UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Emanuela ŽNIDARŠIČ
MATIČNE CELICE ZOBNE PULPE IN MOŽNOSTI NJIHOVE UPORABE
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Emanuela ŽNIDARŠIČ
MATIČNE CELICE ZOBNE PULPE IN MOŽNOSTI NJIHOVE UPORABE
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
DENTAL PULP STEM CELLS AND THEIR POTENTIAL USE
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala doc. dr. Jerneja Ogorevca, za somentorja pa dr. Marka Strbada
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: doc. dr. Jernej OGOREVC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: dr. Marko STRBAD
Biobanka d.o.o., Trzin
Član: prof. dr. Katarina VOGEL MIKUŠ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum predstavitve: 6. september 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 606:61:602.9:611.018:616.314.18(043.2) KG DPSCs, SHED, matične celice, zdravljenje, terapija AV ŽNIDARŠIČ, Emanuela
SA OGOREVC, Jernej (mentor), STRBAD, Marko (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN MATIČNE CELICE ZOBNE PULPE IN MOŽNOSTI NJIHOVE UPORABE TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja)
OP VI, 22 str., 6 sl., 75 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Odkritje DPSCs in napredek v molekularni in celični biologiji sta omogočila uporabo teh celic v bazičnih raziskavah matičnih celic in regenerativni medicini. DPSCs imajo zmožnost regeneracije kompleksa dentin/pulpa in kažejo velik diferenciacijski potencial. Številne študije so pokazale, da so se DPSCs pod vplivom rastnih in transkripcijskih dejavnikov zmožne diferencirati tako v odontoblaste, kot tudi v nevrocite, adipocite, osteocite, hondrocite, kardiomiocite, epitelne celice, β-celice trebušne slinavke in hepatocitam podobne celice. Zmožne so tudi tvorbe novih krvnih žil, v procesu angiogeneze. Lastnosti DPSCs so primerljive z lastnostmi matičnih celic kostnega mozga (BMSCs) in vitro in in vivo, poleg tega pa DPSCs kažejo boljšo sposobnost proliferacije v primerjavi s številnimi drugimi tipi MSCs. V delu so predstavljeni načini pridobivanja in postopki shranjevanja teh celic. Opisane so najbolj obetavne možnosti uporabe DPSCs v sodobnem zobozdravstvu, ki bi lahko nadomestile agresivne postopke, kot so endodontsko zdravljenje in uporaba implantatov iz umetnih mas ter možnost uporabe za zdravljenje parodontalne bolezni in kostnih defektov.
Predstavljene so tudi možnosti uporabe DPSCs na drugih področjih medicine. Glede na njihov diferenciacijski potencial bi se jih lahko uporabljalo še za zdravljenje bolezni, kot so diabetes tipa 1, nevrološke bolezni, bolezni kosti, jeter, oči in krvožilja.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 606:61:602.9:611.018:616.314.18(043.2) CX DPSCs, SHED, stem cells, treatment, therapy AU ŽNIDARŠIČ, Emanuela
AA OGOREVC, Jernej (supervisor), STRBAD, Marko (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI DENTAL PULP STEM CELLS AND THEIR POTENTIAL USE DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)
NO VI, 22 p., 6 fig., 75 ref.
LA sl AL sl/en
AB The discovery of DPSCs and advances in molecular and cell biology have enabled applicative use of these cells in the fields of basic stem cell research and regenerative medicine. DPSCs have a great differentiation potential and the ability to regenerate the dentin / pulp complex. Numerous studies have shown that DPSCs are able to differentiate into odontoblasts as well as neurocytes, adipocytes, osteocytes, chondrocytes, cardiomyocytes, epithelial cells, pancreatic β-cells, and hepatocyte-like cells under the influence of growth and transcription factors, extracellular matrix proteins, and receptor molecules. They are also capable of forming new blood vessels from existing ones, in the process of angiogenesis. The properties of DPSCs are comparable to those of bone marrow stem cells (BMSCs) in vitro as well as in vivo. In addition, DPSCs show better ability to proliferate compared to many other types of MSCs. The thesis reviews methods of obtaining and storing these cells, the most promising options for the use of DPSCs in modern dentistry, which could replace aggressive procedures such as endodontic treatment and the use of plastic implants, and the possibility of using it to treat periodontal disease and bone defects. The possibilities of using DPSCs in other fields of medicine are also presented. Depending on their differentiation potential, they could also be used to treat diseases such as type 1 diabetes, neurological diseases, bone, liver, eye, and vascular diseases.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO SLIK VI
1 UVOD 1
2 ZGRADBA ZOBA IN ZOBNE PULPE 2
2.1 CELICE ZOBNE PULPE 3
2.2 MATIČNE CELICE IZ PULPE MLEČNIH ZOB 3
2.3 KARAKTERIZACIJA DPSCs 3
3 IZOLACIJSKE METODE DPSCs 4
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
ENCIMSKA METODA VZPOSTAVITVE CELIČNE KULTURE METODA VZPOSTAVITVE CELIČNE KULTURE Z IZRAŠČANJEM CELIC IZ DONORSKEGA TKIVA
RASTNO GOJIŠČE KRIOPREZERVACIJA
SHRANJEVANJE DPSCs V BIOBANKAH
4 5 5 5 6 4
4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10
UPORABA DPSCs DENTALNA MEDICINA
NEVROLOŠKE BOLEZNI IN POŠKODBE HRBTENJAČE BOLEZNI SRCA
ZDRAVLJENJE MIŠIČNE DISTROFIJE DIABETES
BOLEZNI JETER BOLEZNI OČI IMUNSKE BOLEZNI
PRIMERI KLINIČNIH ŠTUDIJ ALOGENE TERAPIJE
6 7 8 9 10 11 11 12 12 13 14 5
6 7
TRENUTNE OMEJITVE NA PODROČJU UPORABE DPSCs ZAKLJUČEK
VIRI ZAHVALA
15 16 17 22
VI KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Anatomija zoba 2
Slika 2: DPSCs lahko diferencirajo v različne celične tipe 7 Slika 3: Morfoložki prikaz hrbtenjače po poškodbi in po uporabi SHED celic 8 Slika 4: Histološka analiza z DPSCs injiciranih in neinjiciranih skeletnih mišic pri miših 10 Slika 5: Primer obnove roženice pri kuncu po uporabi mrežic iz matičnih celic 12
Slika 6: Uspešna regeneracija kosti z uporabo DPSCs 14
1 1 UVOD
Matične celice zobne pulpe (DPSCs) so opisane, kot mezenhimske matične celice (MSCs). Te so prisotne v številnih tkivih, tudi pri odraslem človeku. Sprva so bile izolirane iz kostnega mozga, do sedaj pa so njihov obstoj potrdili v različnih tkivih, vključno z zobmi, maščobnim tkivom, endometrijem, amniotsko tekočino in popkovino.
Možnost diferenciacije, migracije na mesto poškodbe, regeneracije tkiva, imunomodulacije in izločanje protivnetnih molekul daje MSCs potencial za zdravljenje številnih kroničnih bolezni.
Čeprav te celice ne veljajo za nesmrtne, se v celični kulturi delijo in daljši čas ohranjajo multipotentnost in telomerazno aktivnost (Chamberlain in sod., 2007). Identificiramo jih na podlagi izražanja označevalcev, kot so CD 90, CD105, CD13 in CD73, ne izražajo pa hematopoetskih označevalcev, kot sta CD34 in CD45 (Musial-Wysocka in sod., 2019).
Podobno velja tudi za označevalce DPSCs. MSCs so podolgovate oblike in spominjajo na fibroblaste. Ker izhajajo iz tkiv odraslih organizmov in jih dokaj lahko pridobimo, so etično bolj spejemljive za uporabo v terapevtske namene, kot embrionalne matične celice (Potdar in Jethmalani, 2015).
Odkritje DPSCs in napredek v molekularni in celični biologiji sta omogočila uporabo teh celic v bazičnih raziskavah matičnih celic in regenerativni medicini. DPSCs imajo precejšen diferenciacijski potecial in možnost regeneracije kompleksa dentin/pulpa. Številne študije so pokazale, da so se DPSCs pod vplivom rastnih in transkripcijskih dejavnikov zmožne diferencirati tako v odontoblaste, kot tudi v nevrocite, adipocite, osteocite, hondrocite, kardiomiocite, epitelne celice, β-celice trebušne slinavke in hepatocitam podobne celice.
Zmožne so tudi tvorbe novih krvnih žil, v procesu angiogeneze. Lastnosti DPSCs so primerljive z lastnostmi matičnih celic kostnega mozga (BMSCs) in vitro in in vivo, poleg tega pa DPSCs kažejo boljšo sposobnost proliferacije v primerjavi s številnimi drugimi tipi MSCs (Tsutsiu, 2020). Zobna pulpa, ki je dragocen vir DPSCs, se pridobi iz odstranjenih zob. Lahko se jo pridobi tudi po manj invazivni poti v procesu endodontskega zdravljenja ali iz izpadlih mlečnih zob. DPSCs se lahko krioprezervira in uporabi kadarkoli je to potrebno, v postopkih regenerativne terapije.
Namen diplomskega dela je bil pripraviti celovit pregled dosedanjih raziskav na področju DPSCs. V delu so predstavljeni načini pridobivanja in postopki shranjevanja teh celic. Opisane so najbolj obetavne možnosti uporabe DPSCs v sodobnem zobozdravstvu, ki bi lahko nadomestile agresivne postopke, kot so endodontsko zdravljenje in uporaba implantatov iz umetnih mas ter možnost uporabe za zdravljenje parodontalne bolezni in kostnih defektov.
Predstavljene so tudi možnosti uporabe DPSCs na drugih področjih medicine. Glede na njihov diferenciacijski potencial bi se jih lahko uporabljalo še za zdravljenje bolezni, kot so diabetes tipa 1, nevrološke bolezni, bolezni kosti, jeter, oči in krvožilja (Potdar in Jethmalani, 2015).
2 2 ZGRADBA ZOBA IN ZOBNE PULPE
Razvoj zoba se prične s signaliziranjem med ustnimi epitelijskimi in ektomezenhimskimi celicami, ki izvirajo iz migratornih celic nevralnega grebena. Interakcije med temi celicami omogočijo nastanek sklenine, katero tvorijo ameloblasti, ki izhajajo iz epitelnih celic. Sklenina prekriva zobno krono, ki je izpostavljen del zoba, cement, ki je kosti podobno tanko tkivo, pa prekriva zobne korenine. Temelj tem trdnim tkivom je vitalen mineraliziran dentin, katerega sintetizirajo odontoblasti (Tatullo in sod., 2014).
Zobna pulpa je nemineralizirano zobno tkivo, ki zaseda osrednjo pulpno votlino vsakega zoba in je sestavljeno iz mehkega vezivnega tkiva, žil ter limfnih in živčnih elementov. Žile in živci v zob vstopajo skozi majhne odprtine v vršičkih zobnih korenin in zobno pulpo oskrbujejo s hranili ter zagotavljajo odziven senzorični živčni sistem. Pulpno votlino obdajajo tri mineralizirana tkiva: dentin, sklenina in cement. Kompleksna struktura sicer zagotavlja trdnost in stabilnost, ampak zobje se kljub temu lahko poškodujejo zaradi mehanskih obremenitev, kemikalij, bakterijske okužbe ali rakavih obolenj. Močna mehanska ovojnica ščiti pulpo pred mikrobiološkim ustnim okoljem, vendar če vanjo, zaradi poškodbe ali zobne gnilobe vdrejo bakterije, ta propade, vnetje pa se razširi na okoliško alveolarno kost (Yu in sod., 2007). Za razliko od kosti, ki se lahko popolnoma regenerira, se zobne strukture ne morejo. Ko je krona dokončno izoblikovana, ameloblasti namreč preidejo v proces programirane celične smrti in izgubijo sposobnost obnove sklenine in vivo. Čeprav odontoblasti niso sposobni obnove dentina in vivo, lahko njihove predniške ali matične celice (DPSCs) migrirajo na poškodovana mesta in se diferecirajo v odontoblaste ter tvorijo sekundarni ali reparativni dentin. Za razliko od primarnega dentina je sekundarni slabo organiziran in nima enakomerno vdelanih dentinskih kanalčkov, zagotavlja pa ustrezno pregrado, ki ščiti zobno pulpo (Almushayt, 1995).
Slika 1: Anatomija zoba (prirejeno po Blaus, 2014)
3 2.1 CELICE ZOBNE PULP
Zobna pulpa ima številne fiziološke funkcije, med katerimi so najpomembnejše induktivne, senzorične, zaščitne in tvorbene. Da se tkivo lahko vzdržuje, ščiti in popravlja, so v pulpi prisotne različne celične populacije: odontoblasti, fibroblasti, DPSCs in imunokompetentne celice (Yildirim, 2013).
Odontoblasti so celice odgovorne za sekrecijo dentina in tvorbo dentinskih kanalov, ki povezujejo dentin in sklenino z zobno pulpo. Ker so locirani na periferiji spominjajo na epitelne celice, a je njihova vloga bolj povezana s celično polarizacijo in diferenciacijo, kot pa s permeabilnostjo (Arana-Chavez in Massa, 2004). Odontoblasti sintetizirajo tudi kolagene, proteoglikane in številne nekolagenske proteine, kot so kostni sialoprotein (BSP), dentinski fosfosialoprotein (DSPP), dentinski fosfoprotein (DPP), fosforin, osteokalcin in drugi (Suzuki in sod., 2012). Druga skupina celic v zobni pulpi so fibroblasti, ki se nahajajo v coni bogati s celicami (angl. cell-rich zone). Njihova glavna naloga je vzdrževanje matriksa zobne pulpe, sodelujejo pa tudi pri celjenju poškodb. Tudi te celice izločajo kolagen, večinoma tipa I in III, ki sta glavna gradnika dentina, in številne nekolagenske proteine. Proizvajajo tudi nekatere vnetne mediatorje, kot so IL-6, IL-8 in vaskularni endotelijski rastni dejavnik (VEGF).
Imunokompetentne celice so potrebne za ustrezen imunski odziv, saj je v ustni votlini ogromno mikroorganizmov, ki zaradi poškodb in bolezni zob lahko zaidejo v notranjost zoba do zobne pulpe. V zobni pulpi so tako prisotne dendritične celice, nevtrofilci, makrofagi ter T in B limfocite (Okiji, 2002). DPSCs se nahajajo v območju bogatem s celicami in v okolici krvnih žil. Izražajo označevalce značilne za različne celične tipe. To kaže na njihov širok diferenciacijski potencial, zaradi česar so DPSCs potencialno zanimive za aplikativno uporabo (Nanci, 2008).
2.2 MATIČNE CELICE IZ PULPE MLEČNIH ZOB
Ker je izpadanje mlečnih zob naraven proces in ima vsak otrok 20 mlečnih zob, je njihovo zbiranje za izolacijo matičnih celic ena od najbolj enostavnih, neinvazivnih in etično sprejemljivih metod. Izolacija DPSCs iz stalnih zob predstavlja problem zlasti zaradi precej nizkega števila matičnih celic v zobni pulpi odraslega človeka (Yildirim, 2013).
Matične celice so iz pulpe mlečnega zoba prvič izolirali leta 2003 in jih poimenovali SHED (angl. stem cells from human exfoliated deciduous teeth) (Miura in sod., 2003). Te celice imajo enake lastnosti kot DPSCs, le da imajo boljšo sposobnost proliferacije in tvorbe kolonij in vitro.
Poročali so celo, da naj bi SHED imele širši spekter diferenciacije, kot DPSCs in BMSCs (angl.
bone marrow mesenchymal stem cells) (Huang, 2009).
2.3 KARATKERIZACIJA DPSCs
DPSCs in SHED celice imajo lastnosti fibroblastov in matičnih celic. Plastičnost ohranjajo
4
tekom vsaj petindvajsetih pasaž, h krati pa vzdržujejo normalen kariotip in stopnjo pomnoževanja matičnih celic (Kerkis in sod., 2006). Z uporabo pretočne citometrije so analizirali celične površinske označevalce DPSCs. Izkazalo se je, da na površini izražajo CD73, CD90, CD105, CD13, CD29, CD44, HLA-A, B in C, ne izražajo pa označevalcev, kot so CD45, CD34, CD15, CD54 in CD33 (Oktar in sod., 2011). Poleg omenjenih označevalcev pa DPSCs in SHED lahko izražajo tudi jedrne označevalce pluripotentnosti, kot so OCT4, NANOG, c- Myc, SOX2 in površinske označevalce, kot so SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 in TRA-1-80.
Seveda pa se raven izražanja genov razlikujejo med tema dvema tipoma matičnih celic (Kerkis in sod., 2006).
3 METODE IZOLACIJE DPSCs
Zaradi pomanjkanja splošno sprejetih označevalcev pri izolaciji mezenhimskih matičnih celic, so tudi metode izolacije in čiščenja DPSCs še precej nedodelane. Še vedno obstajajo polemike o ponovljivosti rezultatov, zlasti kadar gre za metode diferenciacije. Različne metode izolacije imajo namreč različen vpliv na diferenciacijski potencial matičnih celic. Glavna vira za izolacijo matičnih celic zobne pulpe so odstranjeni stalni zobje in izpadli mlečni zobje, kot posledica fiziološke resorbcije. Izkazalo se je, da povečanje števila vnetnih molekul med resorbcijo mlečnega zoba poveča proliferacijski in diferenciacijski potencial SHED (Bernardi in sod., 2011).
Za izolacijo matičnih celic zobne pulpe je potrebno zobno krono po odstranitvi zoba najprej razkužiti z 0,3% klorheksidinom. Nato se le to razkuži še z jodom in 70% etanolom. Zob se shrani v transportnem gojišču, če se izolacijo celic dela v drugem laboratoriju izven zobozdravstvene ordinacije. Zaželeno je, da transportno gojišče vsebuje antibiotik (vsaj 3%
penicilina in steptomicina) in antimikotik (5 ug/ml amfotericina) B. Pri stalnih zobeh se s svedrom najprej naredi odprtino v zobni kroni, da se zagotovi prost dostop do zobnih kanalov in zobne pulpe, nato pa se pulpa izvleče s pomočjo posebne kirurške pincete. Vse orodje mora biti sterilno, da ne pride do kontaminacije. Po odstranitvi zobne pulpe je potrebno vzpostaviti kulturo matičnih celic. V osnovi se ločita dve metodi vzpostavitve celične kulture DPSCs, in sicer encimska metoda in metoda z izraščanjem celic iz donorskega tkiva (Yildirim, 2013).
3.1 ENCIMSKA METODA VZPOSTAVITE CELIČNE KULTURE
Po spiranju s sterilnim fosfatnim pufrom (PBS), je potrebno pulpo razrezati na čim manjše koščke. Razrezano tkivo se s PBS spere še 2x in se ga nato lahko prestavi v 3% raztopino kolagenaze tipa I ter inkubira 1 uro na 37 °C na orbitalnem stresalniku (Yan in sod., 2011) ali pa se uporabi različne kombinacije encimov skupaj s kolagenazo tipa I v različnih koncentracijah. Uporabi se lahko dispazo ali tripsin, čas inkubacije pa je odvisen od koncentracij posameznih encimov. Možna je tudi uporaba le 0,2% tripsina brez kolagenaze tipa I (Yildirim , 2013). Različne kombinacije encimov dajejo različne rezultate pri izolaciji celic,
5
najbolj pa se priporoča tretiranje s tripsinom in nato še s kolagenazo tipa I (Nakashima, 1991).
Celično uspenzijo dobimo s pomočjo cedila z ustrezno velikimi porami ali pa s centrifugiranjem na 130 x g in resuspendiranjem peleta v rastnem gojišču. Celice se lahko kar nekaj pasaž vzdržuje v gojitvenih posodicah (Liu in sod., 2006).
3.2 METODA VZPOSTAVITVE CELIČNE KULTURE Z IZRAŠČANJEM CELIC IZ DONORSKEGA TKIVA
Pri tej metodi se razrezano tkivo zobne pulpe po spiranju s PBS prestavi direktno v rastno gojišče. Največja razlika, v primerjavi z encimsko disociacijo celic, je število celic in njihova homogenost. Pri encimski metodi bodo v gojišču zrasle kolonije sestavljene iz različnih celic, ker z encimi sprostimo iz tkiva vse celice. Čeprav z encimsko metodo dobimo več celičnih kolonij, pa metoda z izraščanjem celic iz donorskega tkiva omogoča boljšo razrast fibroblastom podobnih celic in bolj homogeno celično kulturo (Yan in sod., 2011).
3.3 RASTNO GOJIŠČE
Sestava gojišča lahko vpliva tako na morfologijo celic, kot tudi na diferenciacijo in uspešnost vnosa tuje DNA v postopku genetskega inženiringa (npr. vpliv na permeabilnost membrane, vpliv na rast celic). DPSCs se običajno goji v Eaglovem bazalnem gojišču (BME) , Eaglovem minimalnem esencialnem gojišču (MEM), α-MEM ali pa Dulbeccovem modoficiranem Eaglovem gojišču (DMEM). Gojišča se običajno dopolni z 10%-20% FBS (fetalni goveji serum). Bolj komplekseno Hamovo F12 gojišče (Ham's F12) je bilo optimizirano za kloniranje.
Uporaba DMEM-a in F12 v razmerju 1:1 omogoči razrast mezenhimskih celic brez zgodnje diferenciacije in senescence. Ta kombinacija je uporabna tako za DPSCs, kot tudi za SHED (Freshney, 2005). Gojišče 199 se uporabi, če želimo vzgojiti predvsem fibroblaste, MEM in BME sta primerna za vzgojo številnih vezivnih tkiv in epitelijskih celic (Miller in sod., 1976), DMEM pa prav tako favorizira rast fibroblastov (Nakashima, 1991). S kalcijem bogat MEM omogoča diferenciacijo v celice gladkih mišic, bogatih z aktinom gladkih mišic. Primeren je tudi za vzgojo odontoblastov (Lopez-Cazaux in sod., 2006).
3.4 KRIOPREZERVACIJA
Krioprezervacija je postopek pri katerem se celice ali tkivo shrani z ohlajanjem na izjemno nizko temperaturo, običajno pod -150°C v parah tekočega dušika ali na -196 °C v tekočem dušiku. Tako shranjene celice se lahko kasneje uporabi za nadaljnjo proliferacijo, diferenciacijo in formacijo novega tkiva za terapevtske namene. Seveda je potrebna uporaba krioprotektantov, da ohranimo čim večjo viabilnost celic po odmrzovanju. Woods je v svoji raziskavi primerjal tudi različne krioprotektante: propilen glikol, etilen glikol in DMSO, med katerimi se je slednji izkazal za najbolj učinkovitega (Woods in sod., 2009). Če bi se želeli izogniti uporabi DMSO in vseeno dobiti precej dobro viabilnost po odmrzovanju, pa bi se lahko poslužili magnetne
6
krioprezervacije. Gre za metodo, kjer se celice med zamrzovanjem izpostavi statičnemu magnetnemu polju, ki vpliva na stabilnost membrane in zmanjša možnost poškodb zaradi kristalov (Lin in sod., 2014). Raziskave so pokazale, da zamrzovanje celotnega zoba ni učinkovita metoda za shranjevanje DPSCs, saj krioprotektant ne more prodreti dovolj globoko, da bi zaščitil celice zobne pulpe (Osathanon, 2010). Gioventu in sod. (2015) so razvili novo metodo krioprezervacije, kjer se z laserskim žarkom naredi majhne kanalčke do zobne pulpe, da krioprotektant lahko prodre do celic. Tak zob se nato v celoti shrani na -80 °C. Metoda lahko prihrani ogromno časa, saj celic pred krioprezervacijo ni potrebno izolirati, zmanjša pa se tudi strošek shranjevanja. Celice shranjene po tej metodi, so imele po odmrzovanju izredno visoko stopnjo viabilnosti.
3.5 SHRANJEVANJE DPSCS V BIOBANKAH
Pojem biobanka opisuje ustanove za shranjevanje najrazličnejšega biološkega materiala. Te ustanove predstavljajo strukturiran vir materiala za medicinske in genetske raziskave ter njegovo terapevtsko uporabo. Biobanke so veliko pozornosti namenile razvoju na področju uporabe matičnih celic, kar je privedlo do porasta števila biobank, ki shranjujejo matične celice, po vsem svetu (Riegman in sod., 2008). V zahodnih državah okoli 80% mladostnikov ali mlajših odraslih odstrani modrostne zobe iz katerih je mogoče izolirati matične celice. Študija je pokazala, da je ekstrakcija matičnih celic iz odstranjenega modrostnega zoba možna tudi do 5 dni po posegu (Perry in sod., 2008). S krioprezervacijo se matične celice shrani in po potrebi odmrzne, namnoži ter uporabi. Iz razpoložljivih podatkov vemo, da so pravilno shranjene matične celice uporabne za aplikacije tudi po 25 letih, ampak je ta doba verjetno še precej daljša (Harris, 2016).
4 UPORABA DPSCs
Kot je predstavljeno že v uvodu, DPSCs kažejo potencial za uporabo v regenerativni medicini na različnih področjih. Zaradi zmožnosti diferenciacije v različne celične tipe, se jih lahko uporabi za zdravljenje najrazličnejših bolezni. V predkliničnih študijah so se izkazale kot potencialno uspešne pri zdravljenju bolezni oči (bolezni mrežnice in roženice), nevroloških boleznih (poškodbe hrbtenjače, Parkinsonova bolezen, Alzheimerjeva bolezen), bolezni jeter, ustne votline (bolezni kosti, dlesni in zob), srca, mišic, kosti in diabetesa.
7
Slika 2: DPSCs lahko diferencirajo v različne celične tipe (prirejeno po Zhou in sod., 2020)
4.1 DENTALNA MEDICINA
Na tem področju bi se DPSCs lahko uporabljale za zdravljenje in obnovo celotne zobne pulpe, poškodovane zaradi kariesa ali mehanskih poškodb zoba, zdravljenje bolezni dlesni, kot je parodontoza in zdravljenje alveolarne kostne atrofije.
Iohara in sod. (2011) so proučevali regeneracijo celotne pulpe. Kot model so uporabili odraslega psa in izvedli pulpektomijo. Odstranili so zobno pulpo in zobne kanale napolnili s CD105+ celicami. Pri transplantaciji so si pomagali z iz stromalnih celic pridobljenim dejavnikom 1 (SDF-1). V zobnih kanalih se je pulpa uspešno regenerirala, vključno z žilami in živci. Formiral se je tudi sekundarni dentin. Rosa in sod. (2013) so v študiji proučevali tudi SHED celice za postopek regeneracije kompleksa dentin/pulpa. Uporabili so matične celice iz človeškega zoba in jih skupaj s človeškim rekombinantnim kolagenom tipa 1 in sintetičnim matriksom-hidrogelom (Puramatrix, Corning) nasadili v zobne kanale zobnih korenin odstranjenega človeškega zoba. Zobne korenine so nato subkutano vstavili v imunsko kompromitirane miši. SHED celice so se v zobnih koreninah diferencirale v odontoblaste in omogočile nastanek zobne pulpe in tubularnega dentina. Za uporabo DPSCs v procesu regeneracije zobne pulpe, za zdravljenje pri ljudeh, bo potrebno najti ustrezno ogrodje za rast celic, ki ga bo mogoče injicirati v zobne kanale in v tej študiji so poleg zmožnosti regeneracije dentina in pulpe preverjali tudi primernost dveh zgoraj omenjenih ogrodij (Puramatrixa in kolagena). Peptidni hidrogel (Puramatrix, Corning) se je že v predhodnih študijah izkazal za učinkovitega pri regeneraciji živcev in srčnega tkiva (Cavalcanti in sod., 2013), kolagen pa je pri aplikacijah z DPSCs in SHED v zobozdravstvu zaželen, ker je sestavni del zobne pulpe in
8
podpira rast in regeneracijo celic. V študiji je Puramatrix omogočil hitrejše izražanje ustreznih označevalcev in boljšo regeneracijo dentina v primerjavi s kolagenom (Rosa in sod., 2013).
Khorsand in sod. (2013) so demonstrirali potencial DPSCs za rageneracijo periodontalnih tkiv.
Kot modelni organizem so uporabili psa s parodontalno boleznijo in DPSCs transplantirali na prizadete predele obzobnih tkiv. Opazili so regeneracijo tkiv vključno s cementom, kostjo in periodontalnimi ligamenti. Uspešni so bili tudi pri regeneraciji kosti po transplantaciji DPSCs in plazme bogate s trombociti, ki omogoča hitrejše zdravljenje ran, v model z alveolarno kostno atrofijo. Izoblikovala se je dobro razvita kost z nevrovaskulacijo, ki je omogočila uspešno vstavitev implantata (Yamada in sod., 2010). DPSCs bi bile lahko uporabne tudi za razvoj bioimplantatov. Kot primer bi navedla študijo, kjer so z gojenjem DPSCs na mešanici nanodelcev iz beta-glicerofosfata, poliprolaktona in polietilen oksida uspeli pridobiti kopolimerni celični bioimplantat. Ta sestava biopolimernega konstrukta ima odličen vpliv na indukcijo osteogeneze pri DPSCs, kar bi bilo lahko obetavno na področju kostnega, oralnega in maksilofacialnega tkivnega inženiringa (Hosseini in sod., 2019).
4.2 NEVROLOŠKE BOLEZNI IN POŠKODBE HRBTENJAČE
Nicola je s skupino poročal o možnosti uporabe SHED celic za zdravljenje poškodb hrbtenjače.
Tkivo zobne pulpe so nasadili v hemisektirano hrbtenjačo. Na podganah so dokazali, da se število preživelih motonevronov poveča, kar kaže na funkcionalno bioaktivnost neurotrofičnih dejavnikov iz celic zobne pulpe pri reševanju motonevronov. Podganam se je delno povrnila motorična sposobnost (Nicola in sod., 2017).
Slika 3: Morfoložki prikaz hrbtenjače po poškodbi (SCI), po aplikaciji SHED celic pri podganah s poškodbo hrbtenjače ter pri testni skupini (SHAM) - vidno je povečanje števila motonevronov po uporabi SHED celic (prirejeno po Nicola in sod., 2010).
Matične celice zobne pulpe vplivajo na nevroregeneracijo na tri načine. Prvič, zavirajo s poškodbami hrbtenjače inducirano apoptozo nevronov, astrocitov in oligodendrocitov. To izboljša ohranjanje nevrofilamentov in mielinskih ovojnic. Drugič, s parakrinimi mehanizmi neposredno zavirajo več zaviralcev rasti aksonov, vključno s hondoitin sulfatom, proteoglikanom in z mielinom povezanim glikoproteinom. In tretjič, nadomeščajo izgubljene
9
celice z diferenciacijo v oligodendrocite pri ekstremnih poškodbah hrbtenjače. V študiji so pokazali, da matične celice zobne pulpe presajene v hrbtenjačo migrirajo in diferecirajo v živčne celice (Sakai in sod., 2012). Taghipour in sod. (2011) so uporabili SHED, ki so bile delno diferencirane v smer nastanka živčnih celic in intaktne SHED celice za transplantacijo v model podgane za poškodbo hrbtenjače. Živali, ki so prejele terapijo z delno diferenciranimi SHED so okrevale bolje in hitreje, kot tiste, ki so prejele SHED. Delno diferencirane SHED so torej bolj primerne za terapije, ker imajo večji potencial za dokončno difereciacijo v oligodendrocite in sekrecijo nevrotrofičnih dejavnikov na poškodovanem delu hrbtenjače.
Parkinsonova bolezen (PD) je nevrodegenerativna bolezen, kjer pride do izgube dopaminergičnih nevronov. Intracerebralna transplantacija dopaminogenih nevronov ali matičnih celic je obetaven pristop za zdravljenje te bolezni. Wang je v raziskavi na podganah pokazal, da imajo SHED celice sposobnost diferenciacije v dopaminogenične nevrone in da je transplantacija teh celic v PD modele izboljšala njihovo stanje (Wang in sod., 2010). V študiji z DPSCs so raziskovali vpliv izražanja nevrotrofičnih dejavnikov proti MPP+ (1-metil-4- fenipiridin) in rotenonu. Opazili so, da te celice omogočajo obrambo dopaminogeničnih nevronov pred nevrotoksini. Ker je bil kontakt med celicami preprečen, sklepajo, da so zaščito omogočili dejavniki, kot sta živčni rastni dejavnik in možganski nevrotrofični dejavnik, ki so jih sproščale DPSCs (Nesti in sod., 2011).
Alzheimerjeva bolezen (AD) je neozdravljiva nevrodegenerativna bolezen, pri kateri je zmanjšana kognitivna sposobnost, pojavijo pa se tudi beta-amiloidni plaki v možganih. Za poskuse zdravljenja AD so bili uporabljani že različni tipi matičnih celic, ki so pokazali nekaj pozitivnih učinkov. Terapevtsko možnost z DPSCs se raziskuje in vitro na AD modelih. Ena od raziskovalnih skupin, ki se je pri poskusu zdravljenja Alzheimerjeve bolezni poslužila uporabe DPSCs je nevrone tretirane z beta-amiloidnimi peptidi in oksidopaminom kokultivirala z DPSCs. Opazili so znatno zmanjšanje toksičnosti na nevrone in povečanje njihove viabilnosti.
Opazili so tudi, da so DPSCs začele kazati nevralni fenofip in izražati nevrotrofične faktoje (Apel in sod., 2009). Wang je v raziskavi uporabil z okadaično kislino induciran in vitro model AD, da bi proučil terapevtski učinek DPSCs. Opazili so vidno zmanjšanje apoptoze in povečanje viabilnosti modelnih celic. Prav tako so imele celice kokultivirane z DPSCs morfologijo obnovljenih nevronov s podolgovatimi dendriti, odebeljene mikrotubilne fibrile in gosto razporejene mikrofilamente. Sklepali so, da gre najbrž za posledico delovanja rastnih dejavnikov, ki jih izločajo DPSCs (Wang in sod., 2017).
4.3 BOLEZNI SRCA
Da bi preverili ali imajo DPSCs terapevtski potencial pri popravilu poškodb nastalih zaradi srčnega infarkta, so v DPSCs transducirali GFP (angl. green fluorescent protein) s pomočjo retroviralnih delcev. Celice so namnožili in jih injicirali v srca podgan, katerim so nekaj dni prej povzročili srčni infarkt. Štiri tedne po terapiji so živali začele kazati znake izboljšanja srčnega delovanja. GFP+ celic na območju infarkta niso zaznali, zato sklepajo, da so k
10
izboljšanju stanja DPSCs pripomogle zaradi sekrecije proangiogeničnih in antiapoptotičnih dejavnikov, ne pa zaradi vgnezditve DPSCs v srčno tkivo in diferenciacije v celice miokarda.
Izboljšala se je debelina stene in delovanje levega ventrikla ter povečala angiogeneza v primerjavi s kontrolnimi podganami. Na podlagi rezultatov sklepajo, da bi DPSCs lahko predstavljale dobro alternativo trenutnim možnostim za zdravljenje posledic akutnega miokardnega infarkta in preprečevanje njegovega ponovnega pojava (Gandia in sod., 2008).
Do podobnih rezultatov so prišli tudi pri uporabi SHED celic. Te so zmanjšale velikost prizadetega dela srca, apoptozo ter število vnetnih citokinov (Yamaguchi in sod., 2015).
4.4 ZDRAVLJENJE MIŠIČNE DISTROFIJE
Duchennova mišična distrofija (DMD) je ena najbolj pogostih in hudih oblik mišične distrofije, ki jo povzroča mutacija v genu lociranem na kromosomu Xp21, ki kodira mišični protein distrofin. Kerkis in sod. (2008) so humane DPSCs transplantirali v zlate prinašalce z mišično distrofijo brez imunosupresije na dva načina: direktno injiciranje v mišico in injiciranje preko arterije. Pokazali so, da donorske DPSCs lahko migrirajo, se diferencirajo in vsadijo v gostiteljsko mišico. Čeprav je bilo izražanje distrofina relativno nizko, pa so vseeno opazili izboljšanje stanja pri zdravljenih živalih. Boljši učinek so dosegli pri psih, kjer so bile celice injiciranje preko arterije, kar lahko pojasnimo z imunomodulatornim delovanjem preko parakrinih učinkov matičnih celic zobne pulpe.
Slika 4: Histološka analiza z DPSCs injiciranih in neinjiciranih skeletnih mišic pri miših. H & E (hematoksilin in eozin) barvanje je pokazalo regeneracijo aktivnih mišic kot posledico povečanja števila mišičnih vlaken. Trikromo barvanje po Massonu je pokazalo zmanjšanje mišične fibroze ob uporabi DPSCs (prirejeno po Pisciotta in sod., 2015).
V naslednji študiji so humane DPSCs predhodno usmerili v diferenciacijo proti miogeni celični liniii. Celice so nato injicirali v mečno mišico mišjega modela z DMD in opazovali, če se bodo regenerirala vlakna, ki proizvajajo distrofin. Preko parakrinega delovanja so DPSCs zmanjšale
H & E TRIKROMO BARVANJE PO MASSONU
KONTROLA TRETIRANJE Z DPSCs
11
fibrozo, pospešile obnovo mišičnih vlaken, ki proizvajajo distrofin in izboljšale angiogenezo ter posledično histopatologije mišice (Pisciotta in sod., 2015).
4.5 DIABETES
Možnost diferenciacije DPSCs v različne celične tipe ni zanemarljiva pri odkrivanju novih možnosti za zdravljenje diabetesa. Raziskuje se potencial za diferenciacijo teh celic v celice pankreasa. Govindasamy in sod. (2011) so kot prvi uspeli s primerno sestavo gojišča DPSCs usmeriti v nastanek pankreasnim celicam podobnih skupkov, ki so jih identificirali s pomočjo ditiozonskega pozitivnega barvanja in na podlagi izražanja značilnih označevalcev, npr. C- peptida, PDX-1, PAX4, PAX6, NGN3 in ISL-1. Deseti dan so ti skupki celic začeli ob prisotnosti glukoze izločati inzulin in C-peptid. Dokazali so in vitro funkcionalnost tako diferenciranih celic. Na tak način bi lahko na etično sprejemljiv način pridobili celice, ki bi jih lahko uporabili za personalizirano zdravljenje sladkorne bolezni.
V eni od raziskav so želeli preveriti terapevtsko uporabnost DPSCs in SHED celic na miših, ki so jim povzročili diabetes s streptozotocinom. Diferencirane celične skupke so zapakirali v biokompatibilne mikrokapsule in jih transplantirali v trebušno slinavko modelnih miši. Pri miših, ki so dobile kapsule z matičnimi celicami so opazili vzpostavitev normoglikemije 3-4 tedne po transplantaciji kapsul, ki je bila prisotna več kot 60 dni (Kanafi in sod., 2013). V nekaterih raziskavah so poročali še o drugih terapevtskih učinkih DPSCs celic pri zdravljenju diabetesa. Terapija z njimi naj bi zmanjšala poškodbe pankreasa in izboljšala renalno funkcijo ter bolečo diabetično nevropatijo pri diabetesu tipa 1 (Guimarães in sod., 2013).
4.6 BOLEZNI JETER
DPSCs in SHED se lahko diferencirajo v hepatocitam podobne celice. Za indukcijo diferenciacije so uporabili gojišče dopolnjeno s hepatičnim rastnim dejavnikom, deksametazonom, insulin-transferin-selenom-X in onkostatinom. Oba tipa matičnih celic (SHED in DPSCs) sta po diferenciaciji izražala specifične označevalce jetrnih celic, vključno z alfa-fetoproteinom, albuminom in jetrnim jedrnim dejavnikom 4-alfa. Povečala se je tudi produkcija uree in glikogena (Ishkitiev in sod., 2010). Transplantacija SHED celic preko vranice je ozdravila jetrno disfunkcijo pri z ogljikovim tetrakloridom (CCl4) tretiranih miših.
Donorske SHED celice so preživele in diferencirale v humane hepatocite, ki so izražale hepatocitno specifične gene in izločale albumin in ureo v s CCl4 poškodovanemjeternem tkivu.
S SHED celicami bi v prihodnosti lahko zdravili bolezni jeter, kot je jeterna fibroza (Yamaza in sod., 2015). DPSCs, ki so se diferencirale v hepatocite, so poleg zaviranja jetrne fibroze uravnovesile tudi vsebnost alanin transaminaze, aspartat transaminaze in amoniaka v serumu (Kim in sod., 2016).
12 4.7 BOLEZNI OČI
Zadnje raziskave kažejo, da bi se DPSCs lahko uporabljale tudi za zdravljenje bolezni oči, kot je slepota in glavkom. Glavkom nastane zaradi izgube ganglijskih celic mrežnice (RGC). V študiji so raziskovali potencial DPSCs pri obnovi RGC in jih v ta namen transplantirali v obolela očesa glodavcev. Število RGC se je v enem mesecu povečalo, živčna vlakna mrežnice pa odebelila. RGC funkcija je bila potrjena imunohistokemijsko, z uporabo optične koherenčne tomografije in elektroretinografije. Študija je podprla teorijo o tem, da bi se DPSCs lahko uporabljale kot nevrozaščitna celična terapija pri degenerativnih boleznih očesa (Mead in sod., 2016). Gomes in sod. (2010) so z uporabo DPSCs dosegli obnovo roženice pri kuncih. Očesa so jim poškodovali na različne načine (mehansko, s kemikalijami) in jim nato na poškodovano roženico presadili mrežice iz matičnih celic, proizvedene s tkivnim inženiringom. Po enem mesecu se je roženica vidno obnovila in izboljšala se je njena prosojnost.
Slika 5: Primer obnove roženice pri kuncu po uporabi mrežic iz matičnih celic po šibki (A1-D1 in A2-D2) in močni (E1-I1 in E2-I2) kemijski opeklini (prirejeno po Gomes in sod., 2010).
4.8 IMUNSKE BOLEZNI
Mezenshimske matične celice imajo imunomodulatorne funkcije in predstavljajo sodobno imunoterapevtsko orodje za različne avtoimunske in vnetne bolezni. Glavni mehanizem delovanja je sekrecija topnih dejavnikov, kot so prostagladin E2 (PGE2), indolamin 2,3- dioksigenaza, transformacijski rastni dejavnik beta (TGF-β) in humani levkocitni antigen G5 (HLA-G5). Pomembne so tudi interakcije med MSCs in imunskimi celicami (T- in B-celice, makrofagi in dendritične celice). Ker imajo DPSCs in SHED celice prav tako imunomodulatorne fukcije, bi bile lahko uporabne za celične terapije (Li in sod., 2014).
Študija je pokazala, da DPSCs inhibirajo odziv T-celic močneje kot BMMSCs (angl. bone marrow derived MSC) (Pierdomenico in sod., 2005). SHED celice so imele velik vpliv na inhibicijo T-celic pomagalk . Ob subkutani transplantaciji s pomočjo trikalcijevega fosfata so
13
bile sposobne izboljšanja sistemskega eritematoznega lupusa pri mišjih modelih. Gre za kronično avtoimunsko bolezen, ki prizadene različne organe, zlasti pa kožo, sklepe, krvne celice in ledvice (Yamaza in sod., 2010). DPSCs so bile zmožne inhibirati akutni alogenski imunski odziv s sproščanjem TGF-β, ki je stimuliral T-limfocite (Kwack in sod., 2017).
4.9 PRIMERI KLINIČNIH ŠTUDIJ
Za razliko od široke uporabe v bazičnih študijah na modelnih živlih, se DPSCs za sedaj v praksi pri ljudeh uporabljajo v zelo omejenem obsegu.
Nakashima in Iohara (2017) sta v klinično raziskavo za obnovo zobne pulpe z mobiliziranimi matičnimi celicami zobne pulpe (MDPSCs) vključila 5 bolnikov z irreverzibilnim pulpitisom.
Pacientom so odvzeli serum, ki so ga uporabili kot sestavni del gojišča za namnožitev DPSCs.
Celice zobne pulpe so izolirali iz odstranjenega zoba (denimo osmice) in jih namnožili do 70%
konfluence ter ločili in DPSCs mobilizirali s pomočjo granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika (G-CSF) ter izolirali. DPSCs namreč vsebujejo receptor za G-CSF in migrirajo proti mestu z ustrezno koncentracijo tega dejavnika. Ta metoda je še posebej uporabna, ko imamo na voljo manjšo količino zobne pulpe. Celice so shranili do uporabe na -80 °C. MDPSCs so transplantirali pod ustreznimi pogoji v oboleli zob in paciente opazovali 24 tednov. Toksičnih učinkov ali kakršnega koli poslabšanja stanja niso zaznali. Po 4 tednih se je regenerirana pulpa pričela odzivati na elektostimulacijo. Ustreznost in uspešnost regeneracije so potrdili z magnetno resonančnim slikanjem (MRI). Funkcionalni dentin se je tvoril pri 3 od 5 pacientov.
Podobne rezultate so na večji skupini bolnikov (26) dosegli tudi Xuan in sod. (2018).
DPSCs so v kliničnih raziskavah uporabili tudi za regeneracijo kosti. Yamada in sod. (2016) so na podlagi bazičnih študij za regeneracijo kosti s pomočjo DPSCs sestavili klinični protokol in uspeli so regenerirati alveolarno kost pri pacientih, ki so potrebovali implantat. Na področju regeneracije kosti so izvedli tudi klinične študije za regeneracijo kostnega defekta po odstranitvi zoba. Uporabili so DPSCs v kombinaciji s kolagensko gobico, ki je služila kot ogrodje za rast celic in jih presadili na mesto kostne deformacije (Giuliani in sod., 2013; d'Aquino in sod., 2009). Uspešno so regenerirali kost in čeprav ni bila enaka alveolarni kosti, so se pokazali pozitivni klinični učinki (Giuliani in sod., 2013). S podobno metodo so uspeli izboljšati tudi stanje parodontalne bolezni. Obzobne žepe so uspeli popolnoma zapreti pri 64 % primerih (Aimetti in sod., 2018).
14
Slika 6: Uspešna regeneracija kosti z uporabo DPSCs – slika A prikazuje rentgenski posnetek čeljusti po odstranitvi modrostnega zoba. Označeno je testno (T) in kontrolno (C) mesto. Na sliki B je desna testna stran, kjer so uporabili matične celice zobne pulpe in kolagensko gobico, na sliki C pa je kontrolna stran kjer metode zdravljenja z matičnimi celicami niso uporabili. Beli puščici na delih slike B in C prikazujeta dolžino zobnega vratu, ki ni obdan s kostjo. Vidimo, da se je kost bistveno bolje regenerirala na desni strani, kjer so uporabili DPSCs.
Je pa trenutno odprtih še nekaj kliničnih študij in ena od njih raziskuje vpliv DPSCs na regeneracijo živčnega sistema po kapi (Nagpal in sod., 2016). V kolikor bi se v študiji pokazali pozitivni učinki na regeneracijo živčnega sistema, bi to predstavljalo pomembno odkritje, ki bi omogočilo hitrejši razvoj zdravljenja nevrodegenerativnih bolezni
4.10 ALOGENE TERAPIJE Z DPSCS
Imunski mehanizmi omogočajo takojšnjo zaščito proti telesu tujim organizmom in snovem (prirojena imunost) ter specifični imunski odziv za njihovo nevtralizacijo (pridobljena imunost). Imunski sistem prepoznava tudi tkivno kompatibilnost in v primeru neujemanja se sproži učinkovit imunski odziv proti patogenom in nekompatibilnemu donorskemu tkivu ali celicam. Ta mehanizem je mogoč, ker se na površini celic nahajajo molekule poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (MHC), ki so pri človeku kodirane na lokusu HLA (humani levkocitni antigen). Glavni klinični izziv za uporabo donorskih DPSCs je torej premagati imunološke ovire, da bi se izognili zavrnitvam celic pri celični terapiji. Uporaba celic s kompatibilnim HLA je trenutno najbolj zanimiva metoda za zmanjševanje tveganja zavrnitve (Collart-Dutilleul in sod., 2015). Izkazalo se je tudi, da DPSCs povzročajo manjši odziv T-celic pomagalk, kot BMMSCs, zaradi česa so zanimive tudi za razvoj alogenih terapij (Pierdomenico in sod., 2005).
Ustanovitev alogenih biobank bi bila odlična rešitev za pridobitev ustreznih donorskih celic za vse paciente, zlasti za tiste, pri katerih iz določenih razlogov ne moremo priti do njihovih lastnih matičnih celic. DPSCs bi se v takih bankah shranilo glede na izotip HLA. Ker se odstrani veliko
15
zob, bi lahko hitro pridobili širok spekter HLA-tipiziranih celic in tako zadostili potrebam po matičnih celicah za večje število pacientov. Poleg tega bi alogene biobanke omogočile nove terapevtske in industrijske inovacije, saj bi zagotavljale vir celic, ki bi bile potencialno uporabne za razvoj novih terapij (Zimmermann in sod., 2012).
Pri shranjevanju alogenih matičnih celic, vključno z DPSCs je potrebno, da je donor informiran o svojem tkivu. Vsak donor ima pravico vedeti kje in kako so njegove celice shranjene in za katere postopke se jih bo uporabilo. Prav tako ima tudi pravico do informacij o rezultatih raziskav v katerih so vključene njegove celice (Artene in sod., 2013).
5 TRENUTNE OMEJITVE NA PODROČJU UPORABE DPSCs
Čeprav poročajo o ogromno pozitivnih učinkih uporabe DPSCs za namen celične terapije pri različnih boleznih, pa mehanizmi delovanja teh celic še niso povsem razjasnjeni. Ve se, da DPSCs in SHED celice lahko diferencirajo v različne celične tipe, kar je bilo tudi potrjeno v raziskavah. Transplantirane celice lahko migrirajo v tkivo gostitelja in na ta način prispevajo k regeneraciji tkiva. Poročajo tudi o parakrinem delovanju DPSCs, kar so prav tako potrdili s številnimi študijami. Matične celice zobne pulpe torej lahko migrirajo na poškodovane predele in z različnimi molekulami stimulirajo celice tkiva k okrevanju, brez da bi se pri tem diferencirale in integrirale v tarčno tkivo. Terapevtske lastnosti DPSCs so verjetno posledica tako regeneracije tkiva, kot tudi parakrinega delovanje, vendar so za boljše razumevanje mehanizmov delovanja potrebne nadaljnje študije na tem področju.
Zaradi pomanjkanja podatkov o mehanizmih delovanja matičnih celic, se bazične in predklinične raziskave na modelnih živalih odvijajo v bistveno večjem številu kot klinične raziskave na ljudeh. Da bi z gotovostjo lahko potrdili klinično uporabnost DPSCs bo potrebno opraviti dodatne študije na ljudeh. Največji izziv v terapevtiki še vedno predstavlja striktna regulacija in visoki stroški celotnega procesa priprave in aplikacije celic. V vsaki od bazičnih študij uporabljajo nekoliko drugačne pristope za izolacijo, čiščenje, namnožitev in precepljanje matičnih celic. Uporabljajo se tudi različni nosilci in dostavni sistemi za celične terapije, zato bi bilo potrebno za namen varne množične uporabe optimizirati in standardizirati postopke.
Potrebna bo tudi optimizacija na področju priprave visoko kakovostnih celic, določitev optimalnega števila transplantiranih celic in ocena dolgoročne varnosti uporabe. Pri uporabi avtolognih celic problem predstavlja dolgotrajnost procesa priprave ustreznih celic za transplantacijo, kar lahko dodatno poslabša stanje pacienta in zato bi bil potreben razvoj strategij shranjevanja matičnih celic in postopkov presaditve avtolognih matičnih celic.
16 6 ZAKLJUČEK
Poznanih je več vrst matičnih celic, ki jih lahko razdelimo na embrionalne, odrasle matične celice in inducirane pluripotentne matične celice (iPSCs). V praksi se v regenerativni medicini trenutno uporabljajo predvsem mezenhimske matične celice, ki spadajo v skupino odraslih matičnih celic. Inducirane pluripotnentne matične celice se prav tako postopoma uvajajo v klinične poskuse zdravljenja določenih boleznih. Embrionalne matične celice v bazičnih raziskavah sicer kažejo obetavne rezultate, vendar način njihovega pridobivanja odpira resna etična vprašanja, kar omejuje njihovo aplikativno uporabo.
Zaradi odličnih proliferacijskih sposobnosti so DPSCs zanimive za klinično uporabo. Ker se jih lahko pridobi iz tistih stalnih zob, ki bi jih bilo tako ali tako potrebno odstraniti (vraščene osmice, ortodontsko zdravljenje ipd.), ali celo povsem neinvazivno iz mlečnih zob, ko ti izpadejo, se pri njihovem pridobivanju povsem izognemo etičnim pomislekom. Njihov neverjetno širok spekter diferenciacije bi v prihodnosti lahko pripomogel k bistvenemu povečanju kvalitete življenja ljudi s kroničnimi in drugimi degenerativnimi boleznimi, kot so bolezni oči, živčevja, jeter, ustne votline, mišic, imunske bolezni in diabetes. Kljub temu, da je možnost uporabe DPSCs za alogene terapije še izredno slabo raziskana, verjetno tudi zaradi precej okrnjenega poznavanja HLA sistema pri matičnih celicah, verjamem, da bo v prihodnjih letih prišlo do razmaha tudi na tem področju.
Kot sem že omenila se večina raziskav za uporabo DPSCs v regenerativni medicini za zdaj izvaja na živalskih modelih. Odprtih je sicer kar nekaj kliničnih študij, ki kažejo obetavne rezultate, ampak bo potrebnega še veliko dela, da se do potankosti razišče mehanizme terapevtskih učinkov DPSCs, preden se jih prične uporabljati kot rutinski način zdravljenja določenih bolezni. Gotovo pa lahko trdimo, da imajo potencial, da postanejo močno orodje v regenerativni medicini.
17 7 VIRI
Aimetti M., Ferrarotti F., Gamba M. N., Giraudi M., Romano F. 2018. Regenerative treatment of periodontal intrabony defects using autologous dental pulp stem cells: A 1-year follow- up case series. The International Journal of Periodontics and Restorative Dentistry, 38, 1:
51-58
Almushayt A., Narayanan K., Zaki A. E., George A. 2006. Dentin matrix protein 1 induces cytodifferentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts. Gene Therapy, 13, 7: 611- 620
Apel C., Forlenza O. V., de Paula V. J., Talib L. L., Denecke B., Eduardo C. P., Gattaz W. F 2009. The neuroprotective effect of dental pulp cells in models of Alzheimer's and Parkinson's disease. Journal of Neural Transmission, 116, 1: 71-78
Arana-Chavez E. V., Massa F. L. 2004. Odontoblasts: the cells forming and maintaining dentine. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36, 8: 1367-1373 Artene S. A., Ciurea M. E., Purcaru S. O., Tache D. E., Tataranu L. G., Lupu M., Dricu A.
2013. Biobanking in a constantly developing medical world. Scientific World Journal, 23, 343275, doi: 10.1155/2013/343275:6 str.
Bernardi L., Luisi S. B., Fernandes R., Dalberto T. P., Valentim L., Bogo Chies J. A., Medeiros Fossati A. C., Pranke P. 2011. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics, 37, 7: 973-979 Blaus B. 2014. Medical gallery of Blausen Medical. WikiJournal of Medicine 1, 2, doi:
10.15347/wjm/2014.010
Cavalcanti, B. N., Zeitlin, B. D., Nör, J. E. 2013. A hydrogel scaffold that maintains viability and supports differentiation of dental pulp stem cells. Dental Materials : Official Publication of the Academy of Dental Materials, 29, 1: 97–102
Chamberlain G., Fox J., Ashton B., Middleton J. 2007. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells, 25, 11: 2739-2749
Collart-Dutilleul P. Y., Chaubron F., De Vos J., Cuisinier F. J. 2015. Allogenic banking of dental pulp stem cells for innovative therapeutics. World Journal of Stem Cells, 7, 7: 1010–
1021
d'Aquino R., De Rosa A., Lanza V., Tirino V., Laino L., Graziano A., Desiderio V., Laino G., Papaccio G. 2009. Human mandible bone defect repair by the grafting of dental pulp stem/progenitor cells and collagen sponge biocomplexes. E Cells and Materials, 12, 18: 75- 83
Deuse, T., Hu, X., Gravina, A., Wang, D., Tediashvili, G., De, C., Thayer, W. O., Wahl, A., Garcia, J. V., Reichenspurner, H., Davis, M. M., Lanier, L. L., Schrepfer, S. 2019.
Hypoimmunogenic derivatives of induced pluripotent stem cells evade immune rejection in fully immunocompetent allogeneic recipients. Nature Biotechnology, 37, 3: 252–258 Freshney R. 2005. Culture of animal cells. A manual of basic technique. 5th ed. Wiley-Liss,
New York: 696 str.
18
Gandia C., Armiñan A., García-Verdugo J. M., Lledó E., Ruiz A. Miñana M. D., Sanchez- Torrijos J., Payá R., Mirabet V., Carbonell-Uberos F., Llop M., Montero J. A., Sepúlveda P.
2008. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells, 26, 3: 638-645 Gioventù S., Andriolo G., Bonino F., Frasca S., Lazzari L., Montelatici E., Santoro F., Rebulla
P. 2012. A novel method for banking dental pulp stem cells. Transfusion and Apheresis Science, 47, 2: 199-206
Giuliani A., Manescu A., Langer M., Rustichelli F., Desiderio V., Paino F., De Rosa A., Laino L., d'Aquino R., Tirino V., Papaccio G. 2013. Three years after transplants in human mandibles, histological and in-line holotomography revealed that stem cells regenerated a compact rather than a spongy bone: biological and clinical implications. Stem Cells and Translation Medicine, 2, 4: 316-324
Goldberg M., Hitara A. 2017. The Dental Pulp: Composition properties and function. JSM Dentistry, 5, 1: 1-10
Gomes J. A., Geraldes Monteiro B., Melo G. B., Smith R. L., Cavenaghi Pereira da Silva M., Lizier N. F., Kerkis A., Cerruti H., Kerkis I. 2010. Corneal reconstruction with tissue- engineered cell sheets composed of human immature dental pulp stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science, 51, 3, doi: 10.1167/iovs.09-4029:6 str.
Govindasamy V., Ronald V. S., Abdullah A. N., Nathan K. R., Ab Aziz Z. A., Abdullah M., Musa S., Kasim N. H., Bhonde R. R. 2011. Differentiation of dental pulp stem cells into islet-like aggregates. Journal of Dental Research, 5: 646-652
Guimarães E. T., Cruz Gda S., Almeida T. F., Souza B. S., Kaneto C. M., Vasconcelos J. F., Santos W. L., Santos R. R., Villarreal C. F., Soares M. B. 2013. Transplantation of stem cells obtained from murine dental pulp improves pancreatic damage, renal function, and painful diabetic neuropathy in diabetic type 1 mouse model. Cell Transplantation, 22, 12: 2345-2354 Hosseini F. S., Enderami S. E., Hadian A., Abazari M. F., Ardeshirylajimi A., Saburi E., Soleimanifar F., Nazemisalman B. 2019. Efficient osteogenic differentiation of the dental pulp stem cells on β-glycerophosphate loaded polycaprolactone/polyethylene oxide blend nanofibers. Journal of Cell Physiology 234, 8: 13951-13958
Huang G. T. 2009. Pulp and dentin tissue engineering and regeneration: current progress.
International Journal of Oral Science, 2, 2: 59-65
Iohara, K., Imabayashi, K., Ishizaka, R., Watanabe, A., Nabekura, J., Ito, M., Matsushita, K., Nakamura, H., Nakashima, M. 2011. Complete pulp regeneration after pulpectomy by transplantation of CD105+ stem cells with stromal cell-derived factor-1. Tissue Engineering, 17: 1911–1920
Ishkitiev N., Yaegaki K., Calenic B., Nakahara T., Ishikawa H., Mitiev V., Haapasalo M. 2009.
Deciduous and permanent dental pulp mesenchymal cells acquire hepatic morphologic and functional features in vitro. Journal of Endodontics, 36, 3: 469-474
Kanafi M. M., Rajeshwari Y. B., Gupta S., Dadheech N., Nair P. D., Gupta P. K., Bhonde R.
R. 2013. Transplantation of islet-like cell clusters derived from human dental pulp stem cells restores normoglycemia in diabetic mice. Cytotherapy, 15, 10: 1228-1236
19
Harris D. 2016. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicine, 4: 9-20
Kerkis I., Ambrosio C. E., Kerkis A., Martins D. S., Zucconi E., Fonseca S. A., Cabral R. M., Maranduba C. M., Gaiad T. P., Morini A. C., Vieira N. M., Brolio M. P., Sant'Anna O. A., Miglino M. A., Zatz M. 2008. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic? Journal of Translational Medicine, 6, 35, doi: 0.1186/1479-5876-6-35: 13 str.
Kerkis I., Kerkis A., Dozortsev D., Stukart-Parsons G. C., Gomes Massironi S. M., Pereira L.
V., Caplan A. I., Cerruti H. F. 2006. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers.
Cells, Tissues, Organs, 184, 3-4: 105-116
Khorsand A., Eslaminejad M.B., Arabsolghar M., Paknejad M., Ghaedi B., Rokn A.R., Moslemi N., Nazarian H., Jahangir S. 2013. Autologous dental pulp stem cells in regeneration of defect created in canine periodontal tissue. Journal of Oral Implantology, 39, 4: 433-443
Kim H. J., Cho Y. A., Lee Y. M., Lee S. Y., Bae W. J., Kim E. C. 2016. PIN1 suppresses the hepatic differentiation of pulp stem cells via Wnt3a. Journal of Dental Research, 95, 12:
1415-1424
Kwack K. H., Lee J. M., Park S. H., Lee H. W. 2017. Human dental pulp stem cells suppress alloantigen-induced immunity by stimulating t cells to release transforming growth factor beta. Journal of Endodontics, 4, 1: 100-108
Li Z., Jiang C. M., An S., Cheng Q., Huang Y. F., Wang Y. T., Gou Y. C., Xiao L., Yu W. J., Wang J. 2014. Immunomodulatory properties of dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Oral Diseases, 20, 1: 25-34
Lin S., Chang W., Lin C., Hsieh S., Lee S., Fan K., Lin C., Huang H. 2014. Static magnetic field increases survival rate of dental pulp stem cells during DMSO-free cryopreservation.
Electromagnetic Biology and Medicine, 34, 4: 302-308
Liu H., Gronthos S., Shi S. 2006. Dental pulp stem cells. Methods in enzymology. 419:99-113 Lopez-Cazaux S., Bluteau G., Magne D., Lieubeau B., Guicheux J., Alliot-Licht B. 2006. Culture medium modulates the behaviour of human dental pulp-derived cells: technical note. European Cells and Materials Journal, 17, 11: 35-42
Mead B., Hill L. J., Blanch R. J., Ward K., Logan A., Berry M., Leadbeater W., Scheven B. A.
2016. Mesenchymal stromal cell-mediated neuroprotection and functional preservation of retinal ganglion cells in a rodent model of glaucoma. Cytotherapy, 18, 4: 487-496
Miller W. A., Everett M. M., Freedman J. T., Feagans W. C., Cramer J. F. 1976. Enzyme separation techniques for the study of growth of cells from layers of bovine dental pulp. In Vitro, 12, 8: 580-588
Miura M., Gronthos S., Zhao M., Lu B., Fisher L. W., Robey P. G., Shi S. (2003). SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100, 10: 5807–5812
20
Musiał-Wysocka A., Kot M., Majka, M. 2019. The Pros and Cons of Mesenchymal Stem Cell- Based Therapies. Cell Transplantation, 28, 7: 801–812
Nagpal A., Kremer K. L., Hamilton-Bruce M. A., Kaidonis X., Milton A. G., Levi C., Shi S., Carey L., Hillier S., Rose M., Zacest A., Takhar P., Koblar S. A. 2016. TOOTH (The open study of dental pulp stem cell therapy in humans): Study protocol for evaluating safety and feasibility of autologous human adult dental pulp stem cell therapy in patients with chronic disability after stroke. The International Journal of Stroke, 11, 5: 575-585
Nakamura S., Yamada Y., Katagiri W., Sugito T., Ito K., Ueda M. 2009. Stem cell proliferation pathways comparison between human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells by gene expression profile from promising dental pulp. Journal of Endodontics, 35, 11:
1536-1542
Nakashima M. 1991. Establishment of primary cultures of pulp cells from bovine permanent incisors. Archives of Oral Biology, 36, 9: 655-663
Nakashima M., Iohara K. 2017. Recent progress in translation from bench to a pilot clinical study on total pulp regeneration. Journal of Endodontics, 43, 9: 82-86
Nakashima, M., Iohara, K., Murakami, M., Nakamura, H., Sato, Y., Ariji, Y., Matsushita, K.
2017. Pulp regeneration by transplantation of dental pulp stem cells in pulpitis: a pilot clinical study. Stem Cell Research and Therapy, 8, 1, doi: 10.1186/s13287-017-0506-5: 13 str.
Nanci A. 2008. Ten Cate’s oral histology: development, structure and function. 7th ed. St. Louis, Mosby Elsevier: 432 str.
Nesti C., Pardini C., Barachini S., D'Alessandro D., Siciliano G., Murri L., Petrini M., Vaglini F. 2011. Human dental pulp stem cells protect mouse dopaminergic neurons against MPP+
or rotenone. Brain Research, 1367: 94-102
Nicola F. D. C., Marques M. R., Odorcyk F., Arcego D. M., Petenuzzo L.., Aristimunha D., Vizuete A., Sanches E. F., Pereira D. P., Maurmann N., Dalmaz C., Pranke P., Netto C. A.
2017. Neuroprotector effect of stem cells from human exfoliated deciduous teeth transplanted after traumatic spinal cord injury involves inhibition of early neuronal apoptosis. Brain Research, 1663: 95-105
Okiji T. 2002. Pulp as a connective tissue. In: Hargreaves K, Goodis H (eds) Seltzer and Bender’s dental pulp. Chicago, Quintessence Books: 120 str.
Oktar P. A., Yildirim S., Balci D., Can A. 2011. Continual expression throughout the cell cycle and downregulation upon adipogenic differentiation makes nucleostemin a vital human MSC proliferation marker. Stem Cell Reviews and Reports. 7, 2: 413-424
Osathanon T. 2010. Transplantation of cryopreserved teeth: a systematic review. International Journal of Oral Science, 2, 2: 59–65
Perry B. C., Zhou D., Wu X., Yang F. C., Byers M. A., Chu T. M., Hockema J. J., Woods E.
J., Goebel W. S.. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp- derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering, Part C Methods, 14, 2: 149-156
21
Pierdomenico L., Bonsi L., Calvitti M., Rondelli D., Arpinati M., Chirumbolo G., Becchetti E., Marchionni C., Alviano F., Fossati V., Staffolani N., Franchina M., Grossi A., Bagnara G.
P. 2005. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation, 80, 6, :836-844
Pisciotta A., Riccio M., Carnevale G., Lu A., De Biasi S., Gibellini L., La Sala G. B., Bruzzesi G., Ferrari A., Huard J., De Pol A. 2015. Stem cells isolated from human dental pulp and amniotic fluid improve skeletal muscle histopathology in mdx/SCID mice. Stem Cell Research and Therapy, 6, 1, 10.1186/s13287-015-0141-y: 15 str.
Potdar P. D., Jethmalani Y. D. 2015. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World Journal of Stem Cells, 7, 5: 839–851
Riegman P. H., Morente M. M., Betsou F., de Blasio P., Geary P. 2008. Marble arch international working group on biobanking for biomedical research. biobanking for better healthcare. Molecular Oncology, 2, 3: 213-222
Rosa, V., Zhang, Z., Grande, R. H., Nör, J. E. 2013. Dental pulp tissue engineering in full- length human root canals. Journal of Dental Research, 92, 11: 970–975
Sakai, K., Yamamoto, A., Matsubara, K., Nakamura, S., Naruse, M., Yamagata, M., Sakamoto, K., Tauchi, R., Wakao, N., Imagama, S., Hibi, H., Kadomatsu, K., Ishiguro, N., Ueda, M.
2012. Human dental pulp-derived stem cells promote locomotor recovery after complete transection of the rat spinal cord by multiple neuro-regenerative mechanisms. The Journal of Clinical Investigation, 122, 1, doi: 10.1172/JCI59251: 12 str.
Suzuki ., Haruyama N., Nishimura F., Kulkarni A. B. 2012. Dentin sialophosphoprotein and dentin matrix protein-1: Two highly phosphorylated proteins in mineralized tissues.
Archives of Oral Biology, 57, 9: 1165-1175
Syed-Picard, F. N., Du, Y., Lathrop, K. L., Mann, M. M., Funderburgh, M. L., Funderburgh, J.
L. 2015. Dental pulp stem cells: a new cellular resource for corneal stromal regeneration. Stem Cells Translational Medicine, 4, 3: 276–285
Taghipour Z., Karbalaie K., Kiani A., Niapour A., Bahramian H., Nasr-Esfahani M. H., Baharvand H. 2011. Transplantation of undifferentiated and induced human exfoliated deciduous teeth-derived stem cells promote functional recovery of rat spinal cord contusion injury model. Stem Cells and Development, 21, 10: 1794-802
Tatullo M., Marrelli M., Shakesheff K. M., White, L. J. 2015. Dental pulp stem cells: function, isolation and applications in regenerative medicine. Journal of tissue engineering and regenerative medicine, 9: 1205– 1216
Tsutsui T. W. 2020. Dental Pulp Stem Cells: Advances to Applications. Stem cells and cloning:
advances and applications, 13: 33–42
Wang F., Jia Y., Liu J., Zhai J., Cao N., Yue W., He H., Pei X. 2017. Dental pulp stem cells promote regeneration of damaged neuron cells on the cellular model of Alzheimer's disease.
Cell Biology International, 41, 6: 639-650
Wang J., Wang X., Sun Z., Wang X., Yang H., Shi S., Wang S. 2010. Stem cells from human- exfoliated deciduous teeth can differentiate into dopaminergic neuron-like cells. Stem Cells and Development, 19, 9: 1375-83
22
Woods E. J., Perry B. C., Hockema J. J., Larson L., Zhou D., Goebel W. S. 2009. Optimized cryopreservation method for human dental pulp-derived stem cells and their tissues of origin for banking and clinical use. Cryobiology, 59, 2: 150–157
Xuan K., Li B., Guo H., Sun W., Kou X., He X., Zhang Y., Sun J., Liu A., Liao L., Liu S., Liu W., Hu C., Shi S., Jin Y. 2018. Deciduous autologous tooth stem cells regenerate dental pulp after implantation into injured teeth. Science Translational Medicine, 10, 455, doi:
10.1126/scitranslmed.aaf3227: 14 str.
Yamada, Y., Nakamura, S., Ito, K., Sugito, T., Yoshimi, R., Nagasaka, T., Ueda, M. 2010. A feasibility of useful cell-based therapy by bone regeneration with deciduous tooth stem cells, dental pulp stem cells, or bone-marrow-derived mesenchymal stem cells for clinical study using tissue engineering technology. Tissue Engineering, 16: 1891–1900
Yamaguchi S., Shibata R., Yamamoto N., Nishikawa M., Hibi H., Tanigawa T., Ueda M., Murohara T., Yamamoto A. 2015. Dental pulp-derived stem cell conditioned medium reduces cardiac injury following ischemia-reperfusion. Scientific Reports, 5, 16295, doi:
10.1038/srep16295: 10 str.
Yamaza T., Alatas F. S., Yuniartha R., Yamaza H., Fujiyoshi J. K., Yanagi Y., Yoshimaru K., Hayashida M., Matsuura T., Aijima R., Ihara K., Ohga S., Shi S., Nonaka K., Taguchi T.
2015. In vivo hepatogenic capacity and therapeutic potential of stem cells from human exfoliated deciduous teeth in liver fibrosis in mice. Stem Cell Research and Therary, 6, 1, doi: 10.1186/s13287-015-0154-6: 16 str.
Yamaza, T., Kentaro, A., Chen, C., Liu, Y., Shi, Y., Gronthos, S., Wang, S., Shi, S. 2010.
Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Stem Cell Research and Therapy, 1, 1, doi: 10.1186/scrt5: 11 str.
Yan M., Yu Y., Zhang G., Tang C., Yu J. 2011. A journey from dental pulp stem cells to a bio- tooth. Stem Cell Reviews and Reports, 7, 1: 161-171
Yu C., Abbott P.V. 2007. An overview of the dental pulp: its functions and responses to injury.
Australian Dental Journal Supplement, 52, 1: 4-16
Yildirim S. 2013. Dental Pulp Stem Cells. 3rd ed. SpringerBriefs in stem cells. New York, Springer New York: 147 str.
Zhou D., Gan L.,Peng Y.,Zhou Y.,Zhou X.,Wan M., Fan Y., Xu X., Zhou X., Zheng L., Du W. 2020. Epigenetic regulation of dental pulp stem cell fate. Steam Cells International, doi:
10.1155/2020/8876265: 16 str.
Zimmermann A., Preynat-Seauve O., Tiercy J. M., Krause K. H., Villard J. 2012. Haplotype- based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations.
Stem Cells and Development, 21, 13: 2364-2373
ZAHVALA
Za nasvete, pomoč in vodenje pri pisanju diplomskega dela se iskreno zahvaljujem mentorju Jerneju Ogorevcu ter somentorju Marku Strbadu. Posebej bi se zahvalila staršem in fantu za vso izkazano podporo in prijateljem, ki mi vedno stojijo ob strani.
