MAGISTRSKO DELO

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

MAGISTRSKO DELO

Svit Šmajdek

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE KEMIJA

Določitev hlapnih komponent v medu z GC-MS

MAGISTRSKO DELO

Svit Šmajdek

MENTOR: izr. prof. dr. Drago Kočar

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

magistrskega dela

Spodaj podpisani Svit Šmajdek sem avtor magistrskega dela z naslovom: Določitev hlapnih komponent v medu z GC-MS.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom izr.

prof. dr. Draga Kočarja;

 sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v

predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007));

 sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

 je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, 2021 Podpis avtorja:

(6)

(7)

Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Kemija. Delo je bilo opravljeno na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo UL.

Senat UL FKKT je za mentorja imenoval izr. prof. dr. Draga Kočarja.

Recenzenti: prof. dr. Matevž Pompe, prof. dr. Franc Požgan

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela

Predsednik komisije: prof. dr. Franc Požgan, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo.

Član: izr. prof. dr. Drago Kočar, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo.

Član: prof. dr. Matevž Pompe, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo.

(8)

(9)

Zahvala

Zahvalil bi se mentorju izr. prof. dr. Dragu Kočarju za vodenje in strokovno pomoč pri opravljanju magistrskega dela.

Zahvalil bi se Anžetu Pavlinu, ki mi je tekom eksperimentalnega dela ves čas stal ob strani in mi nudil pomoč, ko sem jo potreboval.

Zahvala gre Zdenki Držaj, Mojci Žitko in Dušanu Komelu za vso pomoč pri eksperimentalnem delu.

Zahvalil bi se tudi svoji družini in prijateljem, ki so mi vsa ta leta stali ob strani.

(10)

(11)

Določitev hlapnih komponent v medu z GC-MS

Povzetek: V magistrskem delu sem se ukvarjal z določitvijo hlapnih komponent v medu z GC-MS. Najprej sem optimiziral metodo za njihovo določitev. Poiskal sem primeren način za pripravo vzorcev. Pri tem sem ugotovil, da dodatek nasičene vodne raztopine NaCl pomaga pri ekstrakciji spojin. Za tem sem optimiziral še čas in temperaturo ekstrakcije ter temperaturni program. S pripravljeno metodo sem določil hlapne komponente v cvetličnem, gozdnem, akacijevem, lipovem, hojevem, smrekovem in kostanjevem medu. V vseh skupaj sem določil prisotnost 148 spojin. Največ različnih je vseboval lipov med. Z masnimi spektri, ki sem jih dobil in njihovo primerjavo z NIST- ovo knjižnico sem uspel identificirati nekatere izmed spojin, ostalim pa sem določil strukturne fragmente, iz katerih so sestavljene. Ugotovil sem, da gre predvsem za alkohole, aldehide, kisline in estre. Pogosto se pojavljajo terpeni in terpenoidi. Za bolj gotovo identifikacijo sem z isto metodo analiziral še nekatere standarde. Ugotovil sem, da nekateri izmed analiziranih vzorcev medu vsebujejo furfural, 2-metilbutanojsko kislino, stiren, benzil alkohol, fenilacetaldehid, acetofenon in fenilocetno kislino. Noben vzorec pa ne vsebuje dekanojske kisline, dodekanola in kinolin-5-ola.

Ključne besede: Med, hlapne komponente, plinska kromatografija, masna spektrometrija.

Determination of volatile compounds in honey with GC-MS

Abstract: In my master's thesis, I studied determination of volatile compounds in honey with the use of GC-MS. I first optimised the method for their determination. I was looking for a suitable way to prepare the samples. In doing so, I found out that the addition of saturated aqueous NaCl solution aids in the extraction of the compounds. After that I optimised the extraction time and temperature, as well as the temperature program. Using the prepared method, I determined the volatile compounds in floral, forest, acacia, lime, fir, spruce and chestnut honey. I determined the presence of 148 compounds, with lime honey containing the most variety. With the obtained mass spectra and their comparison with the NIST library, I was able to identify some of the compounds. In others I determined the structural fragments of which they are composed. I found out that these compounds are mainly alcohols, aldehydes, acids and esters. There are many terpenes and terpenoids. For a more definite identification, I used the same method to analyse some standards. I found that some of the honey samples analysed contained furfural, 2- methylbutanic acid, styrene, benzyl alcohol, phenylacetaldehyde, acetophenone and phenylacetic acid. However, no sample contained decanoic acid, dodecanol or quinolin- 5-ol.

Key words: Honey, volatile compounds, gas chromatography, mass spectrometry.

(12)

(13)

Kazalo

1 UVOD ... 1

1.1 Med ... 1

1.2 GC-MS ... 2

1.3 Ionizacija molekul v MS ... 3

1.4 Masni analizatorji ... 4

1.5 Tandemska masna spektrometrija ... 4

1.6 Določitev hlapnih komponent s pomočjo GC-MS ... 5

1.7 Ekstrakcija hlapnih komponent ... 5

1.7.1 Ekstrakcija s topili ... 5

1.7.2 Ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka (USE)... 5

1.7.3 Tehnika nadprostora (HS) ... 6

1.7.4 Mikroekstrakcija na trdno fazo (SPME) ... 6

1.8 Hlapne komponente v medu ... 8

1.9 GC-MS/MS TSQ 9000 ... 8

2 Namen ... 10

3 Eksperimentalni del ... 11

3.1 Aparature in pribor ... 11

3.1.1 Aparature: ... 11

3.1.2 Pribor: ... 11

3.2 Kemikalije: ... 11

3.3 Priprava raztopin: ... 12

3.4 Postopki ... 14

3.4.1 Optimizacija metode ... 14

3.4.1.1 Priprava vzorcev ... 14

3.4.1.2 Ponovljivost rezultatov ... 15

3.4.1.3 Optimizacija časa in temperature kondicioniranja in ekstrakcije vzorca ... 15

3.4.1.4 Optimizacija temperaturnega programa ... 15

3.4.2 Analiza vzorcev ... 17

3.4.3 Določitev nekaterih hlapnih komponent z uporabo standardov ... 18

4 Rezultati in razprava ... 19

4.1 Optimizacija metode ... 19

4.1.1 Priprava vzorcev ... 19

(14)

4.1.1.1 Vpliv NaCl ... 19

4.1.1.2 Vpliv količine nasičene vodne raztopine NaCl ... 20

4.1.1.3 Vpliv količine medu ... 20

4.1.2 Ponovljivost rezultatov ... 21

4.1.3 Vpliv temperature kondicioniranja in ekstrakcije ... 23

4.1.4 Vpliv časa ekstrakcije ... 24

4.1.5 Optimizacija temperaturnega programa ... 26

4.2 Analiza vzorcev ... 27

4.2.1 Cvetlični med ... 27

4.2.2 Gozdni med ... 30

4.2.3 Akacijev med ... 32

4.2.4 Lipov med ... 34

4.2.5 Hojev med ... 36

4.2.6 Smrekov med ... 37

4.2.7 Kostanjev med ... 39

4.2.8 Ploščina vrhov na TIC kromatogramu... 40

4.2.9 Določitev specifičnih hlapnih markerjev za različne vrste medu ... 40

4.3 Določitev hlapnih komponent s standardi ... 45

5 Sklepi ... 47

6 Viri ... 49

(15)

Kazalo slik

Slika 1: Shema GC-MS. ... 3

Slika 2: Kvadrupol. ... 4

Slika 3: Prikaz HS-SPME ekstrakcije. ... 7

Slika 4: GC-MS/MS TSQ 9000. ... 9

Slika 5: Kromatogram, ki prikazuje primerjavo dodatka milli-Q vode in dodatka nasičene vodne raztopine NaCl. ... 19

Slika 6: Kromatogram, ki prikazuje primerjavo dodatka različne količine nasičene vodne raztopine NaCl. ... 20

Slika 7: Kromatogram, ki prikazuje primerjavo dodatka različne količine medu. ... 20

Slika 8: Kromatogram analize petih vzorcev pripravljenih na enak način. ... 21

Slika 9: Kromatogram druge ponovitve analize petih vzorcev pripravljenih na enak način. ... 21

Slika 10: Število kromatografskih vrhov pri posameznem vzorcu... 22

Slika 11: Kromatogram prve, šeste in dvanajste analize istega vzorca. ... 22

Slika 12: Kromatogrami vzorcev pri različnih temperaturah kondicioniranja in ekstrakcije. ... 23

Slika 13: Ploščine vrhov za C6 dien in benzofenon pri različnih temperaturah kondicioniranja in ekstrakcije. ... 24

Slika 14: Kromatogram vzorcev pri različnem času ekstrakcije. ... 24

Slika 15: Ploščine vrhov za C6 dien in benzofenon v odvisnosti od časa ekstrakcije. .. 25

Slika 16: Kromatogrami dobljeni s prvim (zgoraj), drugim (sredina) in tretjim (spodaj) temperaturnim programom. ... 26

Slika 17: Kromatograma dobljena s četrtim (zgoraj) in petim (spodaj) temperaturnim programom. ... 26

Slika 18: Kromatogram vzorca C142. ... 27

Slika 19: Kromatogram vzorca G146. ... 30

Slika 20: Kromatogram vzorca A147. ... 32

Slika 21: Kromatogram vzorca L061. ... 34

Slika 22: Kromatogram vzorca H118. ... 36

Slika 23: Kromatogram vzorca S143... 37

Slika 24: Kromatogram vzorca K1. ... 39

Slika 25: Povprečna ploščina TIC kromatograma vzorcev specifičnih vrst medu. ... 40

Slika 26: Kromatogram standardov. ... 45

(16)

(17)

Kazalo tabel

Tabela 1: Količina dodatka nas. razt. NaCl. ... 13

Tabela 2: Količina medu in nas. razt. NaCl. ... 13

Tabela 3:Oznake analiziranih vzorcev medu... 17

Tabela 4: Vpliv količine nasičene vodne raztopine NaCl. ... 20

Tabela 5: Vpliv količine medu. ... 21

Tabela 6: Relativne ploščine izbranih vrhov. ... 23

Tabela 7: Spojine v cvetličnem medu 1. del. ... 28

Tabela 8: Spojine v cvetličnem medu 2. del. ... 29

Tabela 9: Spojine v gozdnem medu. ... 31

Tabela 10: Spojine v akacijevem medu. ... 33

Tabela 11: Spojine v lipovem medu. ... 35

Tabela 12: Spojine v hojevem medu. ... 36

Tabela 13: Spojine v smrekovem medu. ... 38

Tabela 14: Spojine v kostanjevem medu. ... 39

Tabela 15: Spojine določene v posameznih vrstah medu. ... 42

Tabela 16: Retencijski časi standardov. ... 45

Tabela 17: Število vzorcev, v katerih so se pojavile določene spojine. ... 46

(18)

(19)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

GC-MS sklopitev plinske kromatografije z masno spektrometrijo USE ultrazvočna ekstrakcija (angl. ultrasonic assisted extraction) HS-SPME mikroekstrakcija na trdno fazo s tehniko vzorčenja nadprostora FID plamensko ionizacijski detektor (angl. flame ionisation detector) TCD toplotno prevodni detektor (angl. thermal conductivity detector) ECD detektor na zajetje elektronov (angl. electron capture detector) CI kemijska ionizacija (angl. chemical ionisation)

EI ionizacija s hitrimi elektroni (angl. electron ionisation) MS/MS tandemska masna spektrometrija

TIC celotni ionski kromatogram (angl. total ion chromatogram)

NIST Narodni urad za standarde in tehnologijo (angl. National Institute of Standards and Technology)

SDE simultana destilacijska ekstrakcija (angl. simultaneous steam distillation extraction)

HS tehnika nadprostora (angl. headspace)

SPME mikroekstrakcija na trdno fazo (angl. solid-phase microextraction) SHS statična tehnika nadprostora (angl. static headspace)

DHS dinamična tehnika nadprostora (angl. dynamic headspace) PDMS polidimetilsiloksan

PAC poliakrilat

CAR karboksen

DVB divinilbenzen

GC-MS/MS sklopitev plinske kromatografije s tandemsko masno spektrometrijo

AEI napredna ionizacija s hitrimi elektroni (angl. advanced electron ionisation)

(20)

(21)

1

1 UVOD

1.1 Med

Med je sladka in viskozna tekočina, ki jo čebele proizvedejo iz cvetličnega nektarja ali iz mane, ki jo izločajo nekatere žuželke [1]. Ker med ne potrebuje nobene dodatne obdelave, ni presenetljivo, da njegova uporaba sega že tisoče let nazaj. V Gruziji so bili odkriti ostanki medu, za katere je ocenjeno, da so iz časov med 27. in 25. stoletjem pred našim štetjem [2]. Zapisi omenjajo uporabo medu v Egiptu že v letu 1500 pred našim štetjem [3]. V tistih časih so med uporabljali za zdravstvene in obredne namene. V času Grkov in Rimljanov pa se je začel uporabljati tudi kot hrana [1].

Poznamo več vrst medu, ki se med seboj ločijo po videzu, vonju in okusu. K raznolikosti največ pripomorejo različne botanične vrste iz katerih med dobimo. Pomembna pa sta tudi lokacija in način pridelave [1]. V grobem ga lahko delimo na med pridelan iz cvetličnega nektarja, med pridelan iz mane in pa mešanico obeh [4].

Med, narejen iz cvetličnega nektarja, je po navadi svetlejše barve, po okusu pa je bolj sladek. V to kategorijo lahko uvrstimo cvetlični in akacijev med [5]. Med iz mane pridobimo s pomočjo žuželk, ki se hranijo s sokovi dreves. Te sokove žuželke v svojem prebavnem traku predelajo in jih izločijo v obliki mane [6]. Tako pridobimo gozdni, smrekov in hojev med. Poznamo tudi vrste medu, ki so pripravljene tako iz nektarja, kot iz mane. V to skupino uvrščamo lipov in kostanjev med [5].

Ker je med v večji meri naravni produkt, je njegovemu izvoru včasih težko slediti. V ta namen je bilo razvitih več analiznih metod, s katerimi lahko določimo, iz katerih botaničnih vrst izvira določena vrsta medu. To nas še posebej zanima pri medu, pripravljenem iz ene same botanične vrste, ki je v večini primerov bolj cenjen. Rezultati analiz so zelo pomembni za potrošnike, prav tako pa z njimi lahko izognemo možnim prevaram na trgu [7].

Najbolj pogosto uporabljene analizne metode so organoleptične in fizikalne. Pri teh botanične vrste v medu določimo glede na okus, vonj, barvo in pa proces kristalizacije medu. V nekaterih primerih se uporablja tudi analiza cvetnega prahu [4].

Ker je znano, da je aroma močno odvisna od sestave hlapnih komponent, je v veljavo prišla tudi analiza medu s pomočjo plinske kromatografije. Znanih je več postopkov, s katerimi je mogoče določiti sestavo hlapnih komponent. Ločijo se glede na način izolacije hlapnih komponent. V zadnjih časih sta najbolj uveljavljena ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka (USE) in mikroekstrakcija na trdno fazo s tehniko vzorčenja nadprostora (HS – SPME) [8]. S slednjo sem se ukvarjal pri tem magistrskem delu.

(22)

2

1.2 GC-MS

Plinska kromatografija je ena izmed najbolj uporabljenih tehnik za kvalitativno in kvantitativno analizo. Pri plinski kromatografiji se komponente ločujejo glede na porazdeljevanje med mobilno in stacionarno fazo. Mobilna faza je nosilni plin. Največ se uporablja helij, pogosta pa je tudi uporaba argona, dušika in vodika. Nosilni plin mora biti inerten in s hlapnimi komponentami ne sme interagirati. Porazdeljevanje je tako odvisno od interakcije med analitom in stacionarno fazo. Ta je lahko trdna, v večini primerov pa se uporablja tekoča stacionarna faza, ki je imobilizirana na površini kolone [9].

Poznamo različne vrste kolon. Njihova dolžina je po navadi 2 – 60 m. V zgodnjih letih so se uporabljale polnjene kolone. Pri teh je na finih delcih nosilca adsorbiran tanek film tekoče stacionarne faze. Njihov premer je 2 - 4 mm. V zadnjih 20 letih pa so v veljavo prišle kapilarne kolone, kjer je stacionarna faza tekoč film debeline le nekaj desetink milimetra. Te omogočajo večjo hitrost analize in boljšo ločljivost [9].

Za zaznavo in določitev analitov pri plinski kromatografiji potrebujemo ustrezen detektor. Ta mora ustrezati več pogojem. Imeti mora čim nižjo mejo zaznave, kratek odziven čas, linearen odziv in delovati v visokih temperaturnih območjih. Pogosto se uporabljajo plamensko ionizacijski detektorji (FID), toplotno prevodni detektorji (TCD) in detektorji na zajetje elektronov (ECD). Pri svojem delu pa sem za detekcijo uporabil masni spektrometer [9].

Sklopitev plinskega kromatografa in masnega spektrometra je znana pod imenom GC- MS. V masnem spektrometru iz molekul tvorimo ione, ki jih nato ločimo glede na razmerje med njihovo maso in nabojem (m/z). Ločene ione zaznamo na detektorju in izrišemo masni spekter. Ker je večina ionov le enkrat nabita (z = 1) pogosto rečemo, da jih ločujemo glede na maso, čeprav to ni povsem korektno. Pri uporabi polnjenih kolon je bilo pred vstopom v masni spektrometer potrebno zmanjšati količino nosilnega plina, ki je prihajala iz plinskega kromatografa. V ta namen so se uporabljale šobe (angl. »jet separator«). Z uveljavljanjem kapilarnih kolon, ki imajo glede na polnjene veliko manjši volumski pretok, pa uporaba teh ni več potrebna [9].

(23)

3 Slika 1: Shema GC-MS.

Slika 1 prikazuje običajno sestavo plinskega kromatografa sklopljenega z masnim spektrometrom.

1.3 Ionizacija molekul v MS

Za ionizacijo molekul se v GC-MS sistemih najpogosteje uporablja ionizacija s hitrimi elektroni (EI) ali pa kemijska ionizacija (CI). Pri ionizaciji s hitrimi elektroni molekule, ki pridejo na ionski izvor, obstreljujemo z žarkom elektronov s kinetično energijo 70 eV.

Posledica trka elektrona in molekule vodi v nastanek molekulskega iona (kation radikal M^+.) [9, 10].

𝑀 + 𝑒⁻ → 𝑀^+.+ 2𝑒⁻

Kation radikal M^+. ima veliko energijo, zaradi katere je nestabilen. To vodi v njegovo fragmentacijo, pri kateri nastanejo ioni z manjšo molekulsko maso. Pozitivne ione nato vodimo na detektor. Na koncu dobimo masni spekter vseh fragmentov, ki je zelo koristen pri identifikaciji spojine [9, 10].

Pri kemijski ionizaciji molekulski ion nastane kot posledica trka molekule z ioni reakcijskega plina. Primeri takih plinov so metan, izobutan in amonijak. Na primeru metana so napisane glavne reakcije pri CI [10].

𝐶𝐻₄+ 𝑒⁻ → 𝐶𝐻₄^+.+ 2 𝑒⁻ 𝐶𝐻₄^+.+ 𝐶𝐻₄ → 𝐶𝐻₅⁺+ 𝐶𝐻₃^.

𝑀 + 𝐶𝐻₅⁺ → 𝑀𝐻⁺+ 𝐶𝐻₄

Z razliko od elektronske ionizacije, kjer pride do fragmentacije molekulskega iona, pri kemijski ionizaciji molekulski ion nima tako velike presežne energije, ki bi vodila v

(24)

4

njegov razpad. Končni produkt CI je tako spekter z manj fragmenti, na katerem je molekulski ion enostavno prepoznati. CI je tako komplementarna EI [9, 10].

1.4 Masni analizatorji

Kot analizator se pri GC-MS uporablja kvadrupol ali pa ionska past [9].

Kvadrupol (slika 2) je sestavljen iz dveh parov nasprotno nabitih elektrod v obliki cilindričnih palic. Ione analizira na tak način, da pri določeni napetosti skozi prepušča le tiste, z določenim razmerjem m/z. S spreminjanjem te napetosti spremenimo tudi razmerje m/z, ki ga analizator prepušča do detektorja. V primerjavi z drugimi analizatorji ima kvadrupol visoko zmogljivost, omogoča hitro pregledovanje m/z, vendar ima relativno majhno ločljivost [9].

Slika 2: Kvadrupol.

Ionska past z oscilirajočim električnim poljem hrani ione. Poenostavljeno bi lahko rekli, da gre za ukrivljen kvadrupol, ki tvori zaključen krog. Pri tem je notranja elektroda zreducirana v točko, ki jo obkroža zunanja elektroda. Zgornja in spodnja palica pa predstavljata pokrova. Vsi ioni, ki jih dobimo iz ionskega izvira, se nahajajo v ionski pasti. S spreminjanjem napetosti ali frekvence napetosti lahko te ione posamično izločimo iz pasti in jih detektiramo na detektorju [10].

1.5 Tandemska masna spektrometrija

Pogosta je uporaba tandemske masne spektrometrije (MS/MS). Ta nam omogoča snemanje spektrov določenih fragmentov ionov. Pri tej v ionskem izvoru dobimo

(25)

5

molekulski ion in fragmente. Te pošljemo skozi prvi masni analizator, ki skozi prepusti le izbran ion (prekurzor). Sledijo reakcije v interakcijski celici, kjer prekurzor fragmentira spontano, zaradi interakcije s plinom ali laserjem. Pri tem nastanejo produktni ioni, ki jih analiziramo z drugim analizatorjem in detektiramo na ionskem detektorju [9].

1.6 Določitev hlapnih komponent s pomočjo GC-MS

MS med analizo konstantno snema spektre. Končne rezultate tako sestavlja tudi po več sto masnih spektrov. Število vseh zaznanih signalov z računalniško analizo seštejemo in izrišemo celotni ionski kromatogram (TIC). Prednost konstantnega snemanja pa je tudi ta, da lahko pri kateremkoli času prikažemo masni spekter in določimo spojino, ki se je takrat eluirala. V veliko pomoč pri identifikaciji spojin so nam knjižnice masnih spektrov, s katerimi lahko s pomočjo računalnika primerjamo rezultate [9]. Ena izmed takih knjižnic je NIST-ova knjižnica masnih spektrov, ki sem jo tudi sam uporabil za določevanje hlapnih komponent.

Poleg določitve spojin z uporabo masnih spektrov se za kvalitativno določitev pogosto uporabljajo standardi. Primerjamo lahko retencijske čase standarda in analita v vzorcu.

Možno je tudi, da vzorcem dodamo majhno količino standarda, za katerega domnevamo, da bi lahko bil v vzorcu in opazujemo, če se na kromatogramu pojavi kakšen novi vrh. V primeru, da se, lahko sklepamo, da ne gre za isto spojino [9].

1.7 Ekstrakcija hlapnih komponent

1.7.1 Ekstrakcija s topili

Da lahko z GC/MS analiziramo hlapne komponente, jih je potrebno najprej ekstrahirati iz nehlapnega vzorca. V primeru medu je potrebno odstraniti sladkorje in vodo. V ta namen literatura omenja uporabo topil [11]. Takšna ekstrakcija je enostavna in ne zahteva gretja vzorcev, ki bi lahko povzročilo razpad termolabilnih spojin. Z uporabo topil z nizko polarnostjo lahko iz vzorcev izločimo tako sladkorje kot vodo. Topila, ki se uporabljajo za ekstrakcijo, so etil acetat, diklorometan in n-heksan [11, 12, 13].

Možna je tudi uporaba simultane destilacijske ekstrakcije (SDE) z uporabo Likens- Nikersonove aparature. Aparaturo sestavlja hladna cev, ki povezuje dve bučki. V prvi bučki se nahaja vzorec, v drugi pa topilo, običajno diklorometan. Bučki grejemo, para iz obeh pa je speljana v hladno cev, kjer se kondenzira. Na dnu cevi se kondenzat loči v dve fazi. Vodna je speljana nazaj v bučko z vzorcem, organska pa v bučko s topilom. Po več ciklih SDE hlapne komponente uspešno ekstrahiramo v bučko s topilom [14].

1.7.2 Ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka (USE)

Ekstrakcija s pomočjo ultrazvoka se kot ekstrakcijska tehnika za analizo medu pogosto omenja v literaturi. Pri tej vzorcem medu dodamo organsko topilo oz. mešanico

(26)

6

organskega topila in vode. Možen je tudi dodatek soli (npr. MgSO4), ki poveča izkoristek ekstrakcije. Vzorce za določen čas postavimo v ultrazvočno kopel. Organsko fazo nato ločimo in oddestiliramo topilo [15, 16, 17].

1.7.3 Tehnika nadprostora (HS)

Statična tehnika vzorčenja nadprostora (SHS) se za analizo medu ni uveljavila. Razlog za to je nizka koncentracija hlapnih komponent v medu. Namesto te se uporablja dinamična tehnika nadprostora (DHS) »purge and trap«. Ta omogoča tako identifikacijo kot kvantifikacijo hlapnih komponent. Tehnika deluje tako, da hlapne komponente iz nadprostora izpihujemo z inertnim nosilnim plinom. Te se pred vstopom v GC ujamejo in skoncentrirajo v hladni pasti. Na ta način močno povečamo občutljivost metode in znižamo mejo zaznave [18].

1.7.4 Mikroekstrakcija na trdno fazo (SPME)

Mikroekstrakcija na trdno fazo je tehnika, ki se je s časom vedno bolj uveljavila za analizo hlapnih komponent v medu. Z razliko od ekstrakcij tekoče-tekoče in parnih destilacij ne potrebuje dragih in po možnosti toksičnih topil [18]. Tehnika uporablja silikatno vlakno, prevlečeno z nehlapnim polimerom. Analit se na vlakno adsorbira direktno iz tekočih vzorcev ali iz nadprostora nad vzorcem. Kasneje pa ga z gretjem desorbiramo na injektorju plinskega kromatografa [9]. Glavne prednosti SPME so v njeni enostavnosti, visoki občutljivosti, potrebi po majhni količini vzorca in nizki ceni za analizo. Uporabimo jo lahko za določitev tako polarnih kot tudi nepolarnih komponent iz trdnih, tekočih ali plinastih vzorcev. SPME daje ponovljive rezultate in omogoča tako kvalitativno, kot tudi kvantitativno analizo [18]. Sam postopek ekstrakcije hlapnih komponent s SPME tehniko je prikazan na sliki 3.

(27)

7 Slika 3: Prikaz HS-SPME ekstrakcije.

Pri SPME je pomembna izbira vlakna. Polarnost tega se mora ujemati s polarnostjo analita. To pomeni, da za nepolarne analite uporabljamo nepolarna vlakna, za polarne analite pa polarna vlakna [18]. Pri vzorcih, kjer nas zanima več hlapnih komponent, je zato včasih smiselna uporaba kombinacije več vlaken.

V primeru medu literatura navaja več različnih polimerov, ki omogočajo SPME analizo.

Uporaba enokomponentih vlaken odetih s polidimetilsiloksanom (PDMS), poliakrilatom (PAC) in karboksenom (CAR) je pokazala, da se izmed naštetih najbolj izkaže PAC. Pri enakih pogojih je pri njegovi uporabi mogoče opaziti večje ploščine vrhov na kromatogramu kot pri PDMS in manjše popačenje vrhov kot pri CAR [19]. Slabosti PDMS in CAR lahko odpravimo z uporabo kombinacije več polimerov polidimetilsiloksan/divinilbenzen (PDMS/DVB), karboksen/polidimetilsiloksan (CAR/PDMS) in divinilbenzen/ karboksen/polidimetilsiloksan (DVB/CAR/PDMS) [20, 21, 22]. Poleg vlakna odetega s PAC dajejo vsa izmed naštetih kombiniranih vlaken zadovoljive rezultate za analizo hlapnih komponent v medu [18].

Koncentracija analita, ki se ekstrahira na vlakno, je odvisna od njegove polarnosti in debeline, časa ekstrakcije in pa seveda koncentracije analita v vzorcu. Učinkovitost ekstrakcije analita lahko še dodatno povečamo s spremembo pH vzorca, višanjem temperature ekstrakcije in dodatkom soli. Izsoljevanje hlapnih komponent lahko dosežemo z dodatkom natrijevega klorida, natrijevega hidrogenkarbonata, kalijevega karbonata ali amonijevega sulfata [18].

(28)

8

1.8 Hlapne komponente v medu

Na področju hlapnih komponent v medu je bilo v zadnjih letih opravljenih veliko raziskav. Te so iskale primerne tehnike ekstrakcije hlapnih komponent in metode, s katerimi je te mogoče kvalitativno in kvantitativno določiti. Določene so bile različne spojine, ki jih najdemo v medu, prav tako pa so bili določeni markerji, ki so specifični za določene botanične vrste, iz katerih med izvira.

Določene so bile spojine iz vrst alkoholov, aldehidov, ketonov, etrov, estrov, kislin, ogljikovodikov, derivatov furana in benzena, aminov in žveplovih spojin. Vsem tem je skupno, da so prisotne v nizkih koncentracijah, imajo pa tudi relativno nizko molekulsko maso [23].

Nekatere vrste medu, ki sem jih tudi sam analiziral in izvirajo le iz ene botanične vrste, so že omenjene v literaturi. Tem so bili na podlagi primerjave z drugimi vrstami že določeni markerji, ki bi lahko bili uporabljeni za določitev botaničnega izvora. Med te vrste medov sodijo akacijev, kostanjev, lipov in hojev med.

Marker za akacijev med je lahko prisotnost cis-linalol oksida in heptanala, ter hkratna odsotnost fenilacetaldehida in dimetil disulfida. Te kombinacije ne najdemo v medu, ki ga dobimo iz evkalipta, lipe, rožmarina, sončnice, jesenske vrese, kostanja ali oljne ogrščice [23].

Specifične spojine, ki jih najdemo v kostanjevem medu, so 2-metildihidrofuranon, α- metilbenzil alkohol, heks-3-en-1-ol in dimetilstiren [23]. Ostali markerji, ki so še mogoči, so prisotnost acetofenona, 1-feniletanola in 2-aminoacetofenona [24].

Lipov med vsebuje več spojin kot ostale naštete vrste medu. Posledično je tudi več spojin, ki so zanj specifične. Med njimi so 2-metilfuran, α-terpinen, α-pinen oksid, 2,3- bis(metilen)biciklo[3.2.1]oktan, metil izopropil benzen, 5-metilen-6- izopropilencikloheks-3-en-1-ol in 5-metilacetofenon. Specifična je tudi odsotnost 3- metilbutanola [23].

Pri hojevem medu so specifične hlapne komponente 6-metilhapten-2-ol, 2-hidroksi-3,5,5- trimetilcikloheks-2-en-1-on, 2-acetilfuran in 3,4,5-trimetilfenol. V relativno visokih koncentracijah pa sta prisotna tudi nonan in 5-metilnon-4-en [25].

1.9 GC-MS/MS TSQ 9000

Pri magistrskem delu sem za analize uporabil GC-MS/MS sistem TSQ 9000 prikazan na sliki 4. Pri tem gre za sklopitev plinskega kromatografa Trace 1310 z masnim spektrometrom. Na sistem je bil priklopljen še avtomatski vzorčevalnik TriPlus RSH. Ta omogoča avtomatsko vzorčenje s HS in SPME tehniko, možno pa je tudi avtomatsko vzorčenje direktno iz tekočih vzorcev. TriPlus RSH vsebuje tudi komoro za kondicioniranje SPME vlakna in agitator za kondicioniranje vzorcev.

(29)

9

V GC sistemu sem za ločbo spojin uporabil kapilarno kolono HP-5ms. Gre za nepolarno kolono s (5 %-fenil)-metilpolisiloksansko stacionarno fazo [26].

V samem masnem spektrometru je izvor elektronov »ExtractaBrite«, ki omogoča tako ionizacijo s hitrimi elektroni kot tudi kemijsko ionizacijo. Poleg tega vsebuje še vir ionov za napredno ionizacijo s hitrimi elektroni (AEI). Kot analizator se v sistemu uporabljajo trije kvadrupoli [27].

Celoten sistem je mogoče upravljati z računalniškim programom »Chromeleon.« Ta omogoča enostavno nastavljanje parametrov za samo analizo, na njem pa je mogoča tudi obdelava končnih rezultatov.

Slika 4: GC-MS/MS TSQ 9000.

(30)

10

2 Namen

Namen magistrskega dela je bil pripraviti in optimizirati metodo za analizo hlapnih komponent v medu s tehniko HS-SPME/GC-MS. S pripravljeno metodo pa v nadaljevanju izvesti analize na vzorcih cvetličnega, gozdnega, akacijevega, lipovega, hojevega, smrekovega in kostanjevega medu. Cilj je bil ugotoviti, katere spojine se nahajajo v medu in katere so specifične za posamezno botanično vrsto medu.

(31)

11

3 Eksperimentalni del

3.1 Aparature in pribor

3.1.1 Aparature:

Pri delu sem uporabil:

 GC-MS/MS sistem TSQ 9000.

 Plinski kromatograf Trace 1310.

 Avtomatski vzorčevalnik TriPlus RSH.

 Nastavek za SPME s CAR/PDMS/DVB vlaknom.

3.1.2 Pribor:

Uporabil sem naslednji pribor:

 Batna pipeta (1-5 mL).

 Batna pipeta (100-1000 µL).

 Batna pipeta (10-100 µL).

 Bučka 50 ± 0,06 mL, razred A.

 Bučka 25 ± 0,04 mL, razred A.

 Polnilna pipeta 1 ± 0,008 mL, razred AS.

 Čaše različnih volumnov.

 Steklene viale 20 mL.

 Magnetni pokrovčki za viale s silikon/PTFE septo.

 Klešče za zapiranje vial.

 Tehtalna ladjica.

 Plastična žlička.

3.2 Kemikalije:

Uporabil sem naslednje kemikalije:

 Natrijev klorid, NaCl (M = 58,44 g/mol), CAS: 7647-14-5, Emsure, čistost ≥ 99,5 %.

 Benzofenon, C13H10O (M = 182,22 g/mol), CAS: 119-61-9, Sigma-Aldrich, čistost 99 %.

 Metanol, CH3OH (M = 32,04 g/mol), CAS: 67-56-1, J. T. Baker, čistost 99,8 %.

 Kinolin-5-ol, C9H7NO (M = 145,16 g/mol), CAS: 578-67-6.

 Fenilacetaldehid, C8H8O (M = 120,15 g/mol), CAS: 122-78-1, Janssen Chimica, čistost 85 %.

 Furfural, C5H4O2 (M = 96,08 g/mol), CAS: 98-01-1, Fluka.

 Fenilocetna kislina, C8H8O2 (M = 136,15 g/mol), CAS: 103-82-2, Merck, čistost ≥ 99 %.

 Benzil alkohol, C7H8O (M = 108,14 g/mol), CAS: 100-51-6, Kemika.

(32)

12

 2-metilbutanojska kislina, C5H10O2 (M = 102,13 g/mol), CAS: 116-53-0, Fluka Chemika, čistost ≥ 98 %.

 Stiren, C8H8 (M = 104,14 g/mol), CAS: 9003-53-6.

 Acetofenon, C8H8O (M = 120,15 g/mol), CAS: 98-86-2, Merck, čistost ≥ 98 %.

 Dodekanol, C12H26O (M = 186,33 g/mol), CAS: 112-53-8, Fluka, čistost ≥ 98,5 %.

 Dekanojska kislina, C10H20O (M = 172,26 g/mol), CAS: 334-48-5, Aldrich Chemical, čistost ≥ 99 %.

3.3 Priprava raztopin:

 Osnovna raztopina benzofenona v metanolu γ = 1,030 g/L.

Na tehtalni ladjici sem natehtal 0,515 g benzofenona in ga kvantitativno prenesel v 50 mL bučko. Bučko sem do oznake napolnil z metanolom in vsebino dobro premešal.

Raztopino sem za nadaljnjo uporabo hranil v hladilniku.

 Raztopina standardov.

V 25 mL bučko sem natehtal približno 0,1 g kinolin-5-ola, fenilocetne kisline, dodekanola in dekanojske kisline. Tem sem z batno pipeto dodal še 100 µL fenilacetaldehida, furfurala, benzil alkohola, 2-metilbutanojske kisline, stirena in acetofenona. Bučko sem nato z milli-Q vodo dopolnil do oznake in vsebino dobro premešal. Končno raztopino sem še 25-krat razredčil tako, da sem 1 mL raztopine prenesel v novo 25 mL bučko in jo z milli-Q vodo napolnil do oznake. Raztopino sem premešal in jo za nadaljnjo uporabo hranil v hladilniku.

 Raztopina 2-metilbutanojske kisline γ = 3,76 g/L.

Z batno pipeto sem v 25 mL bučko odmeril 100 µL 2-metilbutanojske kisline (ρ = 0,940 g/mL). Bučko sem z milli-Q vodo dopolnil do oznake in vsebino dobro premešal.

Raztopino sem hranil v hladilniku.

 Raztopina fenilocetne kisline γ = 4 g/L.

Na tehtalni ladjici sem natehtal približno 0,1 g fenilocetne kisline in jo prenesel v 25 mL bučko. Bučko sem z milli-Q vodo napolnil do oznake in vsebino dobro premešal.

Raztopino sem hranil v hladilniku.

(33)

13

 Standardna raztopina benzofenona v metanolu γ = 0,0412 g/L (interni standard).

S polnilno pipeto sem odmeril 1 mL osnovne raztopine benzofenona v metanolu γ = 1,030 g/L in jo prenesel v 25 mL bučko. Bučko sem do oznake napolnil z metanolom in vsebino dobro premešal. Raztopino sem hranil v hladilniku.

 Splošen postopek za pripravo vzorcev.

V 20 mL vialo sem natehtal 4,0 ± 0,1 g medu, z batno pipeto sem dodal 125 µL standardne raztopine benzofenona v metanolu γ = 0,0412 g/L. Dodal sem še 3 mL nasičene vodne raztopine NaCl, vialo zaprl z zamaškom in vsebino dobro premešal.

 Vzorci medu za testiranje vpliva nasičene raztopine NaCl.

V 20 mL vialo sem natehtal 4,0 ± 0,1 g medu in z batno pipeto dodal 125 µL internega standarda. Vzorcu 3.1 sem z batno pipeto dodal 1,4 mL nasičene vodne raztopine NaCl, vzorcu 4.1 pa sem dodal 1,4 mL milli-Q vode. Vsebino vial sem dobro premešal.

 Vzorci medu za testiranje vpliva količine nasičene raztopine NaCl.

V 20 mL vialo sem natehtal 4,0 ± 0,1 g medu in z batno pipeto dodal 125 µL internega standarda. Vzorcem sem nato z batno pipeto dodal različne količine nasičene vodne raztopine NaCl in vsebino dobro premešal.

Tabela 1: Količina dodatka nas. razt. NaCl.

Vzorec Količina nas. razt. NaCl [mL]

5.1 1

6.1 2

7.1 3

 Vzorci medu za testiranje vpliva količine medu.

V 20 mL viale sem natehtal različno količino medu in z batno pipeto dodal 125 µL internega standarda. Vzorcema sem nato z batno pipeto dodal takšne količine nasičene vodne raztopine NaCl, da je bil skupni volumen medu in raztopine približno 5 mL (privzel sem, da je gostota medu 1,5 g/mL). Vsebino vial sem dobro premešal.

Tabela 2: Količina medu in nas. razt. NaCl.

Vzorec Količina medu [g] Količina nas. razt. NaCl

[mL]

10.1 2 3,67

11.1 6 1

(34)

14

 Vzorec standardov za določitev nekaterih hlapnih komponent v medu.

V 20 mL vialo sem z batno pipeto dodal 100 µL raztopine standardov, 100 µL raztopine 2-metilbutanojske kisline γ = 3,76 g/L, 100 µL raztopine fenilocetne kisline γ = 4 g/L, 125 µL internega standarda in 3 mL nasičene vodne raztopine NaCl. Vsebino viale sem dobro premešal.

3.4 Postopki

Analize vzorcev sem izvajal na GC-MS/MS TSQ 9000. Uporabljal sem nastavek za SPME analizo s CAR/PDMS/DVB vlaknom. Nosilni plin je bil helij. Vse vzorce sem pripravil v 20 mL vialah. Na masnem spektrometru sem temperaturo ionskega izvora pri vseh analizah nastavil na vrednost 270 °C, temperaturo »transfer line« pa na 250 °C.

Nastavitev območja m/z je bila 50-550.

V programu »Chromeleon« sem pripravil procesno metodo, ki je omogočila avtomatsko integracijo vseh vrhov, katerih ploščina je večja ali enaka 500 000 counts×min. Pri vsakem temperaturnem programu sem pred samo meritvijo vzorcev meritev naredil na prazni viali. Pri tej sem določil nekaj spojin, ki so izvirale iz septe na viali ali kolone na GC. Vse izmed vrhov, ki so se pojavili, sem kot izjeme vnesel v procesno metodo, da jih program pri sami meritvi vzorcev ni integriral.

3.4.1 Optimizacija metode 3.4.1.1 Priprava vzorcev

Pri določitvi najprimernejšega načina za pripravo vzorcev sem testiral, ali NaCl vpliva na rezultate meritev. Preveril sem tudi, kako na rezultate vpliva različna količina nasičene vodne raztopine NaCl in različna količina medu. V te namen sem na GC-MS naredil meritve na vzorcih medu za testiranje vpliva nasičene raztopine NaCl, vzorcih medu za testiranje vpliva količine nasičene raztopine NaCl in vzorcih medu za testiranje vpliva količine medu. Za pripravo vzorcev sem uporabil cvetlični med. Enak med sem uporabil pri vseh stopnjah optimizacije metode.

Pri določitvi sem uporabljal naslednje nastavitve parametrov na GC-MS:

 Čas kondicioniranja vlakna: 30 min

 Temperatura kondicioniranja vlakna: 270 °C

 Čas kondicioniranja vzorca: 20 min

 Temperatura kondicioniranja vzorca: 45 °C

 Čas ekstrakcije vzorca: 40 min

 Temperatura ekstrakcije vzorca: 45 °C

 Čas desorpcije vzorca: 5 min

 Temperatura desorpcije vzorca: 270 °C

 Temperaturni program:

o 5 min izotermno na 45 °C o Gradient 5 °C/min do 180 °C

(35)

15

o Gradient 10 °C/min do 230 °C o 10 min izotermno na 230 °C

 Pretok plina: 1,2 mL/min

 Kolona: HP-5ms

Ko sem določil optimalen način priprave vzorcev, sem tega uporabil pri vseh nadaljnjih analizah. V nadaljevanju sem tako za pripravo vseh vzorcev uporabil splošen postopek za pripravo vzorcev, ki je opisan v pripravi raztopin.

3.4.1.2 Ponovljivost rezultatov

Ponovljivost rezultatov med paralelkami sem testiral tako, da sem na enak način pripravil 5 vzorcev. Vsakega sem dvakrat analiziral na GC-MS, uporabil pa sem enake nastavitve kot pri optimizaciji priprave vzorcev. Testiral sem tudi ponovljivost na enem vzorcu, in sicer tako, da sem enega izmed teh vzorcev analiziral dvanajstkrat zapored.

3.4.1.3 Optimizacija časa in temperature kondicioniranja in ekstrakcije vzorca

Pri optimizaciji časa in temperature kondicioniranja vzorca sem za vsako meritev pripravil nov vzorec. Najprej sem testiral temperaturo kondicioniranja in ekstrakcije vzorca. To sem nastavil na 50 °C in 60 °C. Ostali parametri pa so imeli naslednje vrednosti:

o 5 min izotermno na 45 °C o Gradient 5 °C/min do 180 °C o Gradient 10 °C/min do 230 °C o 10 min izotermno na 230 °C

 Kolona: HP-5ms

V naslednjem koraku sem preveril še vpliv časa ekstrakcije vzorca. Tega sem nastavil na 20 min, 30 min in na 60 min. Temperaturo kondicioniranja in ekstrakcije sem v obeh primerih nastavil na 45 °C, ostali parametri pa so ostali enaki.

3.4.1.4 Optimizacija temperaturnega programa

Pri optimizaciji sem analizo najprej izvedel pri treh različnih temperaturnih programih.

 Prvi temperaturni program:

(36)

16

 Drugi temperaturni program:

 Tretji temperaturni program:

o 2 min izotermno na 45 °C o Gradient 10 °C/min do 180 °C o Gradient 20 °C/min do 230 °C o 10 min izotermno na 230 °C Ostali parametri pri teh programih so bili:

 Kolona: HP-5ms

Na podlagi rezultatov, ki sem jih dobil z uporabo teh nastavitev na GC-MS, sem pripravil še dva programa, s katerima bi lahko dokončno določil optimalne parametre za analizo hlapnih komponent v medu.

Četrti program:

o 2 min izotermno na 60 °C o Gradient 3 °C/min do 160 °C o Gradient 20 °C/min do 230 °C o 5 min izotermno na 230 °C Peti program:

o 2 min izotermno na 45 °C o Gradient 3 °C/min do 110 °C

(37)

17

o Gradient 20 °C/min do 230 °C o 5 min izotermno na 230 °C Ostali parametri pri teh programih so enaki kot prej.

3.4.2 Analiza vzorcev

Analiziral sem 10 različnih vzorcev cvetličnega medu, 6 vzorcev gozdnega medu, 6 vzorcev akacijevega medu, 6 vzorcev lipovega medu, 1 vzorec hojevega medu, 1 vzorec smrekovega medu in 1 vzorec kostanjevega medu. Vzorce sem pripravil po splošnem postopku za pripravo vzorcev.

Tabela 3:Oznake analiziranih vzorcev medu.

Vzorci cvetličnega medu

Vzorci gozdnega medu

Vzorci akacijevega medu

Vzorci lipovega medu

Vzorci hojevega medu

Vzorci smrekovega medu

Vzorci kostanjevega medu

C142 G146 A147 L061 H118 S143 K1

C140 G109 A111 L088

C139 G106 A105 L077

C138 G102 A104 L076

C137 G101 A089 L073

C136 G098 A086 L066

C134 C129 C127 C126

Parametri na GC-MS so bili naslednji:

 Kolona: HP-5ms

(38)

18

3.4.3 Določitev nekaterih hlapnih komponent z uporabo standardov

Na GC-MS sem naredil analizo vzorca standardov za določitev nekaterih hlapnih komponent v medu. V tem primeru je šlo le za kvalitativno analizo, zato me točne koncentracije standardov niso zanimale. Dodal sem takšno količino posameznega standarda, da sem na kromatogramu lahko odčital retencijski čas in ga primerjal z ostalimi vzorci medu. Parametri na GC-MS so bili identični tistim za analizo vzorcev.

(39)

19

4 Rezultati in razprava

4.1 Optimizacija metode

Pred samo meritvijo vzorcev je bilo potrebno razviti ustrezno metodo. Po pregledu literature sem pripravil poskusno metodo, temu pa je sledila optimizacija. Poiskal se primeren način za pripravo vzorcev, poskrbel za ponovljive rezultate in dobro ločbo spojin v čim krajšem možnem času.

4.1.1 Priprava vzorcev 4.1.1.1 Vpliv NaCl

Slika 5: Kromatogram, ki prikazuje primerjavo dodatka milli-Q vode in dodatka nasičene vodne raztopine NaCl.

Kromatogram na sliki 5 prikazuje vzorca medu, ki sem jima dodal milli-Q vodo oz.

nasičeno vodno raztopino NaCl. Zaradi večje preglednosti sem prikazal le del kromatograma med 8,8 min in 19,3 min, kjer se eluira največ spojin. Na enak način sem prikazal tudi nekatere druge kromatograme v nadaljevanju.

Na kromatogramu lahko vidimo opazno razliko v višinah in ploščinah vrhov. Program

»Chromeleon« je pri vzorcu z milli-Q vodo integriral le 13 vrhov, medtem ko jih je pri vzorcu z nasičeno raztopino NaCl 24. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da dodatek soli privede do boljših rezultatov.

(40)

20

4.1.1.2 Vpliv količine nasičene vodne raztopine NaCl

Slika 6: Kromatogram, ki prikazuje primerjavo dodatka različne količine nasičene vodne raztopine NaCl.

V naslednjem koraku sem preveril, kako količina dodane raztopine NaCl vpliva na rezultate. Primerjavo lahko vidimo na sliki 6. Iz tabele 4 lahko razberemo, da večja količina dodane raztopine NaCl privede do več vrhov na kromatogramu. Dodatek več kot 3 mL bi verjetno pokazal še boljše rezultate, vendar viale ni mogoče napolniti več kot do četrtine. Večji volumen lahko med mešanjem raztopine v agitatorju privedel do stika raztopine s SPME vlakom.

Tabela 4: Vpliv količine nasičene vodne raztopine NaCl.

Količina medu [g] Količina nas. razt. NaCl [mL]

Število vrhov na kromatogramu

4,0 1,00 24

4,0 2,00 20

4,0 3,00 30

4.1.1.3 Vpliv količine medu

Slika 7: Kromatogram, ki prikazuje primerjavo dodatka različne količine medu.

V zadnjem koraku optimizacije priprave vzorcev sem testiral še vpliv količine medu na rezultate. Vzel sem različne količine medu in dodal toliko nasičene raztopine NaCl, da je bil volumen pri vseh vzorcih približno enak. Primerjavo kromatogramov lahko vidimo na sliki 7. Ugotovil sem, da najboljše rezultate dobim pri 4,0 g medu z dodanimi 3 mL raztopine NaCl (tabela 5). Takšno razmerje sem uporabil še pri vseh nadaljnjih meritvah.

(41)

21 Tabela 5: Vpliv količine medu.

Količina medu [g] Količina nas. razt. NaCl [mL]

Število vrhov na kromatogramu

2,0 3,65 3

4,0 3,00 30

6,0 1,00 20

4.1.2 Ponovljivost rezultatov

Slika 8: Kromatogram analize petih vzorcev pripravljenih na enak način.

Slika 9: Kromatogram druge ponovitve analize petih vzorcev pripravljenih na enak način.

Iz kromatograma na sliki 8 lahko razberemo, da so rezultati pri različnih vzorcih, pripravljenih na enak način, ponovljivi. Kromatogrami posameznih vzorcev so med seboj praktično identični. Ploščine vrhov so približno enake. Na sliki 9 lahko opazimo, da so si rezultati druge meritve vzorcev podobni, vendar se ploščine posameznih vrhov razlikujejo od prve meritve.

(42)

22

Slika 10: Število kromatografskih vrhov pri posameznem vzorcu.

Graf na sliki 10 prikazuje število vrhov, ki jih je program »Chromeleon« avtomatično integriral pri posamezni paralelki.

Slika 11: Kromatogram prve, šeste in dvanajste analize istega vzorca.

Iz kromatograma na sliki 11 lahko razberemo, da meritve na istem vzorcu niso ponovljive.

Tekom dvanajstih ponovitev analize na istem vzorcu se ploščina večine vrhov zmanjša.

Nekateri izmed vrhov tudi popolnoma izginejo iz kromatograma. Primer takšnega je vrh pri retencijskem času 15,04 min, ki sem ga identificiral kot linalol. Po drugi strani pa se pri kasnejših analizah pojavijo nekateri novi vrhovi, ki jih pri prvi meritvi ni bilo mogoče zaznati. Takšen primer je vrh za benzil 2-kloroetil sulfon, ki se je iz kolone eluiral pri 17,44 min.

Večina hlapnih komponent se iz vzorca v večjem deležu ekstrahira že pri prvi analizi, zato je njihov delež pri kasnejših analizah manjši. Nekatere manj hlapne komponente pa se verjetno s signifikantnim deležem ekstrahirajo šele po več ciklih kondicioniranja in jih tako zaznamo pri kasnejših analizah. V tabeli 6 so prikazane relativne ploščine nekaterih

0 10 20 30 40 50

1 2 3 4 5

št. vrhov

Paralelka

št. vrhov prva meritev št. vrhov druga meritev

(43)

23

večjih vrhov, pri katerih so razlike najbolj opazne. Ploščina se z meritvami na istem vzorcu manjša pri linalolu, C6 dienu, C10-11 kislini in C9-11 estru. Pri terpenoidu in benzil-2-kloroetil sulfonu pa se ploščina vrhov veča.

Tabela 6: Relativne ploščine izbranih vrhov.

Ime spojine Retencijski čas [min]

Relativna ploščina vrha pri prvi ponovitvi [%]

Relativna ploščina vrha pri šesti ponovitvi [%]

Relativna ploščina vrha pri dvanajsti ponovitvi [%]

terpenoid 14,14 4,59 6,72 11,27

linalol 15,04 7,22 / /

C6 dien 15,17 32,06 19,78 26,64

C10-11 kislina 15,84 3,12 / /

benzil-2-

kloroetil sulfon 17,44 / / 5,98

C9-11 ester 18,82 4,65 2,58 2,20

4.1.3 Vpliv temperature kondicioniranja in ekstrakcije

Slika 12: Kromatogrami vzorcev pri različnih temperaturah kondicioniranja in ekstrakcije.

Iz kromatograma na sliki 12 je razvidno, da so ploščine vrhov pri višji temperaturi kondicioniranja in ekstrakcije vzorca večje, zato je večje tudi število integriranih vrhov.

Pri 45 °C program »Chromeleon« integrira 30, pri 50 °C 34 in pri 60 °C 40 vrhov. Za primer ploščine lahko vzamemo najvišji vrh, ki se eluira pri času 15,16 min (C6 dien) in interni standard, ki se eluira pri času 29,15 min (benzofenon). Njune ploščine so prikazane na sliki 13.

(44)

24

Slika 13: Ploščine vrhov za C6 dien in benzofenon pri različnih temperaturah kondicioniranja in ekstrakcije.

Pri C6 dienu se ploščina vrha pri spremembi temperature ekstrakcije iz 45 °C na 50 °C poveča za 41 %, pri spremembi iz 45 °C na 60 °C pa za 97 %. Pri benzofenonu pa se ploščina vrha pri spremembi temperature ekstrakcije iz 45 °C na 50 °C oz. 60 °C poveča za 33 % oz. 140 %.

Vidimo lahko torej, da višja temperatura v agitatorju privede do boljše ekstrakcije hlapnih komponent, zato jo je smiselno nastaviti na vsaj 60 °C.

4.1.4 Vpliv časa ekstrakcije

Slika 14: Kromatogram vzorcev pri različnem času ekstrakcije.

Kromatogram na sliki 14 prikazuje, da so ploščine vrhov pri daljšem času ekstrakcije večje. Tako kot pri vplivu temperature ekstrakcije lahko tudi pri vplivu časa ekstrakcije za primer vzamemo največji vrh, ki se eluira pri času 15,16 min (C6 dien) in interni standard, ki se eluira pri času 29,15 min (benzofenon). Njune ploščine so prikazane na sliki 15.

0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000 35000000 40000000 45000000 50000000

40 45 50 55 60 65

Ploščina vrha [counts×min]

Temperatura kondicioniranja in ekstrakcije [°C]

C6 dien Benzofenon

(45)

25

Slika 15: Ploščine vrhov za C6 dien in benzofenon v odvisnosti od časa ekstrakcije.

Pri C6 dienu se ploščina vrha pri spremembi časa ekstrakcije iz 20 min na 30, 40 in 60 min poveča za 40 %, 246 % in 95 %. Pri benzofenonu pa se ploščina vrha pri spremembi časa ekstrakcije iz 20 min na 30, 40 in 60 min poveča za 35 %, 221 % in 50 %.

Pri obeh vrhovih sicer vidimo, da se ploščina najbolj poveča pri ekstrakcijskem času 40 min, vendar to za večino drugih spojin ne drži. Razlog za tako veliko povečanje je v tem, da se je pri C6 dienu in benzofenonu povečala relativna ploščina napram drugim vrhovom. Na kromatogramu na sliki 14 lahko vidimo, da ima večina spojin največjo ploščino vrhov pri ekstrakcijskem času 60 min. Relativno povečanje teh dveh vrhov v primerjavi z ostalimi je lahko posledica eksperimentalne napake.

Potrebno je upoštevati tudi dejstvo, da želimo zaradi večje količine vzorcev analize opraviti v čim krajšem času. Ker so rezultati pri 40 min ekstrakciji že povsem zadovoljivi sem ocenil, da je nadaljnjo podaljševanje tega časa nesmiselno.

0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000

0 10 20 30 40 50 60 70

Ploščina vrha [counts×min]

Čas ekstrakcije [min]

C6 dien Benzofenon

(46)

26 4.1.5 Optimizacija temperaturnega programa

Slika 16: Kromatogrami dobljeni s prvim (zgoraj), drugim (sredina) in tretjim (spodaj) temperaturnim programom.

Če primerjamo kromatograme na sliki 16, lahko ugotovimo, da se za najboljšega izkaže drugi temperaturni program. V primerjavi s temperaturnim programom, ki sem ga uporabljal za predhodne analize, je smiselno, da se čas pri temperaturi 45 °C skrajša iz 5 min na 2 min, saj se v prvih minutah ne eluira nobena spojina. Gradient v delu med 45 °C in 180 °C mora biti čim manjši, da se izognemo prekrivanju vrhov, saj se v tem delu eluira največ spojin. Za tem pa se eluira le še relativno malo spojin, zato lahko gradient nastavimo na 20 °C/min in na ta način skrajšamo čas analize.

Slika 17: Kromatograma dobljena s četrtim (zgoraj) in petim (spodaj) temperaturnim programom.

Kromatograma na sliki 17 prikazujeta primerjavo dveh temperaturnih programov, ki sem ju pripravil glede na rezultate prejšnjih analiz.

(47)

27

Če med seboj primerjamo temperaturna programa, lahko ugotovimo, da je ločba pri zgornjem nekoliko slabša. Vrhovi se pojavijo med 2,84 min in 32,76 min, vendar se razen treh spojine eluirajo že pred 17 min. Pride tudi do prekrivanja nekaterih vrhov. Temu se pri spodnjem programu izognemo, saj sem pri tem analizo pričel pri 45 °C, namesto pri 60 °C. V tem programu se tudi izognemo nepotrebnemu čakanju, saj sem temperaturni gradient zvišal že, ko je temperatura dosegla 110 °C, namesto pri 160 °C. Vse spojine se tako eluirajo v intervalu med 5,43 min in 28,59 min.

4.2 Analiza vzorcev

Pri meritvah vzorcev medu se je izkazalo, da program, določen pri testnem vzorcu medu, ni najbolj primeren, saj se je v nekaterih vzorcih pojavilo tudi do trikrat več spojin kot v testnem vzorcu. Zaradi prekrivanja vrhov sem začetni temperaturni gradient spremenil iz 3 °C/min na 2 °C/min in ga pustil, vse dokler temperatura ni dosegla 120 °C.

Same rezultate analize vzorcev sem razdelil na tri odseke, s katerimi sem opisal hlapne komponente v posameznih vrstah medu. V prvem sem se posvetil kvalitativnim in semi- kvantitativnim rezultatom pri posameznih vzorcih. Določil sem, koliko spojin vsebuje določena vrsta medu in katere se pojavljajo v večjem deležu. V drugem odseku sem s pomočjo ploščin pod vrhovi v TIC kromatogramih določil splošno količino hlapnih komponent v posameznih vrstah medu v primerjavi z ostalimi. Zadnji odsek pa temelji predvsem na kvalitativni analizi. Pri tem sem iskal specifične markerje, katerih prisotnost ali odsotnost je karakteristična za posamezno vrsto medu.

Ker večine spojin v vzorcih ni bilo mogoče nedvoumno določiti, sem za poimenovanje uporabil njihove strukturne fragmente. Zaradi večje preglednosti sem spojine, ki so sestavljene iz enakih strukturnih fragmentov oštevilčil (primer: terpen¹, terpen²). Številke sledijo vrstnemu redu, po katerem so se spojine eluirale iz kolone.

4.2.1 Cvetlični med

Slika 18: Kromatogram vzorca C142.

Kromatogram na sliki 18 prikazuje enega izmed vzorcev cvetličnega medu, v katerem sem poleg standarda zaznal 60 različnih spojin. Pri analizi desetih različnih vzorcev

(48)

28

cvetličnega medu sem v posameznih vzorcih določil med 35 in 60 spojin. V povprečju jih je bilo 43 različnih spojin na vzorec. Skupno sem identificiral 97 različnih spojin.

V tabelah 7 in 8 so zapisane relativne ploščine najbolj pomembnih spojin v cvetličnem medu. Za najbolj pomembne spojine sem smatral tiste, pri katerih je ploščina vrhov presegala 1 700 000 counts×min pri vsaj treh izmed desetih vzorcev. Iz skupne ploščine lahko vidimo, da te spojine res predstavljajo glavnino hlapnih komponent, saj v večini vzorcev predstavljajo več kot 85 % celotne ploščine integriranih vrhov.

Med izbranimi spojinami najbolj izstopata benzen + C3³ in C6 dien. Ti dve spojini se pojavita pri vseh desetih vzorcih. Njun delež v večini primerov presega vrednost 10 %, v primeru C6 diena pa doseže tudi vrednost 43 %.

Tabela 7: Spojine v cvetličnem medu 1. del.

Zap.

št. Retencijski

čas [min] Spojina

C142 relativna ploščina [%]

1 5,601 furfural 0,00 0,00 0,70 5,35 0,26

2 10,507 benzaldehid 0,90 0,90 2,17 1,91 0,96

3 13,773 benzen + C2 + okso spojina 0,00 1,29 2,48 0,62 0,00

4 13,955 terpen⁶ 4,14 0,56 0,00 1,66 2,52

6 15,148 benzenacetaldehid 0,31 0,32 0,47 1,30 0,54

7 16,993 terpenoid¹ 1,49 3,04 1,99 5,99 3,82

7 17,959 benzen + C3³ 26,91 8,32 2,74 13,69 18,86

8 18,811 linalol 0,69 2,19 4,49 1,89 0,75

9 19,122 C6 dien 14,94 43,17 30,29 29,68 37,03

10 19,481 neidentificirana spojina⁴ 0,85 1,55 2,76 1,08 0,90

11 20,471 C9-11 ester³ 0,00 2,47 5,08 3,17 1,43

12 20,528 C9-11 ester⁴ 0,80 0,42 0,00 0,00 0,39

13 21,151 terpen¹⁵ 0,85 0,76 1,14 1,59 0,72

14 21,49 C10-14 alkohol² 0,48 0,76 1,17 1,31 0,34

15 21,842 izomer 2,4-dimetoksitoluena¹ 1,18 0,31 0,00 0,40 0,46

16 22,003 terpenoid² 0,40 1,07 1,94 1,90 0,35

17 23,583 terpenoid³ 1,50 2,58 2,08 1,23 0,85

18 24,217 terpenoid⁴ 4,44 0,46 0,00 1,07 3,34

19 24,485 izomer (E)-2-heksenil

heksanoata¹ 0,00 2,35 2,23 1,04 0,89

20 24,562

2-izopropil-1-metoksi-4-

metilbenzen 8,19 2,39 1,95 1,98 6,24

21 24,773 benzen + C3 + okso spojina 0,52 1,78 2,60 0,38 0,34

22 25,494 terpen¹⁸ 1,82 1,09 0,00 0,36 0,62

23 26,182 izomer retinala⁵ 0,38 1,20 1,01 0,65 0,63

24 26,44 izomer (E)-2-heksenil

heksanoata² 1,10 5,37 5,99 1,04 1,12

25 27,087 C9-11 ester⁵ 2,09 4,13 7,72 4,14 0,00

26 33,556 C9-11 ester⁶ 0,36 0,55 1,43 0,58 0,54

27 37,024 neidentificirana spojina¹⁰ 0,85 0,53 0,00 1,19 0,55

28 43,449 benzofenon 7,77 5,83 6,06 8,07 5,91

Skupna ploščina vseh vrhov [%] 82,95 95,38 88,48 93,26 90,34