BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
DIPLOMSKO DELO
BERNARDA FINŽGAR
UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Študijski program: Biologija in gospodinjstvo
Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov
DIPLOMSKO DELO
Mentorica: prof. dr. Nina Gunde-Cimerman Kandidatka: Bernarda Finžgar Somentorica: doc. dr. Polona Zalar
Ljubljana, marec 2012
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa Biologija in gospodinjstvo. Opravljeno je bilo v laboratorijih Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Študijska komisija na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete je za mentorico diplomskega dela imenovala prof. dr. Nino Gunde-Cimerman, za somentorico doc. dr.
Polono Zalar in za recenzentko prof. dr. Ines Mandić-Mulec.
Mentorica: prof. dr. Nina Gunde-Cimerman Somentorica: doc. dr. Polona Zalar
Recenzentka: prof. dr. Ines Mandić-Mulec.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Barbara Vilhar
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: prof. dr. Nina GUNDE-CIMERMAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: doc. dr. Polona ZALAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: prof. dr. Ines MANDIĆ-MULEC.
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Podpisana se strinjam z objavo svoje diplomske naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.
Datum zagovora:
Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Bernarda Finžgar
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dn
DK 577.2:582.282.23(043.2)=163.6
KG glive/kvasovke/Saccharomyces cerevisiae/morfologija/naravni habitati/ITS rDNA/industrijska okolja/življenjski krog
AV FINŽGAR, Bernarda
SA GUNDE-CIMERMAN, Nina (mentorica)/ZALAR, Polona (somentorica)/MANDIĆ- MULEC, Ines (recenzentka)
KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo LI 2012
IN Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov TD diplomsko delo (univerzitetni študij)
OP XII, 79 str., 23 pregl., 16 sl., 7 pril., 85 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Pivska kvasovka Saccharomyces cerevisiae je že od 60. let 20 stoletja evkariontski eksperimentalni organizem, ki je postal leta 1996 z določitvijo celotnega nukleotidnega zaporedja genoma še pomembnejši. Čeprav njena biokemijska vloga v fermentacijskem procesu dolgo časa ni bila pojasnjena, smo njen metabolizem in produkte uporabljali že tisočletja (npr. kruh, pivo, vino). Kvasovka S. cerevisiae je pomembno orodje za pridobivanje rekombinantnih proteinov (genska manipulacija). Predstavlja pa tudi velik potencial na področju biogoriv, proizvodnje bioetanola iz odpadnih materialov, kot je lignoceluloza. Kvasovka sicer pogosto naseljuje antropogena okolja, manj pa je znanega o njeni ekologiji. Namen diplomskega dela je bila selektivna izolacija vrste S. cerevisiae iz antropogenih in manj običajnih naravnih okolij. Cilj naloge je bila pridobitev sevov s potencialno neobičajnimi metaboličnimi lastnostmi za to vrsto, ki bi bile uporabne pri sintezi bioetanola. V sklopu diplomske naloge smo nabrali 273 različnih vzorcev, ki smo jih razdelili v 27 različnih skupin. Z uporabo selektivnega gojišča z dodatkom 10 % etanola smo izolirali 122 kvasnih kultur, ki smo jih sprva proučevali na ravni morfologije (barva, oblika) in mikromorfologije kolonij (velikost in oblika celic). Preverjali smo, ali so sevi homo- ali heterotalični ter v ta namen proučevali prisotnost spolnih struktur (aski, askospore) na acetatnem agarju. Dokončna identifikacija je potekala na molekularno-genetskem nivoju s primerjavo nukleotidnih zaporedij regij notranjih distančnikov 1 in 2, vključno s 5,8S rDNA zaporedjem (ITS rDNA). Iz 122 vzorcev smo izolirali 44 sevov kvasovke vrste S.
cerevisiae. Vrsto S. cerevisiae smo najpogosteje izolirali iz vinogradniških vzorcev ter vod industrijskih okolij, posamezne seve pa smo izolirali tudi iz mlečnih izdelkov, sveže stisnjenih nepasteriziranih sadnih sokov, tal pod sadnim drevjem, sadjem in zelenjavo, iz žuželk, domačega kisa, razgrajenega lesa, svežega in gnilega sadja in zelenjave ter iz silaže. Sevom S. cerevisiae smo določili asimilacijski, fermentacijski in temperaturni profil ter opazovali odstopanja med posameznimi sevi.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Dn
DC 577.2:582.282.23(043.2)=163.6
CX fungi/ yeast/Saccharomyces cerevisiae/morphology/natural habitat/ITS rDNA/
industrial environment/life cycle AU FINŽGAR, Bernarda
AA GUNDE-CIMERMAN, Nina (supervisor)/ZALAR, Polona (co-advisor)/MANDIĆ- MULEC, Ines (reviewer)
PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Faculty of education, Biology – home ecomomics University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology PY 2012
TI Isolation of yeast Saccharomyces cerevisiae from unusual natural habitats DT Graduation Thesis (University studies)
NO XII, 79 p., 23 tab., 16 fig., 7 ann., 85 ref.
LA sl AL sl/en
AB Baker yeast Saccharomyces cerevisiae has been an eukarontic experimental organism since 1960s, becoming even more significant with the determination of its complete nucleotide genome sequence in 1996. Even though its biochemical function in the fermentation process had long remained unclear, its metabolism and products (eg. bread, beer, wine) have been used for millennia. S. cerevisiae yeast represents an important organism for production of recombinant proteins (gene manipulation). Moreover, it exhibits great potential for biofuels and the process of bioethanol production from waste materials such as lignocellulose. The yeast is generally found in anthropogenic environments, yet little is known about its ecology. The purpose of this given thesis was to perform a selective isolation of the S. cerevisiae species from both anthropogenic and less common natural habitats. The aim was to aquire strains with metabolic properties that would be potentially uncommon for the species, yet effective in bioethanol synthesis. In the scope of the research, 273 collected samples were divided into 27 different groups. Through the use of a selective growth medium with the addition of 10 % ethanol, 122 yeast cultures were isolated and initially defined according to their morphology (colour, shape) and micromorphology (cell size and shape). In order to identify the strains according to their homothallic or heterothallic properties, the presence of sexual structures (asci, ascospores) was examined on acetate agar. The concluding identification took place at the molecular genetic level through the comparison of nucleotide sequencing of the regions of internal transcribed spacers 1 and 2, including the 5.8S rDNA sequence (ITS rDNA). From the 122 samples, 44 strains of the S.
cerevisiae yeast were isolated. The S. cerevisiae species was typically isolated from vinicultural samples and industrial environment waters, whereas individual strains were isolated also from dairy products, freshly squeezed non-pasteurized juices, the ground beneath fruit trees, fresh or rotten fruits and vegetables, insects, vinegar, decomposed wood, and from silage. The S. cerevisiae strains were determined according to their assimilation, fermentation and temperature profiles, and the differences among individual strains were examined.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO PREGLEDNIC ... VIII KAZALO SLIK ... IX KAZALO PRILOG ... X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... XI
1 UVOD ... 1
1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE ... 2
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 KVASOVKA SACCHAROMYCES CEREVISIAE ... 3
2.1.1 Osnovna opredelitev kvasovke Saccharomyces cerevisiae... 3
2.1.2 Taksonomija kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 3
2.1.3 Uporaba kvasovke Saccharomyces cerevisiae skozi zgodovino do danes... 4
2.1.4 Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 5
2.1.4.1 Oblika in velikost celic in kolonij kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 5
2.1.5 Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 5
2.1.5.1 Genom kvasovke Saccharomyces cerevisiae... 5
2.1.5.1.1 Ribosomska DNA kvasovk ... 6
2.1.5.2 Hibridi rodu Saccharomyces ... 6
2.1.6 Življenjski krog kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 7
2.1.6.1 Razmnoževanje kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 7
2.1.7 Fermentacijski sistemi in produkti kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 8
2.1.7.1 Potrebna temperatura in pH za rast kvasovk... 8
2.1.7.2 Kisik kot vir energije ... 8
2.1.7.3 Prehrana in presnova pri kvasovkah ... 9
2.1.7.3.1 Presnova ogljika pri kvasovkah ... 9
2.1.7.3.2 Presnova sladkorjev do etanola ... 9
2.1.7.3.3 Ostali produkti presnove sladkorjev ... 10
2.1.7.3.4 Presnova dušika pri kvasovkah ... 10
2.1.7.4 Tehnološko industrijska uporabnost produktov kvasovk ... 10
2.1.7.4.1 Izrabljanje produktov kvasovke S. cerevisiae v prehrambeni industriji . 10 2.1.7.4.2 Uporaba kvasovke S. cerevisiae v pivovarstvu ... 11
2.1.7.4.3 Proizvodnja bioetanola z razgradnjo lignoceluloze ... 11
2.1.7.4.4 Uporabnost kvasovke S. cerevisiae pri rekombinantnih tehnikah ... 12
2.1.8 Ekologija kvasovke S. cerevisiae in njeni habitati ... 13
2.1.8.1 Poznana nahajališča kvasovke S. cerevisiae iz industrijskih procesov ... 13
2.1.8.2 Nahajališča kvasovke S. cerevisiae v naravi ... 14
2.2 METODIKA PROUČEVANJA KVASOVK ... 14
2.2.1 Metodika izolacije kvasovk ... 14
2.2.1.1 Vzorčenje, izolacija in gojenje kvasovk na gojiščih ... 14
2.2.2 Metode identifikacije kvasovk ... 15
2.2.2.1 Klasične metode identifikacije kvasovk ... 15
2.2.2.1.1 Morfološke metode ... 15
2.2.2.1.2 Fiziološke značilnosti ... 16
2.2.2.2 Molekularne metode identifikacije ... 16
3 MATERIAL IN METODE ... 17
3.1 MATERIAL ... 17
3.1.1 Mikrobiološka gojišča za gojenje kvasovk ... 17
3.1.2 Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae... 18
3.1.3 Raztopine, pufri in zmesi... 21
3.1.4 Reagenti ... 23
3.1.5 Kemikalije ... 23
3.1.6 Laboratorijska oprema ... 25
3.2 METODE ... 25
3.2.1 Vzorčenje... 25
3.2.2 Izolacija kvasovk iz nabranih vzorcev ... 27
3.2.2.1 Priprava vzorcev in anaerobno gojenje v tekočem gojišču ... 27
3.2.2.2 Aerobno gojenje na trdem gojišču ... 27
3.2.2.3 Izbira in redčenje kulture do posameznih kolonij ... 27
3.2.2.4 Shranjevanje ... 27
3.2.3 Določevanje fenotipskih lastnosti ... 28
3.2.3.1 Morfologija kolonij ... 28
3.2.3.2 Morfologija kvasnih celic ... 28
3.2.3.3 Morfologija askospor ... 28
3.2.4 Določevanje genotipskih lastnosti ... 28
3.2.4.1 Izolacija genomske DNA ... 28
3.2.4.1.1 Izolacija genomske DNA z izolacijskim kitom Prepman Ultra® ... 28
3.2.4.1.2 Ekstrakcija DNA z mehansko lizo ... 28
3.2.4.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR) ... 29
3.2.4.3 Gelska elektroforeza ... 30
3.2.4.4 Določanje in obdelava nukleotidnega zaporedja ... 30
3.2.4.5 Shranjevanje izoliranih kvasovk ... 30
3.2.5 Asimilacijske, fermentacijske in encimske lastnosti ... 30
3.2.5.1 Asimilacijske lastnosti ... 30
3.2.5.2 Fermentacijske lastnosti ... 31
3.2.5.3 Encimske lastnosti ... 31
3.2.5.4 Temperaturni testi ... 31
3.2.6 Parjenje haploidnih sevov Saccharomyces cerevisiae ... 31
4 REZULTATI ... 32
4.1 OPIS VZORCEV ... 32
4.1.1 Izolacija kvasovk glede na skupine vzorcev ... 36
4.1.1.1 Brezalkoholne gazirane pijače ... 39
4.1.1.2 Citrusi ... 39
4.1.1.3 Domači kis ... 40
4.1.1.4 Gnilo sadje in zelenjava ... 40
4.1.1.5 Gobe, lišaji ... 40
4.1.1.6 Gozdna stelja (listni drobir) ... 40
4.1.1.7 Jagodičevje ... 40
4.1.1.8 Mlečni izdelki ... 41
4.1.1.9 Razgrajen les ... 42
4.1.1.10 Silaža ... 42
4.1.1.11 Sladki sadeži ... 42
4.1.1.12 Sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo ... 43
4.1.1.13 Vinogradniški vzorci ... 43
4.1.1.14 Voda iz industrijskih okolij ... 44
4.1.1.15 Tla pod sadnimi drevesi, sadjem, zelenjavo ... 46
4.1.1.16 Žuželke (vinske mušice) ... 46
4.2 IZOLACIJA IN IDENTIFIKACIJA KVASOVKE S. CEREVISIAE ... 47
4.2.1 Vzorci, iz katerih smo izolirali kvasovko Saccharomyces cerevisiae... 47
4.2.2 Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 49
4.2.3 Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 54
4.2.4 Fiziološki testi sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae ... 56
4.2.5 Parjenje haploidnih sevov na acetatnem agarju ... 60
5 RAZPRAVA IN SKLEPI ... 62
5.1 RAZPRAVA ... 62
5.1.1 Rod Saccharomyces ... 65
5.1.2 Druge kvasovke ... 66
5.2 SKLEPI ... 67
5.3 ANALIZA UČNIH NAČRTOV ZA OSNOVNO ŠOLO ... 68
5.3.1 Obravnavanje mikroorganizmov v izobraževalnem procesu ... 68
6 POVZETEK ... 71
7 VIRI ... 73
PRILOGE ... 80
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Taksonomska opredelitev kvasovke S. cerevisiae. ... 3
Preglednica 2: Seznam reagentov s proizvajalci. ... 23
Preglednica 3: Seznam kemikalij s proizvajalci. ... 23
Preglednica 4: Seznam laboratorijske opreme. ... 25
Preglednica 5: Seznam možnih nahajališč oz. vzorčenih substratov za uspevanje kvasovke S. cerevisiae. .... 26
Preglednica 6: PCR-mešanica za en vzorec. ... 29
Preglednica 7: PCR-program. ... 30
Preglednica 8: Pregled skupin vzorcev glede na izvor in število vzorcev, število vseh kvasnih izolatov in izolatov kvasovke S. cerevisiae kot delež med vsemi kvasnimi izolati. ... 32
Preglednica 9: Opis vzorcev po skupinah glede na kraj, število vseh odvzetih vzorcev in število pozitivnih izolatov na kvasovke. ... 36
Preglednica 10: Spisek kvasnih izolatov iz površin gob in lišajev. ... 40
Preglednica 11: Spisek kvasnih izolatov iz mlečnih izdelkov. ... 41
Preglednica 12: Spisek kvasnih izolatov iz razgrajenega lesa. ... 42
Preglednica 13: Spisek kvasnih izolatov iz silaže. ... 42
Preglednica 14: Spisek kvasnih izolatov iz sveže stisnjenih nepasteriziranih sadnih sokov. ... 43
Preglednica 15: Spisek kvasih izolatov iz vinogradniških vzorcev. ... 44
Preglednica 16: Spisek kvasih izolatov iz vod v industrijskih okoljih. ... 45
Preglednica 17: Spisek kvasih izolatov iz tal pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo. ... 46
Preglednica 18: Izolati vseh sevov S. cerevisiae z opisom vzorca za izolacijo ... 47
Preglednica 19: Morfološke lastnosti izoliranih sevov S. cerevisiae. ... 51
Preglednica 20: Primerjava ITS zaporedij sevov S. cerevisiae s tipskim sevom: primerjava dolžine pomnožka in zaporedja, odstotka podobnosti po BLAST algoritmu in odstotka ujemanja (sorodnosti). ... 55
Preglednica 21: Asimilacijski profili sevov S. cerevisiae po 21 dneh inkubacije. ... 57
Preglednica 22: Rezultati fermentacijskih testov glukoze, saharoze, maltoze in ksiloze pri izbranih sevih S. cerevisiae po 28 dneh inkubacije... 60
Preglednica 23: Kombinacije parjenja sevov S. cerevisiae, ki tvorijo askospore. ... 61
KAZALO SLIK
Slika 1: Kolonije in oblika celic S. cerevisiae. ... 5
Slika 2: Shematski prikaz enot rDNA. ... 6
Slika 3: Življenjski krog kvasovke (menjava haploidne in diploidne generacije). ... 7
Slika 4: Zastopanost posamezne skupine vzorcev glede na število vseh vzorcev. ... 34
Slika 5: Osnovne izolacijske plošče gojišča MEA s kloramfenikolom. ... 35
Slika 6: Število vseh kvasnih izolatov razporejeno na izolate sevov vrste S. cerevisiae in na izolate drugih kvasovk po skupinah vzorcev. ... 38
Slika 7: Zastopanost posameznih vrst kvasovk med izolati... 39
Slika 8: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz mlečnih izdelkov. ... 41
Slika 9: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz vinogradniških vzorcev . ... 43
Slika 10: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz voda industrijskih okolij. ... 45
Slika 11: Primerjava števila nabranih vzorcev s številom vseh izolatov kvasovk in številom izoliranih sevov S. cerevisiae po skupinah vzorcev. ... 48
Slika 12: Deleži izoliranih sevov S. cerevisiae po skupinah vzorcev. ... 49
Slika 13: Osnovna izolacijska gojišča MEA + Ch in YM s kolonijami S. cerevisiae. ... 50
Slika 14: Posamezne kvasne celice različnih sevov S. cerevisiae ... 53
Slika 15: Mikrografije mikroskopskih preparatov po acidorezistentnem barvanju sevov S. cerevisiae pod različnimi povečavami... 54
Slika 16: Parjenje sevov S. cerevisiae pri 400× in 1000× povečavi. ... 61
KAZALO PRILOG
Priloga A: Opis vzorcev s krajem vzorčenja po skupinah vzorcev za vse seve kvasovk.
Priloga B: Opis vzorcev, iz katerih nismo izolirali kvasovk, s krajem vzorčenja po skupinah vzorcev.
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ATP energetsko bogata molekula adenozin 5-trifosfat
ATPaza adenozintrifosfataza, encim, ki katalizira hidrolizo APT-ja v ADP in fosfat BLAST osnovno iskalno orodje lokalne poravnave (Basic Local Alignment Search Tool) bp bazni par
CBS mikrobiološka zbirka gliv Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht Ch kloramfenikol
CTAB cetil trimetil amonijev bromid DNA deoksiribonukleinska kislina dNTP deoksinukleotid trifosfat EDTA etidiaminotetrocetna kislina EtOH etanol
EXF Mikrobiološka zbirka gliv na Katedri za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov, Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani
FADH2 koencim, prenašalec elektronov (»Flavin Adenine Dinucleotide«) GTP energetsko bogata molekula gvanozin 5-trifosfat
ITS notranji distančniki, ki ločujejo rDNA posameznih ribosomskih podenot (»Internal Transcribed Spacer«)
MEA agar s sladnim ekstraktom (»Malt Extract Agar«)
mRNA obveščevalna (»Messenger«) RNA, ki prenaša genetično sporočilo iz jedra do ribosomov v citoplatmi
mtDNA mitohondrijsko zaporedje DNA
NAD koencim, prenašalec elektronov (»Nicotinamide Adenine Dinucleotide«) NADH na NAD vezan vodikov elektron
NCBI internetna baza podatkov »National Center for Biotechnology Information«
PCR polimerazna verižna reakcija (»Polymerase Chain Reaction«) PDA krompirjev agar z glukozo (»Potato Dextrose Agar«)
rDNA zaporedje DNA, ki kodira ribosomsko RNA
RNAza encim, ki cepi molekule RNA RNA ribonukleinska kislina
sp. vrsta (»species«)
TBE Tris-boratni elektroforezni pufer
TE Tris-EDTA
Tris 2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol
tRNA prenašalna (»Transfer«) RNA, ki prenaša potrebne aminokisline za sintezo beljakovin do mRNA na ribosomih
UREA sečnina oz. organska spojina (NH2)2CO za presnovo dušikovih spojin
YCB definirano gojišče z univerzalnim virom ogljika, brez vira dušika (»Yeast Carbon Base«)
YE kvasni ekstrakt (»Yeast extract«)
YM agar s sladno-kvasnim ekstraktom (»Yeast-Malt extract«)
YNB definirano gojišče z univerzalnim virom dušika, brez vira ogljika (»Yeast Nitrogen Base«)
1 UVOD
Eden glavnih problemov današnje družbe je zadovoljitev energetskih potreb in zamenjava surovin fosilnih materialov z obnovljivimi viri. S tem bi zmanjšali onesnaževanje s toplogrednimi plini. Bioetanol predstavlja primeren in vzdržen obnovljiv alternativni vir energije, primeren je tudi kot transportno gorivo, predvsem pa bi veliko doprinesel k zmanjševanju emisij toplogrednih plinov v primerjavi z naftnim bencinom.
Dandanes je vsa proizvodnja bioetanola usmerjena v tehnologijo prve generacije, pri katerih uporabljajo surovine, kot so trsni sladkor ali žitni škrob, vendar je produkcija nezadovoljiva glede na potrebe. Velik potencial za proizvodnjo etanola kot goriva predstavljajo lignocelulozni materiali kot druga generacija biogoriv. Glavni obetajoči viri so različni odpadni produkti lignoceluloze v kmetijstvu (koruzna stebla, pšenična in ječmenova slama, vlakna sladkornega trsa), odpadni produkti iz gozdov, papirne industrije in komunalnih vod. Procesi uporabe lignoceluloznih zalog za produkcijo bioetanola so še vedno v razvojni fazi in potrebujejo tehnološki preboj, da bodo postopki postali ekonomično izvedljivi. Procese sestavljajo štiri glavne tehnološke operacije: predhodna obdelava surovin materialov, hidroliza ogljikovih polimerov v sladkorje, fermentacija sladkorjev z mikroorganizmi do etanola in destilacija oz. separacija do čistega etanola.
Med mikroorganizmi je predvsem kvasovka vrste Saccharomyces cerevisiae prednostni organizem, ki je sposoben produkcije etanola. Zaradi tega se mednarodni evropski 7.
okvirni projekt NEMO (Novel high performance enzymes and micro-organisms for conversion of lignocellulosic biomass to bioethanol) v okviru enega od glavnih ciljev osredotoča na izboljšavo lastnosti kvasovk, predvsem vrste S. cerevisiae. Namen je vzgojiti bolj učinkovit mikroorganizem, primeren za razgradnjo heksoznih in pentoznih sladkorjev, v kombinaciji z visoko toleranco na povišan etanol, temperaturo in biomasne inhibitorje.
Projekt temelji na raziskovanju in razvijanju novih tehnologij z uporabo nenavadno visokozmogljivih encimov in najbolj tolerantnih mikroorganizmov. Etanolni doprinos fermentacije ksiloze in arabinoze (pentoze) je dokaj nizek v primerjavi s heksoznimi sladkorji, zato poleg večjega doprinosa etanola poskušajo zmanjšati ostale produkte (npr.
ksilitol in glicerol).
Vrsta Saccharomyces cerevisiae je poznana že iz zgodovine s tradicionalnih področij pridelave kruha, vina, piva in mošta. Zasledili so jo v vinogradih, grozdju in drugem sadju, na insektih, hrastovem in drugem lubju in v tleh pod drevesi (Diezmann in Dietrich, 2009;
Erlend s sod., 2006), kot kvarljivca hrane in pri ostalih fermentacijskih procesih (Pitt in Hocking, 1999). Na splošno lahko izpostavimo, da se kvasovka nahaja v zelo raznolikih habitatih v naravi, saj za svojo rast potrebuje zadostno količino ogljikovih virov (npr.
glukozo, fruktozo, manozo, galaktozo, saharozo in maltozo ob prisotnosti kisika) (Boulton in Quain, 2001).
V diplomskem delu smo želeli dobiti vpogled v naravne habitate kvasovke Saccharomyces cerevisiae. Na podlagi že opisanih nahajališč v literaturi in možnih nahajališč smo nabirali različne vzorce ter iz njih z uporabo selektivne metode izolacije osamili kvasovke.
Osredotočili smo se na kvasovke, ki so bile morfološko podobne vrsti Saccharomyces cerevisiae. Izolate smo najprej morfološko okarakterizirali in jih nato identificirali na
osnovi molekularnogenetskih značilnosti. Preverjali smo tudi njihove metabolične sposobnosti asimilacije različnih virov ogljika in dušika ter fermentacijo.
1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE
V diplomskem delu smo imeli namen izolirati čim večje število sevov kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz naravnih, raznolikih nahajališč, poznanih že iz literature, in iz različnih potencialnih nahajališč.
Cilj diplomske naloge je bil, da seve kvasovke S. cerevisiae morfološko opredelimo na podlagi fenotipskih lastnosti (morfologija kolonij, mikroskopska morfologija celic, acidorezistentno barvanje askospor, UREA testi) in izolate molekularno identificiramo s pomočjo genotipskih lastnosti kvasovke do vrste z nukleotidnim zaporedjem ITS rDNA z uporabo metode PCR.
Predvidevali smo, da se pojavljajo določene razlike med sevi kvasovk glede zmožnosti asimilacije različnih virov ogljika, dušika in zmožnosti rasti pri različnih temperaturah.
Glede teh lastnosti smo pričakovali možne razlike med sevi v sklopu znotrajvrstne variabilnosti.
2 PREGLED OBJAV
2.1 KVASOVKA SACCHAROMYCES CEREVISIAE
2.1.1 Osnovna opredelitev kvasovke Saccharomyces cerevisiae
Kvasovka vrste Saccharomyces cerevisiae je enocelični mikroorganizem iz kraljestva gliv, ki se razmnožuje z brstenjem, zatorej ne tvori spor v/na plodiščih (Walker, 2009). Je najbolj natančno proučen evkariontski organizem na celičnem, molekulskem in genetskem nivoju, zato služi kot model ekoloških in evolucijsko-genetskih študij (Landry s sod., 2006).
2.1.2 Taksonomija kvasovke Saccharomyces cerevisiae
Kvasovko S. cerevisiae taksonomsko uvrščamo med askomicetne glive kvasovke (Walker, 2009). Taksonomska opredelitev kvasovke S. cerevisiae je prikazana v preglednici 1.
Preglednica 1: Taksonomska opredelitev kvasovke S. cerevisiae (NCBI).
Taksonomska kategorija Opredelitev S. cerevisiae Domena Eukarya (evkariont)
/ Opisthokonta Kraljestvo Fungi (glive) Podkraljestvo Dikarya
Deblo Ascomycota / Saccharomyceta Poddeblo Saccharomycotina
Razred Saccharomycetes (kvasovke) Red Saccharomycetales
Družina Saccharomycetaceae Rod Saccharomyces
Vrsta Saccharomyces cerevisiae
Glive (lat. Fungi) so evkariontski organizmi, ki jih uvrščamo v posebno kraljestvo.
Predstavljajo obsežno in raznoliko skupino organizmov, ki jih medsebojno povezuje morfologija, način prehranjevanja in ekologija. So heterotrofni organizmi, saj je njihova rast odvisna od organsko vezanega ogljika. Kot saprofiti pridobijo za svoj obstoj potrebna hranila iz odmrlih delov organizmov s pomočjo razgradnje na račun zelo raznolikih hidrolitičnih encimov. Manjše organske molekule pa nato absorbirajo v celice preko celične stene in membrane (Solomon s sod., 2005).
Kraljestvo gliv delimo na štiri debla glede na tvorbo spolnih spor: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota in Basidiomycota. Včasih so askomicetne glive razporejali glede na ureditev askov, danes pa askomicetne glive razvrščamo na podlagi razvoja askov in plodišč, po načinu in odprtju askov ter sproščanju askospor.
Posebnost debla Ascomycota so glive, ki jih uvrščamo v red Saccharomycetales, saj tvorijo posamezne celice, ki jih imenujemo kvasovke. Kvasovke so kljub podobni rasti in ekološkim podobnostim heterogena skupina. Najdemo jih tako med zigomicetnimi,
bazidiomicetnimi (npr. Cryptococcus spp. in Rhodotorula spp.) in askomicetnimi glivami (npr. Saccharomyces spp.) (Walker, 2009).
2.1.3 Uporaba kvasovke Saccharomyces cerevisiae skozi zgodovino do danes
Vrsta Saccharomyces cerevisiae je sinonim za kvasovke, katere predstavnike imenujemo po vrsti kvasovke v pivskem sladu, opazovani leta 1837. Ta vrsta je po vsej verjetnosti najstarejši gojeni mikroorganizem. Zapisi pričajo o uporabi kvasovke pri varjenju piva v Sumeriji in Babilonu že 6000 let pr. n. št. V tistem času je bila S. cerevisiae uporabljena tudi v Gruziji pri obdelavi grozdja in v Egiptu kot krušni kvas (Feldman, 2005). Na njeno uporabo kaže tudi najdba kvasovke v keramičnem posodi za vino v grobnici enega od prvih kraljev Egipta, Scorpiona I, ki je vladal 3150 let pr. n. št. (Landry s sod., 2006).
Kvasovka S. cerevisiae lahko fermentira sladkor (Feldman, 2005). Biokemijska vloga kvasovke v fermentacijskem procesu dolgo časa ni bila pojasnjena, kljub temu da so produkt procesa uporabljali že tisočletja. To specifično lastnost so uporabljali pri proizvodnji alkoholnih pijač (npr. vino, pivo), prehrani (npr. kruh, kefir) in medicinski uporabi (npr. antibiotiki in encimi). Van Leeuwenhoek je leta 1680 prvi opazoval kvasne celice pod mikroskopom (Kavanagh, 2005). Zaradi edinstvenih lastnosti je postala raziskovalni organizem. Prve študije o kvasovki je zapisal Louis Pasteur (Études sur la bière) leta 1857 (Feldman, 2005), šele leta 1863 pa je dokončno pojasnil toliko let nepoznano biokemijsko vlogo Saccharomyces cerevisiae v fermentacijskem procesu (Feldman, 2005; Kavanagh, 2005).
Kvasovka S. cerevisiae je postala modelni eksperimentalni organizem okoli leta 1960, ko so jo začeli uporabljati kot eksperimentalni sistem v molekularni biologiji. Kasneje, leta 1980, je bila uporabljena kot gostiteljski organizem pri proizvodnji zdravila za hepatitis B (Feldman, 2005). Leta 1996 pa je postala prvi evkariontski organizem, pri katerem so določili celotno nukleotidno zaporedje genoma (Feldman, 2005; Kavanagh, 2005). Po sekveniranju genoma so znanstveniki določili funkcijo 6000 genov (Solomon s sod., 2005).
V naslednjih letih je kvasovka postala uporabna referenca za določitev homologije sekvenc pri človeških, živalskih ali rastlinskih genih in pri primerjalnih študijah mnogih enoceličnih organizmov (Feldman, 2005). Kvasovka je imela pomembno vlogo pri razvoju različnih tehnologij in je utrla pot biološkim raziskavam z uporabo tehnike rekombinantnih DNA (Kavanagh, 2005).
Ugotovljeno je, da je kvasovka idealni sistem za uspešno proučevanje celične zgradbe in osnovnih celičnih mehanizmov. V primerjavi z ostalimi evkariontskimi modelnimi organizmi ima Saccharomyces cerevisiae naslednje prednosti:
- Je enocelični organizem, ki ga v nasprotju z bolj kompleksnimi evkarionti, lahko gojimo na različnih gojiščih, kar zagotavlja popoln nadzor nad okoljskimi parametri.
- Je uporaben mikroorganizem za različne klasične in genetske tehnike.
- Je primer, s katerim so dokazali, da so se bistvene celične funkcije ohranile vse od kvasovk do sesalcev.
- Generacijski čas kvasovke je približno 80 min, saj je masovna produkcija celic zato hitra.
- Enostavni postopki izolacije visoke molekulske mase DNA za rDNA, mRNA in tRNA (Feldman, 2005; Walker, 2009).
Čeprav je kvasovka vrste Saccharomyces cerevisiae dobro proučena kot modelni eksperimentalni organizem s poznanim nukleotidnim zaporedjem celotnega genoma, pa kljub temu zelo malo vemo o njenih naravnih habitatih in populacijski genetiki (Sampaio in Gonçalve, 2008).
2.1.4 Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae
2.1.4.1 Oblika in velikost celic in kolonij kvasovke Saccharomyces cerevisiae
Vrsta S. cerevisiae tvori na trdih gojiščih okrogle do eliptične kolonije z gladkim robom.
Profil kolonije je gladek, lahko pa je kolonija tudi popkasto oblikovana (umbilicirana kolonija). Kolonije so rahlo pigmentirane – kremne barve (Barnett s sod., 2000; Walker, 2009) in mazave. V tekočem gojišču lahko opazimo sedimentacijo in flotacijo celične mase. Sedimentacija je granulirana (Pitt in Hocking, 1999).
Velikost kvasnih celic je lahko zelo različna glede na razvojno stopnjo, vrste in pogoje za rast. Celice vrste Saccharomyces cerevisiae (glej sliko 1) so eliptične do jajčaste oblike, dolge od 5 do 10 µm in široke od 1 do 7 µm. Povprečni celični volumen kvasovke je 29 µm3 za haploidno in 55 µm3 za diploidno celico (Feldman, 2005). Askospore so kroglaste oblike in gladke. Aski so lahko kroglasti ali elipsoidni (Pitt in Hocking, 1999).
Slika 1: Kolonije in oblika celic S. cerevisiae (Pitt in Hocking, 1999; CBS baza podatkov).
A: kolonija na MEA, B, C: celice kolonije različne povečave, D: aski in askospore
2.1.5 Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae 2.1.5.1 Genom kvasovke Saccharomyces cerevisiae
Genom kvasovke S. cerevisiae je znan že več kot deset let. Kvasni genom vsebuje okoli 6000 genov, ki so locirani na 16 kromosomih (Landry s sod., 2006). Vsebuje relativno majhen, zelo racionalno izkoriščen genom z 12,5 Mb neponavljajočih zaporedij DNA.
(Kavanagh, 2005; Feldman, 2005). Na začetku zaporedja je 1200 genov ribosomskih ponovitev (rDNA), ki kodirajo RNA in beljakovine. Ta regija se pogosto uporablja pri filogenetskih študijah (Feldman, 2005). Poleg jedrnega genoma, ki v haploidnem laboratorijskem sevu predstavlja 70 do 80 % skupne dednine, vsebujejo kvasovke še mitohondrijsko DNA (Kavanagh, 2005).
2.1.5.1.1 Ribosomska DNA kvasovk
Glavni razlog za pogosto uporabo ribosomske DNA v molekularno-genetski identifikaciji je prisotnost gena v številnih kopijah. Poleg tega so ribosomi prisotni pri vseh kvasnih celicah in so evolucijsko zelo ohranjeni (van de Peer s sod., 1997).
Vsaka enota rDNA je sestavljena iz nukleotidnega zaporedja za ribosomsko RNA, ki kodira malo podenoto – 18S rDNA (SSU) in veliko podenoto – 28S rDNA (LSU), ter 5.8S rDNA. Te funkcionalne regije so ločene med seboj z vmesniki. SSU (»small subunit«) rDNA in LSU (»large subunit«) rDNA sta ločeni z zunanjima prepisnima vmesnikoma (ETS) in neprepisnima vmesnikoma (NTS). Oba vmesnika imenujemo medgenska vmesnika (IGS). 5.8S rDNA je vrinjena med dva notranja prepisna vmesnika (ITS1, ITS2).
Regija ITS se nahaja znotraj zapisa za 18S in 28S. Geni, ki kodirajo posamezno enoto rDNA (18S, 5.8S in 28S) se navadno nahajajo v tandemu, te pa se lahko ponavljajo od sto do tisočkrat v genomu in predstavljajo približno 10 % celotnega genoma (Hwang in Kim, 1999).
Slika 2: Shematski prikaz enot rDNA (Hwang in Kim, 1999: 216).
ETS – zunanja prepisna vmesnika, NTS – zunanji neprepisni vmesnik, IGS – medgenski vmesnik (ETS, NTS), ITS1 in ITS2 – notranja prepisna vmesnika
Za kvasovko S. cerevisiae je značilno, da ima regijo rDNA bogato z adeninom in timinom (A + T). Avtonomna ponavljajoča sekvenca (Autonomously replicating sequence ARS) je pri kvasovki S. cerevisiae: (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) (Palzkil s sod., 1986).
2.1.5.2 Hibridi rodu Saccharomyces
Evoluciji hibridov vrst Saccharomyces lahko sledimo preko zapisa DNA. Zelo sorodne vrste imajo te zapise zelo identične in jih uvrščamo v skupino Saccharomyces sensu stricto; druge, manj kompatibilne oz. manj podobne seve pa v skupino Saccharomyces sensu lato (Sampaio in Gonçalve, 2008).
Sodobnejše filogenetske študije v rodu Saccharomyces priznavajo osem vrst: S. bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus, S. pastorianus, S. uvarum, S. cariocanus, S. kudriavzevii in S.
mikatae. Večina teh vrst se je razvijala ločeno. Vrsti S. pastorianus in S. bayanus pa naj bi bili hibrida, saj je v njunih genomih zaslediti nukleotidna zaporedja tako S. cerevisiae kot S. uvarum (Sampaio in Gonçalve, 2008). Kvasovke rodu Saccharomyces sensu stricto predstavljajo šest vrst in en naravni hibrid (Liti s sod., 2006).
V skupino Saccharomyces sensu stricto, poleg S. cerevisiae, spadajo še najbližji sorodniki S. bayanus, S. pastorianus in S. paradoxus (Boulton in Quain, 2001). Najbližji sorodnik S.
cerevisiae po sekvenci je S. paradoxus (Liti s sod., 2006). Najbolj sorodne znotraj skupine delimo lahko v dve skupini, in sicer S. bayanus in S. pastorianus ter S. cerevisiae in S.
paradoxus glede na temperaturno odzivnost (Boulton in Quain, 2001). Nekateri dokazi jasno kažejo, da različne temperature rasti posameznih vrst igrajo pomembno vlogo pri križanju različnih vrst Saccharomyces in nastajanju novih hibridov (Sampaio in Gonçalve, 2008). Skupini cerevisiae in bayanus sta zmožni rasti pri nižji maksimalni in optimalni temperaturi in imata značilen transport fruktoze preko aktivnega protonskega transporta.
Križanci med skupinama cerevisiae in bayanus so stabilni genetski hibridi. Jedro in mitohondrijska DNA sta podedovana od enega organizma s fragmenti DNA obeh organizmov (Boulton in Quain, 2001). Edino vrst S. kudriavzevii in S. uvarum sta zmožni rasti pri še nižji temperaturi kot S. cerevisiae in S. paradoxus iz skupine Saccharomyces sensu stricto (Liti s sod., 2006).
Odkriti so bili tudi hibridi med vrstama Saccharomyces cerevisiae in Saccharomyces kudriavzevii, hibridi med S. cerevisiae in S. bayanus in trojni hibrid S. bayanus × S.
cerevisiae × S. kudriavzevii (Gonzalez s sod., 2006).
2.1.6 Življenjski krog kvasovke Saccharomyces cerevisiae 2.1.6.1 Razmnoževanje kvasovke Saccharomyces cerevisiae
Kvasovka Saccharomyces cerevisiae je zelo dobro proučen organizem z zelo jasno določenim, kompleksnim življenjskim krogom (Landry s sod., 2006; Kavanagh, 2005).
Življenjski krog kvasovke lahko delimo na dve stopnji: (1) nespolno razmnoževanje poteka v obliki brstenja ter (2) spolno razmnoževanje kot parjenje in sporulacija (nastanek askospor). Bistvo življenjskega kroga kvasovke je, da celice izmenjujejo spolno in nespolno fazo (glej sliko 3) (Landry s sod., 2006).
Slika 3: Življenjski krog kvasovke (menjava haploidne in diploidne generacije).
Kvasovko S. cerevisiae po navadi v naravi najdemo kot enocelični diploidni (2n) organizem (Landry s sod., 2006; Hartwell, 1974). Razmnoževanje in rast celic S.
cerevisiae so v splošnem vezani na brstenje. To je nespolno razmnoževanje (mitoza), ki poteka na specifični lokaciji na površini materinske celice. Brstenje zagotavlja, da hčerinska celica dobi celotno kopijo genetskega materiala materinske celice (Kavanagh, 2005). Po prepisu genetskega materiala na obe nastajajoči celici se del celične stene
podaljša in zraste v hčerinsko celico. Novonastali brst lahko odpade, ko je še zelo majhen, ali pa zraste na materinski celici skoraj do končne velikosti. Včasih nekaj brstov ostane med seboj povezanih (Zalar in Gunde-Cimerman, 2002). Brazgotine brsta (t. i. porodne brazgotine) so specifične in se kažejo kot izbokline na celični površini. Ostanejo na obeh celicah po delitvi in nastanku nove hčerinske celice (Feldman, 2005). Po poteku mitoze nastaneta torej dve genetsko enaki diploidni celici.
Proces nespolnega razmnoževanja lahko omejujejo določeni okoljski parametri.
Pomanjkanje hranil (npr. dušika) ali prisotnost nefermentabilnih virov ogljika lahko izzove pri kvasovkah spolno razmnoževanje (mejozo). Diploidne celice z mejozo tvorijo tetrado štirih haploidnih askospor (štiri genetsko različne celice) v aska, katerega steno predstavlja stena prej diploidne celice (Landry s sod., 2006). Proces običajno poteka aerobno (Calum in Grei, 2008). Z razpadom aska se sprostijo štiri haploidne askospore (Feldman, 2005).
Nastale haploidne askospore po mejozi se lahko ob prisotnosti potrebnih hranil naprej nespolno razmnožujejo z mitozo, kar imenujemo kaljenje (Herskowitz, 1988).
Kvasovka ostane v haploidni fazi do srečanja celice nasprotnega paritvenega tipa – poteče parjenje (Raspor, 1996). Pri kvasovkah S. cerevisiae sta poznana dva paritvena tipa: a in (dve različni haploidni askospori). Paritveni tip a in α sta dve celici, ki se med sabo 100 % privlačita zaradi delovanja feromonov. Pri parjenju a in α celic dobimo a/α diploidne celice (Landry s sod., 2006). Posebnost kvasovke vrste S. cerevisiae je, da haploidne celice lahko spremenijo paritveni tip s pomočjo DNA-preureditve (Herskowitz, 1988). Novo nastali enocelični diploidni (2n) organizmi tako sklenejo življenjski krog kvasovke.
Do zaustavitve kaljenja lahko pride tudi takrat, ko so v bližini prisotne celice drugih kvasovk, s katerimi lahko poteka paritev (Herskowitz, 1988). Tako lahko nastanejo hibridi s sorodnimi vrstami kvasovk Saccharomyces sensu stricto. Diploidni hibridi nastanejo z združitvijo celic dveh različnih vrst. Ti hibridi se razmnožujejo nespolno z mitozo. Pri njih produkcija spor z mejozo ni mogoča zaradi razlike v genetskem materialu, ki ga v nov organizem doprinese vsaka vrsta (Calum J. M., Greig, 2008).
2.1.7 Fermentacijski sistemi in produkti kvasovke Saccharomyces cerevisiae 2.1.7.1 Potrebna temperatura in pH za rast kvasovk
Večina laboratorijskih in industrijskih kvasovk najbolje uspeva v temperaturnem območju med 20 in 30 °C. Optimalna rast za kvasovko S. cerevisiae je območje med 25 do 35 °C (Pitt in Hocking, 1999), torej je kvasovka termotolerantna (Rupnik s sod., 2005). Nekateri sevi kvasovke so sposobne rasti tudi v območju od 10 °C do 39 °C (Pitt in Hocking, 1999).
Večina kvasovk raste najbolje na gojiščih med pH 4,5 in 6,5. Znotrajcelični pH kvasovk je reguliran v sorazmerno ozkem območju, predvsem preko delovanja ATP-azne protonske membranske črpalke. Pri kvasovki S. cerevisiae je pH okoli 5 (Walker, 2009).
2.1.7.2 Kisik kot vir energije
Kot vsi organizmi tudi kvasovke potrebujejo vir energije za preživetje. Energijo pridobivajo s celičnim dihanjem, pri katerem se s pomočjo kisika oksidirajo organske molekule. Energija se shranjuje v kemijskih vezeh ATP-ja. Poznamo dve vrsti celičnega
dihanja – anaerobno in aerobno. Če kvasovka lahko raste tako ob prisotnosti, kot tudi v odsotnosti kisika, jo imenujemo fakultativni aerob ali pa fakultativni anaerob, odvisno od prednostnega načina rasti npr. fakultativni anaerob preferenčno raste aerobno (Petro, 2010).
Kvasovke vrste S. cerevisiae so fakultativno anaerobni organizmi in so na splošno nezmožni rasti pod striktno anaerobnimi pogoji. Kisik je potreben kot dejavnik rasti, poleg tega pa ga potrebujejo za zagotavljanja terminalnih elektronskih akceptorjev pri celičnem dihanju, pri biosintezi membranskih maščobnih kislin in sterolov. S. cerevisiae je auksotrofična. To je lastnost organizma, nezmožnega sintetizirati esencialne organske spojine, potrebne za rast. Če so prisotni steroli in določene nenasičene maščobne kisline, je kvasovka S. cerevisiae sposobna rasti tudi v anaerobnih pogojih (Verduyn s sod., 1990).
2.1.7.3 Prehrana in presnova pri kvasovkah
Kvasne celice za rast potrebujejo makrohranila (vir ogljika, dušika, kisika, žvepla, fosforja, kalija in magnezija), elemente v sledovih (npr. Ca, Cu, Fe, Mn in Zn) in rastne faktorje (organske komponente, ki jih ne uporabljajo kot vir energije) (Walker, 2009).
2.1.7.3.1 Presnova ogljika pri kvasovkah
V prisotnosti kisika praktično vse vrste kvasovk lahko oksidirajo sladkorje z dihanjem v mitohondrijih. Prav tako so sposobne pretvoriti sladkor v etanol in CO2 (Raspor, 1996).
Kvasovka S. cerevisiae dobro raste na heksozah (glukozi, fruktozi, manosi in galaktozi) in preprostih oligosaharidih (maltozi, saharozi in rafinozi) (Sampaio in Gonçalve, 2008;
Boulton in Quain, 2001). Za te vrste sladkorjev je značilno, da jih S. cerevisiae lahko fermentira v alkohol in ogljikov dioksid. Ostale ogljikove substrate, kot so etanol, glicerol in acetati, pa kvasovka lahko uporabi le ob zadostnem viru kisika (Walker, 2009).
2.1.7.3.2 Presnova sladkorjev do etanola
Različne vrste kvasovk so sposobne asimilirati in fermentirati različne vrste sladkorjev.
Njihov potencial je povezan s transportnimi sistemi v celični membrani in razpoložljivimi hidrolitičnimi encimi, ki jih izločajo v okolje (Raspor, 1996).
Osnovna presnova sladkorjev pri kvasovkah temelji na fermentaciji in respiraciji. Sladkor (glukozo) preko glikolize pretvori v piruvat. Če je prisoten kisik, nato poteče respiracija, če kisika ni, pa fermentacija. Pri alkoholni fermentaciji sladkorjev S. cerevisiae oksidira koencim NADH v NAD, ki je potreben za nastanek piruvata. Pri tem sodeluje encim piruvat dekarboksilaza, ki dekarboksilira piruvat v acetaldehid, ki ga nato reducira alkoholna dehidrogenaza do alkohola. Regeneracija NAD je potrebna za ohranjanje redoks ravnotežja, da ne pride do zaustavitve glikolize (Walker, 2009; Kavanagh, 2005). Aerobna respiracija glukoze je pri kvasovkah energetsko učinkovita presnova, ki zajema glikolizo in ciklus citronske kisline (Krebsov cikel), elektronsko transportno verigo in oksidativno fosforilacijo (Walker, 2009).
Kvasovke vrste S. cerevisiae imajo tako imenovan »Crabtree efekt«. Sposobne so fermentirati visoke koncentracije sladkorjev, če je prisoten kisik (respirofermentator) (Walker, 2009). Crabtree efekt je alkoholna fermentacija ob prisotnosti kisika, ko glukoza
preseže določeno mejno koncentracijo. Ob prisotnosti presežka sladkorja poteče aerobna fermentacija glukoze v etanol, ta pa zagotavlja velik del energije, ki je potrebna za tvorbo biomase (Verduyn s sod., 1990). Kvasovke delimo na Crabtree pozitivne in negativne.
Kvasovke, kot je Saccharomyces cerevisiae, ki kopičijo etanol tudi v prisotnosti kisika, imenujemo Crabtree pozitivne kvasovke, ostale, ki razgradijo sladkor do CO2, pa Crabtree negativne kvasovke (Piškur s sod., 2006; Wardrop s sod., 2004).
2.1.7.3.3 Ostali produkti presnove sladkorjev
Pri fermentaciji alkoholnih pijač (npr. pri pivu, vinu, destiliranih žganih pijačah, jabolčniku) lahko poleg etanola in ogljikovega dioksida opazimo tudi druge produkte presnove. Ti metaboliti so razni derivati alkoholov (npr. izoamil alkohol, butanol), polioli (npr. glicerol), estri (npr. etil acetat), organske kisline (npr. sukcinat) in aldehidi (npr.
acetaldehid) (Walker, 2009; Kavanagh, 2005).
2.1.7.3.4 Presnova dušika pri kvasovkah
Kvasovke potrebujejo za rast dušik. Amonijev sulfat je pogosto uporabljeno hranilo v gojiščih za rast kvasovk, ker na ta način lahko zagotovimo tako asimilacijo dušika kot žvepla. Nekatere kvasovke lahko kot vir dušika uporabljajo tudi nitrat in nitrit. Tudi veliko organskih dušikovih virov, kot so npr. aminokisline, peptidi, purini, pirimidini in amini, lahko zagotovi potrebe kvasne celice po dušiku (Walker, 2009).
2.1.7.4 Tehnološko industrijska uporabnost produktov kvasovk
Kvasovke so pomembne pri tradicionalni biotehnologiji kot tudi pri moderni biotehnologiji. Kvasovke rodu Saccharomyces predstavljajo konkurenco ostalim kvasovkam z edinstveno kombinacijo lastnosti, kot so hitra rast, tudi ob visoki koncentraciji sladkorjev, dobra sposobnost za proizvodnjo in porabo etanola in toleranca na več okoljskih stresorjev, kot so visoka koncentracija etanola in nizka koncentracija kisika (Piškur s sod., 2006).
Poleg tega, da kvasovko S. cerevisiae uporabljamo pri različnih tehnologijah proizvodnje hrane, je pomembna tudi pri tehnologijah za raziskavo dednine, uporabljamo pa jo tudi kot gostiteljski organizem pri tehnologijah za heterologne proteine. Je nepogrešljiva pri proizvodnji protiteles, hormonov, encimov, npr. amilaz, proteaz, barvil in arom (Walker, 2009). Kvasovka S. cerevisiae je organizem, pri katerem so izolirali encima alkohol dehidrogenazo in invertazo (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Še posebej je zanimiva zaradi svoje tradicionalne prisotnosti v človeških okoljih in je splošno priznana kot varen organizem, zato jo uporabljamo pri eksperimentalnem delu (Raspor, 1996). Poleg vseh naštetih komercialnih sektorjev (živila, kemikalije, industrijski encimi, farmacija) pa je pomembna tudi z vidika kmetijstva in okolja (Walker, 2009).
2.1.7.4.1 Izrabljanje produktov kvasovke S. cerevisiae v prehrambeni industriji
Kvasovka S. cerevisiae je nenadomestljiva v tehnologiji proizvodnje piva, vina, sakeja, pekovskega kvasa in kruha, sira, kisa, alkoholnih destilatov, energije, krmnega kvasa, uporabnih kemikalij in aditivov. Njihovi proizvodi so skoraj nepogrešljivi (Piškur s sod., 2006).
Vrsta S. cerevisiae med kvasovkami zasluži posebno mesto, saj je njena uporaba v prehrambene namene skoraj tako stara kot naša civilizacija (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Produkcija etanola in proizvodnja CO2 je za človeka najvažnejša tehnološka lastnost kvasovke, ki jo izkoriščajo za vzhajanje pekovskih izdelkov. Specifični produkti kvasovk dajejo živilom svojevrstne organoleptične lastnosti (Raspor, 1996; Kavanagh, 2005).
2.1.7.4.2 Uporaba kvasovke S. cerevisiae v pivovarstvu
V pivovarstvu poteka proizvodnja piva kot semi-aerobni proces, ki ga lahko reguliramo s temperaturo in mešanjem. V primeru pivovarskih produktov je glavni vir ogljika ječmen.
Večina kvasovk ne fermentira škroba, zato amilaza in glukoamilaza ječmen pretvorita v slad. Na ta način škrob hidrolizira do sladkorjev, ki jih kvasovke lahko fermentirajo do etanola (Kavanagh, 2005). V tem postopku poteča kvasna flokulacija (kosmičenje), kar je nespolno in reverzibilno združenje celic. Celice se držijo druga druge in tvorijo kosmiče. V pivovarski industriji uporabljajo predvsem kvasovko S. cerevisiae, da lahko njene celice preprosto in stroškovno učinkovito ločijo od fermentacijskega produkta (Zhao in Bai, 2009; Kavanagh, 2005).
2.1.7.4.3 Proizvodnja bioetanola z razgradnjo lignoceluloze
Dandanes je bioetanol zelo pomemben v industriji goriva. Tudi plastiko, kot je na primer polietilen, lahko proizvedejo iz etanola. Bioetanol so uporabljali že med 2. svetovno vojno, vendar je bila proizvodnja tedaj ekonomsko nekonkurenčna. V zadnjih treh desetletjih pa se temu zopet posveča ogromno raziskav (Taherzadeh in Karimi, 2007).
Produkcija etanola kot goriva temelji na surovinah z visoko vsebnostjo saharoze (trsni sladkor), na škrobne surovine in na lignocelulozno biomaso (Sánchez in Cardona, 2008).
Manj kot 4 % etanola proizvedejo iz olj, ostali etanol pa proizvajajo preko fermentacije bioloških virov. Trenutno ga največ proizvajajo iz sladkorjev in škrobnih materialov, vendar ima največji potencial v prihodnosti lignoceluloza. Lignocelulozni material je obnovljiv, velikokrat neuporabljen in zelo dostopen vir surovin. Glavni viri lignoceluloze so predvsem ostanki lesne industrije, komunalni odpadki, odpadne vode in rastlinski odpadni produkti. Ti materiali vsebujejo polimerizirane sladkorje v obliki celuloze in hemiceluloze, ki jih lahko razgradimo s hidrolizo in kasneje fermentiramo v etanol s pomočjo mikroorganizmov (Taherzadeh in Karimi, 2007).
Lignocelulozni material vsebuje predvsem zmes ogljikovih polimerov (celulozo in hemicelulozo – holoceluloza), lignina in rudnin (Taherzadeh in Karimi, 2007). Ogljikove hidrate v lignoceluloznem materialu je potrebno spremeniti s hidrolizo (kemična in encimska) v enostavne sladkorje še pred fermentacijo. Celulozo in hemicelulozo lahko fermentiramo v etanol, lignin pa ostane stranski produkt. Po hidrolizi nastanejo poleg heksoz tudi pentoze, predvsem ksiloza je glavni sladkor po hidrolizi hemiceluloze. Med fermentacijo morajo biti mikroorganizmi sposobni učinkovite razgradnje in velikega izkoristka, morajo biti odporni na proteinske inhibitorje in fermentirati etanol iz pentoz (Taherzadeh in Karimi, 2007).
Kvasovka S. cerevisiae ima najbolj obetavne lastnosti, ki jo uvrščajo med prednostne mikroorganizme za pridelavo bioetanola druge generacije. Glavna pomanjkljivost je, da kvasovka ne fermentira ksiloze (Taherzadeh in Karimi, 2007; Semenčenko s sod., 2011).
Lastnosti kvasovke, da fermentira pentoze je možno spremeniti tudi z genetskim inženirstvom oziroma s tehnologijo rekombinantne DNA. Pri tem ostaja organizem toleranten na etanol in pridobi sposobnost, da presnavlja dodaten substrat. Drugi pristop k rešitvi tega problema pa je uporaba drugih mikroorganizmov (kvasovk in bakterij), ki so sposobni fermentirati tudi pentozo (V. Semenčenko s sod., 2011).
Glavni problem pri proizvodnji bioetanola je fermentacija zmesi heksoz in pentoz ob prisotnosti inhibitorjev. V ta namen želijo razviti mikroorganizem, ki bi bil sposoben razgradnje obeh vrst sladkorjev. Naslednji problem je okoljevarstveni, saj bi morali biti trdi ostanki proizvodnje etanola in odpadna voda, ki nastanejo v etanolnem obratu, spremenjeni v druge produkte ali razgradljivi (Taherzadeh in Karimi, 2007).
2.1.7.4.4 Uporabnost kvasovke S. cerevisiae pri rekombinantnih tehnikah
Poleg produkcije etanola je druga pomembna metabolična aktivnost tudi sinteza homo- in heterolognih proteinov (Raspor, 1996). Kvasovke kot gostiteljski sistem so primerni za intracelularno in ekstracelularno izražanje genov različnega izvora (humanega, živalskega, rastlinskega ali virusnega). Izražanje tujih genov vključuje več korakov. Začne se z vključitvijo tuje kodirajoče sekvence DNA (cDNA) v primerno ekspresijsko kaseto (vektor), ki vsebuje kvasni promotor in terminator. Nadaljnji postopek poteka z vključitvijo oz. vnosom vektorja v ustrezen gostiteljski sev ter stabilno vzdrževanje le-tega v celicah. Sledi sinteza heterolognega proteina pri specifičnih, točno določenih pogojih gojenja in kot končna faza izolacija in čiščenje tarčnega proteina (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006).
Kvasovka S. cerevisiae je zaradi svojih lastnosti pomembno orodje za pridobivanje rekombinantnih proteinov. Je primeren gostiteljski organizem za uspešno produkcijo številnih proteinov: protiteles, hormonov, rastnih dejavnikov ter drugih farmacevtsko pomembnih makromolekul. Dobro poznavanje njene genetike in fiziologije omogoča uspešno načrtovanje vektorjev, posttranslacijskih modifikacij, visokoprodukcijskih gostiteljskih sevov in enostavno gensko manipulacijo. Dobro poznavanje njenih molekularnih in biokemijskih lastnosti omogoča razvoj specifičnih, tako klasičnih kot rekombinantnih genskih tehnik (Novak-Štagoj in Podobnik., 2006).
Poleg številnih prednosti pa ima uporaba S. cerevisiae tudi nekaj pomanjkljivosti, kot so:
nezmožnost rasti do visokih gostot, neučinkovito izločanje proteinov v gojišče, prekomerna in nepravilna glikozilacija (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Čeprav obstajajo številne omejitve pri uporabi te kvasovke kot gostitelja heterolognih proteinov, pa prednosti uporabo odtehtajo. Prednost kvasovk v primerjavi s kompleksnejšimi gostitelji, kot so sesalske celice, je v tem, da so preprostejše, enostavnejše, njihovo gojenje je cenejše in poznavanje boljše (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006).
Prednost S. cerevisiae je še v tem, da ima status GRAS (Generally Regarded As Safe) in za večino genskih manipulacij ni etično sporna. Prvi ekspresijski vektorji so bili razviti prav za S. cerevisiae (Raspor, 1996). Na njihovi osnovi se je že v zgodnjih 80 letih prejšnjega stoletja razvila proizvodnja številnih, zlasti farmacevtsko zanimivih rekombinantnih proteinov v industrijskem merilu (kot so npr.: inzulin, hepatitis B antigen, uratna oksidaza, glukagon, stimulator rasti granulocit-makrofaga, trombocitni rastni dejavnik, hirudin/desirudin, hirudin/lepirudin) (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006).
2.1.8 Ekologija kvasovke S. cerevisiae in njeni habitati
Kvasovko Saccharomyces cerevisiae štejemo med udomačene enocelične organizme, ki so jih v preteklosti izolirali iz njenega naravnega habitata za potrebe človeku pomembnih fermentacij in industrij (Landry s sod., 2006; Sampaio in Gonçalve, 2008). V naravnem ekosistemu jo običajno težje zasledimo, nekaj raziskav pa kaže, da naj bi S. cerevisiae v naravnem okolju obstajala mnogo pred človeško uporabo za fermentacijo (Sampaio in Gonçalve, 2008).
Danes S. cerevisiae najdemo v okoljih, ki jih dobro poznamo zaradi industrijskih procesov, kot so pridelava kruha, vina, jabolčnika in piva. V industriji s hrano je ena glavnih krivcev za kvar hrane (Pitt in Hocking, 1999; Carter s sod., 2009). Vendar pa kvasovko S.
cerevisiae najdemo tudi v naravi (Pitt in Hocking, 1999; Carter s sod., 2009). Naravni habitati S. cerevisiae so še vedno dokaj neraziskani (Sampaio in Gonçalve, 2008). V literaturi je navedeno, da S. cerevisiae lahko osamimo iz vinogradov, grozdja in drugega sadja, pri fermentacijskih procesih, iz insektov, hrastovega lubja ali tal poleg hrasta in drugih listnatih dreves (Erlend s sod., 2006).
Kvasovko S. cerevisiae v naravi običajno najdemo v diploidni fazi (Kavanagh, 2005). To so industrijski udomačeni sevi, ki smo jih iz človeškega fermentacijskega okolja prenesli v naravo. Naravni divji sevi so haploidni in so manj odporni kot industrijski sevi, ki pri izolatih običajno prevladujejo. Prisotnost obeh, udomačenih in divjih sevov, so zasledili v naravi na izolatih iz sadja, v produktih iz grozdja, izcedkih dreves in v sadnih sokovih.
Našli pa so jih tudi na insektih, ki jih sladki rastlinski sokovi in smole različnih dreves privlačijo (Fay in Benavides, 2005; Kavanagh, 2005).
2.1.8.1 Poznana nahajališča kvasovke S. cerevisiae iz industrijskih procesov
Kvasovke poseljujejo habitate, ki vsebujejo bogat vir ogljika. Najbolj so proučene predvsem kvasovke S. cerevisiae v habitatih, ki so tehnološko pomembni za človeka, kot so fermentacija vina, pridelava grozdja v vinogradih in vse stopnje fermentacije do končnih produktov. Prisotnost kvasovk je povezana z vsebnostjo sladkorja. Ko vsebnost sladkorja pada, narašča pri fermentaciji količina etanola. Kvasovke, ki niso tolerantne na etanol, odmrejo, prevladajo pa kvasovke S. cerevisiae, ki so tolerantne na etanol (Boundy- Mills, 2006). Glavni tehnološko-okoljevarstveni pomen kvasovke S. cerevisiae je tudi ta, da pretvorijo saharide in tako zaščitijo določena hranila pred razpadom. Njihovi metabolični proizvodi, npr. alkohol pri S. cerevisiae, omogoča konverzijo živila v novo obliko ob sočasnem konzerviranju (Raspor, 1996).
Kvasovke vrste S. cerevisiae so torej našli v smolah različnih dreves, pri fermentaciji vina, viskija in kakava (Pitt in Hocking, 1999), na razpadlem lesu, različnem sadju (Boundy- Mills, 2006) in palminem vinu (Ibekwe s sod., 2006). Izolirali so jo tudi iz različnih sokov in ekstraktov, pokvarjenih naravnih sokov, raznih osvežilnih pijač, ki so bile izpostavljene staranju (npr. mineralna voda, pomarančni sok z mehurčki, izotonični napitki), in sokov pred pasterizacijo. Prav tako je znano, da so kvasovko S. cerevisiae izolirali iz mlečnih produktov, kot je sir, jogurt in skuta. Poleg tega so jih našli tudi v fermentiranih mlečnih izdelkih in kefirju (Pitt in Hocking, 1999).
Na splošno bioetanol proizvajajo s fermentacijo sladkorjev in škrobnih materialov. V prihodnosti pričakujejo, da bo lignoceluloza glavni vir za produkcijo etanola poleg ostalih omenjenih. Zato lahko pričakujemo, da bi lahko našli kvasovko S. cerevisiae tudi med gozdnimi ostanki (les, lubje, smola, trhlovine), komunalnimi odpadki, odpadnimi vodami in raznimi rastlinskimi odpadnimi produkti (tudi listna stelja, humus, listni drobir) (Pitt in Hocking, 1999; Taherzadeh in Karimi, 2007).
2.1.8.2 Nahajališča kvasovke S. cerevisiae v naravi
Vedno več raziskav kaže, da S. cerevisiae zaseda in poseljuje večje število habitatov, ki niso povezani s človeško aktivnostjo (Landry s sod., 2006). Večina kvasovk se nahaja v tleh ali na razpadajočih organskih odpadkih v okolju ter sodelujejo pri procesu kroženja organskih in anorganskih snovi. Njihov cikel je v nekaterih primerih, npr. pri fermentaciji mošta v vino, proučevan, vendar še vedno niso pojasnjeni vsi odnosi v kroženju in razširjanju teh mikroorganizmov (Raspor, 1996).
Prednostni habitati kvasovk so sicer rastlinska tkiva (listi, cvetovi in plodovi), nekatere vrste pa lahko najdemo tudi v parazitskem razmerju z živalmi. Nekaj vrst kvasovk je možno izolirati iz specifičnih ali ekstremnih okoljih, kot so nahajališča z zelo nizko vodno aktivnostjo (okolja z visoko vsebnostjo sladkorja ali soli), nizko temperaturo (npr. polarna območja) ali kjer je zelo majhna prisotnost kisika (npr. prebavni trakt živali). Kvasovko S.
cerevisiae so zasledili v vodi, na rastlinah, živalih in insektih (Walker, 2009).
Nove vrste so odkrili pri raziskavah habitatov, kot so listje, čebele, hrošči, druge žuželke in drugi nevretenčarji, kumare in druga zelenjava, brezalkoholne gazirane pijače, mlečni izdelki, čiste vode in morska okolja (Boundy-Mills, 2006). Veliko izolatov vrste Saccharomyces cerevisiae so izolirali iz vinogradov, in sicer v povezavi z grozdjem (grozdne jagode, ki so jih ptiči ali insekti poškodovali), iz poškodovanega sadja, iz tal pod drevesi (predvsem drevesne vrste Quercus), iz izcedkov sadnih dreves in smol (Sampaio in Gonçalve, 2008; Landry s sod., 2006), ter iz riževega vina in drugih vrst vin (Sujayas sod., 2003). Kvasovko so našli tudi v rastlinskih tekočinah različnih drevesnih vrst (npr. smole in drugi izločki dreves), v tleh pod drevesi in na površini gob (Sampaio in Gonçalve, 2008).
Kvasovka S. cerevisiae poseljuje mnogo habitatov. Z raziskavami v zadnjih letih so ugotovili, da vsaka populacija določenega habitata skriva pomembne genetske variacije (Landry s sod., 2006). Glavni dejavniki so predvsem klima, geografska lokacija, temperatura, padavine, habitat, vsebnost makro- in mikrohranil, kisik, vlaga, pH, prisotnost metabolitov in toksinov (Boundy-Mills, 2006).
2.2 METODIKA PROUČEVANJA KVASOVK 2.2.1 Metodika izolacije kvasovk
2.2.1.1 Vzorčenje, izolacija in gojenje kvasovk na gojiščih
Kvasovke lahko osamimo iz vzorcev z uporabo bodisi selektivnih (nizek pH gojišča, visoko koncentracijo etanola ali sladkorja) ali bogatitvenih metod (gojišča z dodatkom
specifičnih virov ogljika, npr. etanola, rafinoze). V obeh primerih gojiščem dodajamo antibiotike, ki zavrejo rast drugih mikroorganizmov (Sampaio in Gonçalve, 2008).
Osnovna sestava gojišča za rast in vzdrževanje kvasovk vsebuje sladni ali kvasni ekstrakt s peptonom in glukozo (Walker, 2009). Za rast potrebujejo vir ogljika (npr. glukoza, fruktoza, saharoza) in dušika (npr. pepton, tripton), določene vitamine, minerale in rastne faktorje, ki so za vsako vrsto specifični. Pogosto gojiščem dodajamo tudi dodatke (npr.
kvasni ekstrakt, sladni ekstrakt). YM (»Yeast-Malt extract«) in MEA (»Malt extract agar«) gojišči sta zelo pogosti za izolacijo, uporabljajo pa jih tudi za vzdrževanje in shranjevanje kvasnih kultur v tekoči ali trdni obliki. Gojiščem lahko dodamo različne dodatke, kot npr.
sol (10 % NaCl), kloramfenikol (Ch) in etanol (10 % EtOH). Takšna gojišča pogosto uporabljamo za izolacijo kultur, medtem ko za rast specifične vrste ali skupine kvasovk uporabljamo selektivne ali diferencialne medije (Boundy-Mills, 2006).
Nekatere fizikalno-kemijske dejavnike zagotovimo s sestavo gojišč (pH), druge pa z zunanjim okoljem (temperatura, kisik). Gojimo jih pod pogoji, ki so za mikroorganizme najbolj optimalni (Rupnik s sod., 2005).
2.2.2 Metode identifikacije kvasovk
Določevanje kvasovk temelji večinoma na morfoloških znakih – fenotipske lastnosti. Za določitev je potrebna gojitev na gojišču. Pomembne so značilnosti kulture, kot so barva, oblika in struktura kolonij (Guarro s sod., 1999; Tarr, 2004). Prepoznava vrst kvasovk s pomočjo morfoloških znakov je pogosto močno omejena. Vse lastnosti, kot so rast, celična morfologija, rezultati fermentacijskih in asimilacijskih testov, lahko zelo varirajo med sevi znotraj vrste (Kurtzman, 2006). Zato se vzporedno z morfološkimi znaki za prepoznavo oz.
identifikacijo uporabljajo fiziološke in biokemijske tehnike. Za razliko od teh so molekularne tehnike splošno uporabnejše, saj so genotipski znaki prisotni povsod in so neodvisni od ekspresije (Guarro s sod., 1999). Uporabljamo primerjave nukleotidnih zaporedij DNA, saj tako lahko natančno identificiramo vrsto (Kurtzman, 2006).
2.2.2.1 Klasične metode identifikacije kvasovk 2.2.2.1.1 Morfološke metode
Vrste kvasovk lahko identificiramo in karakteriziramo na podlagi več različnih kriterijev, kot so celična morfologija (npr. način celične delitve in oblika spor), fiziologija (npr. testi fermentacije sladkorjev) in imonulogija (npr. imunoflurescenca) (Walker, 2009).
Morfološke lastnosti vegetativnih in spolnih struktur kvasovk so pomembne pri prepoznavanju rodov kvasovk, poleg tega pa upoštevamo tudi izgled kolonij. K slednjemu prištevamo barvo kolonij, površino, profil ter rob kolonij. Kvasovka S. cerevisiae se razmnožuje tudi spolno, kar opazimo kot menjavo generacij s tvorbo značilnih celic (askospor). Tvorbo askospor lahko pri nekaterih rodovih kvasovk izzovemo s specifičnimi gojišči (acetatni agar za rod Saccharomyces, redčen V8 agar za rod Metschnikowia, malt agar za rod Pichia). Za razvoj askospor je pomembna tudi temperatura, saj večina rodov sporulira pri temperaturi od 20 do 25 ºC. Izgled askospor je prav tako pomemben taksonomski znak (Zalar, 2011). Askospore lahko opazujemo z različnimi barvanji, npr. pri rodu Saccharomyces z acidorezistentnim barvanjem – askospore so acidorezistentne in se
ne razbarvajo s kislim alkoholom. Acidorezistentno barvanje je diferencialno barvanje, pri katerem preparat obarvamo z barvilom karbolfuksin, ter razbarvamo s kislim alkoholom.
Zaradi značilne sestave celične stene ostanejo obarvane le acidorezistentne askospore.
Sledi barvanje s kontrastnim barvilom metilenskim modrilom. Pri kvasovki S. cerevisiae se askospore obarvajo rdeče, aski in vegetativne celice pa modro (Barnett s sod., 2000).
2.2.2.1.2 Fiziološke značilnosti
Asimilacijske in fermentacijske lastnosti kvasovk so še vedno tiste ključne lastnosti, na podlagi katerih kvasovke opisujemo in identificiramo do nivoja vrst. Prav tako je pomemben temperaturni razpon rasti, rast ob prisotnosti oz. odsotnosti določenih vitaminov, cikloheksimida ter toleranca visokih koncentracij glukoze in NaCl. Kot dodatne lastnosti se uporabljajo zmožnost sinteze škroba, ocetne kisline, hidroliza sečnine in diazonium modro B-reakcija.
Za kvasovko Saccharomyces cerevisiae je značilno, da asimilira D-glukozo, naslednje vire ogljika pa sevi lahko asimilirajo ali ne: D-galaktozo, saharozo, maltozo, trehalozo, rafinozo, malezitozo, melebiozo, škrob, glicerol, D-manitol, etanol, nekateri sevi asimilirajo tudi D-glukozid in laktat (Boulton in Quain, 2001; Barnett s sod., 2000).
Kvasovka lahko tolerira 10 % NaCl oz. 50 % glukoze v gojišču. Raste pri optimalni temperaturi 25 °C, maksimalna temperatura rasti pa je 30 °C do 35 °C, včasih tudi od 37 oz. do 42 °C. Škroba ne sintetizira, niti ne ocetne kisline, prav tako pa ne hidrolizira sečnine, reakcija diazonium modro pa je negativna (Barnett s sod., 2000).
2.2.2.2 Molekularne metode identifikacije
Prepoznava vrst kvasovk s pomočjo zgoraj opisanih morfoloških in fizioloških znakov je pogosto močno omejena. Zato se vzporedno s fenotipskimi znaki za prepoznavanje vrst oz.
identifikacijo uporabljajo zanesljivejše metode na ravni genotipa (Guarro s sod., 1999;
Kurtzman, 2006). V taksonomiji kvasovk je najbolj pogosto uporabljeno zaporedje 26 S rDNA oz. D1/D2 domena zaporedja LSU (Kurtzman s sod., 2011). Vrste in seve lažje ločimo na podlagi variabilnejših zaporedij, kot je ITS rDNA. Pri tem je poleg samega zaporedja pomembna tudi dolžina pomnožene DNA, saj je le-ta različna pri različnih vrstah kvasovk (van der Vossen s sod., 2003; Sujaya s sod., 2003).
Glavni razlogi za uporabo regije ITS, ki kodirajo ribosomsko RNA, je pojavljanje v več kopijah v tandemskem zaporedju, poleg tega pa so ribosomi prisotni v vseh organizmih in imajo skupni evolucijski izvor (Guarro s sod., 1999; Kurtzman, 2006). Metoda verižne reakcije s polimerazo (»Polymerase Chain Reaction« – PCR) z izbranim parom oligonukleotidnih začetnikov ob določenih pogojih pomnoži del jedrne DNA. Nukleotidna zaporedja pomnožkov uporabljamo za identifikacijo in jih primerjamo z nukleotidnimi zaporedji v javno dostopnih bazah (Kurtzman, 2006; Zalar, 2011).
