentka: prof. dr. Polona JAMNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik:
Mentor:
Recenzentka:
Datum zagovora:
Meta Brkopec
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 664.654.1:582.282.23(043)=163.6
KG pekovske kvasovke, Saccharomyces cerevisiae, sevi, kvasna biomasa, optična gostota, celična rast, vsebnost vode, vzhajalni potencial, vzhajanje, kvašeno testo, kruh
AV BRKOPEC, Meta
SA POŽRL, Tomaž (mentor), JAMNIK, Polona (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021
IN PRIPRAVA RAZLIČNIH SEVOV KVASOVK VRSTE Saccharomyces cerevisiae ZA PEKO KRUHA
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana) OP VII, 22 str., 4 pregl., 3 sl., 1 pril., 26 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Namen diplomskega dela je bil pripraviti kvasno biomaso z uporabo treh različnih sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae in z analizo nastale kvasne biomase ovrednotiti tehnološke lastnosti sevov. Uporabili smo sev ZIM 2113, izoliran iz mošta Kraljevina iz vinorodnega okoliša Dolenjska, sev ZIM 3704, izoliran iz jabolčnega vina na Koroškem, ki dobro presnavlja maltozo in sev suhega komercialnega kvasa znamke Di-go. Seve smo namnožili v dveh različnih tekočih gojiščih (gojišče YPD, jabolčni sok) in med samo kultivacijo spremljali rast z merjenjem optične gostote ter izrisali rastne krivulje. Najintenzivnejšo rast smo opazili pri sevu ZIM 3704, in sicer v gojišču YPD. Tudi pri določanju števila celic kvasovk pod mikroskopom smo najvišjo vrednost na koncu kultivacije določili pri sevu ZIM 3704. Sledilo je določanje vsebnosti vode v proizvedeni kvasni biomasi s sušenjem do konstantne mase. Večjih razlik pri tej analizi med kvasno biomaso posameznih sevov nismo določili. Tehnološke lastnosti različnih sevov kvasa smo vrednotili z določanjem vzhajalnega potenciala. Z metodo merjenja časa dviganja testa smo najkrajši čas vzhajanja testa izmerili pri sevu komercialnega kvasa, pri sevih ZIM 2113 in ZIM 3704 pa sta bila izmerjena časa bistveno daljša.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 664.654.1:582.282.23(043)=163.6
CX baker`s yeast, Saccharomyces cerevisiae, strains, yeast biomass, optical density, cell growth, water content, rising potential, rising, leavened dough, bread
AU BRKOPEC, Meta
AA POŽRL, Tomaž (supervisor), JAMNIK, Polona (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2021
TI DIFFERENT Saccharomyces cerevisiae YEAST STRAINS PROPAGATION FOR BREADMAKING
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition) NO VII, 22 p., 4 tab., 3 fig., 1 ann., 26 ref.
LA sl AL sl/en
AB The aim of this work was to produce yeast biomass using three different strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae and to evaluate the technological properties of the strains by analysing the resulting yeast biomass. If the strains used prove to be good producers of yeast biomass, they would be used for large scale production of yeast biomass outside the laboratory. We used strain ZIM 2113 isolated from must Kraljevina from Dolenjska wine region, strain ZIM 3704 isolated from cider from Carinthia, which metabolizes maltose well and strain of commercial dry yeast of Di- go brand. The strains were propagated to the appropriate concentration in two different liquid media (YPD broth and apple juice), the growth of the cells was monitored during propagation by measuring the optical density and growth curves were obtained. The most intense growth was observed with strain ZIM 3704. Also, when the number of yeast cells was determined using a microscope, the highest value was observed for strain ZIM 3704. This was followed by determination of water content in the produced yeast biomass by drying to constant mass. No major differences were observed in the analysis of yeast biomass of each strain. The technological properties of different yeast strains were evaluated by determining the rising potential. Using the method of measuring the rising time of the dough, the shortest rising time of the dough was measured for the strain of commercial yeast;
for the strains ZIM 2113 and ZIM 3704, the measured times were significantly longer.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VII KAZALO SLIK ... VII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... VII
1 UVOD ... 1
1.1 NAMEN DELA ... 1
1.2 DELOVNE HIPOTEZE ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 2
2.1 SUROVINE ZA PRIPRAVO TESTA ... 2
2.1.1 Moka ... 2
2.1.2 Voda ... 2
2.1.3 Sol ... 3
2.1.4 Kvas ... 3
2.2 VLOGA KVASA PRI PRIPRAVI KRUHA ... 3
2.3 KVASNA BIOMASA ... 4
2.3.1 Kvasovke vrste Saccharomyces cerevisiae ... 4
2.3.2 Vplivi na aktivnost kvasnih celic ... 5
2.3.2.1 Temperatura ... 5
2.3.2.2 Osmotski tlak... 6
2.3.2.3 Vrednost pH ... 6
2.3.2.4 Sev kvasovke ... 6
2.3.3 Proizvodnja kvasne biomase ... 7
2.3.3.1 Priprava ... 7
2.3.3.2 Kultivacija ... 7
2.3.3.3 Ločevanje in filtracija... 8
2.3.3.4 Pakiranje in končni izdelek ... 8
3 MATERIAL IN METODE ... 9
3.1 NAČRT DELA ... 9
3.2 MATERIALI ... 10
3.2.1 Proizvodnja kvasne biomase in vrednotenje vzhajalnega potenciala kvasa ... 10
3.2.2 Naprave in oprema ... 10
3.3 METODE ... 11
3.3.1 Priprava tekočega gojišča YPD ... 11
3.3.2 Priprava gojišča iz jabolčnega soka ... 11
3.3.3 Inokulacija gojišč ... 12
3.3.4 Spremljanje rasti kvasovk z merjenjem optične gostote ... 12
3.3.5 Določanje števila celic kvasovk ... 12
3.3.6 Pridobivanje kvasne biomase s centrifugiranjem ... 13
3.3.7 Določanje vsebnosti vode v kvasni biomasi ... 13
3.3.8 Vrednotenje vzhajalnega potenciala kvasne biomase ... 13
4 REZULTATI Z RAZPRAVO ... 15
4.1 SPREMLJANJE RASTI KVASOVK Z MERJENJEM OPTIČNE GOSTOTE .. 15
4.2 DOLOČANJE ŠTEVILA KVASOVK ... 16
4.3 DOLOČANJE VSEBNOSTI VODE V KVASNI BIOMASI ... 16
4.3.1 Pridobivanje kvasne biomase s centrifugiranjem ... 16
4.3.2 Določanje vsebnosti vode v kvasni biomasi ... 17
4.4 VREDNOTENJE VZHAJALNEGA POTENCIALA KVASA ... 18
5 SKLEPI ... 19
6 POVZETEK ... 20
7 VIRI ... 21 ZAHVALA
PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Število celic v 1 mL kvasne suspenzije ... 16
Preglednica 2: Mokra kvasna biomasa ... 17
Preglednica 3: Vsebnost vode v kvasni biomasi ... 17
Preglednica 4: Čas vzhajanja testa... 18
KAZALO SLIK Slika 1: Shema poskusa ... 9
Slika 2: Rastna krivulja kvasovk v gojišču YPD ... 15
Slika 3: Rastna krivulja kvasovk v jabolčnem soku ... 15
KAZALO PRILOG
Priloga A: Rastna krivulja kvasovk ZIM pri kultivaciji v večjem merilu
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI I0 intenziteta prepuščene svetlobe skozi slepi vzorec
I intenziteta prepuščene svetlobe skozi raztopino pravega vzorca N število mikroorganizmov
NaCl natrijev klorid
OD650 optična gostota pri 650 nm
R redčitev
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
YPD gojišče s kvasnim ekstraktom, peptonom in glukozo (ang. Yeast Peptone Dextrose medium)
ZIM Zbirka industrijskih mikroorganizmov
1 UVOD
Fermentacija je ena najstarejših znanih bioloških tehnologij za proizvodnjo pekovskih in drugih izdelkov, kot sta pivo in vino. Fermentirana živila predstavljajo pomemben del prehrane ljudi; so tako rekoč bistvena za človeštvo, saj so zaradi fermentacije bolj hranilna, okusnejša, lažje prebavljiva in varnejša, s tem pa prispevajo k boljšemu počutju ljudi.
Skupina najpomembnejših živil so pekovski izdelki, katerih glavni predstavnik je kruh. Kruh je tesno povezan z razvojem človeka in civilizacije. Vsebuje vsa osnovna hranila, kot so ogljikovi hidrati, lipidi in beljakovine, poleg tega pa je pomemben vir prehranske vlaknine, vitaminov, mineralov ter elementov v sledovih. Pri izdelavi kruha je bistvenega pomena kvas. Kvas je pri tradicionalni pridelavi pekovskih izdelkov najpomembnejše vzhajalno sredstvo, saj kvasovke presnavljajo sladkorje v moki in jih pretvarjajo v produkte, ki dajo kruhu značilno luknjičasto strukturo ter teksturo, prispevajo pa tudi snovi, ki tvorijo značilen vonj in aromo kruha. Poznanih je veliko različnih kvasovk, v pekarstvu pa je najbolj razširjena vrsta Saccharomyces cerevisiae, poznana tudi pod imenom »pekovska kvasovka«.
Zaradi svojih fermentabilnih sposobnosti in raznolikosti sevov znotraj vrste je pogosto predmet različnih študij in raziskav.
1.1 NAMEN DELA
Cilj diplomske naloge je bil proizvesti ustrezno količino kvasne biomase z uporabo treh različnih sevov kvasovk Saccharomyces cerevisiae, ki so jih v drugem diplomskem delu uporabili pri peki kruha. Poleg tega smo proizvedenemu kvasu ovrednotili tehnološke lastnosti posameznih sevov.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE Predpostavljamo, da bo:
- kinetika rasti različnih sevov kvasovk Saccharomyces cerevisiae različna, - čas vzhajanja testa pri kvasovkah iz ZIM daljši kot pri komercialnem kvasu.
2 PREGLED OBJAV
Kruh uvrščamo med pekovske izdelke, kamor spada tudi pekovsko pecivo in drugi pekovski izdelki. Izdelan je z mesenjem, oblikovanjem, vzhajanjem in peko testa (Pravilnik o kakovosti pekovskih izdelkov, 2015). Obstajajo številne različice postopka priprave kruha, izbira določenega postopka pa je odvisna od tradicije, stroškov, vrste razpoložljive energije, vrste moke, vrste kruha, časa med peko in porabo kruha in drugih dejavnikov (Collado- Fernández, 2003). Zgodovinski zapisi so pokazali, da se starodavni postopki priprave kruha ne razlikuje toliko od sodobnih postopkov priprave. Navsezadnje za pripravo kruha ni potrebnega nič kaj več kot le nekaj sestavin, malo mešanja, nekaj časa za fermentacijo in pečica za peko (Bamforth in Ward, 2014).
2.1 SUROVINE ZA PRIPRAVO TESTA
Poleg postopkov priprave se kruh med seboj razlikuje tudi po uporabljenih surovinah.
Osnovne in hkrati tudi esencialne surovine za pripravo kruha so moka, voda, sol in kvas, ostale surovine, ki se še lahko dodajo krušnemu testu, vendar niso esencialne za pripravo kruha, pa so sladkor, maščobe, različni encimski pripravki ter aditivi, kot so oksidanti in površinsko aktivne snovi (Delcour in Hoseney, 2010).
2.1.1 Moka
Osnovna surovina za pripravo pekovskih izdelkov je pšenična moka. Sestava moke ni pomembna le s prehranskega vidika, temveč ima ključen vpliv tudi na funkcionalnost oz.
tehnološke lastnosti same moke (Delcour in Hoseney, 2010). Vsebnost in kakovost beljakovin v moki v veliki meri vplivata na sposobnost zadrževanja plinov. Večja namreč kot je vsebnost beljakovin v moki, bolj čvrsta glutenska mreža se oblikuje in boljše je zadrževanje plinov, to pa pripomore h končnemu produktu večjega volumna in boljše teksture (Cauvain, 2017). Moka vsebuje tudi naravno prisotne encime – amilaze, ki imajo velik vpliv na aktivnost kvasnih celic. Večja kot je encimska aktivnost moke, več sladkorja je na voljo kvasovkam in posledično je njihova aktivnost večja (Cauvain, 2017).
2.1.2 Voda
Voda je pri pripravi pekovskih izdelkov ena izmed nepogrešljivih surovin (Gélinas, 2006), saj sodeluje pri večini procesov, ki pomembno vplivajo na kakovost pekovskih izdelkov (Cauvain in Young, 2008). Pomembna je za hidracijo beljakovin, skupaj z moko pa sta odgovorni za strukturo kruha, saj z razvojem glutenske mreže pri samem zamesu tvorita viskoelastično testo, ki zadržuje pline (Delcour in Hoseney, 2010).
2.1.3 Sol
Sol se pri pripravi pekovskih izdelkih dodaja za izboljšanje okusa in vpliva na hidracijo glutena, zaradi česar se posledično izboljša zadrževanje plinov. Običajno se uporablja v koncentracijah 1–2 % glede na težo moke (Delcour in Hoseney, 2010).
2.1.4 Kvas
Kvas se uporablja kot vzhajalno sredstvo, ki pri pripravi kruha pretvori fermentirajoče ogljikove hidrate (sladkorje) v CO2 in etanol. Med fermentacijo nastali CO2 povzroči povečanje volumna testa in zagotavlja značilne teksturne lastnosti kruha ob koncu peke (Delcour in Hoseney, 2010). Kvas s fermentacijsko aktivnostjo vpliva tudi na reološke lastnosti testa. Sodeluje pri razvoju teksture testa, ki vključuje zapletene spremembe, vključno z mehanskimi silami mešanja, ki vodijo do tvorbe glutenske mreže. Med mešanjem se ustvarijo zračni mehurčki, v katere se ujame nastali ogljikov dioksid. Brez kvasa pa se ne bi razvila tudi značilna aroma kruha. Aroma kruha je zelo kompleksna, saj je sestavljena iz spojin arome, ki so značilne za osnovne surovine, fermentacijskih produktov in spojin, ki nastanejo med peko. Raziskave so pokazale prisotnost več kot 200 hlapnih spojin, od katerih jih veliko nastane kot stranski produkt kvasne fermentacije – organski estri in kisline, alkoholi in karbonilne spojine (Deák, 2003). Na razvoj aromatičnih spojin v kruhu vplivajo količina uporabljenega kvasa, čas fermentacije in temperatura fermentacije. Daljši čas fermentacije ne omogoča kvasovkam samo produkcije večje količine metabolitov, ampak spreminja tudi ravnovesje okusov (Wirtz, 2003).
Poznamo različne vrste kvasa, ki jih uporabljamo pri pripravi pekovskih izdelkov: stisnjeni kvas, presejani kvas, kvasno mleko, suhi kvas, hitro delujoči kvas. Razlikujejo se predvsem v aktivnosti, kar vpliva na doziranje, po vsebnosti vode in suhe snovi, po roku uporabnosti in po hranilni vrednosti (Hrovat, 2000).
2.2 VLOGA KVASA PRI PRIPRAVI KRUHA
Prva faza priprave kruha po pripravi surovin je zames testa. Mešanje in gnetenje skupaj predstavljata mehansko fizikalni proces, ki aktivira številne kemijske in mikrobiološke procese, katerih rezultat je nastanek testa. Med zamesom se osnovne surovine in dodatki homogenizirajo; dodatki se vgradijo in aktivirajo, sestavine moke pa se med mešanjem z vodo hidrirajo. Posledično pride do razvoja lepka oz. glutenske strukture, aktivirajo se kvasovke, v testo se vmešajo tudi zračni mehurčki, ki so osnova za tvorbo večjih CO2
mehurčkov pozneje med fermentacijo, poleg tega pa je kisik potreben tudi za kvasno aktivnost. Po končanem zamesu dobimo formirano testo z določenimi reološkimi lastnostmi, ki je pripravljeno za nadaljnjo obdelavo (Gélinas, 2006). Počivanje testa lahko poteka takoj
po zamesu in kasneje po deljenju in oblikovanju. Testo se razdeli na enake kose in oblikuje v želeno obliko (Delcour in Hoseney, 2010).
Sledi fermentacija. Kvasovke so živi mikroorganizmi, ki so med shranjevanjem praktično neaktivni. Ko kvas med zamesom dodamo v testo pri temperaturi, ki zagotavlja optimalno rast in razmnoževanje kvasovk, te postanejo aktivne. Fermentacija je aerobno-anaerobni proces, ki poteka pri nadzorovani temperaturi (30–35 °C), ki omogoča optimalno aktivnost kvasovk. Pomembna je tudi in relativna vlaga (okrog 85 %), ki preprečuje izsuševanje površine testa, kar lahko kasneje vpliva na kakovost in kvantiteto končnega izdelka (Delcour in Hoseney, 2010).
Nastanek CO2 vpliva na znižanje pH vrednost testa. Ta znaša po mešanju okoli 6,0, med fermentacijo pa pade na približno 5,0. Preden se začne zaradi nastanka CO2 volumen testa povečevati, mora postati vodna faza testa nasičena s CO2. Topnost CO2 v vodni fazi testa je odvisna od temperature in pH. Ko se vodna faza nasiti s CO2, lahko le-tapovzroči vzhajanje testa, tako da z difuzijo preide v prej obstoječe plinske celice oz. mehurčke v testu (Delcour in Hoseney, 2010). Poleg proizvajanja vzhajalnega plina, ki se ujame v glutensko mrežo in v testu tvori luknjice, značilne za teksturo testa in kasneje kruha, kvasovke z metaboliti, ki jih proizvajajo med fermentacijo, vplivajo na aromo kruha in povečajo elastičnost testa (Gélinas, 2006).
Po fermentaciji testa sledi peka kruha. Ob tem se volumen testa poveča, začne se sušenje površine testa in spreminjanje barve skorje. Povečanje volumna med peko je posledica dviga temperature testa, kar pripomore k povišani aktivnosti kvasnih celic, ki s tem proizvedejo še več CO2. Volumen testa se med peko še dodatno poveča zaradi termične ekspanzije CO2. Kvasni encimi so aktivni dokler temperatura ne doseže okrog 40–55 °C (Delcour in Hoseney, 2010). Pri temperaturi okrog 78 °C beljakovine denaturirajo in koagulirajo, s tem pa učvrstijo strukturo in odpuščajo vezano vodo. Sledi sušenje površine testa in oblikovanje skorje hlebca, do česar pride zaradi stalnega stika površine testa s suhim zrakom z visoko temperaturo v pečici. Po nastanku skorje ta postopoma pridobiva temnejšo barvo in dodatno aromo. To je posledica Maillardove reakcije in karamelizacije sladkorjev. Različni produkti kvasne fermentacije pa imajo poleg snovi arome, ki nastajajo med peko, tudi ključno vlogo pri oblikovanju značilnih senzoričnih lastnosti pekovskih izdelkov, kot sta vonj in okus (Serna-Saldivar, 2010).
2.3 KVASNA BIOMASA
2.3.1 Kvasovke vrste Saccharomyces cerevisiae
Uporaba mikroorganizmov sega daleč nazaj v zgodovino človeštva. Ena izmed najpogosteje uporabljenih vrst mikroorganizmov v prehrani so kvasovke, ki jih pri proizvodnji piva, vina
in pekovskih izdelkov uporabljamo že vse od antičnih časov. Za pripravo kruha se uporablja več kot 30 vrst kvasovk (Carbonetto in sod., 2018), najpogosteje uporabljeni pa so sevi kvasovk Saccharomyces cerevisiae, izbrani zaradi njihove dobre fermentacijske aktivnosti pri pripravi kruha (Zhou in sod., 2007).
Vrsta kvasovk Saccharomyces cerevisiae, poznana tudi pod imenom »pekovska kvasovka«, je ključnega pomena pri številnih industrijskih procesih vse od živilske do farmacevtske industrije (Copetti, 2019). Kvasovke v testu potrebujejo hranila, ki jim zagotavljajo energijo za metabolne procese in omogočajo rast. S pekarskega vidika je najpomembnejši fermentacijski metabolizem ogljikovih hidratov, s katerim proizvajajo ogljikov dioksid, ki je nujen za vzhajanje testa, skupaj z etanolom, ki ima vlogo pri kondicioniranju beljakovin iz moke (Wirtz, 2003). Poznamo različne oblike kvasne biomase, kot sta npr. stisnjeni ali suhi kvas, ki se razlikujejo predvsem v aktivnosti, to pa vpliva na doziranje, saj npr. en gram stisnjenega kvasa ne vsebuje enakega števila kvasnih celic kot en gram suhega kvasa (Hrovat, 2000).
Kvasovke začnejo s fermentacijo na koncu faze gnetenja in po fazi počitka, ko se v mikro mehurčkih, razpršenih po testu, porabi kisik. Za fermentacijo so zmožne uporabiti različne sladkorje, ki so prisotni v moki: glukozo, fruktozo, manozo, maltozo in saharozo. Kvasne celice vsebujejo različne transportne encime, ki transportirajo sladkorje iz okolja v celico, kjer jih nato kvasovka uporabi kot vir ogljika in vir energije za svoj metabolizem.
Monosaharide, kot sta glukoza in fruktoza, lahko kvasovke uporabijo direktno, disaharide, kot sta saharoza, ki je sestavljena iz molekule glukoze in fruktoze, ter maltoza, ki je sestavljena iz dveh enot glukoze, pa mora kvasna celica s pomočjo encimov najprej razgraditi na posamezne enote sladkorjev (Zhou in sod., 2007). Glukoza in maltoza sta v moki naravno prisotna sladkorja, saharozo in fruktozo pa se lahko v testo doda z dodatkom sladkorja ali sirupa (Carbonetto in sod., 2018). Kvasovke med fermentacijo najprej porabijo glukozo in fruktozo ter saharozo, ki jo kvasni encimi zunaj celice hitro razgradijo na molekulo glukoze in molekulo fruktoze, maltoze pa celica ne porabi, dokler ostali sladkorji niso skoraj popolnoma izrabljeni (Zhou in sod., 2007).
2.3.2 Vplivi na aktivnost kvasnih celic
Na kvasno aktivnost vpliva več različnih dejavnikov:
2.3.2.1 Temperatura
Temperatura ima na kvasno aktivnost največji vpliv. Pri temperaturi pod 4 °C kvasovke praktično niso aktivne in do fermentacije ne pride, posledično je to idealna temperatura za shranjevanje kvasa. Pri temperaturi 10–15 °C je kvasna aktivnost majhna (Collado- Fernández, 2003), optimalna temperatura fermentacije, ki omogoča največjo kvasno
aktivnost, pa se giblje med 28 in 35 °C, potrebno pa je poudariti, da najbolj optimalna temperatura zares variira med različicami testa. Občutljivost kvasovk na temperaturo je v veliki meri odvisna od narave testa. Na primer, v sladkanem testu, ki vsebuje 15–20 % dodanega sladkorja, so kvasovke veliko bolj občutljive na visoke temperature, saj so zaradi povišanega osmotskega tlaka, ki ga ustvarjajo sladkorji, izpostavljene velikemu stresu (Wirtz, 2003). Ko temperatura med peko doseže 45 °C, se aktivnost kvasovk ponovno zmanjša, pri temperaturi okrog 50–55 °C pa kvasne celice niso več aktivne (Collado- Fernández, 2003).
2.3.2.2 Osmotski tlak
Osmotski tlak ima poleg temperature velik vpliv na aktivnost kvasnih celic. V testu brez dodanega sladkorja je kvasna aktivnost največja, dokler ne zmanjka zalog naravno prisotne glukoze. Potem začne aktivnost kvasnih celic upadati, dokler kvasovke ne začnejo izkoriščati maltoze kot vira ogljika za nadaljevanje fermentacije. V primeru sladkega testa, ko je dodana večja količina sladkorja, pa je osmotski tlak zelo povišan, kar posledično privede do nizke kvasne aktivnosti že na začetku fermentacije. Postopoma se koncentracija sladkorja zaradi porabe s strani kvasovk manjša, kar zniža tudi osmotski tlak in kvasna aktivnost zaradi tega nekoliko naraste (Wirtz, 2003). Podobno na aktivnost kvasnih celic vpliva tudi sol. Previsoka koncentracija soli namreč enako kot sladkor zviša osmotski tlak, to pa zavira delovanje kvasovk. (Delcour in Hoseney, 2010).
2.3.2.3 Vrednost pH
Vrednost pH v splošnem na kvasno aktivnost nima tolikšnega vpliva kot temperatura ali osmotski tlak (Wirtz, 2003). Kvasovke so namreč dobro prilagojene na spremembe pH.
Uspevajo lahko v okolju s pH od 2,0 do 8,0; optimalna pH vrednost za aktivnost kvasnih celic pa je 4,0–6,0 (Collado-Fernández, 2003). Krušno testo ima zaradi vsebnosti beljakovin iz moke določeno puferno kapaciteto (Wirtz, 2003), njegova pH vrednost je običajno okoli 5,0 (Collado-Fernández, 2003), zato vrednosti pH redko padejo pod 4,0 (Wirtz, 2003).
2.3.2.4 Sev kvasovke
Izbira pravega seva je pomembna, saj se lahko le-ti med seboj po lastnostih, prilagajanju na razmere v okolju in produktivnosti zelo razlikujejo. Različni sevi imajo različne sposobnosti izkoriščanja substrata, zaradi česar proizvajajo različne vrste in količine sekundarnih metabolitov, ki nato dajejo tako kruhu kot drugim živilom (npr. pivo, vino), katerih proizvodnja temelji na sevih S. cerevisiae, različne arome (Capece in sod., 2016).
Da bi kvas ohranil dobro proizvodnjo plina, zahteva stalno oskrbo z glukozo ali fruktozo kot virom energije. Encimi amilaze v moki škrob razgrajujejo do maltoze, ki kvasovkam
predstavlja pomemben vir ogljika, ko zmanjka glukoze v enostavni obliki (Struyf in sod., 2017). Maltozo kvasni encimi prenesejo v celico, kvasna celica pa jo mora razgradi na dve molekuli glukoze, saj jo lahko šele v taki obliki uporabi kot substrat za fermentacijo (Gélinas, 2006). Različni sevi kvasovk imajo različno sposobnost presnavljanja maltoze.
Nekateri imajo genski zapis za kodiranje dveh pomembnih encimov (maltoza-permeaza in amilaza), ki omogočajo presnovo maltoze. Amilaza konstantno razgrajuje škrob v moki, zaradi česar nenehno nastajajo nove molekule maltoze. Posledično lahko v zgodnjih fazah fermentacije pride do povečane vsebnosti maltoze, ki je celica ne porablja, vse dokler je raven glukoze dovolj visoka. To lahko povzroči zaostanek v proizvodnji CO2, saj potrebujejo kvasovke nekaj časa za prilagoditev na povečano vsebnost maltoze, da se geni za kodiranje encimov za presnavljanje maltoze inducirajo (Struyf in sod., 2017).
Komercialni pekovski sevi naj bi imeli, glede na raziskavo, ki jo opisujejo Struyf in sod., (2017), večjo sposobnost presnavljanja maltoze kot sevi iz drugih virov, kar kaže na prilagoditev pekovskih sevov na pogoje, ki jim jih nudi krušno testo.
2.3.3 Proizvodnja kvasne biomase
Bioproces proizvodnje kvasne biomase poteka v več fazah. Začne se s sterilizacijo in polnjenjem bioreaktorskega sistema, sledi inokulacija, vodenje bioprocesa, praznjenje in čiščenje ter na koncu priprava za naslednjo polnitev (Cimerman in Raspor, 1992).
2.3.3.1 Priprava
Proizvodnja pekovskega kvasa se začne na dveh ločenih področjih – v laboratoriju z razmnoževanjem čiste kulture kvasnih celic in izven laboratorija, v tovarni s pripravo bioreaktorjev in gojišča (Deák, 2003). Za proizvodnjo kvasne biomase potrebujemo tekoče gojišče, v katerem poteka submerzna kultivacija. Zahtevam za optimalno vodenje bioprocesa najlažje zadostimo, če izvajamo kultivacijo v bioreaktorju. Ta skupaj z mešalom, sistemom za regulacijo temperature in vnosom zraka ter s senzorji, ki omogočajo sprotne meritve pH, pO2, temperature in optične gostote, predstavlja bioreaktorski sistem (Raspor, 1996).
2.3.3.2 Kultivacija
Bioproces začnemo z inokulacijo. Določeno količino prej pripravljenega inokuluma aseptično dodamo v gojišče. Ravno prav koncentriran inokulum zagotavlja hitro razmnoževanje kulture v bioreaktorju (Cimerman in Raspor, 1992). Kvasovke S. cerevisiae presnavljajo sladkorje tako pod anaerobnimi kot pod aerobnimi pogoji. Če zagotovimo ustrezne pogoje, z aerobno razgradnjo glukoze dobimo prirast biomase, pri anaerobni razgradnji glukoze pa poteka fermentacija in z njo tvorba etanola. Kadar je glukoza v presežku, pa lahko tudi pri aerobnih pogojih poteka alkoholna fermentacija. Pojav, ko
kvasovke proizvajajo etanol pri aerobnimi pogoji, imenujemo Crabtree efekt (Piškur, 2006).
Zaradi Crabtree efekta torej pride do zmanjšanja produktivnosti kvasnih celic in prekomerne tvorbe alkohola (Deák, 2003). Da bi se temu izognili, je potrebno pri proizvodnji kvasne biomase zagotoviti aerobne pogoje – prepihovanje z zrakom, hkrati pa tudi mešanje. Na ta način se omogoči zadostno raztapljanje kisika v mediju, v katerem gojimo kvasovke, s tem pa omogočimo hitrejšo rast kvasovk, kar se kaže v večji količini proizvedene kvasne biomase (Raspor, 1996). Običajno kultivacija poteka 12–18 ur pri temperaturi 28–30 °C (Deák, 2003).
Poznamo dva načina proizvodnje kvasne biomase (Žnidaršič in Pavko, 2002):
- šaržni bioproces, pri katerem inokulum vnesemo v sterilizirano gojišče in med potekom bioprocesa ne dodajamo substratov za rast,
- bioproces z dohranjevanjem, pri katerem porabljeno količino substratov nadomeščamo z dodajanjem enake količine novega substrata med samim bioprocesom.
Pri proizvodnji kvasne biomase z dohranjevanjem imamo večji izkoristek, produktivnost in boljšo kakovost končnega proizvoda. Izognemo se namreč negativnemu učinku pri visoki vsebnosti glukoze v gojišču in posledično nastanku prevelike količine etanola – Crabtree efektu (Žnidaršič in Pavko, 2002).
2.3.3.3 Ločevanje in filtracija
Po končani kultivaciji sledi pridobivanje kvasne biomase iz izrabljenega medija s centrifugiranjem. Dobimo kvasno biomaso, ki se v nadaljevanju koncentrira s filtracijo na rotacijskih vakuumskih filtrih ali filtrirnih stiskalnicah. Dobimo kvasno pogačo s približno 27–30 % vsebnostjo suhe snovi (Deák, 2003).
2.3.3.4 Pakiranje in končni izdelek
Po filtraciji kvasno pogačo zmešamo z olji, emulgatorji in majhno količino vode, nato mešanico stisnemo, iztisnemo v bloke ali granuliramo. Olje in emulgatorji izboljšajo videz izdelka in pomagajo pri oblikovanju kvasa. Končni produkt je stisnjeni kvas, ki predstavlja tradicionalno obliko pekovskega kvasa. Shranjuje se pri temperaturi okoli 4 °C do nekaj tednov. Poznamo tudi granulirano obliko, ki se ravno tako shranjuje v hladilniku, saj nizka temperatura zavira metabolno aktivnost kvasnih celic in izsuševanje kvasa samega. Posušeni kvas pa je oblika kvasa, ki ima daljši rok trajanja. Stabilnost kvasnih celic ohrani tudi pri shranjevanju na sobni temperaturi. Obstaja več različic posušenega kvasa – aktivni suhi kvas, ki ga je potrebno pred uporabo rehidrirati v topli vodi, in instant suhi kvas, ki pred uporabo ne potrebuje rehidracije in ga je mogoče mešati neposredno z moko pri pripravi testa (Deák, 2003).
3 MATERIAL IN METODE
Diplomsko delo smo izvajali v laboratorijih Oddelka za živilstvo, na Katedri za tehnologije rastlinskih živil in vino ter na Katedri za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil na Biotehniški fakulteti v Ljubljani. Želeli smo pripraviti ustrezno količino kvasne biomase treh različnih sevov kvasovk Saccharomyces cerevisiae in z različnimi metodami med seboj primerjati tehnološke lastnosti posameznih sevov. Z merjenjem optične gostote pri valovni dolžini 650 nm smo spremljali kinetiko rasti kvasnih celic, v mililitru kvasne susupenzije smo določali število kvasnih celic, določali pa smo tudi vsebnost vode v kvasni biomasi ter vrednotili njen vzhajalni potencial. Za poskus smo uporabili tri različne seve: dva seva iz Zbirke industrijskih mikroorganizmov z Oddelka za živilstvo na Biotehniški fakulteti (sev ZIM 2113, izoliran iz mošta Kraljevina na Dolenjskem in sev ZIM 3704, izoliran iz jabolčnega vina na Koroškem), pripravljena na Katedri za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil, kot tretji sev pa smo uporabili komercialni suhi pekovski kvas.
3.1 NAČRT DELA
Slika 1: Shema poskusa
INOKULACIJA GOJIŠČ
Meritve:
- določanje števila kvasnih celic v utežni enoti,
- določanje vsebnosti vode v kvasni biomasi,
- vrednotenje vzhajalnega potenciala kvasa.
Merjenje optične gostote
PRIDOBIVANJE KVASNE BIOMASE S CENTRIFUGIRANJEM
KULTIVACIJA
PRIPRAVA KULTURE Saccharomyces cerevisiae STERILIZACIJA GOJIŠČ
IN LABORATORIJSKE OPREME
OSNOVNE SUROVINE
PRIPRAVA GOJIŠČ
3.2 MATERIALI
3.2.1 Proizvodnja kvasne biomase in vrednotenje vzhajalnega potenciala kvasa
Za proizvodnjo kvasne biomase in analize smo uporabili:
- Gojišče YPD (Condalab) (glukoza 20 g/L, pepton 20 g/L, kvasni ekstrakt 10 g/L) - 100 % jabolčni sok, proizveden na Oddelku za živilstvo; vsebnost suhe snovi 12,0 % - hranila za kvasovke OPTIMUM-WHITE, Lallemand inc., Kanada, za pripravo raztopine
s koncentracijo 0,4 g hranil/L - destilirano vodo
- morsko kuhinjsko sol, proizvajalec Droga Kolinska, d. d.
- kulture: seva kvasovk iz Zbirke industrijskih mikroorganizmov (ZIM): sev ZIM 2113 (izoliran iz mošta Kraljevina iz Dolenjskega vinorodnega okoliša), sev ZIM 3704 (dobro presnavlja maltozo, izoliran iz jabolčnega vina na Koroškem) in komercialni suhi kvas Di-go (instant suhi pekarski kvas Saf-instant, Lesaffre, Francija)
- 96 % etanol
- pšenično belo moko tipa 500, proizvajalec Žito, d. o. o.
- rafinirano sončnično olje, trgovska blagovna znamka A la chef 3.2.2 Naprave in oprema
Naprave in oprema, ki je bila uporabljena za proizvodnjo kvasne biomase in njeno analizo:
- tehtnica Sartorius MC210P - magnetno mešalo, Rotamix - avtoklav Semlab
- laminarij Iskra PIO
- spektrofotometer Photometer Iskra MA9510
- hladilnik
- stresalnik Infors, MultiTron Pro - stresalnik Vortex
- centrifuga Beckman Coulter - pipete Eppendorf Research plus - konice za pipete
- erlenmajerice s stransko kiveto - čaše
- žličke - merilni valj
- penasti zamaški za erlenmajerice
- fluorescenčni mikroskop Axioskop (Opton)
- Bürker-Türk hemocitometer - centrifugirke
- falkonke
- stojalo za falkonke - kapalke
- merilni valj
- mikro filtri za aseptično filtracijo hranil - tehtiči
- plastična posoda - jedilna žlica
- sušilna omara Termoproc Sob 5250.135 PID
- pločevinasti kalup - prečka kalupa - nož
- aluminijasta folija - petrijeve plošče - cepilne zanke
- štoparica - epruvete - gorilnik 3.3 METODE
Rast vseh treh sevov kvasovk v različnih gojiščih (gojišče YPD, jabolčni sok) smo ovrednotili z merjenjem optične gostote kvasne suspenzije v različnih časovnih enotah in po končani kultivaciji z določanjem števila celic kvasovk pod mikroskopom. V pridobljeni kvasni biomasi smo določili tudi vsebnost vode. Tehnološke lastnosti kvasne biomase smo ovrednotili z vrednotenjem vzhajalnega potenciala.
3.3.1 Priprava tekočega gojišča YPD
Gojišče YPD se uporablja za rast in vzdrževanje kvasovk Saccharomyces cerevisiae. Je kompleksno gojišče, ki vsebuje vsa potrebna hranila za rast kvasovk. Sestavljeno je iz glukoze (20 g/L), peptona (20 g/L) in kvasnega ekstrakta (10 g/L) (Cold Spring Harbor Protocols, 2017).
Kot osnovo za gojišče smo uporabili že pripravljeno mešanico gojišča YPD. Za pripravo 900 mL gojišča smo v 1000 mL čašo zatehtali 45 g mešanice YPD v prahu in do oznake 900 mL napolnili z destilirano vodo, s pomočjo magnetnega mešala pa smo raztopino dobro premešali. Pripravili smo štiri 500-mL erlenmajerice s stransko kiveto in v vsako prelili 180 mL raztopine YPD. Vsaka erlenmajerica s stransko kiveto in raztopino je predstavljala gojišče za posamezni sev, četrta pa je bila v nadaljevanju namenjena umerjanju spektrofotometra med spremljanjem optične gostote kvasne suspenzije. Preostanek pripravljene raztopine smo uporabili za pripravo inokuluma. Vse erlenmajerice z gojišči smo zamašili s penastimi zamaški in te dobro pritrdili z aluminijasto folijo. Tako so bila gojišča pripravljena na sterilizacijo s toploto oz. avtoklaviranje. Gojišča smo v avtoklavu sterilizirali 15 minut pri temperaturi 120 °C, saj bi daljša sterilizacija povzročila karamelizacijo sladkorjev. Po ohlajanju so bila gojišča pripravljena na inokulacijo.
3.3.2 Priprava gojišča iz jabolčnega soka
Rast kvasovk in njihovo produkcijo kvasne biomase v tekočem gojišču YPD smo želeli primerjati z rastjo kvasovk in produkcijo kvasne biomase v cenejši obliki gojišča. Kot cenejše gojišče smo uporabili jabolčni sok.
Za pripravo gojišča iz jabolčnega soka je bilo potrebno steklovino najprej sterilizirati v avtoklavu 20 minut pri 120 °C. V tem primeru smo sterilizirali samo steklovino brez gojišč, zato je bila sterilizacija daljša. Jabolčnega soka ni bilo potrebno sterilizirati, saj je bil med
samo proizvodnjo polnjen v stekleno embalažo in nato pasteriziran. V laminariju smo s pomočjo steriliziranega merilnega valja in čaše aseptično prenesli pasteriziran jabolčni sok v sterilizirane 500-mL erlenmajerice s stransko kiveto. Ker sam jabolčni sok po sestavi ni primerljiv z gojiščem YPD, smo v gojišča dodali 2 mL raztopine hranil za kvasovke. Sledila je inokulacija gojišč.
3.3.3 Inokulacija gojišč
Kulturo posameznega seva ZIM smo s pomočjo cepilne zanke prenesli s petrijeve plošče v 150-mL erlenmajerice z gojiščem (YPD in jabolčni sok) in ob tem na spektrofotometru uravnali optično gostoto kvasne susupenzije na vrednost med 0,50 do 0,55 pri valovni dolžini 650 nm. Inokuluma za sev ZIM 2113 in sev ZIM 3704 sta bila s tem pripravljena, inokulum za sev iz komercialnega kvasa pa smo pripravili tako, da smo v laminariju kvas z žličko aseptično postopoma prenašali v erlenmajerico in enako kot pri sevih ZIM merili optično gostoto pri 650 nm. Sledil je prenos 20-mL kvasne suspenzije v 180-mL gojišča.
3.3.4 Spremljanje rasti kvasovk z merjenjem optične gostote
Po inokulaciji smo erlenmajerice z gojiščem postavili na stresalnik (T = 28 °C, hitrost mešanja = 240 obratov/min), pri čemer je potekala aerobna submerzna kultivacija kvasne biomase. Med kultivacijo smo rast kvasovk spremljali z merjenjem optične gostote vsake dve uri. Stransko kiveto erlenmajeric smo napolnili s suspenzijo celic in ji izmerili optično gostoto pri valovni dolžini 650 nm. Ko se je rast kvasovk ustavila, je bila inkubacija končana in proizvedena kvasna biomasa pripravljena za nadaljnje postopke oz. analize.
3.3.5 Določanje števila celic kvasovk
Število celic kvasovk v volumski enoti smo določali z metodo štetja celic po Bürker-Türku.
Za pripravo redčitev po Kochu smo pripravili fiziološko raztopino (0,9 % raztopina NaCl), ki smo jo predhodno v avtoklavu sterilizirali 15 minut pri 120 °C. Celice smo po inkubaciji s pomočjo Bürker-Türkove števne plošče pod mikroskopom prešteli in izračunali število celic/mL po enačbi (1) (Incyto, 2010):
𝑁 𝑥 𝑅 𝑥 2,5 𝑥 105 = š𝑡. 𝑐𝑒𝑙𝑖𝑐/𝑚𝐿 ...1
N ... število kvasnih celic
R ... redčitev vzorca, pri kateri smo šteli celice 2,5 x 105 … faktor števnega polja na hemocitometru
3.3.6 Pridobivanje kvasne biomase s centrifugiranjem
Brozgo vsakega seva posebej smo razporedili v falkon epruvete in centrifugirali 5 minut pri 4000 obratih na minuto. Po centrifugiranju smo odlili supernatant, usedlina pa je predstavljala mokro kvasno biomaso.
3.3.7 Določanje vsebnosti vode v kvasni biomasi
Ker je bila produkcija kvasne biomase pri uporabi jabolčnega soka manj uspešna, smo za določanje vsebnosti vode v kvasni biomasi in vrednotenje vzhajalnega potenciala kvasa uporabili samo kvasno biomaso, proizvedeno v gojišču YPD
Vsebnost vode smo določali po principu sušenja vzorca do konstantne mase (Lane, 1999).
V tehtiče posušene na 105 °C in ohlajene v eksikatorju smo odtehtali 2 do 5 g vzorca. Vse skupaj smo sušili v sušilniku pri temperaturi 105 °C do konstantne mase. Tehtiče smo nato ohladili v eksikatorju, stehtali in izračunali vsebnost vode v vzorcu s pomočjo enačb (2) in (3):
Vsebnost suhe snovi:
(g/100 g) = 𝑏
𝑎∗ 100 …2
a … masa svežega vzorca (g) b … masa vzorca po sušenju (g) Vsebnost vode v svežem vzorcu:
(g/100 g) = 100 – vsebnost suhe snovi (g/100 g) …3
3.3.8 Vrednotenje vzhajalnega potenciala kvasne biomase
Vrednotenje vzhajalnega potenciala kvasovk smo izvedli s postopkom merjenja časa dviganja testa, zato smo potrebovali večjo količino kvasa kot za ostale analize. Poleg tega je bil del naše naloge tudi priprava zadostne količine kvasa za zames testa in peko kruha ter vrednotenje tehnoloških lastnosti treh sevov kvasovk, kar je bila naloga druge diplomske naloge. V ta namen smo pripravili večjo količino gojišča YPD: posebej za sev ZIM 2113 in sev ZIM 3704 smo v štirih 1000-mL erlenmajericah s stransko kiveto pripravili 360 mL tekočega gojišča YPD in 40 mL inokuluma za vsako gojišče. Za primerjavo rasti kvasovk, pripravljenih v manjšem merilu z rastjo v večjem merilu smo tudi pri kultivaciji v večjem merilu spremljali rast kvasovk z merjenjem optične gostote. Za centrifugiranje proizvedene
kvasne biomase smo uporabili 1000-mL centrifugirke Pri komercialnem kvasu smo za analize uporabili kvas direktno iz embalaže.
Z namenom vrednotenja tehnoloških lastnosti kvasnih sevov smo za določanje vzhajalnega potenciala uporabili modificirano metodo določanja aktivnosti pekovskega kvasa (JUS E.M8.024), ki je na Katedri za tehnologije rastlinskih živil in vino uporabljena v komercialne namene. Uporabljena metoda, pri kateri merimo čas dviganja testa v definiranih pogojih, določa ustreznost kvasne aktivnosti s prvim časom dviganja testa (največ 70 minut) in vsoto vseh treh časov dviganja testa (največ 125 minut) pri uporabi 5 g stisnjenega kvasa. Pri izvedbi našega poskusa smo poskušali normirati aktivnost različnih oblik kvasa (suhega kvasa in mokre kvasne biomase) na podlagi vsebnosti vode oz. suhe snovi. Suhi komercialni kvas je vseboval približno 95 % suhe snovi, kvasna biomasa pridobljena s kultivacijo sevov iz ZIM pa je vsebovala približno 25 % suhe snovi. Zato smo uporabili različne mase kvasa pri zamesu testa.
Vzhajalni potencial kvasa smo določali v termostatirani komori pri 35 °C. Za merjenje smo uporabili pločevinaste kalupe velikosti 15 cm x 10 cm x 9 cm. Pripravili smo 2,5 % raztopino NaCl, tako da smo 12,5 g soli raztopili v 500 mL destilirane vode. V posodo smo nato natehtali 280 g pšenične moke tipa 500. Nato smo pripravili kvasno suspenzijo. Za zames testa smo pri določanju vzhajalnega potenciala suhega komercialnega kvasa potrebovali 1,6 g kvasa, pri določanju vzhajalnega potenciala kvasne biomase sevov iz ZIM pa smo potrebovali 6 g kvasa.
Kvas smo suspendirali v 150 mL 2,5 % raztopine NaCl. Pred zamesom testa smo vse surovine temperirali pri 35 °C. Po temperiranju smo pripravljeno kvasno suspenzijo zmešali z moko in od tega trenutka dalje merili čas dviganja testa. Dobljeno zmes smo hitro zamesili v testo in ga dali v kalup namazan z rastlinskim oljem. Na kalup smo namestili prečko in ga prenesli v termostat na 35 °C. Merili smo čas, v katerem je testo doseglo prečko (čas 1). Ob tem smo testo prerezali navzkriž in diagonalno ter ga z batom potlačili, na kalup ponovno položili prečko in ponovno merili čas dviganja testa v termostatu (čas 2). Postopek smo še enkrat ponovili in dobili še tretji čas dviganja testa (čas 3). Glede na seštevek vseh treh časov smo nato ovrednotili vzhajalni potencial. Opisana metoda določa ustreznost kvasne aktivnosti s prvim časom dviganja testa (največ 70 minut) in vsoto vseh treh časov dviganja testa (največ 125 minut) pri uporabi 5 g kvasa.
4 REZULTATI Z RAZPRAVO
4.1 SPREMLJANJE RASTI KVASOVK Z MERJENJEM OPTIČNE GOSTOTE
V šaržnem bioprocesu se okolje med bioprocesom spreminja, zato smo s spremljanjem optične gostote na vsaki dve uri inkubacije dobili značilno rastno krivuljo mikroorganizmov.
Slika 2 predstavlja rastne krivulje kvasovk v gojišču YPD, slika 3 pa rastne krivulje kvasovk v gojišču z jabolčnim sokom.
Slika 2: Rastna krivulja kvasovk v gojišču YPD
Slika 3: Rastna krivulja kvasovk v jabolčnem soku
Faze rasti so zelo lepo razvidne. Faza prilagajanja celic je nekoliko bolj opazna v gojišču YPD, faza pospešene rasti in eksponentna faza pa se lepo vidita na krivuljah obeh vrst gojišč, kjer lahko opazimo razliko v obliki krivulj. Največjo razliko v intenziteti razmnoževanja opazimo med 6. in 10. uro in je večja primeru gojišča YPD. Opazna je največja intenziteta razmnoževanja seva ZIM 3704, ki je OD650 = 1 dosegel že po 8 urah kultivacije, medtem ko sta jo sev 2113 in sev komercialnega kvasa dosegla šele po 10 urah. Pri uporabi jabolčnega soka pa po 10 urah kultivacije OD650 = 1 ni dosegel nobeden izmed sevov, zato sklepamo, da je sestava gojišča YPD primernejša za kultivacijo kvasovk, kar potrjuje tudi nekoliko večja optična gostota kvasovk v tem gojišču po zaključeni kultivaciji.
0,20 0,40,6 0,81 1,21,4 1,61,82
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
OD650
čas (h)
ZIM 2113 ZIM 3704 KOMERCIALNI KVAS
0,20 0,40,6 0,81 1,21,4 1,61,82
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
OD650
čas (h)
ZIM2113 ZIM 3704 KOMERCIALNI KVAS
Za uporabljene kvasne seve v literaturi nismo našli primerljivih podatkov. V raziskavi Rozene in sod. (2021), ki je vrednotila rast pekovskega kvasa v primerljivih pogojih, so določili podobne vrednosti OD600 in tudi podobno obliko rastne krivulje kot v našem eksperimentu.
Na podlagi rezultatov spremljanja optične gostote rasti kvasovk v gojišču YPD in v gojišču z jabolčnim sokom ter pozneje štetja kvasnih celic pod mikroskopom smo se za nadaljnje analize izbranih sevov odločili za uporabo gojišča YPD. To gojišče je namreč zagotovilo intenzivnejšo rast in večjo količino proizvedene kvasne biomase. V ta namen smo pripravili večjo količino kvasne biomase sevov iz ZIM v gojišču YPD. Rastni krivulji kultivacije v večjem merilu sta prikazani na sliki v Prilogi A. S spremljanjem optične gostote suspenzije ZIM kvasovk med kultivacijo v večjem merilu smo določili primerljivi rastni krivulji s krivuljami kultivacije v gojišču YPD v manjšem merilu. Pridobljeno kvasno biomaso smo nato uporabili za določanje vzhajalnega potenciala sevov in pripravo pekovskih izdelkov.
4.2 DOLOČANJE ŠTEVILA KVASOVK
Z metodo štetja celic pod mikroskopom s pomočjo Bürker-Türkovih plošč smo po zaključeni kultivaciji v manjšem merilu izračunali število celic v volumski enoti in dobili rezultate, prikazane v Preglednici 1.
Preglednica 1: Število celic v 1 mL kvasne suspenzije
Sev Gojišče YPD Jabolčni sok
ZIM 2113 4,00 x 108 celic/mL 2,50 x 108 celic/mL
ZIM 3704 5,25 x 108 celic/mL 3,00 x 108 celic/mL
KOMERCIALNI KVAS 3,75 x 108 celic/mL 2,25 x 108 celic/mL
Kot je bilo pričakovano glede na rezultate spremljanja optične gostote med rastjo kvasovk, smo v povprečju nekoliko večjo koncentracijo celic določili pri kultivaciji v gojišču YPD.
Rezultati merjenja optične gostote in določanja števila celic dokazujejo, da je gojišče YPD, ki je v osnovi namenjeno kultivaciji kvasovk, boljše gojišče v primerjavi z jabolčnim sokom.
V gojišču YPD je bilo namreč proizvedene več kvasne biomase kot v jabolčnem soku.
4.3 DOLOČANJE VSEBNOSTI VODE V KVASNI BIOMASI 4.3.1 Pridobivanje kvasne biomase s centrifugiranjem
V Preglednici 2 so prikazane vrednosti mokre kvasne biomase pridobljene v gojišču YPD in jabolčnem soku. Ugotovili smo, da je bil prirast kvasne biomase za vse seve manjši v jabolčnem soku, kar je skladno s predhodnimi ugotovitvami. Ne glede na to, da je bil jabolčni
sok obogaten s hranili za kvasovke, lahko sklepamo, da je gojišče YPD ustreznejše gojišče za uporabljene seve kvasovke Saccharomyces cerevisiae.
Preglednica 2: Mokra kvasna biomasa
Kvasna biomasa seva m mokra kvasna biomasa (g)
– gojišče YPD m mokra kvasna biomasa (g) – jabolčni sok
ZIM 2113 3,43 3,14
ZIM 3704 5,83 3,02
KOMERCIALNI KVAS 4,64 3,62
Pridobljena količina kvasne biomase je le delno primerljiva z rezultati določanja števila kvasnih celic. V gojišču YPD je najboljše rezultate pokazal sev ZIM 3704, ki pa je v jabolčnem soku generiral najmanjši prirast (glede na maso). Pri suhem kvasu smo pričakovali najmanjšo mokro maso (glede na rezultate merjenja števila celic), a je bil prirast v gojišču YPD drugi največja, v jabolčnem soku pa prvi. Neskladje med rezultati je najverjetneje posledica neizenačenih pogojev med centrifugiranjem in odlivanjem supernatanta pri pripravi mokre kvasne biomase.
4.3.2 Določanje vsebnosti vode v kvasni biomasi
Preglednica 3: Vsebnost vode v kvasni biomasi
Kvasna biomasa Vsebnost vode (%)
ZIM 2113 74,17 ± 0,40
ZIM 3704 72,82 ± 0,30
KOMERCIALNI KVAS 76,61 ± 0,20
Vsebnost vode smo določali samo v kvasni biomasi, kultivirani v gojišču YPD. Določali smo jo s sušenjem do konstantne mase in jo izračunali s pomočjo podatkov o masi kvasne biomase pred in po sušenju. Izračunane vrednosti vsebnosti vode v kvasni biomasi nam prikazuje Preglednica 3.
Vsebnost vode v kvasni biomase vseh treh sevov kvasovk je podobna, manjše razlike pa kažejo, da proces centrifugiranja in odlivanja supernatanta ni bil popolnoma izenačen.
Morda je bil zaradi nehomogenosti kvasne biomase najbolj problematičen odvzem vzorca za določanje vsebnosti vode. Podatki o vsebnosti vode v stisnjenem kvasu, ki smo jih našli v literaturi, kažejo, da stisnjen kvas vsebuje 65–75 % vode in 35–25 % suhe snovi (Hrovat, 2000), kar pomeni, da je bila določena vsebnost vode v kvasni biomasi vseh treh sevov podobna kot v komercialnih oblikah stisnjenega kvasa.
4.4 VREDNOTENJE VZHAJALNEGA POTENCIALA KVASA
V sklopu določanja vzhajalnega potenciala posameznega kvasa smo trikrat izmerili čas vzhajanja testa. Preglednica 4 prikazuje izmerjene vrednosti časa dviganja testa.
Preglednica 4: Čas vzhajanja testa
ZIM 2113 ZIM 3704 KOMERCIALNI
KVAS
Čas 1 (min) 48,00 ± 4,00 57,00 ± 2,94 77,00 ± 0,07
Čas 2 (min) 35,00 ± 2,00 37,00 ± 5,50 22,00 ± 0,13
Čas 3 (min) 68,00 ± 8,00 61,00 ± 6,67 19,00 ± 1,00
Vsota časov (min) 151,00 ± 1,50 155,00 ± 15,11 118,00 ± 0,95
Glede na vsoto časov dviganja testa je ustrezne rezultate dosegel samo komercialni suhi kvas, kar je najverjetneje posledica selekcije kvasnih sevov, ki je pri komercialni proizvodnji pekovskega kvasa redna praksa. Seva iz ZIM pa sta bila pri dviganju testa premalo aktivna, saj je vsota časov pri obeh presegla mejo 125 minut, kar kaže na manjši vzhajalni potencial.
Pri sevu ZIM 3704 je prišlo med paralelkama do približno 30-minutnega odstopanja, kar je verjetno posledica neizenačenih pogojev poskusa. Kljub temu lahko rečemo, da je bila vsota časov dviganja pri sevih iz ZIM primerljiva.
Med seboj lahko primerjamo tudi vmesne čase. Pri prvem času, ki naj bi tudi opredeljeval kvasno aktivnost, sta oba seva iz ZIM dosegla krajši čas od 70 minut, suhi kvas pa daljšega.
Predvidevamo, da je to posledica daljšega časa, ki ga komercialni kvas potrebuje za aktivacijo v primerjavi z mokro kvasno biomaso. Naslednji časi dviganja so bili pri suhem kvasu občutno krajši, kar kaže na to, da je verjetno suhi komercialni kvas bolj prilagojen za izkoriščanje maltoze iz moke. To potrjujejo tudi ugotovitve naloge Kanc (2020), ki je v nadaljevanju naše naloge primerjala tehnološke in senzorične lastnosti različnih vzorcev kruha, pripravljenega z uporabo treh različnih sevov kvasovk S. cerevisiae (suhi komercialni sev, sev ZIM 3704 in sev ZIM 2113). Najboljše tehnološke lastnosti (npr. specifični volumen kruha) je določila pri kruhu, pripravljenem s komercialnim kvasom. Do podobnega zaključka lahko pridemo tudi s primerjavo vmesnih časov dviganja testa. Pri suhem komercialnem kvasu se vmesni časi krajšajo, pri sevih iz ZIM pa daljšajo, kar bi lahko povezali s sposobnostjo izkoriščanja maltoze, ki jo kvasovke med fermentacijo testa začnejo izkoriščati šele, ko porabijo ostale sladkorje (glukozo, saharozo). Med sevoma iz ZIM smo določili podobne čase dviganja testa, se je pa sev ZIM 3704 bolje izkazal pri pripravi kruha, saj je bil specifični volumen kruha večji kot pri uporabi seva ZIM 2113 (Kanc, 2020).
5 SKLEPI
Na podlagi rezultatov analiz kvasne biomase, proizvedene z izbranimi tremi sevi, smo prišli do naslednjih zaključkov:
- Spremljanje rastnih krivulj treh sevov kvasovk z merjenjem optične gostote OD650 v gojišču YPD je pokazala najintenzivnejšo rast seva ZIM 3704. V jabolčnem soku je bila za vse seve v primerjavi z gojiščem YPD rast manj intenzivna. Na podlagi ugotovitev lahko hipotezo 1, ki pravi, da bo kinetika rasti različnih sevov kvasovk Saccharomyces cerevisiae različna, potrdimo za gojišče YPD.
- Rezultati merjenja optične gostote in določanja števila celic pod mikroskopom dokazujejo, da je gojišče YPD boljše gojišče v primerjavi z jabolčnim sokom.
- Vsebnost vode v kvasni biomasi vseh treh sevov je bila primerljiva s komercialno uporabljenimi oblikami stisnjenega kvasa.
- Pri določanju vzhajalnega potenciala kvasne biomase smo najmanjšo vsoto časov dviganja testa določili pri suhem komercialnem kvasu. Tako lahko tudi hipotezo 2, ki pravi, da bo čas vzhajanja testa pri kvasovkah iz ZIM daljši kot pri komercialnem kvasu, potrdimo.
6 POVZETEK
Vrsta kvasovk Saccharomyces cerevisiae, poznana tudi pod imenom »pekovska kvasovka«, je zaradi svojih fermentacijskih sposobnosti pogosto prisotna v živilstvu. Pri pripravi pekovskih izdelkov kvasovke med fermentacijo sladkorja producirajo ogljikov dioksid, zaradi katerega volumen testa naraste, hkrati pa se oblikujeta značilna luknjičasta struktura in tekstura kruha. Med posameznimi fazami priprave kruha je potrebno zagotoviti ustrezne pogoje za optimalno aktivnost kvasnih celic, kar vpliva na kakovost končnega izdelka.
Vzdrževati je potrebno ustrezno temperaturo, poleg tega pa na aktivnost kvasovk vpliva osmotski tlak, količina in sev kvasovk, pH vrednost testa, uporabljene surovine in drugo.
Ena izmed bolj pomembnih lastnosti pekovskih sevov je sposobnost presnavljanja maltoze, ki se kaže v hitrosti vzhajanja testa in volumnu končnega izdelka.
V sklopu diplomske naloge smo pripravili kvasno biomaso treh sevov kvasovke S.
cerevisiae z različnimi lastnostmi in nato ovrednotili tehnološke lastnosti uporabljenih sevov. Uporabili smo sev ZIM 2113 izoliran iz mošta iz vinorodnega okoliša Dolenjska, sev ZIM 3704 izoliran iz jabolčnega vina na Koroškem, ki dobro presnavlja maltozo in sev suhega komercialnega kvasa Di-go. Med kultivacijo sevov kvasovk v gojišču YPD in jabolčnem soku smo z merjenjem optične gostote spremljali rast kvasovk. Gojišče YPD se je zaradi višjih izmerjenih vrednosti optične gostote že med samo kultivacijo in ob koncu le- te pri vseh treh sevih izkazal za ustreznejše gojišče kot jabolčni sok. Največjo intenziteto rasti je v gojišču YPD pokazal sev ZIM 3704. Analiza določanja števila celic v mililitru kvasne suspenzije po kultivaciji je rezultate spremljanja kinetike rasti sevov kvasovk le še potrdila. Določali smo tudi vsebnost vode v kvasni biomasi, pri čemer smo kvasni biomasi vseh treh sevov določili primerljive rezultate z vrednostmi iz literature (okoli 75 % vsebnost vode v kvasni biomasi). Za konec smo kvasni biomasi, proizvedeni s kultivacijo sevov iz ZIM in suhemu komercialnemu kvasu izmerili vzhajalni potencial. Najkrajši čas vzhajanja testa je dosegel komercialni kvas, kar je najverjetneje posledica selekcije pekovskih sevov, uporabljenih za komercialno proizvodnjo. Za seva iz ZIM pa smo določili manjši vzhajalni potencial, saj sta presegla zgornjo mejo (125 minut) vzhajanja testa.
Zaključimo lahko, da ima suhi komercialni kvas boljše tehnološke lastnosti kot seva iz ZIM, so pa ostali rezultati pokazali, da smo oba seva iz ZIM, še posebej sev ZIM 3704 uspešno kultivirali oz. propagirali in dosegli relativno velik prirast celic.
7 VIRI
Bamforth C.W., Ward R.E. 2014. The Oxford handbook of food fermentations. New York, Oxford University Press: 448–457
Capece A., Granchi L., Guerrini S., Mangani S., Romaniello R., Vincenzini M., Romano P.
2016. Diversity of Saccharomyces cerevisiae strains isolated from two Italian wine- producing regions. Frontiers in Microbiology, 7: 1018, doi:
10.3389/fmicb.2016.01018: 11 str.
Carbonetto B., Ramsayer J., Nidelet T., Legrand J., Sicard D. 2018. Bakery yeasts, a new model for studies in ecology and evolution. Yeast, 35: 591–603
Cauvain S.P., Young L.S. 2008. Bakery food manufacture and quality: Water control and effects. 2nd ed. West Sussex, Wiley-Blackwell: 1–72, 263–284
Cauvain S.P. 2017. Baking problems solved. UK, Woodhead Publishing: 61–62
Cimerman A., Raspor P. 1992. Mikrobna biomasa. V: Biotehnologija. Raspor P. (ur.).
Ljubljana, BIA: 475–482
Cold Spring Harbor Protocols. 2017. Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YPD) medium (liquid or solid). Cold Spring Harbor Laboratory Press, doi:10.1101/pdb.rec090563: 1 str.
Collado-Fernández M. 2003. Bread: breadmaking processes. V: Encyclopedia of food science and nutrition. Vol. 1. 2nd ed. Caballero B. (ur.). Amsterdam, Academic Press: 627–634 Copetti V.M. 2019. Yeasts and molds in fermented food production: an ancient bioprocess.
Current Opinion in Food Science, 25: 57–61
Deák T. 2003. Yeasts. V: Encyclopedia of food science and nutrition. Vol. 10. 2nd ed.
Caballero B. (ur.). Amsterdam, Academic Press: 6233–6239
Delcour J.A., Hoseney R.C. 2010. Principles of cereal science and technology. 3rd ed. St. Paul, AACC International, Inc.: 29–60, 177–197
Gélinas P. 2006. Yeast. V: Bakery products: science and technology. 1st ed. Hui Y.H. (ur.).
Ames, Blackwell Publishing: 173–185
Hrovat M. 2000. Surovine v pekarstvu in slaščičarstvu. Ljubljana, Tehniška založba Slovenije: 26–28
Incyto. 2010. Hemocytometer DHC-B02 (Burker Turk). Seonggeo-gil, Incyto: 1 str.
www.incyto.com/product/product04_detail.php (10.3.2021)
JUS E.M8.024. Određivanje aktivnosti pekarskog kvasca: metode za ispitivanje proizvoda industrije vrenja. Jugoslovenski standard sa obaveznom primenom od 1987-10-28.
1987: 3 str.
Kanc P. 2020. Uporaba različnih sevov kvasovk vrste Saccharomyces cerevisiae za pripravo kruha. Diplomsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 20 str.
Lane R. H. 1999. Cereal foods. V: Official methods of analysis of AOAC international. Vol.
2. 16th ed. Cunniff P. (ur.). Gaithersburg, AOAC International, Chapter 32: 1–43 Piškur J., Rozpędowska E., Polakova S., Merico A., Compagno C. 2006. How did
Saccharmyces evolve to become a good brewer? Trends in Genetics, 22, 4: 183–186 Pravilnik o kakovosti pekovskih izdelkov. 2015. Uradni list Republike Slovenije, 25, 11: 872-
874
Raspor P. 1996. Biotehnologija, osnovna znanja. Ljubljana, BIA: 495–473
Rozene J., Morkvenaite-Vilkonciene I., Bruzaite I., Zinovicius A., Ramanavicius A. 2021.
Baker’s yeast-based microbial fuel cell mediated by 2-methyl1,4-naphthoquinone.
Membranes, 11, 3: 182, doi: 10.3390/membranes11030182: 10 str.
Serna-Saldivar S. O. 2010. Cereal grains: properties, processing and nutritional attributes.
Boca Raton, CRC Press, Taylor and Francis Group: 752 str.
Struyf N., Van der Maelen E., Hemdane S., Verspreet J., Verstrepen K. J., Courtin C. M. 2017.
Bread dough and baker’s yeast: an uplifting synergy. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 16, 5: 850–867
Wirtz R.L. 2003. Grain, baking, and sourdough bread: A brief historical panorama. V:
Handbook of dough fermentations. Vol. 1. Kulp K., Lorenz K. (ur.). New York, Marcel Dekker, Inc: 1–6
Zhou W., Therdhai N., Willaert R. 2007. Bakery products. V: Handbook of food products manufacturing. Hui Y.H. (ur.). New Jersey, John Wiley & Sons: 259–507
Žnidaršič P., Pavko A. 2002. Praktikum iz biokemijskega inženirstva. Ljubljana, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Ljubljani: 14–29
ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem mentorju izr. prof. dr. Tomažu Požrlu za vso strokovno pomoč, nasvete in potrpežljivost, predvsem pa za odzivnost med nastajanjem mojega diplomskega dela.
Zahvaljujem se tudi recenzentki prof. dr. Poloni Jamnik za temeljit in strokoven pregled diplomske naloge, hkrati pa tudi za usmerjanje pri delu v laboratoriju.
Zahvalila bi se vsem, ki so mi pomagali pri praktičnem delu naloge, me spodbujali in usmerjali; Zdenki Zupančič, Mateju Šerganu, Maji Paš, Andreju Živkoviću in Niki Kozoderc.
Hvala Lini Burkan Makivić za tehnični pregled, odzivnost in vso pomoč pri oblikovanju diplomske naloge.
Zahvala pa gre tudi moji družini, fantu in prijateljem, ki ste me skozi celoten študij in proces pisanja diplomskega dela spremljali, spodbujali in mi bili v podporo.
Iskrena hvala vsem!
PRILOGE
Priloga A: Rastna krivulja kvasovk ZIM pri kultivaciji v večjem merilu
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
OD650
čas (h)
ZIM 2113 ZIM 3704
