DIPLOMSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Karmen Mlinar

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA

Določitev izražanja kanabinoidnih receptorjev na ravni informacijske RNA v celičnih linijah raka dojke

DIPLOMSKO DELO

Karmen Mlinar

M

ENTORICA

: izr. prof. dr. Nataša Debeljak, univ. dipl. biol.

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Karmen Mlinar sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Določitev izražanja kanabinoidnih receptorjev na ravni informacijske RNA v celičnih linijah raka dojke.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom izr.

prof. dr. Nataše Debeljak, univ. dipl. biol.;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, datum Podpis avtorice:

(6)

(7)

(8)

(9)

Zahvaljujem se mentorici prof. dr. Nataši Debeljak, da mi je v prvi vrsti omogočila opravljanje diplomske naloge pod njenim okriljem. Hvala za ves njen čas in trud, ki ga je vložila v samo izvedbo naloge ter za usmerjanje in popravljanje pri pisanju diplomskega dela.

Zahvaljujem se delovni mentorici dr. Sandri Ropret, ki se je zelo potrudila in me jasno ter natančno popeljala skozi eksperimentalni del naloge, prav tako pa tudi pregledala vmesni in končni izdelek.

Zahvaljujem se doc. dr. Veri Župunski za pregled in popravo diplomske naloge.

Rada bi se zahvalila tudi mami, sestrama, bratu, fantu in prijateljem za vso podporo in spodbudo tekom dodiplomskega študija in pisanja diplomske naloge.

(10)

(11)

Določitev izražanja kanabinoidnih receptorjev na ravni informacijske RNA v celičnih linijah raka dojke

Povzetek

Kanabinoidni receptorji (CBR) so membranski receptorji povezani z G-proteini, ki vežejo kanabinoide eksogenega in endogenega izvora in so del endokanabinoidnega sistema.

Ločimo dva tipa CBR: tip 1 (CB1, gen CNR1) s prevladujočim izražanjem v živčnih celicah in tip 2 (CB2, gen CNR2) z značilnim izražanjem v celicah imunskega sistema.

CB1 receptor je v treh izooblikah: CB1, CB1a in CB1b, CB2 receptor pa v dveh izooblikah: CB2A in CB2B. Rak dojke je najpogostejša oblika malignosti pri ženskah, saj predstavlja kar 30 % vseh oblik raka pri ženskah. Na podlagi izražanja hormonskih receptorjev (HR) in receptorja za človeški epidermalni rastni faktor 2 (HER2) ločimo HR- pozitivni oz. luminalni, HER2-pozitivni in trojno negativni rak dojke. V celicah raka dojke je potrjeno izražanje CBR. Številne študije kažejo, da kanabinoidi vplivajo na lastnosti raka, znani pa so tako pozitivni kot negativni vplivi. Namen naše raziskave je bil pregledati obstoječe RNA prepise genov CNR1 in CNR2 ter določiti njuno izražanje na ravni RNA v celičnih linijah raka dojke. V prvem, bioinformatskem, delu naloge smo pregledali podatke o izražanju in obstoječe RNA prepise genov CNR1 in CNR2 v zbirkah Ensembl, NCBI in UniProt. Znotraj zbirke RefSeq smo našli 11 prepisov izooblike CB1, 1 izooblike CB1b in 1 izooblike CB2B, za izoobliki CB1a in CB2A pa nismo našli nobenega prepisa. V drugem, laboratorijskem, delu naloge smo določili raven izražanja CBR na izbranih celičnih linijah raka dojke (MCF7, T-47D, SK-BR-3, MDA-MB-231, MDA-MB-361), ki se razlikujejo v izražanju HR in HER2, ter dveh kontrolnih vzorcih (SH-SY5Y in možgansko tkivo). Iz vzorcev smo izolirali RNA in jo reverzno prepisali v cDNA. Izvedli smo kvantitativni PCR s testi TaqMan, ki so pokrivali največje število različnih prepisov preiskovanih genov CNR1 in CNR2, ter referenčna gena RPLP0 in HPRT1, izbranih na podlagi sorodnih študij. Iz dobljenih rezultatov smo z metodama za relativno kvantifikacijo določili raven izražanja preiskovanih genov. Nasprotno s svojimi pričakovanji v nobeni analizirani celični liniji raka dojke nismo zaznali izražanja gena CNR1. Izražanja gena CNR2 nismo mogli določiti, ker izbrani vzorci za pozitivno kontrolo niso bili ustrezni. Raziskavo bomo v prihodnje razširili na več celičnih linij raka dojke, preverili izražanje na ravni proteinov in zagotovili ustrezne pozitivne in negativne kontrole.

Ključne besede: kanabinoidni receptorji, RNA prepisi, rak dojke, celične linije raka dojke

(12)

Characterisation of cannabinoid receptors messenger RNA expression on breast cancer cell lines

Abstract

Cannabinoid receptors (CBR) are G-protein coupled receptors that bind cannabinoid ligands of exogenous and endogenous origin and are part of endocannabinoid system.

There are two types of CBR: type 1 (CB1, gene CNR1) expressing mainly in neural cells, and type 2 (CB2, gene CNR2) expressing typically in immune cells. Three isoforms of CB1 receptor are known: CB1, CB1a, and CB1b, and two isoforms of CB2 receptor:

CB2A and CB2B. Breast cancer is the most common form of malignancy in women, presenting 30 % of all forms of cancer in women. Based on the expression of the hormone receptors (HR) and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), three types of breast cancer are distinguished: HR-positive or luminal, HER2-positive, and triple- negative breast cancer. In breast cancer cells CBR expression has been confirmed. Several studies have shown the tumor modulating effect of cannabinoids, and both positive and negative effects are known. Our study aimed to overview known transcripts of the genes CNR1 and CNR2 and to characterise their expression in breast cancer cell lines on RNA level. In the first bioinformatic part of the thesis, we reviewed the expression data and known transcripts of the genes CNR1 and CNR2 in the Ensembl, NCBI and UniProt databases. In the RefSeq database, we found 11 transcripts of isoform CB1, 1 of isoform CB1b, 1 of isoform CB2B, and none of isoforms CB1a and CB2A. In the second laboratory part of the thesis, we determined the level of CBR expression on selected breast cancer cell lines (MCF7, T-47D, SK-BR-3, MDA-MB-231, MDA-MB-361) that differ HR and HER2 expression, and two control samples (SH-SY5Y and brain tissue). We isolated RNA from the samples and reverse transcribed it into cDNA. We performed quantitative PCR with TaqMan assays that cover the largest number of different transcripts of the genes of interest CNR1 and CNR2 and reference genes RPLP0 and HPRT1, which we selected based on related studies. From the obtained results, we determined the expression levels of genes of interest using methods for relative quantification. Contrary to our expectations, we were unable to detect CNR1 gene expression in any analysed breast cancer cell line. We could not determine the expression level of gene CNR2 due to not suitable positive control. The study will be extended to several breast cancer cell lines, characterization on protein level, and finding appropriate positive and negative controls.

Keywords: cannabinoid receptors, RNA transcripts, breast cancer, breast cancer cell lines

(13)

Kazalo vsebine

1 Uvod ... 1

1.1 Endokanabinoidni sistem ... 1

1.1.1 Kanabinoidni receptor tipa 1 ... 2

1.1.2 Kanabinoidni receptor tipa 2 ... 7

1.2 Rak dojke ... 9

1.2.1 Odkrivanje bolezni in zdravljenje... 10

1.2.2 Celične linije raka dojke ... 11

1.2.3 Povezava s kanabinoidi in kanabinoidnimi receptorji ... 12

2 Namen dela in hipoteze ... 15

3 Materiali in metode ... 17

3.1 Bioinformatska analiza ... 17

3.1.1 Iskanje prepisov ... 17

3.1.2 Poravnava prepisov ... 18

3.1.3 Pregled obstoječih testov TaqMan za izražanje genov ... 18

3.2 Eksperimentalni del ... 18

3.2.1 Celične linije raka dojke in kontrolni vzorci ... 18

3.2.2 Izolacija RNA iz celic v kulturi ... 19

3.2.3 Merjenje koncentracije RNA ... 20

3.2.4 Razgradnja DNA ... 21

3.2.5 Obraten prepis RNA v cDNA ... 21

3.2.6 Validacija testov TaqMan ... 22

3.2.7 Kvantitativni PCR ... 25

3.2.8 Relativna kvantifikacija ... 28

4 Rezultati in razprava ... 31

4.1 Bioinformatska analiza ... 31

4.1.1 Iskanje prepisov ... 31

4.1.2 Poravnava prepisov ... 32

(14)

4.1.3 Pregled obstoječih TaqMan testov ... 35

4.2 Eksperimentalni del ... 37

4.2.1 Izolacija RNA iz celic v kulturi ... 37

4.2.2 Razgradnja DNA ... 38

4.2.3 Validacija testov TaqMan ... 38

4.2.4 Kvantitativni PCR ... 42

4.2.5 Relativna kvantifikacija ... 44

5 Zaključek ... 45

6 Literatura ... 49

7 Priloge ... 55

7.1 Povzetek in plakat predstavitve raziskave na 16. obletnici CFGBC. ... 55

7.2 Povzetek predstavitve raziskave na Cutting Edge 2021 ... 57

(15)

Kazalo slik

Slika 1.1: Lokalizacija receptorja CB1 v celici in njihova vloga. ... 3

Slika 1.2: Kristalna struktura receptorja CB1 v kompleksu s proteinom G in signalne poti, ki se sprožijo ob njegovi aktivaciji. ... 4

Slika 1.3: Shema gena in proteina CNR1. ... 6

Slika 1.4: Kristalna struktura receptorja CB2 v kompleksu s proteinom G in signalne poti, ki se sprožijo ob njegovi aktivaciji. ... 8

Slika 1.5: Shema gena CNR2. ... 8

Slika 3.1: Shema predpriprave kvantitativnega PCR na plošči s 96 vdolbinicami. ... 26

Slika 3.2: Shema kvantitativnega PCR na plošči s 384 vdolbinicami. ... 27

Slika 4.1: Poravnava končnega dela 5'-UTR regije z začetkom prepisa gena CNR1. .... 33

Slika 4.2: Poravnava začetka 3'-UTR regije s koncem prepisa gena CNR1. ... 34

Slika 4.3: Poravnava izooblik gena CNR1. ... 35

(16)

Kazalo preglednic

Preglednica 1.1: Celične linije raka dojke in njihove značilnosti... 12

Preglednica 3.2: Celične linije raka dojke in kontrolna celična linija. ... 19

Preglednica 3.2: Seznam uporabljenih reagentov za izolacijo RNA. ... 20

Preglednica 3.3: Seznam uporabljene laboratorijske opreme za izolacijo RNA. ... 20

Preglednica 3.4: Seznam uporabljene laboratorijske opreme za merjenje koncentracije RNA. ... 21

Preglednica 3.5: Reakcijska mešanica za razgradnjo DNA. ... 21

Preglednica 3.6: Reakcijska mešanica za obraten prepis. ... 22

Preglednica 3.7: Seznam uporabljenih reagentov za tretma z DNAzo I in obraten prepis ... 22

Preglednica 3.8: Seznam uporabljene laboratorijske opreme za tretma z DNAzo I in obraten prepis. ... 22

Preglednica 3.9: Sestava vzorca za validacijo z mešanico 5 µg RNA. ... 23

Preglednica 3.10: Sestava reakcijske mešanice za tretma z DNAzo I pri validaciji. ... 23

Preglednica 3.11: Sestava reakcijske mešanice za obraten prepis pri validaciji. ... 24

Preglednica 3.12: Sestava reakcijskih mešanic za kvantitativni PCR brez cDNA ... 25

Preglednica 3.13: Hitri temperaturni program za kvantitativni PCR. ... 27

Preglednica 3.14: Seznam uporabljenih reagentov za kvantitativni PCR. ... 28

Preglednica 3.15: Seznam uporabljene laboratorijske opreme za kvantitativni PCR. ... 28

Preglednica 4.1: Seznam prepisov gena CNR1 v zbirki Ensembl in NCBI-Gene. ... 31

Preglednica 4.2: Seznam prepisov gena CNR2 v zbirkah NCBI-RefSeq, Ensembl in UniProt. ... 32

Preglednica 4.3: Testi TaqMan za preiskovanja izražanja gena CNR1. ... 36

Preglednica 4.4: Testi TaqMan za preiskovanja izražanja gena CNR2. ... 37

Preglednica 4.5: Izmerjene absorbance vzorcev izolirane RNA. ... 37

Preglednica 4.6: Izračunana koncentracija in čistoča izoliranih RNA. ... 38

Preglednica 4.7: Priprava 10 µl raztopine RNA s koncentracijo 300 ng/µl. ... 38

Preglednica 4.8: Rezultati kvantitativnega PCR za validacijske vzorce. ... 39

Preglednica 4.9: Rezultati kvantitativnega PCR za preiskovane vzorce. ... 42

(17)

Preglednica 4.10: Rezultati kvantitativnega PCR za pozitivno kontrolo iz človeških možganov. ... 43 Preglednica 4.11: Rezultati relativne kvantifikacije po Livakovi in ΔCT metodi. ... 44

(18)

(19)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

AC adenilil ciklaza

AEA anandamid, N-arahidonol-etanolamin Akt protein kinaza B

bp bazni pari

cAMP ciklični adenozinmonofosfat CB1/2/3 kanabinoidni receptor tipa 1/2/3

CB1 izooblika 1 kanabinoidnega receptorja 1 CB1a izooblika 2 kanabinoidnega receptorja 1 CB1b izooblika 3 kanabinoidnega receptorja 1 CB2A izooblika 1 kanabinoidnega receptorja 2 CB2B izooblika 2 kanabinoidnega receptorja 2 CBN kanabinol

CBR kanabinoidni receptor

CDS kodirajoče zaporedje (angl. coding sequence) (c)DNA (komplementarna) deoksiribonukleinska kislina CHCl3 kloroform

CNR1/2 gen za kanabinoidni receptor tipa 1/2 COX-2 ciklooksigenaza-2

CT pražni cikel

DAG diacilglicerol

ddH2O ultračista voda brez DNAz/RNaz

DDBJ DNA baza podatkov Japonske (angl. The DNA Data Bank of Japan) DNA deoksiribonukleinska kislina

DNAza deoksiribonukleaza

dT deoksitimidin

dU deoksiuridin

E učinkovitost pomnoževanja eCB endokanabinoidi

ECS endokanabinoidni sistem

(20)

EMBL Evropski laboratorij za molekularno biologijo (angl. The European Molecular Biology Laboratory)

EMBL-EBI Evropski inštitut za bioinformatiko (angl. The European Bioinformatics Institute)

ER estrogenski receptor

ERK protein kinaza ERK (angl. extracellular signal-regulated kinase)

Gly glicin

GPCR z G-proteini povezani receptorji

HER2 receptor za človeški epidermalni rastni faktor 2 HR hormonski receptor

IP3 inozitol 1,4,5-trisfosfat Leu levcin

MAPK protein kinaza, aktivirana z mitogenom

NCBI Nacionalni center za biotehnološke raziskave (angl. National Center for Biotechnology Information)

NGS sekvenciranje naslednje generacije (angl. next generation sequencing) NTC negativna kontrola brez matrice (angl. negative template control) PCR verižna reakcija s polimerazo

PIP2 fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat PI3K fosfatidilinozitol 3-kinaza PKA protein kinaza A

PKC protein kinaza C PLC fosfolipaza C

PR progesteronski receptor RNaza ribonukleaza

RT reverzna transkriptaza

(m)RNA (informacijska) ribonukleinska kislina SERM selektivi modulator estrogenskih receptorjev TAM tamoksifen

test TaqMan mešanica sond in začetnih oligonukleotidov, komercialno pripravljena in funkcionalno preverjena

TNRD trojno negativni rak dojke

(21)

UNG uracil-N-glikozilaza

UniProt angl. The Universal Protein Resource UTR neprevedena regija

VEGF vaskularni endotelijski rastni faktor

VGCC napetostni kalcijev kanalček (angl. voltage-gated calcium channel) WHO Svetovna zdravstvena organizacija

2-AG 2-arahidonol glicerol Δ⁹-THC delta-9-tetrahidrokanabinol

(22)

(23)

Določitev izražanja kanabinoidnih receptorjev na ravni informacijske RNA v celičnih linijah raka dojke

1

1 Uvod

1.1 Endokanabinoidni sistem

Endokanabinoidni sistem (ECS) je kompleksno fiziološko omrežje, ki sodeluje pri ustvarjanju homeostaze in vzdrževanju človeškega zdravja [1]. Sestavljajo ga kanabinoidni receptorji (CBR), endokanabinoidi (eCB) in proteini, ki sodelujejo pri transportu, sintezi in razgradnji eCB [1–4]. Večina komponent ECS ima več funkcij, zato ECS ne deluje kot zaprt sistem, vendar vpliva in je tudi sam pod vplivom številnih drugih signalnih poti. ECS ima osrednjo vlogo pri razvoju živčnega sistema, v zrelem živčnem sistemu pa modulira nevronsko aktivnost in delovanje nevronske mreže [2]. Številne študije potrjujejo, da ima ECS ključno vlogo pri spominu, razpoloženju, nagrajevalnem sistemu možganov, zasvojenosti z drogami, metabolnih procesih (npr. lipoliza, metabolizem glukoze, energijsko ravnovesje) [5].

Kanabinoidni receptorji so membranski receptorji povezani z G-proteini (GPCR). Vežejo kanabinoidne ligande endogenega in eksogenega izvora. Ločimo dva tipa kanabinoidnih receptorjev, tip 1 (CB1, gen CNR1) in tip 2 (CB2, gen CNR2) [1-5]. Nedavne študije so pokazale, da kanabinoidi lahko aktivirajo tudi druge receptorje, kot so: GPR18, GPR119, TRPV1 in GPR5. Le-te nekateri obravnavajo kot nov, tretji tip kanabinoidnih receptorjev (CB3) [1, 3, 6].

Kanabinoidi so biološko aktivne komponente, ki se vežejo in aktivirajo kanabinoidne receptorje [1]. Glede na izvor ločimo tri skupine kanabinoidov:

1) Fitokanabinoidi ali kanabinoidi rastlinskega izvora. Gre za strukturno raznolike kemične komponente iz rastlin rodu Cannabis, ki se vežejo na kanabinoidne receptorje v našem telesu in sprožijo različne signalne poti, ki vodijo do psihotropnih in terapevtskih učinkov [1]. Najbolj znan predstavnik skupine je delta-9-tetrahidrokanabinol (Δ⁹-THC), ki je glavna psihoaktivna komponenta rastline Cannabis sativa. Deluje kot delni agonist na receptorja CB1 in CB2. Drugi predstavnik je kanabinol (CBN), ki pa na oba receptorja deluje kot inverzni agonist [1, 6].

2) Endokanabinoidi ali endogeni kanabinoidi (eCB). Gre za lipidne derivate iz dolgih verig polinenasičenih maščobnih kislin, amidov, estrov in etrov, ki jih proizvede naše telo in so del ECS. Najbolj raziskana eCB sta N- arahidonol-etanolamin (anandemid, AEA) in 2-arahidonolglicerol (2-

(24)

2

AG). Oba sta derivata arahidonske kisline. Anandemid je bil prvič izoliran iz prašičjih možganov leta 1992 in deluje kot delni agonist na CB1 in CB2.

Nekaj let kasneje so iz pasjega črevesja izolirali še 2-AG, ki deluje kot polni agonist na receptorja CB1 in CB2 [1–3].

3) Sintetični kanabinoidi. Gre za umetno sintetizirane kemične komponente, ki oponašajo strukturo fito- in endokanabinoidov. Prvi so bili sintetizirani leta 1970 z namenom razvoja novih zdravil za blaženje bolečin pri raku.

Danes je poznanih več kot 560 sintetičnih kanabinoidov [7].

Sinteza in razgradnja eCB-ov sta strogo regulirana procesa. eCB so sintetizirani na mestih, kjer in ko se pojavi njihova potreba. Takrat se aktivirajo specifični encimi, običajno lipaze, ki razcepijo njihove prekurzorje v membrani. Biosinteza anandemida in 2-AG lahko poteka po različnih poteh. Na izbor poti verjetno vpliva količina razpoložljivega prekurzorja in/ali tip celice in tkiva, v katerem poteče sinteza [1, 2].

1.1.1 Kanabinoidni receptor tipa 1

Izražanje in funkcija receptorja CB1 je najbolje raziskana v osrednjem in perifernem živčnem sistemu. Izražanje pa ni omejeno le na živčni sistem, vendar ga najdemo tudi v drugih tkivih, kot so maščobno tkivo, skeletne mišice, pljuča, limfni vozli, slepič, jetra, koža, itd. [2, 6, 8]. Receptor CB1 je tako kot večina drugih GPCR-jev primarno lokaliziran v celični membrani. Nahaja se tudi v več znotrajceličnih organelih (slika 1.1).

Del znotrajceličnih CB1 se nahaja v endosomih kot posledica konstantne internalizacije receptorjev iz plazmaleme. Drugi del znotrajceličnih CB1 se nahaja v lizosomih, tretji del pa se izraža v zunanji membrani mitohondrija. Lokacija receptorja pa vpliva tudi na njegovo funkcijo [3, 6, 9, 10].

(25)

3

Slika 1.1: Lokalizacija receptorja CB1 v celici in njihova vloga. Povzeto po [9]. Slika je narejena s programom BioRender.

CB1 je protein sestavljen iz sedmih transmembranskih vijačnic, z N-koncem zunaj celice in C-koncem v citosolu. Sestavljajo ga tri domene: Gα, Gβ in Gγ (slika 1.2) [10]. Aktivacija CB1 v celični membrani povzroči vezavo receptorja z inhibitornimi G proteini Gi in Go

(Gi/o), kar vodi do inhibicije adenilil ciklaze (AC, slika 1.2). Posledično se koncentracija cikličnega adenozin monofosfata (cAMP) v celici zmanjša in onemogočena je aktivacija protein kinaze A (PKA). Pride tudi do zaprtja napetostnih kalcijevih kanalčkov (VGCC), s čimer se zavira dotok kalcijevih ionov v celico. Na drugi strani receptor CB1 aktivira številne proteine iz družine protein kinaz, aktiviranih z mitogenom (MAPK), med drugimi ERK1/2, p38 ter JNK, in signalno pot fosfatidilinozitol 3-kinaze/protein kinaze B (PI3K/Akt). Pod določenimi pogoji, lahko pride do spremembe vezave receptorja CB1 iz Gi/o na stimulatorne G proteine Gs in Gq. Gs aktivira AC in posledično aktivira signalno pot protein kinaze C (PKC), med tem ko Gq aktivira signalno pot fosfolipaze C (PLC).

Končni rezultat signalnih poti, ki jih sproži aktivacija receptorja CB1, je odvisen od samega liganda ter znotrajceličnega okolja in lahko stremi k preživetju celice ali celični smrti. CB1 regulira fiziološke procese, kot so apetit, učenje, spomin, regulacija bolečine, energijski metabolizem, funkcije reproduktivnega in kardiovaskularnega sistema [2, 6, 9].

(26)

4

Slika 1.2: Kristalna struktura receptorja CB1 v kompleksu s proteinom G in signalne poti, ki se sprožijo ob njegovi aktivaciji. V kristalni strukturi je z rumeno barvo označenih sedem transmembranskih vijačnic CB1, z modro barvo domena Gα, zeleno Gβ in roza Gγ. Kristalna struktura je pridobljena iz PDB (koda: 6N4B). Povzeto po [9]. Slika je narejena s programom BioRender.

Receptorji se lahko ob vezavi liganda internalizirajo in preidejo v endosom (slika 1.1).

Njihova signalizacija poteka preko β-arestina. CB1, ki so lokalizirani na lizosomih, lahko signalizirajo zvišanje koncentracije znotrajceličnega kalcija preko sprostitve internih zalog kalcija. Povzročijo tudi povečanje prepustnosti lizosoma. CB1 na mitohondriju pa inhibirajo mitohondrijsko celično dihanje in proizvodnjo cAMP ter s tem regulirajo celični energijski metabolizem [9].

1.1.1.1 Gen CNR1

Receptor CB1 zapisuje gen CNR1, ki je na kromosomu 6 (6q15). Dolg je 27.486 nukleotidov (nt). Sestavlja ga osem eksonov, med katerimi je kodirajoči le zadnji, osmi ekson (slika 1.3-A) [8].

(27)

5

1.1.1.2 Protein CNR1

Kot posledica alternativnega izrezovanja so poznane tri izooblike receptorja CB1, računalniško pa sta predvideni še dve potencialni izoobliki. Izoobliko 1 (CB1) sestavlja 472 aminokislin dolgo zaporedje in predstavlja najpogostejšo izoobliko. Izooblika 2 (CB1a) ima zaradi zamika bralnega okvirja prvih 89 aminokislin zamenjanih za 28 drugih in jo tako sestavlja 411 aminokislinskih ostankov. Izoblika 3 (CB1b) pa ima 33 aminokislin med Leu-33 in Gly-55 izbrisanih in meri 439 aminokislinskih ostankov [10].

Tekom diplomske naloge bo kratica CB1 označevala vse kanabinoidne receptorje tipa 1, razen kjer bo zraven eksplicitno pisalo, da gre za izoobliko. Takrat bo z CB1 označevala izoobliko 1.

V študiji iz leta 2016, so opisali takrat znane štiri eksone in cepitvena mesta. Znotraj takratnega eksona 1 imamo dve cepitveni mesti – 1A in 1B, znotraj zadnjega eksona, takratnega eksona 4, pa štiri cepitvena mesta – 4A, 4B, 4C in 4D (slika 1.3-A, zgoraj) [11]. Alternativno izrezovanje eksonov 1 in 4 vodi do nastanka šestih variant transkriptov.

Kadar gre za transkript izooblike CB1, se ekson 4 prepiše v celoti. Transkripti izooblike CB1a imajo izrezano zaporedje med mestoma B in D, transkripti izooblike CB1b pa med mestoma A in C (slika 1.3-B) [11]. Zdaj so znani še štirje dodatni eksoni, dva pred prvim eksonom in dva med eksonoma 2 in 3 (slika 1.3-A, spodaj). Z novimi eksoni so bile odkrite tudi nove variante transkriptov [8].

(28)

6

Slika 1.3: Shema gena in proteina CNR1. A – Stara in nova struktura gena CNR1.

Zgoraj je prikazana struktura gena povzeta iz Isabel González-Mariscal in drugi (2016) [11], spodaj pa trenutno znana struktura povzeta iz NCBI. Z modrimi pravokotniki so označeni eksoni, s črno črto pa introni. Nad eksonom 1 in 4 zgoraj in 3 in 8 spodaj so s puščicami označena cepitvena mesta. B – Struktura izooblik proteina CB1. Z modrimi pravokotniki je ptikazan eksoni 8, s črno črto pa del eksona, ki je pri posamezni izoobliki izrezan. Izooblike posameznega prikaza so navedene na desni strani. Povzeto po [11].

Slika je narejena s programom BioRender.

Razlike med izooblikami so slabo raziskane in jih je težko razumeti. Na eni strani študije dokazujejo, da CB1 veže tako 2-AG kot anandamid, med tem ko CB1a in CB1b vežeta le 2-AG z visoko afiniteto. Poleg tega 2-AG deluje na CB1 kot agonist, na CB1a in CB1b pa kot reverzni agonist. Na drugi strani pa študije ne opažajo razlik v afiniteti do ligandov med posameznimi izooblikami [10, 12]. V možganih in skeletnih mišicah prevladuje CB1, v manjših količinah se izraža CB1a, CB1b pa skoraj ni, med tem ko je v jetrih raven izražanja CB1b desetkrat večja kot raven izražanja CB1 [11].

(29)

7

1.1.2 Kanabinoidni receptor tipa 2

Receptor CB2 so odkrili tri leta kasneje kot CB1 v makrofagih, izoliranih iz vranice.

Njihova vloga je slabše raziskana kot vloga CB1. CB2 se v največji meri izraža v celicah imunskega sistema, njegovo izražanje so potrdili v človeških levkocitih, kot so B- in T- celice, bazofilci, makrofagi, eozinofilci, naravne celice ubijalke in nevtrofilci. Najdemo ga tudi v drugih perifernih tkivih, vključno s kardiovaskularnim sistemom, gastrointestinalnim traktom, jetri, adipoznim tkivom, kostmi in reproduktivnim sistemom. Sprva niso opazili prisotnosti receptorjev CB2 v osrednjem živčevju, a v kasnejših raziskavah so dokazali njegovo izražanje v možganih, vendar na precej nižji ravni kot v celicah imunskega sistema. Glavna naloga CB2 je, da glede na vezan ligand v celicah imunskega sistema sproži provnetno ali protivnetno delovanje. Pomembno vlogo igra tudi pri nevroloških dejavnostih, kot so nocicepcija, nevroinflamacija in odvisnost od drog [6, 9].

CB2 sestavlja sedem transmembranskih vijačnic, N-konec proteina se nahaja na zunanji strani celice in C-konec v citosolu. Sestavljajo ga tri domene: Gα, Gβ in Gγ (slika 1.4) [13]. Receptor CB2 je Gi/o tip GPCR, kar pomeni, da inhibira aktivnost AC, zniža koncentracijo cAMP v celici in prepreči aktivacijo PKA, vendar ne more zapreti VGCC.

Prav tako kot CB1 aktivira proteine iz družine MAPK, predvsem ERK in p38, in signalno pot PI3K/Akt. Poleg tega pa aktivira tudi PLC, ki katalizira pretvorbo fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat (PIP2) iz membrane v inozitol 1,4,5-trisfosfat (IP3) in diacilglicerol (DAG).

IP3 vodi do zvišanja koncentracije Ca²⁺ v celici in mitohondriju (slika 1.4) [1, 6, 9].

(30)

8

Slika 1.4: Kristalna struktura receptorja CB2 v kompleksu s proteinom G in signalne poti, ki se sprožijo ob njegovi aktivaciji. V kristalni strukturi je z zeleno barvo označenih sedem transmembranskih vijačnic CB2, z modro barvo domena Gα, rjavo Gβ

in roza Gγ. Kristalna struktura je pridobljena iz PDB (koda: 6KPF). Povzeto po [6]. Slika je narejena s programom BioRender.

1.1.2.1 Gen CNR2

Receptor CB2 zapisuje gen CNR2, ki se nahaja na kromosomu 1 (1p36.11). Dolg je 42.848 nt. Sestavlja ga šest eksonov, med katerimi je kodirajoč le zadnji, šesti ekson (slika 1.5) [14].

Slika 1.5: Shema gena CNR2. Z modrimi pravokotniki so označeni eksoni, s črno črto pa introni. Povzeto iz NCBI. Slika je narejena s programom BioRender.

(31)

9

Kot posledica alternativne uporabe promotorja sta poznani dve izoobliki, CB2A in CB2B, ki pa se razlikujeta le v 5'-UTR regiji. CB2A se predominantno izraža v testisih in možganih, CB2B pa v vranici in levkocitih. Receptor CB2 sestavlja zaporedje 360 aminokislinskih ostankov, a le 44 % zaporedja je homolognega s CB1 [13].

1.2 Rak dojke

Rak dojke je najpogostejša oblika malignosti pri ženskah, saj predstavlja kar 30 % vseh oblik raka pri ženskah. Zelo redko se bolezen lahko pojavi tudi pri moških [15]. V letu 2020 je bilo po statističnih podatkih Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) 2,3 milijona žensk po svetu diagnosticiranih z rakom dojke, 685 000 pa jih je bitko z boleznijo izgubilo [16]. Med razlogi za smrt so metastaze, ponovitev bolezni in odpornost na zdravila, zaradi neuspešnosti trenutnih terapij. V zadnjih desetletjih se je umrljivost zaradi raka dojke občutno zmanjšala predvsem na račun izboljšanega zgodnjega odkrivanja bolezni in razvoja učinkovitejših dodatnih terapij [17].

Izraz rak dojke zajema heterogeno skupino bolezni, katerih osnovni značilnosti sta nenadzorovana delitev in razrast spremenjenih, rakavih celic. Rak dojke se najpogosteje začne v epitelnih strukturah – žleznih izvodilih/duktusih (85 %) in lobulih (15 %). Rakave celice se najprej širijo le znotraj teh struktur in so od veziva/strome ločene z bazalno membrano. Takrat govorimo o neinvazivnem karcinomu ali karcinomu in situ, ki običajno ne povzroča nobenih simptomov. Kasneje lahko rakave celice vraščajo v okoliška tkiva in jih okvarjajo – rakave celice prebijejo bazalno membrano in se vraščajo v stromo dojke. Tam pogosto prodrejo v mezgovnice in žile, posledično jih krvni in limfni obtok razneseta še v druge, oddaljene organe. Nastanejo novi tumorji, ki jih imenujemo metastaze. Ko rakave celice prodrejo v stromo dojke, govorimo o invazivnem karcinomu [16, 18].

Rak dojke se klinično deli v tri glavne podskupine na podlagi izraženosti hormonskih receptorjev (HR) za estrogen (ER) in progesteron (PR) ter receptorja za človeški epidermalni rastni faktor 2 (HER2) [15, 19]:

1) HR-pozitivni/Luminalni rak dojke: izraženost ER in PR ter odsotnost HER2. Gre za obliko z najboljšo prognozo in najmanjšo agresivnostjo. Poznamo dva tipa:

luminalni tip A in luminalni tip B.

2) HER2-pozitiven rak dojke: odsotnost ER in PR ter čezmerna izraženost HER2 in/ali pomnožitev gena HER2. Določa se z imunohistokemijo in in situ

(32)

10

hibridizacijo. Gre za agresivnejšo obliko s slabšo prognozo kot luminalni rak dojke.

3) Trojno negativni rak dojke (TNRD): odsotnost ER, PR in HER2. Gre za obliko z najslabšo prognozo, saj ta oblika raka hitro napreduje, se razširi in je bolj agresivna [15, 19].

ER in PR sta hormonska receptorja, ki se nahajata večinoma v jedru rakavih celic. Njuno prisotnost se določi z imunohistokemijo. Ženski spolni hormon estrogen, ki se veže na ER, igra pomembno vlogo pri raku dojk, saj pospešuje rast in razmnoževanje rakavih celic [20].

1.2.1 Odkrivanje bolezni in zdravljenje

V primeru, da je bolezen odkrita pravočasno, torej v zgodnji fazi razvoja, so možnosti za ozdravitev velike. Za zgodnje odkrivanje bolezni je pomembno samopregledovanje dojk in mamografija (t. j. rentgensko slikanje dojk), ki lahko zasledi raka, ko je še netipen [15, 18]. V ta namen v Sloveniji poteka presajalni program DORA, v katerega so vključene vse ženske med 50. in 69. letom starosti [21]. Dodatne metode za odkrivanje raka dojke so ultrazvočne preiskave in slikanje dojk z magnetno resonanco [15, 18].

Rak dojke se najpogosteje pojavlja kot neboleča zatrdlina. Pogosto pride tudi do spremembe velikosti, oblike ali videza dojke, na koži se lahko pojavijo jamice, pordelost ali kakšne druge spremembe, lahko se spremeni videz bradavice ali kože, ki obdaja bradavico, pojavi se lahko tudi nenormalen izcedek iz bradavic [16].

Zdravljenje je običajno sestavljeno iz operacije, radioterapije in sistemskega zdravljenja.

Radioterapija omogoča nadzor bolezni v dojkah, bezgavkah in okoliških območjih, sistemsko zdravljenje pa obsega zdravila, ki se dozirajo peroralno ali intravenozno in zdravijo in/ali zmanjšujejo možnost širjenja raka. Sem spadajo endokrina/hormonska terapija, kemoterapija in biološko zdravljenje [16].

V večini primerov se zdravljenje začne kirurško. Kadar imamo opravka z velikimi tumorji, je potrebna mastektomija, torej odstranitev celotne dojke. Pogosto pa je možna le delna mastektomija, imenovana lumpektomija, kjer se iz dojke odstrani le tumor. V takih primerih je običajno potrebna še radioterapija, da se zmanjša možnosti ponovitve.

V primeru invazivnega raka, se odstrani tudi limfne vozle [15, 16].

Pogosta praksa pri HER2-pozitivnem raku dojke je neoadjuvantno zdravljanje. Splošni princip temelji na tem, da se pred kirurškim posegom uporabi enako sistemsko

(33)

11

zdravljenje, kot se ga bi po operaciji. Temu zdravljenju nato sledi kirurški poseg, obsevanje in če je treba, še nadaljnje post-neoadjuvantno sistemsko zdravljenje [15].

HER2-pozitivni rak dojke se lahko zdravi s tarčnimi biološkimi zdravili, kot je trastuzumab. Gre za zelo učinkovito zdravilo, ki pa je precej drago, saj gre za protitelesa.

Biološko zdravljenje poteka v kombinaciji s kemoterapijo, da je pobijanje rakavih celic učinkovito [16].

Kemoterapija se uporablja pri bolnicah z ER-pozitivnim rakom dojk. Je najpogostejša oblika neoadjuvantnega zdravljenja. Kemoterapija učinkovito zmanjšuje možnost širjenja ali ponovitve raka [15, 16].

Pri bolnicah z ER-pozitivnim rakom dojke v zgodnjem stadiju se uporablja endokrino oziroma hormonsko zdravljenje. Cilj je znižati nivo estrogena oziroma ER receptorjev [15, 16, 20]. Poznamo tri vrste hormonskega zdravljenja: odstranitev jajčnikov, obsevanje jajčnikov in zdravila, ki preprečujejo delovanje jajčnikov (antiestrogeni, zaviralci aromataz, fulvestrant in progestini) [20]. Pri premenopavznih ženskah se najpogosteje uporablja antiestrogen tamoksifen (TAM), pri pomenopavznih ženskah pa TAM ali eden izmed zaviralcev aromataz [15, 20]. TAM je selektivni modulator ER (SERM). Gre za sintetično nesteroidno eksogeno snov. Njegova učinkovitost zaviranja ER-pozitivnega raka se predpisuje predvsem njegovi sposobnosti, da deluje kot antagonist ER. Z visoko afiniteto se veže na ER in s tem prepreči vezavo estrogenu in posledično inhibira ER- posredovano izražanje genov [6, 22]. Dokazali pa so, da TAM kaže citotoksične učinke tudi pri ER-negativnih tipih raka dojke. Ugotovili so, da so apoptotični učinki TAM v celicah raka dojke ER-neodvisni in da gre pravzaprav za efekt, posredovan z aktiviranjem kaspaz 6, 7 in 9. Poleg tega zmanjšuje angiogenezo, potrebno za maligno rast in metastaze, z inhibicijo izločanja vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja (VEGF) v celicah raka dojke [22].

1.2.2 Celične linije raka dojke

Veliko raziskav poteka na celičnih linijah raka dojke. Prva celična linija je bila razvita leta 1958, do danes pa je njihovo število že precej naraslo. V preglednici 1.1 so prikazane izbrane celične linije raka dojke, njihovo izražanje ER, PR in HER2 ter kateremu podtipu raka dojke pripadajo [19].

(34)

12

Preglednica 1.1: Celične linije raka dojke in njihove značilnosti. S +/– je označeno izražanje/ne izražanje posameznih receptorjev. Povzeto po [19].

CELIČNA LINIJA ER PR HER2 PODTIP

MCF7 + + - Luminalni tip A

T-47D + + - Luminalni tip A

MDA-MB-134 + - - Luminalni tip A

HCC-202 - - + HER2-pozitivni

KPL-4 - - + HER2-pozitivni

SK-BR-3 - - + HER2-pozitivni

MDA-MB-231 - - - TNRD

HCC-70 - - - TNRD

SK-BR-7 - - - TNRD

MDA-MB-361 + +/- + Luminalni tip B

IBEP-3 - + + Luminalni tip B

ZR-75-30 + - + Luminalni tip B

1.2.3 Povezava s kanabinoidi in kanabinoidnimi receptorji

Terapevtski učinek kanabinoidov je v zadnjem času postal pogost predmet raziskav.

Podatki iz predkliničnih in vitro in in vivo študij kažejo na protitumorsko učinkovanje kanabinoidov. Obstajajo študije o vplivu na odziv na terapijo in študije, v katerih opažajo, da kanabinoidi spodbujajo tumor k napredovanju [23]. Številne študije so dokazale, da se v celicah raka dojke izražajo kanabinoidni receptorji. Maria M. Caffarel in sod. so s kvantitativnim PCR ugotavljali izražanja CNR1 in CNR2 na ravni informacijske RNA (mRNA) in s konfokalnim mikroskopom na proteinski ravni. Ugotovili so, da se v celicah tkiva raka dojke receptor CB1 izraža v zmernih količinah, med tem ko je raven izražanja receptorja CB2 visoka [24]. Fran Kristanović je v magistrski nalogi z metodo prenosa Western in imunocitokemijo zaznal receptorja CB1 in CB2 v petih celičnih linijah raka dojke [25]. V drugi študiji so Maria M. Caffarel in sod. z uporabo imunohistokemije prišli do rezultata, da se CB1 izraža v 14 %, CB2 pa v 72 % primerov karcinomov, med tem ko v nepreoblikovanem tkivu raka dojke niso zaznali pomembnejše imunoreaktivnosti obeh CBR [26]. Ekspresija CB2 se povezuje z agresivnostjo tumorjev – agresivnejši tumorji izražajo višje ravni CB2 [23]. Kanabinoidi v rakavih celicah ustavijo celični cikel v G1/S fazi preko CB1 in v G2/M fazi preko CB2. Preprečijo tudi celično rast in sprožijo apoptozo. To dosežejo preko inhibicije konstitutivno aktivnih proonkogenih signalnih poti, kot je pot posredovana s protein kinazami ERK (ERK, angl. extracellular signal- regulated kinases). V živalskih modelih raka dojke zmanjšajo angiogenezo in metastaziranje. Kanabinoidi učinkujejo na vse tri oblike raka dojke. Pri HER2-pozitivnem

(35)

13

raku dojke in TNRD z inhibicijo Akt in cikooksigenaze-2 (COX-2) preko receptorja CB2 preprečijo napredovanje tumorja in metastaziranja [23].

Luciano De Petrocellis in sod. so dokazali, da anandamid lahko inhibira razmnoževanje celic MCF7 in T47-D, ki izražajo ER. Do inhibicije pa ne pride zaradi toksičnosti ali apoptoze celic, vendar zaradi zaviranja sinteze receptorjev za prolaktin in posledično samega odgovora, ki ga sproži vezava prolaktina. To vodi do zmanjšanega izražanja gena BRCA1, katerega produkt sodeluje pri popravljanju napak v DNA. Njihov zaključek je bil, da je ta učinek inhibicije posredovan preko receptorja CB1 [6, 27]. Dominique Maelck in sod. so ugotovili, da v celicah MCF-7 anandamid inhibira AC in aktivira MAPK, kar vodi v zmanjšano izražanje receptorjev za prolaktin in tropomiozin receptor kinaz ter posledično v inhibicijo celičnega razmoževanja [6, 28]. Na drugi strani so Katherine E. Hanlon in sod. pokazali, da JWH-015, selektivni agonist receptorja CB2, zmanjša sposobnost preživetja celic MCF-7, tako da sproži apoptozo celic preko od kalcija odvisnega mehanizma, ki povzroči spremembe MAPK/ERK signalizacije [6, 29].

Dokazano je bilo, da aktivacija receptorja CB2 z ligandom THC zmanjša napredovanje celičnega cikla in spodbuja apoptozo človeških celic raka dojke. Kanabidiol inducira smrt celic raka dojke in vitro z apoptozo in avtofagijo [30]. V večini študij so za raziskovanje uporabili neselektivne agoniste CBR, kot sta anandamid in THC, njihovo delovanje pa je zaviralo razmnoževanje rakavih celic. Daniela Sarnataro in sod. pa so dokazali, da tudi rimonabant, ki je sintetični selektivni agonist receptorja CB1, zavira razmoževanje rakavih celic, ki izražajo ER. Inhibicija poteče preko mehanizma, ki ga posredujejo lipidni rafti. Ugotovili so tudi, da je bila inhibicija razmnoževanja v celicah MDA-MB-231, ki pripadajo TNRD, celo bolj učinkovita kot v celicah MCF7 in T-47D [6, 31].

Dokazano je tudi, da se molekularne poti CBR in estrogena prekrivajo, kar lahko vpliva na patogenezo HR-pozitivnega raka dojk [6]. Estrogen vpliva na izražanje CBR preko različnih molekularnih poti. Na drugi strani so ugotovili, da se TAM veže na receptorja CB1 in CB2 z zmerno afiniteto in kaže inverzno aktivnost. Posledično se zmanjša bazalna aktivnost G-proteinov, poveča aktivnost AC in posledično zviša koncentracija cAMP.

Vse to kaže, da so CBR molekularne tarče za TAM in lahko prispevajo k ER-neodvisnim citotoksičnim učinkom tega zdravila, poleg tega pa predlagajo, da ima tudi estrogen direkten vpliv na CBR [22, 30].

(36)

(37)

15

2 Namen dela in hipoteze

V namen nadaljnjih raziskav vpliva CBR na lastnosti raka dojke je treba opredeliti modelne celične linije raka dojke, ki različno izražajo CBR. Le-to bi omogočilo nadaljnjo analizo vpliva CBR in CB na zdravljenje raka dojke

Namen diplomske naloge je analiza izražanja CBR v celičnih linijah raka dojke, ki smo jo naslovili v dveh sklopih:

1. V teoretičnem delu naloge smo pregledali vse obstoječe RNA prepise genov CNR1 in CNR2 v podatkovnih zbirkah in jih primerjati med sabo. Na osnovi analize smo načrtovali izbiro začetnih oligonukleotidov in sond, ki zajamejo čim večje število prepisov različnih izooblik.

2. V eksperimentalnem delu naloge smo s kvantitativnim PCR in relativnimi metodami za kvantifikacijo določili izražanje genov CNR1 in CNR2 v izbranih celičnih linijah raka dojke (MCF7, T-47D, SK-BR-3, MDA-MB-231, MDA-MB-361) na nivoju RNA.

Postavili smo hipotezi:

Hipoteza 1: Celične linije raka dojke izražajo receptorja CNR1 in CNR2.

Hipoteza 2: Raven izražanja receptorjev CNR1 in CNR2 med celičnimi linijami raka dojke se razlikuje.

(38)

(39)

17

3 Materiali in metode

Raziskovanja smo se lotili z bioinformatsko analizo, kjer smo pregledali zbirke nukleotidnih in aminokislinskih zaporedij ter poiskali vse obstoječe RNA prepise genov CNR1 in CNR2. Sledil je eksperimentalni del, kjer smo izolirali RNA iz izbranih celičnih linij raka dojke, jo tretirali z DNAzo I, izvedli obratni prepis v cDNA in določili izražanje s kvantitativnim PCR.

3.1 Bioinformatska analiza

3.1.1 Iskanje prepisov

Znane RNA prepise genov CNR1 in CNR2 smo poiskali v zbirkah nukleotidnih zaporedij:

Ensembl [32] in NCBI (Gene, Nucleotide in RefSeq) [33], ter zbirki aminokislinskih zaporedij UniProt [34]. Ensembl je zbirka nukleotidnih zaporedij, zasnovana s strani Evropskega inštituta za bioinformatiko EMBL-EBI (angl. The European Bioinformatics Institute), ki deluje v okviru Evropskega laboratorija za molekularno biologijo EMBL (angl. The European Molecular Biology Laboratory) [32]. Nacionalni center za biotehnološke raziskave (NCBI) je oddelek Nacionalne medicinske knjižnice, ki upravlja z različnimi podatkovnimi zbirkami s poudarkom na genomiki, genetiki in biomedicini [33]. Na dnevni ravni poteka izmenjava podatkov med zbirkami nukleotidnih zaporedij EMBL, NCBI in DNA bazo podatkov Japonske (DDBJ) [32, 33]. UniProt (angl. The Universal Protein Resource) je obširen vir proteinskih zaporedij in anotacijskih podatkov.

Obsega tri zbirke: UniProtKB (angl. UniProt Knowledgebase), UniRef (angl. UniProt Reference Clusters) in UniParc (angl. UniProt Archive). Več kot 100 ljudi skrbi za kuriranje zbirk, razvoj programske opreme in podpore [34]. Čeprav je UniProt zbirka proteinskih zaporedij, ima v kategoriji Zaporedja med drugimi navedene povezave do pripadajočih nukleotidnih zaporedij iz zbirk Ensembl in NCBI-RefSeq. Pri zaporedjih iz NCBI-RefSeq ločimo dve vrsti zapisov mRNA. Tiste, katerih kode zapisov se začnejo z NM_, so protein kodirajoči prepisi, predpona XM_ pa označuje predvidene modele protein kodirajočih prepisov [35]. V analizo smo zajeli le dejanske protein kodirajoče prepise (NM_). Za izooblike, pri katerih ni bilo mogoče najti prepisa znotraj zbirk NCBI- RefSeq in Ensembl, smo za prepise pogledali v GenBank in NCBI-Nucleotide.

(40)

18

3.1.2 Poravnava prepisov

Poravnavo vseh nukleotidnih zaporedij smo izvedli z orodjem Clustal Omega. To je program za poravnavo večjega števila zaporedij, ki ga je ustvaril EMBL-EBI [36].

3.1.3 Pregled obstoječih testov TaqMan za izražanje genov

Za uporabo pri kvantitativnem PCR, s katerim smo določali izražanja CBR v celičnih linijah raka dojke, smo pregledali vnaprej pripravljene in funkcionalno preverjene mešanice sond in začetnih oligonukleotidov TaqMan (predesigned TaqMan Gene expression assay, Applied Biosystems; v nadaljevanju 'test TaqMan'). V zbirki ThermoFisher Scientific, TaqMan Assays smo pregledali vse obstoječe teste TaqMan za preiskovana ter referenčna gena.

3.2 Eksperimentalni del

Pred začetkom dela smo vsa orodja in površine prebrisali z etanolom in sredstvom za inaktivacijo RNaz (RNase Zap). Vsi plastični izdelki, ki smo jih uporabili pri eksperimentalnem delu (nastavki za pipete, mikrocentrifugirke, …), morajo biti brez RNaz. Delo je potekalo na ledu, razen kjer ni eksplicitno navedeno drugače.

3.2.1 Celične linije raka dojke in kontrolni vzorci

Za našo študijo smo izbrali pet celičnih linij raka dojke: MCF7, T-47D, SK-BR-3, MDA- MB-231, MDA-MB-361 (preglednica 3.1). Pri izboru smo upoštevali pogoj, da zajamemo vse tri podtipe raka dojke (HR-pozitivni, HER2-pozitivni in TNRD), torej da se celične linije razlikujejo v izražanju HR in HER2.

MCF7 je celična linija raka dojke, ki je bila pridobljena leta 1970 iz plevralnega izliva adenokarcinoma 69-letne ženske. Izraža ER in PR ter pripada raku dojke luminalnega tipa A. Celice so uporabne za študij raka dojk in vitro, ker so ohranile več idealnih značilnosti, zlasti za epitelij dojk, kot je pretvorba estrogena v estradiol preko ER v celični citoplazmi [37]. T-47D prav tako izraža ER in PR in predstavlja luminalni tip A raka dojke. Celična linija je bila pridobljena iz plevralnega izliva duktalnega karcinoma dojke 54-letne ženske [38]. Celična linija SK-BR-3 izhaja iz plevralnega izliva adenokarcinoma 43-letne ženske iz leta 1970. Prekomerno izraža HER2 in tako pripada HER2- pozitivnemu raku dojke [39]. Epitelijska celična linija MDA-MB-231 je bila pridobljena iz plevralnega izliva 51-letne ženske z adenokarcinomom. Celice MDA_MB_231 so zelo agresiven, invaziven in slabo diferenciran TNRD, ki ne izraža tako ER in PR kot HER2 [40]. Celična linija MDA-MB-361 izvira iz 40-letne ženske z adenokarcinomom, celice

(41)

19

pa so bile izolirane iz metastatskega mesta v možganih. Celice izražajo ER, nekatere tudi PR in pripadajo luminalneu tipu B raka dojke [41].

Za kontrolo smo si izbrali nevroblastomsko celično linijo SH-SY5Y (preglednica 3.1).

Gre za trikrat klonirano podvrsto linije SK-N-SH, ki je bila pridobljena z biopsijo kostnega mozga pri bolniku z nevroblastomom [42].

Preglednica 3.1: Celične linije raka dojke in kontrolna celična linija.

CELIČNA LINIJA VRSTA PASAŽA PROIZVAJALEC

MCF7

Rak dojke

154

ATCC

T-47D 43

SK-BR-3 34

MDA-MB-231 32

MDA-MB-361 69

SH-SY5Y Nevroblastom 22

Za pozitivno kontrolo pri izražanju gena CNR1 smo poleg nevroblastomske celične linije SH-SY5Y uporabili cDNA, ki je reverzni prepis RNA, izolirane iz celic človeških možganov. Iz Nacionalnega inštituta za biologijo smo prejeli 6 µl cDNA s koncentracijo 40 ng/µl. Izvedli smo kvantitativni PCR po protokolu pod točko 3.2.4, prilagojenem na 1 vzorec.

Za izražanje gena CNR2 nismo uspeli pridobiti vzorca za pozitivno kontrolo.

3.2.2 Izolacija RNA iz celic v kulturi

Zamrznjene celice celičnih linij raka dojke in kontrolne nevroblastomske celične linije smo postavili na led, jim dodali 0,5 ml Tri Reagent za lizo in jih razbili s pipetiranjem.

Lizate smo prestavili v mikrocentrifugirke brez RNaz/DNAz in 5 minut inkubirali pri sobni temperaturi. Nato smo jim dodali 0,1 mL CHCl3 in intenzivno premešali na maksimalni hitrosti (16.873 g) 15 sekund. Po 3 minutni inkubaciji pri sobni temperaturi smo vzorce 15 minut centrifugirali v ohlajeni centrifugi (4 °C) na 12.000 g. V vzorcih so se pojavile tri faze: rdeča organska faza (proteini) spodaj, bela vmesna faza (DNA) ter brezbarvna vodna faza (RNA) zgoraj. Vodno fazo smo prenesli v svežo mikrocentrifugirko, vmesno in organsko fazo pa shranili pri -20 °C za morebitno kasnejšo izolacijo proteinov in DNA. Vodni fazi smo dodali 0,25 ml ohlajenega izopropanola in 15 sekund intenzivno mešali na vibracijskem mešalu pri maksimalni hitrosti. Sledila je 30 minutna inkubacija pri -80 °C, da se je RNA oborila. Vzorce smo nato 15 minut centrifugirali (4 °C, 12.000 x g). Odstranili smo supernatant in vzorce trikrat sprali.

(42)

20

Spiranje je potekalo tako, da smo vzorcu dodali 0,5 ml ohlajenega etanola, na hitro intenzivno premešali, da se je pelet odlepil iz dna mikrocentrifugirke, 5 minut centrifugirali (4 °C, 12.000 x g) in odpipetirali supernatant. Pri zadnjem spiranju je bilo potrebno odpipetirati maksimalno možno količino supernatanta in nato vzorce posušiti na zraku. Pri tem koraku smo čez mikrocentrifugirke postavili aluminijasto folijo, prebrisano z RNase Zap. Posušenim vzorcem smo dodali 40 µl ultra čiste vode brez RNaz/DNAz (ddH2O) in pomešali s pipetiranjem. Raztapljanje smo pospešili z 10-15 minutno inkubacijo v PCR aparatu pri 55 °C. Na koncu smo v 0,2 ml PCR mikrocentrifugirko odvzeli 2,5 µl vzorca, preostanek vzorcev pa smo shranili pri -20 °C do naslednjega koraka.

Preglednica 3.2: Seznam uporabljenih reagentov za izolacijo RNA.

REAGENTI PROIZVAJALEC

RNase Zap Invitrogen, #AM9782

Ultra čista voda brez RNaz/DNAz Invitrogen, #10977035

Tri RNA isolation Reagent Sigma, # T9424

CHCl3 Merck, # K38200945 751

Izopropanol Merck, # K44166634 305

Absolutni etanol Merck, # K47249283 546

Preglednica 3.3: Seznam uporabljene laboratorijske opreme za izolacijo RNA.

LABORATORIJSKA OPREMA PROIZVAJALEC

Nastavki s filtri TipOne (10 ul, 20 ul, 200 ul, 1000 ul) StarLab Pipete (0,1-1 ul, 20 ul, 200 ul, 1000 ul) Gilson

1,5 ml posamično pakirane mikrocentrifugirke BioPur Eppendorf, #0030 121.589

15 ml centrifugirke TPP, #91014

50 ml centrifugirke TPP, #91050

0,2 ml PCR mikrocentrifugirke Eppendorf, #951010006

Hlajena centrifuga 5418R Eppendorf

Vibracijsko mešalo (vortex) IKA

PCR aparat GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems

3.2.3 Merjenje koncentracije RNA

Vzorce, ki smo jih odvzeli v 0,2 ml mikrocentrifugirke (2,5 µl), smo uporabili za merjenje koncentracije in čistoče RNA. Meritve absorbanc pri valovni dolžini 230, 260 in 280 nm smo izvedli na aparaturi Synergy H4 (preglednica 3.4). Testno ploščico smo najprej očistili s čistimi bombažnimi krpami brez vlaken in ddH2O, nato pa na testna polja nanesli po 2 µl vsakega vzorca. Za slep poskus smo uporabili ddH2O. Iz izmerjenih absorbanc je aparat sam preračunali razmerja A260/A280 in A260/A230, s katerimi smo določili čistočo

(43)

21

vzorcev izoliranih RNA, preko Beer-Lambertovega zakona pa je izračunal še koncentracijo RNA. Beer-Lambertov zakon predstavlja enačba 𝐴260 = 𝑐 ∗ 𝑙 ∗ 𝜀 (c je koncentracija RNA, l je dolžina poti žarka, pri Synergy H4 znaša 0,5 mm, ε je ekstincijski koeficient, za RNA znaša 0,025 (µg/ml)^-1cm^-1) [43, 44].

Preglednica 3.4: Seznam uporabljene laboratorijske opreme za merjenje koncentracije RNA.

Synergy H4 Hybrid Reader Biotek

3.2.4 Razgradnja DNA

Vzorce RNA smo odmrznili in s pomočjo izmerjenih koncentracij pri prejšnjem koraku po enačbi 𝑉 = 𝑚/𝑐 preračunali volumne, ki ustrezajo 3000 ng RNA. V 0,2 ml trak smo najprej dali ustrezno količino ddH2O, nato pa dodali preračunane volumne vzorcev, tako da je skupni volumen znašal 10 µl.

Pripravili smo 64 µl reakcijske mešanice za razgradnjo DNA (preglednica 3.5), kjer smo upoštevali, da imamo 6 vzorcev in pribitek 2,4 %. Predhodno pripravljenim vzorcem v traku smo dodali po 10 µl reakcijske mešanice. Celokupni volumen za inkubacijo je znašal 20 ul.

Preglednica 3.5: Reakcijska mešanica za razgradnjo DNA.

REAGENTI V [µl] ZA 1

VZOREC

V [µl] ZA 6 VZOREV

KONČNI V [µl]

(2,4 % PRIBITEK)

10x pufer 2 12 12,8

DNAza I 1 6 6,4

H2O 7 42 44,8

DNA / / /

skupaj 10 60 64

Sledila je najprej 10 minutna inkubacija pri 30 °C, nato pa še 10 minutna inkubacija pri 75 °C. Vzorce smo za tem postavili nazaj na led.

3.2.5 Obraten prepis RNA v cDNA

Pripravili smo 128 µl reakcijske mešanice za obraten prepis (preglednica 3.6), kjer smo upoštevali, da imamo 6 vzorcev ter pribitek 2,4 %. Vzorcem, tretiranim z DNAzo I, smo dodali po 20 µl reakcijske mešanice. Celokupni volumen za inkubacijo je znašal 40 ul.

(44)

22

Preglednica 3.6: Reakcijska mešanica za obraten prepis.

VZOREC V [µl] ZA 6

VZORCEV KONČNI V [µl]

(2,4 % PRIBITEK)

začetni oligonukleotidi – RnHex 0,25 1,5 1,6

začetni oligonukleotidi – PolyA 0,25 1,5 1,6

10 mM dNTP mešanica 1 6 6,4

5x RT pufer 8 48 51,2

ddH2O 9,5 57 60,8

RT Maxima 1 6 6,4

DNA / / /

skupaj 20 120 128

Ker smo uporabili naključne heksamerne začetne oligonukleotide (RnHex), je sledila 10 minutna inkubacija pri 25 °C in nato 30 minutna inkubacija pri 50 °C. To je omogočilo prileganje začetnih oligonukleotidov in obraten prepis, saj RT Maxima deluje v območju 45-65 °C. Reakcijo smo prekinili s 5 minutno inkubacijo pri 85 °C. Vzorce smo do naslednjega koraka shranili pri -20 °C.

Preglednica 3.7: Seznam uporabljenih reagentov za tretma z DNAzo I in obraten prepis.

REAGENTI PROIZVAJALEC

DNAza I (10000 U, 10 U/µl), 10x pufer Roche, #04 716 728 001 Ultra čista voda brez RNaz/DNAz Invitrogen, #10977035 Maxima H minus first strand cDNA

synthesis kit, 20 x 20 ul reakcij*

Thermo Scientific, #1651

*naredili smo scale-down → 40 x 10 µl reakcij

Preglednica 3.8: Seznam uporabljene laboratorijske opreme za tretma z DNAzo I in obraten prepis.

8-well trakovi s pokrovčki, 120 kom 4titude, #4ti-0792 Nastavki s filtri TipOne (10 ul, 20 ul, 200 ul) StarLab

Pipete (0,1-1 ul, 20 ul, 200 ul) Gilson

1,5 ml posamično pakirane mikrocentrifugirke BioPur Eppendorf, #0030 121.589 PCR aparat GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems

3.2.6 Validacija testov TaqMan

Za analizo izražanja gena CNR1 in CNR2 smo izbrali vnaprej pripravljen test TaqMan.

Referenčna gena HPRT1 in RPLP0 smo izbrali na podlagi predhodno opravljenih

(45)

23

raziskav s tega področja, kjer so bili predhodno določeni kot optimalni geni za normalizacijo izražanja izbranih celičnih linij raka dojke [45].

Po navodilih proizvajalca za vnaprej pripravljene in funkcionalno preverjene mešanice sond in začetnih oligonukleotidov (TaqMan pre-designed GE assay), validacija in s tem izračun učinkovitosti pomnoževanja pri uporabi testov TaqMan nista potrebna. Kljub temu smo se odločili, da validacijo izvedemo tudi sami.

Za validacijo smo pripravili vzorec, v katerem smo zmešali RNA vseh preiskovanih celičnih linij. V mešanici smo želeli imeti 5 µg celokupne RNA, kar pomeni, da smo pri vsakem vzorcu odvzeli tako količino, ki ustreza 833 ng RNA (5000 ng : 6 = 833 ng) (preglednica 3.9). Mešanica RNA za 1 vzorec ima volumen 9,2 µl. Pripravili smo mešanico za dva vzorca.

Preglednica 3.9: Sestava vzorca za validacijo z mešanico 5 µg RNA.

CELIČNA LINIJA V [µL] ZA 1 VZOREC

MCF7 0,9

T-47D 1,8

SK-BR-3 1,6

MDA-MB-231 1,4

MDA-MB-361 2,9

SH-SY5Y 0,7

skupaj 9,2

Pripravljeno mešanico vzorcev smo nato tretirali z DNAzo I po prilagojenem protokolu pod točko 3.2.4 (preglednica 3.10). Reakcijsko mešanico smo zmešali v 0,2 ml mikrocentrifugirko v traku.

Preglednica 3.10: Sestava reakcijske mešanice za tretma z DNAzo I pri validaciji.

REAGENTI V [µl]

10x pufer 4

DNAza I 1

H2O 25,8

mešanica RNA 9,2

skupaj 40

Po inkubaciji smo 10,5 µl reakcijske mešanice prenesli v drugo 0,2 ml mikrocentrifugirko v traku in to uporabili za RT- vzorec, preostanek vzorca v prvotni mikrocentrifugirki pa je služil za RT+ vzorec. RT+ vzorcu smo dodali 9,5 µl reakcijske mešanice za obraten prepis (preglednica 3.11) in 1 µl reverzne transkriptaze Maxima. RT- vzorcu smo dodali

(46)

24

20 µl vode (skupni volumen = 30,5 µl) in 9,5 µl reakcijske mešanice za obraten prepis.

Temu vzorcu nismo dodali reverzne transkriptaze, vendar smo že prej dodali 1 µl vode več. Sledila je inkubacija po protokolu pod točko 3.2.5.

Preglednica 3.11: Sestava reakcijske mešanice za obraten prepis pri validaciji.

REAGENTI V [µl] ZA 1 VZOREC

začetni oligonukleotidi-RnHex 0,25

začetni oligonukleotidi-PolyA 0,25

10 mM dNTP mešanica 1

5x RT pufer 8

RNA /

skupaj 9,5

V namen validacije smo izvedli štirikratne serijske redčitve vzorca RT+. Postopek je potekal tako, da smo v mikrocentrifugirko dali 30 µl ddH2O, dodali 10 µl vzorca, intenzivno premešali in na hitro centrifugirali. Postopek smo ponovili še štirikrat v namen priprave 6 redčitev vzorca za kvantitativni PCR s sledečimi faktorji redčenja: 1, 1/4, 1/16, 1/64, 1/256 in 1/1536.

Po protokolu pod točko 3.2.7 smo nato izvedli kvantitativni PCR. Pripravili smo reakcijske mešanice za vsak test TaqMan, kjer smo upoštevali, da imamo štirikratne serijske redčitve cDNA (6 vzorcev), RT- vzorec in NTC (t.j. negativna kontrola, kjer reakcijski mešanici namesto vzorca dodamo vodo) ter da delo poteka v triplikatih. Po podobnem postopku, kot pri 3.2.7, smo kvantitativni PCR predpripravili na plošči s 96 vdolbinicami in nato v triplikatih razpipetirali v ploščo s 384 vdolbinicami. Na koncu smo izvedli PCR pod enakimi pogoji kot pri 3.2.7.

Sledil je izračun učinkovitosti pomnoževanja. Pri kvantitativnem PCR smo dobili vrednosti pražnih ciklov (CT) za validacijske vzorce. Pražni cikel je cikel, v katerem je fluorescenca, ustvarjena pri reakciji, dovolj velika, da jo lahko zaznamo. Količina fluorescence je premo sorazmerna s količino produkta [46]. Iz pridobljenih podatkov smo narisali graf, ki ima na y osi povprečne CT vrednosti, na x osi pa logaritemske vrednosti redčitev, in dobili premico. Iz enačbe premice smo razbrali njen naklon, ki je potreben za izračun učinkovitosti (E). Učinkovitost smo nato izračunali po enačbi 𝐸 = −1 + 10⁻

1 𝑛𝑎𝑘𝑙𝑜𝑛.

(47)

25

3.2.7 Kvantitativni PCR

Na začetku smo za vsak test TaqMan pripravili 120 µl reakcijske mešanice za kvantitativni PCR (preglednica 3.12), kar ustreza 30 x 5 µl reakcijam (6 vzorcev + NTC, delo v triplikatih + pribitek). V mešanici smo poleg TaqMan GE Assay in ddH2O uporabili TaqMan Fast MasterMix, ki vsebuje uracil-N-glikozilazo (UNG). UNG prepreči prenos produktov PCR v naslednje reakcije, če so se v predhodni reakciji v produkt namesto dT vgrajevali dU. Hidrolizira uracil-glikozidno vez v eno- in dvoverižnih DNA [47]. Pripravljene mešanice smo premešali in na hitro centrifugirali (spin-down). Protokol proizvajalca smo prilagodili tako, da smo uporabili polovično količino testa TaqMan ter celokupen volumen reakcije zmanjšali iz 20 µl na 5 µl.

Preglednica 3.12: Sestava reakcijskih mešanic za kvantitativni PCR brez cDNA.

REAKCIJO

V [µl] ZA 30 REAKCIJ

20x TaqMan pre-designed GE Assay* 0,1 3

2x TaqMan Fast MasterMix 2,5 75

ddH2O 1,4 42

skupaj 4 120

* prilagojena količina testa TaqMan

Reakcijske mešanice smo nato razdelili na ploščo s 96 vdolbinicami po shemi na sliki 3.1 (16 µl mešanice na vdolbinico). Nato smo v vdolbinice napipetirali še po 4 µl ustrezne cDNA.

(48)

26

Slika 3.1: Shema predpriprave kvantitativnega PCR na plošči s 96 vdolbinicami. Po stolpcih so nanesene reakcijske mešanice posameznih TaqMan testov, po vrsticah pa cDNA iz različnih celičnih linij.

Ploščo smo zaprli s folijo, jo premešali s pomočjo vibracijskega mešala, povili z aluminijasto folijo in centrifugirali 2 min na 320 g. Sledilo je razpipetiranje 5 µl reakcijske mešanice s cDNA na vdolbinico v ploščo s 384 vdolbinicami po shemi na sliki 3.2. TaqMan test smo izvedli v triplikatu.

(49)

27

Slika 3.2: Shema kvantitativnega PCR na plošči s 384 vdolbinicami. Vsebino plošče s 96 vdolbinicami smo razpipetirali na ploščo na sliki tako, da smo posamezne vzorce ene vrstice iz plošče s 96 vdolbinicami, v triplikatih nanesli v eno vrstico plošče s 384 vdolbinicami. Tako se v eni vrstici nahajajo kombinacije ene reakcijske mešanice testa TaqMan s cDNA iz vseh celičnih linij, vključno z NTC.

Ploščico smo zaprli z optično aktivno folijo, povili v aluminijasto folijo in centrifugirali 3 minute na 750 g. Ploščico smo nato vstavili v napravo ViiA^TM 7 za PCR v realnem času, nastavili parametre (temperaturni program, MasterMix, volumen vzorcev, postavitev vzorcev, …) in pognali reakcijo. Uporabili smo hitri temperaturni program, ki je prikazan v preglednici 3.13, ter TaqMan Fast MasterMix, ki vsebuje UNG, zato je pred začetkom kvantitativnega PCR potrebna dodatna inkubacija pri 50 °C za 2 minuti [47].

Preglednica 3.13: Hitri temperaturni program za kvantitativni PCR.

TEMPERATURA [°C] ČAS [s]

INKUBACIJA 50 120

DENATURACIJA 95 20

DENATURACIJA 95 1

40 ciklov PRILEGANJE +

PODALJŠEVANJE 60 20