UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA Poučevanje na predmetni stopnji
Miha Lampe
Vpliv obdelave s hladno kisikovo plazmo na glivno združbo semen navadne ajde
Magistrsko delo
Ljubljana, 2020
UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA
Poučevanje na predmetni stopnji
Miha Lampe
Vpliv obdelave s hladno kisikovo plazmo na glivno združbo semen navadne ajde
Magistrsko delo
Mentorica: prof. dr. Katarina Vogel Mikuš
Ljubljana, 2020
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Poučevanje na predmetni stopnji na Pedagoški fakulteti Univerze v Ljubljani. Delo je bilo opravljeno na Katedri za botaniko in fiziologijo rastlin na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani in na Institutu Jožef Štefan, Oddelek za tehnologijo površin in optoelektroniko.
Študijska komisija Oddelka za biologijo je za mentorja magistrskega dela imenovala prof. dr.
Katarino Vogel Mikuš, za recenzentko prof. dr. Marjano Regvar in za predsednico komisije prof. dr. Matejo Germ.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: prof. dr. Mateja Germ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: prof. dr. Marjana Regvar
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: prof. dr. Katarina Vogel Mikuš
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora:
ZAHVALA
Zahvaljujem se celotni Katedri za botaniko in fiziologijo rastlin na Oddelku za biologijo za omogočeno pisanje in izvedbo magistrske naloge. Posebno bi se rad zahvalil svoji mentorici prof. dr. Katarini Vogel Mikuš tako za pomoč pri izbiri zanimive teme in potrpljenje pri mojem delu kakor tudi za nasvete, popravke in podano strokovno znanje. Prav tako bi se rad iz srca zahvalil asistentu Juretu Mravljetu za potrpežljivost in spremljanje mojega laboratorijskega dela pa tudi za številne ure, ki si jih je vzel za popravljanje, komentiranje in pogovore o izbrani temi. Brez njega moje magistrsko delo ne bi bilo tako, kot je.
Zahvalil bi se tudi recenzentki prof. dr. Marjani Regvar in predsednici komisije prof. dr.
Mateji Germ za podane popravke in strokovno znanje ter za predloge izboljšav mag. naloge.
Zahvaljujem se tudi tehnični sodelavki Mileni in dekletom z oddelka fitofiziologije za pomoč pri laboratorijskem delu.
Zahvaljujem se staršem, sestri in Ajdi za spodbudo in razumevanje. Za tehnično podporo se zahvaljujem tudi Anžljcu in Juretu.
I POVZETEK
Navadna ajda (Fagopyrum esculentum) je gospodarsko pomembna poljščina, ki se na globalni ravni uporablja v prehrambni industriji in katere neto globalna proizvodnja znaša skoraj 4 milijone ton. Hladna plazma, ioniziran plin pri sobni temperaturi, se uporablja tako za aktivacijo kot za dekontaminacijo površin različnih materialov. Hladna plazma ima v primerjavi z visokotemperaturno plazmo nižjo temperaturo, kar ji daje potencialno možnost uporabe na bioloških toplotno občutljivih materialih. Zadnja leta so bile metode izpostavitve HP uspešno uporabljene v kmetijstvu in biomedicini za izboljšanje kakovosti kalitve semen in inaktivacijo patogenih mikroorganizmov, ki naseljujejo semena rastlin. Novi pristopi uporabe hladne plazme bi tako lahko zagotavljali donosnejšo in bolj trajnostno pridelavo in predelavo navadne ajde. V naši raziskavi smo preiskovali vpliv hladne plazme na kaljivost in glivne združbe semen. Za generacijo plazme je bil uporabljen induktivno sklopljen (IC) radiofrekvenčni (RF) napajalnik s frekvenco 27.12 MHz. Uporabljen plin je bil kisik (O2) pri tlaku 50 Pa in delovni moči okrog 8kW. Parametri so bili pri vseh obdelavah enaki, spreminjal se je le čas izpostavitve plazmi (0, 15, 30, 45, 60, 90 in 120 sekund). V nasprotju z dognanjem drugih avtorjev smo iz naših rezultatov ugotovili, da obdelava s hladno plazmo ni imela pozitivnega vpliva na kaljivost uporabljenih semen, opazili pa smo, da se je kaljivost poslabšala pri izpostavitvah 90 s in 120 s. Uspešno smo izolirali in identificirali 32 vrst gliv, ki so zrastle na PDA-gojiščih. Najštevilčnejše zastopane vrste so bile: Epicoccum nigrum, Didymella glomerata, Alternaria alternaria in Hannaella sp. Ugotovili smo, da je 120- sekundna izpostavitev hladni plazmi primerljivo uspešno dekontaminirala glive s površine semen kot klasično sterilizirana kontrola (30 % vodikov peroksid H2O2). Kljub temu so nekatere vrste gliv (Hannaella spp.) ostale prisotne tudi po najdaljši časovni obdelavi.
Izpostavitve semen hladni plazmi nad in vključno 120 s, bi lahko dobile pomen npr. kot dekontaminacijsko sredstvo za namene prehranske industrije ali pa za preprečevanje razraščanja gliv na zrnih ajde v skladiščih in silosih za namene nadaljnje predelave.
KLJUČNE BESEDE:
hladna plazma, navadna ajda, glive, kalitev, dekontaminacija
II ABSTRACT
Common buckwheat (Fagopyrum esculentum) is economically important crop used in the food industry worldwide, with a net global production of almost 4 million tons. Cold plasma (ionized gas at room temperature) treatment of materials is widely used for both activation and decontamination of surfaces. Cold plasmas have lower temperatures compared to high- temperature plasmas, which gives them the potential to be used on biological, heat-sensitive materials. In recent years, these methods have been successfully used in agriculture and biomedicine to improve the quality of seed germination and the inactivation of pathogenic microorganisms colonizing plant seeds. New approaches to the use of cold plasma could thus ensure a more profitable and sustainable production and processing of common buckwheat. In our study we investigated the effect of cold plasma on germination and fungal communities of buckwheat seeds. The plasma was generated by an inductively coupled (IC) radio frequency (RF) power supply with a frequency of 27.12 MHz. The gas used was oxygen (O2), at a pressure of 50 Pa and an operating power of about 8 kW. These parameters remained the same at all treatments, only the plasma exposure time was changed (0, 15, 30, 45, 60, 90 and 120 seconds). In contrast to the results of other authors, we found that treatment with cold plasma had no positive effect on the germination of the seeds used, and we observed almost no germination at exposures of 90 s and 120 s. We successfully isolated and identified 32 species of fungi that were grown on PDA media. The most abundant species were: Epicoccum nigrum, Didymella glomerata, Alternaria alternaria and Hannaella sp. We found that 120 s treatment with cold plasma successfully decontaminated most of the fungi from the seed surface and was comparable with a classical sterilized control (30 % H2O2). Nevertheless, some fungal species (Hannaella sp.) remained present even after the longest plasma exposure.
Based on our findings, seed cold plasma treatments with exposures of 120 s and above, could become important as a decontamination agent for the purposes of the food industry or to prevent fungal growth on buckwheat grains in warehouses and silos for further processing.
KEY WORDS:
Nonthermal (cold) plasma, common buckwheat, fungi, germination, decontamination
III KAZALO VSEBINE
1. Uvod ...1
1.1. Namen dela ...1
1.2. Delovne hipoteze ...1
2. Plazemske tehnologije ...2
2.1. Vrste plazme ...3
2.1.1. Hladna plazma...3
3. Navadna ajda (Fagopyrum esculentum Moench) ...4
3.1. Glive, prisotne pri navadni ajdi ...6
4. Vpliv hladne plazme na biološki material ...8
4.1. Vpliv hladne plazme na glivne združbe ... 10
5. Materiali in metode ... 12
5.1. Kemikalije ... 12
5.2. Laboratorijska oprema ... 12
5.3. Obdelava semen navadne ajde ... 12
5.4. Kalitveni testi ... 13
5.5. Test viabilnosti ... 13
5.6. Priprava gojišč ... 14
5.7. Spremljanje rasti glivnih združb ... 14
5.8. Izolacija gliv do čistih kultur ... 14
5.9. Izolacija glivne DNA ... 15
5.9.1. Pomnoževanje izolirane DNA s PCR ... 15
5.9.2. Sekvenciranje ... 16
5.9.3. Identifikacija nukleotidnih zaporedij... 16
5.10. Statistična analiza ... 16
6. Rezultati ... 17
6.1. Kalitveni testi ... 17
6.2. Viabilnost ... 18
6.3. Stopnja rasti glivnih hif ... 19
6.4. Diverziteta glivnih morfotipov... 20
6.5. Molekulska identifikacija izoliranih gliv ... 26
6.5.1. Zastopanost taksonov ... 32
6.5.2. Glivna diverziteta po izpostavitvah ... 34
IV
6.6. Občutljivostni razredi ... 35
7. Diskusija ... 36
7.1. Vplivi plazme na kaljivost in viabilnost semen navadne ajde ... 36
7.2. Stopnja glivne kontaminacije ... 37
7.3. Diverziteta glivnih morfotipov in identifikacija izoliranih gliv ... 38
8. Sklepi ... 42
9. Viri ... 43
10. Priloga 1 ... 47
Kazalo tabel Tabela 1: Seznam uporabljenih kemikalij, reagentov in encimov ter njihovih proizvajalcev ..12
Tabela 2: Viabilnost semen navadne ajde... 19
Tabela 3: Opis glivnih morfotipov izoliranih iz semen navadne ajde, zrastlih na PDA gojišču ... 21
Tabela 4: Najbližji BLAST zadetek izoliranih gliv iz semen navadne ajde, zrastlih na PDA gojišču. Tabela vsebuje oznako morfotipa, ki smo ga določili, oznako agar plošče, na kateri je ta morfotip zrastel, najbližji Blast zadetek in ugotovljeno E-vrednost ter delež ujemanja v %. Izpisana je tudi pristopna številka določene glive ter za katero glivno vrsto oz. rod gre. Glivne vrste oz. rodove smo tudi naprej uvrstili v pripadajoče družine in širšo taksonomsko skupino ... 27
Tabela 5: Indeks biodiverzitete ... 35
Tabela 6: Občutljivostni razredi glivnih vrst ... 35
Kazalo slik Slika 1: Dielektrično barierno razelektritvena plazma (DBD) (vir: https://www.igvp.uni- stuttgart.de/en/research/plasma-technology/sources/barrier/) ...2
Slika 2: Navadna ajda (Fagopyrum esculentum) (vir: http://www.bizeljsko.si/navadna-ajda- fagopyrum-esculentum/ - 2020) ...4
Slika 3: Kaljivost semen navadne ajde – prvi poskus (povprečje ± standardna napaka, n = 100) Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilne razlike med izpostavitvami (p < 0,05, enosmerna ANOVA, Duncanov post – hoc test). K – kontrola; 15s – 15-sekundna izpostavitev plazmi; 30s – 30-sekundna izpostavitev plazmi; 45s – 45-sekundna izpostavitev plazmi; 60s – 60-sekundna izpostavitev plazmi; 90s – 90-sekundna izpostavitev plazmi; 120s – 120-sekundna izpostavitev plazmi ... 17 Slika 4: Kaljivost semen navadne ajde – drugi poskus (povprečje ± standardna napaka, n = 100). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilne razlike med izpostavitvami (p
< 0,05, enosmerna ANOVA, Duncanov post – hoc test). K – kontrola; 15s – 15-sekundna izpostavitev plazmi; 30s – 30-sekundna izpostavitev plazmi; 45s – 45-sekundna izpostavitev
V
plazmi; 60s – 60-sekundna izpostavitev plazmi; 90s – 90-sekundna izpostavitev plazmi; 120s – 120-sekundna izpostavitev plazmi ... 18 Slika 5: Stopnja rasti glivnih hif (skupaj cela in rezana semena) (povprečje ± standardna napaka, n = 10). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilne razlike med izpostavitvami (p < 0,05 enosmerna ANOVA, Duncanov post – hoc test). K – kontrola; 15s – 15-sekundna izpostavitev plazmi; 30s – 30-sekundna izpostavitev plazmi; 45s – 45-sekundna izpostavitev plazmi; 60s – 60-sekundna izpostavitev plazmi; 90s – 90-sekundna izpostavitev plazmi; 120s – 120-sekundna izpostavitev plazmi. KS – sterilizirana kontrola ... 20 Slika 7: Skupno število glivnih morfotipov po izpostavitvah, združeno za cela in rezana semena (n = 10). Oznake: K – kontrola; 15s – 15-sekundna izpostavitev plazmi; 30s – 30- sekundna izpostavitev plazmi; 45s – 45-sekundna izpostavitev plazmi; 60s – 60-sekundna izpostavitev plazmi; 90s – 90-sekundna izpostavitev plazmi; 120s – 120-sekundna izpostavitev plazmi. ... 24 Slika 9: Odstotek izolatov, ki pripada posamezni vrsti gliv ... 32 Slika 12: Graf glivne diverzitete pri različnih izpostavitvah. Oznake: K – kontrola; 15s – 15- sekundna izpostavitev plazmi; 30s – 30-sekundna izpostavitev plazmi; 45s – 45-sekundna izpostavitev plazmi; 60s – 60-sekundna izpostavitev plazmi; 90s – 90-sekundna izpostavitev plazmi; 120s – 120-sekundna izpostavitev plazmi ... 34
1 1. Uvod
Z vse bolj strmo naraščajočim številom prebivalstva na Zemlji, ki naj bi po ocenah FAO do leta 2050 doseglo skoraj 10 milijard, bodo za globalno oskrbo s hrano nujni novi in inovativni pristopi za pridelavo in predelavo hrane. Enega takšnih alternativnih pristopov predstavljajo tehnologije obdelave semen s hladno plazmo, ki so v zadnjem času pritegnile pozornost mnogih svetovnih raziskovalcev z različnih področij, med drugim tudi v kmetijstvu in živilski industriji. Skoraj tretjina svetovne proizvodnje hrane za namene prehrane ljudi je izgubljena ali zapravljena vzdolž prehranske verige, tako na nivoju pridelave, predelave in dobave (Galanakis, 2015 cit. v Misra in sod., 2016). Okolju prijazne strategije, ki ščitijo pridelke ali prehranske proizvode pred propadanjem ali škodljivci, kar pomeni manjše izgube in podaljšanje njihovega roka uporabnosti, so ključne za zagotavljanje globalne preskrbe s hrano (Misra in sod., 2016). Uporaba novih tehnologij, kakršna je obdelava semen s hladno kisikovo plazmo, bi lahko nadomestila uporabo dosedanjih tradicionalnih pristopov, kot je denimo uporaba pesticidov (fungicidov), ki puščajo škodljive kemične ostanke v okolju.
Poleg tega so številni škodljivci razvili odpornost proti pesticidom, kar je povzročilo, da so jih kmetje začeli uporabljati še v večjih količinah, tako v državah v razvoju kakor tudi v razvitih državah. Zato bo v prihodnje bistvenega pomena razvoj novih okolju prijaznih in ekonomičnih tehnologij za nadzor škodljivcev tako pred setvijo semen na polja kot tudi med skladiščenjem zrn po žetvi (Cullen in sod., 2016).
Tehnologija obdelave semen s hladno plazmo za namen sterilizacije je novo in v zadnjem času precej hitro razvijajoče se področje. Izsledki raziskav kažejo, da ima HP lahko zelo učinkovito protimikrobno delovanje, kar predstavlja izhodišče za razvoj novih metod učinkovite in okolju prijazne sterilizacije bioloških materialov (semen, hrane) z minimalnim vplivom na njihovo kakovost in hranilno vrednost (Misra in sod., 2016). Navadna ajda (Fagopyrum esculentum) je ena izmed gospodarsko pomembnih vrst poljščin, katere neto globalna proizvodnja znaša skoraj 4 milijone ton (FAO 2020). Novi pristopi uporabe hladne plazme bi tako lahko zagotavljali donosnejšo in bolj trajnostno pridelavo in predelavo navadne ajde.
1.1. Namen dela
Namen naloge je pokazati in dokazati vpliv hladne kisikove plazme na viabilnost in kaljivost semen navadne ajde ter izolirati, kvantificirati, morfološko karakterizirati in molekulsko identificirati glive iz semen navadne ajde (površinskih in endofitov) pred obdelavo s hladno kisikovo plazmo in po njej.
1.2. Delovne hipoteze
Izpostavitev semen hladni kisikovi plazmi bo vplivala na njihovo viabilnost in kaljivost.
Pri krajših izpostavitvah bosta viabilnost in kaljivost primerljivi ali boljši kot v kontrolni skupini, pri daljših pa bosta kaljivost in viabilnost manjši.
Z daljšanjem časa izpostavitve semen hladni plazmi se bo zmanjševala kontaminacija z glivami (pri višjih dozah bo sterilizacija učinkovitejša).
Z daljšanjem časa izpostavitve se bo zmanjševala vrstna pestrost pridobljenih gliv.
2 2. Plazemske tehnologije
Plazma je delno ioniziran plin. Pogosto jo označujejo kot četrto agregatno stanje snovi, ki ima edinstvene lastnosti (Fridman, 2008). Predstavlja več kot 99 odstotkov vesolja. Sestavljena je iz elektronov, ionov in nevtralnih delcev, ki so tako v osnovnem kot tudi v vzbujenem stanju.
Z makroskopskega vidika je plazma električno nevtralna snov, vendar pa vsebuje proste nosilce naboja in je zato električno prevodna (Tendero in sod., 2006).
Za nastanek plazme se lahko uporabi kateri koli vir energije, ki lahko ionizira plin. Plazmo sestavljajo številni atomi in molekule plinov – v osnovnem ali vzbujenem stanju, ki soobstajajo z ionskimi, radikali in drugimi reaktivnimi zvrstmi, vključno z elektroni ter elektromagnetnimi sevanji (UV fotoni in vidna svetloba) (Misra in sod., 2016). Prosti električni naboji, elektroni in ioni naredijo plazmo električno prevodno in močno odzivno na elektromagnetna polja (Fridman, 2008).
Slika 1: Dielektrično barierno razelektritvena plazma (DBD) (vir: https://www.igvp.uni- stuttgart.de/en/research/plasma-technology/sources/barrier/).
Električno polje prenaša energijo na elektrone v plinu, ki so najbolj mobilna nabita zvrst plazme. Ta elektronska energija se nato s trki prenaša na nevtralne zvrsti. Ti trki sledijo verjetnostnim zakonom in jih lahko razdelimo na:
elastične trke: ne spremenijo notranje energije nevtralne zvrsti, ampak nekoliko dvignejo kinetično energijo;
neelastične trke: ko je elektronska energija dovolj visoka, trki spremenijo elektronsko strukturo nevtralnih zvrsti. Posledica tega je ustvarjanje vzbujenih zvrsti ali pa ionov, če so ti trki dovolj visokoenergijski.
Večina vzbujenih zvrsti ima zelo kratko življenjsko dobo in kmalu preidejo nazaj v osnovno stanje z oddajanjem fotonov. Na drugi strani poznamo »metastabilne zvrsti«, ki so tudi vzbujena stanja, vendar z dolgo življenjsko dobo, ker je njihovo razpadanje zaradi emisije
3
sevanja ovirano, njihov razpad pa lahko poteka le s prenosom energije s trkom (Tendero in sod., 2006). Radikalne zvrsti, ki nastanejo pri trkih elektronov, navadno sprožijo bolj ali manj zapletene verige kemijskih reakcij, kar vodi k večinoma majhnemu številu relativno dolgoživih reaktivnih zvrsti, ki soomogočajo ta proces (Turner, 2016).
2.1. Vrste plazme
Plazme lahko razdelimo na ravnotežno ali visokotemperaturno (angl. thermal plasma) in na ne-ravnotežno ali nizkotemperaturno (angl. non-thermal) plazmo. Če se plin segreje na dovolj visoko temperaturo (običajno do 20.000 K) in visoka temperatura povzroči ionizacijo plina, tako plazmo imenujemo visokotemperaturna plazma. V taki plazmi obstajajo vse sestavine kemičnih zvrsti, elektronov in ionov v termodinamičnem ravnovesju.
Nizkotemperaturna plazma ali hladna plazma (HP) pa je plazma, ki ni v termodinamičnem ravnovesju, ker je temperatura elektronov veliko višja od temperature težkih zvrsti (ionov in nevtronov). Znana nizkotemperaturna plazma je živosrebrni plin znotraj fluorescenčne sijalke, kjer elektronski oblak doseže temperaturo 20.000 K (19.700 °C; 35.500 °F), preostali del plina, ioni in nevtralni atomi pa ostanejo komaj nad sobno temperaturo, tako da se lahko žarnice med delovanjem dotaknemo tudi z roko. Nizkotemperaturno plazmo pa lahko nadalje razdelimo v navidezno ravnotežno plazmo (običajno temperature 100–150 °C) in ne- ravnotežno plazmo (temperature pod 60 °C). V prvem tipu med kemičnimi zvrstmi obstaja lokalno termodinamično ravnovesje, medtem ko je pri drugem hlajenje ionov in nenabitih molekul učinkovitejše od prenosa energije iz elektronov, zato plin ostane pri nizki temperaturi. HP lahko generiramo pri atmosferskem ali znižanem tlaku (v vakuumu) in zahteva manjši vnos energije v primerjavi z visokotemperaturno plazmo. HP se lahko ustvari z razelektritvijo v plinu z uporabo različnih virov.Tipični načini za nastajanje hladne plazme pri atmosferskem tlaku vključujejo koronsko razelektritev (angl. corona discharge), razelektritev z dielektrično zaporo (angl. dielectric barrier discharge oz. DBD), radiofrekvenčno razelektritev in razelektritev z drsnim lokom (angl. gliding arc discharge). V nasprotju pa visokotemperaturne plazme nastajajo pri višjih tlakih in zahtevajo večje vhodne moči (Misra in sod., 2019).
2.1.1. Hladna plazma
Hladne plazme dosežejo v primerjavi z visokotemperaturnimi plazmami nižje temperature. To je posledica tega, da večina dovedene električne energije za ustvarjanje plazme iz izhodnih plinov primarno vzbudi elektrone v začetnem mediju, namesto da se segreva okoliški plin. To pomeni, da temperature elektronov niso v toplotnem ravnovesju s samim okoliškim plinom.
Povišana temperatura in vzbujevalna narava nabitih elektronov in plazemskih molekul sta odgovorni za sprožitev verižnih reakcij, povezanih s tvorbo plazme. Pri mnogih vrstah razelektritev je kinetična temperatura plina sobna temperatura. Nizka temperatura plina se doseže tudi z omejitvijo časa, ki ga plin porabi v procesu elektrifikacije (Ferrell in Galov, 2013).
Osnovni koncept večine hladnih plazem vključuje nastajanje visokoenergijskih elektronov z električnim vzbujanjem, ti elektroni pa nato prenašajo svojo energijo na nevtralne atome plina
4
v procesih, ki ustvarjajo reaktivne kemične zvrsti. Te reaktivne zvrsti so glavnina plazemskega procesa. Visokoenergetski elektroni se zlahka proizvedejo iz dveh razlogov:
prvič, ker so elektroni nabiti in tako nanje deluje električno polje, in drugič, ker je masa elektronov v primerjavi z nevtralnimi molekulami majhna in elektroni ne izgubljajo energije v elastičnih trkih. Posledično se elektroni dokaj enostavno pospešijo do visoke energije (več elektronskih voltov), s katerimi lahko vzbudijo, disociirajo ali ionizirajo nevtralne molekule (Turner, 2016). Za večino aktivnih kemičnih zvrsti plazme je pogosto značilno zelo učinkovito protimikrobno delovanje (Misra in sod., 2016).
Eden izmed najbolj pogostih virov hladne plazme, ki delujejo pri atmosferskem tlaku, je razelektritev z dielektrično zaporo (DBD), kjer plin prehaja med dvema elektrodama, od katerih je vsaj ena prekrita s plastjo dielektričnega materiala. Za takšne vire je značilno, da v njih nastajajo mikrodisperzije ali tokovi razelektritve (Kogelschatz in sod., 1999). Podobne lastnosti imajo tudi koronski reaktorji in površinski reaktorji (Chang, 1993 cit. v Whitehead, 2016). Te naprave poganjajo pulzirajoči ali izmenični viri napajanja, njihovo delovanje pa lahko nadziramo tako s spreminjanjem moči, frekvence ali oblike pulza. Za ustvarjanje razelektritve lahko uporabljamo tudi mikrovalovno in radiofrekvenčno vzbujanje; navadno uporabljamo konfiguracijo brez elektrod (Laroussi in Akan, 2007; Niu in sod., 2013 cit. v Whitehead, 2016). Tudi razelektritve z drsnim lokom (angl. gliding arc discharge) se vse pogosteje uporabljajo za procesiranje plinov, zanje pa je značilna toplejša razelektritev kot pri dielektrični zapori in koroni podobnim sistemom (Fridman in sod., 1999 cit. v Whitehead, 2016).
3. Navadna ajda (Fagopyrum esculentum Moench)
Navadna ajda je enoletna rastlina z rdečkastimi stebli in cvetovi, katerih barva variira od bele do roza. Zaradi svoje hitre rasti se jo goji kot pokrovni posevek (angl. cover crop) in pomaga pri ohranjanju kompaktne strukture tal ter s tem preprečuje erozijo med deževnimi sezonami.
Rastlina je še posebej tolerantna na tla slabe kakovosti, na peščena ali kisla tla (FAO 2020).
Slika 2: Navadna ajda (Fagopyrum esculentum) (vir: http://www.bizeljsko.si/navadna-ajda-fagopyrum- esculentum/ - 2020).
5
Izvirala naj bi iz osrednje in zahodne Kitajske, iz divje azijske vrste Fagropyrum cymosum.
Na Kitajskem jo gojijo že več kot 1000 let, v Evropo pa so jo prinesli v srednjem veku. Škoti so skovali besedo buckwheat (ajda) iz dveh anglosaksonskih izrazov, boc (bukev) in whoet (pšenica). Besedo bukev so uporabljali zato, ker je bil plod rastline podoben žiru. – Ajdo uvrščamo med psevdožita. Skupna površina gojene ajde na svetu znaša približno 5 milijonov hektarjev. Glavne države proizvajalke so: Rusija, Kitajska, Brazilija, Poljska, Francija, Japonska, Združene države Amerike, Južna Afrika in Avstralija. Države bivše Sovjetske zveze (54 odstotkov) in Kitajska (38 odstotkov) predstavljajo največji odstotek njene svetovne proizvodnje (Alberta's agricultural industry, 2001).
Po vsem svetu se uporabljata dve vrsti ajde: navadna ajda (Fagopyrum esculentum) in tatarska ajda (Fagopyrum tataricum). Katera od njiju je uporabljena pogosteje, je odvisno predvsem od regije gojenja. V Evropi, ZDA, Kanadi, Braziliji, Južni Afriki in Avstraliji na splošno pogosteje gojijo navadno ajdo. Enako velja za večino azijskih držav, kjer gojijo ajdo, na primer za Japonsko, Korejo ter osrednji in severni del Kitajske. Tatarsko ajdo pa gojijo in uporabljajo v gorskih regijah jugozahodne Kitajske (Sečuan) (Lin, Tao in Li, 1992). V severni Indiji, Butanu in Nepalu sta znani obe vrsti, le da tatarsko ajdo gojijo v bolj ostrih podnebnih razmerah (Bonafaccia in sod., 2003). V Evropi se ajda goji že stoletja in je danes poleg pire ena od najpomembnejših alternativnih kulturnih rastlin, primernih za ekološko pridelavo brez uporabe umetnih gnojil ali pesticidov (Bonafaccia in sod., 2000). Dolga leta je gojenje ajde upadalo, vendar pa je v zadnjem času zanimanje za staro oz. tradicionalno hrano in s tem ponovno uvajanje značilnih regionalnih izdelkov privedlo do ponovne oživitve njenega gojenja (Bonafaccia in sod., 2003).
Preveč gnojil, zlasti dušikovih, zmanjšuje njen donos. V vročem podnebju jo lahko gojimo le s setvijo pozno v sezoni, tako da nato cveti v hladnejšem vremenu. Prisotnost naravnih opraševalcev močno poveča njen pridelek. Nektar iz ajdovega cveta daje medu temno obarvanost (Fang in sod., 2018).
Plod je rožka, podobna sončničnemu semenu, z enim semenom znotraj trde zunanje lupine.
Škrobnat endosperm je bel in tvori večino ali celoto ajdove moke. Ovoj semena je zelene ali rjave barve in potemni ajdovo moko. Temna moka je v francoščini znana kot blé noir (črna pšenica), skupaj z imenom sarrasin (saracen). Zrno lahko pripravimo s preprostim odstranjevanjem lupine, mletjem v zdrob, v polnozrnato ali v belo moko. Zrno ajde lahko za posebne namene tudi ločimo v škrob, kalčke in ovoj (Taylor in sod., 2010).
Za navadno ajdo so značilne zanimive prehranske lastnosti, kot so prisotnost proteinov z visoko biološko vsebnostjo naravnih antioksidantov, mineralov, vitaminov (zlasti tistih iz skupine B) in prehranskih vlaknin (Alamprese in sod., 2007). Proteini iz navadne ajde lahko preprečujejo tvorjenje žolčnih kamnov, lahko pa tudi zavirajo nastanek raka na dojkah preko znižanja ravni serumskega estradiola. Prav tako zavirajo rakotvornost na debelem črevesju z zmanjšanjem proliferacije celic (Tomotake in sod., 2000; Liu in sod., 2001). Poleg tega so semena pomemben prehranski vir cinka, bakra in mangana ter se lahko uporabljajo kot dodatek za izboljšanje kakovosti kruha ali drugih izdelkov (Stibilj in sod., 2004; Fang in sod., 2018). Ker ajda ne vsebuje glutena, jo lahko jedo tudi ljudje z motnjami v presnovi glutena, kot so denimo celiakija, občutljivost na gluten ali dermatitis herpetiformis (Ciacci in sod., 2015).
6
Navadna ajda je rastlina z več možnostmi uporabe. Mladi poganjki se lahko jedo kot listnata zelenjava, zeleni listi se lahko uporabljajo v medicinske namene, saj pospešujejo cirkulacijo, zrna pa se uporabljajo za pripravo ajdove moke za prehrano ljudi pa tudi za krmo živine (FAO 2020). Ajda se včasih uporablja tudi kot zeleni gnoj (angl. green manure), kot rastlina za preprečevanje erozije tal (pričvrščevanje prsti) in za krmljenje živali (Valenzuela in Smith, 2002).
3.1. Glive, prisotne pri navadni ajdi
Ajdo lahko okuži več kot 30 različnih vrst gliv, ki pripadajo 22 različnim rodom (Milevoj, 1989), med njimi različne plesni, glive listne pegavosti, uvelosti, trohnobe, ožigi, sneti, rje idr.
Glive lahko okužijo ajdo od semena do žetve, najpogosteje pa so okuženi listi rastlin.
Patogene glive v prsti povzročijo gnilobo kalečih semen, odmiranje kalic, trohnobo korenin in stebel. Nekatere glive povzročijo pegavost listov z različnimi oblikami in barvami peg, okuženi listi se posušijo in odpadejo (Milevoj, 1989).
V različnih presejalnih študijah so poročali, da semena ajde lahko naseljuje do 36 različnih glivnih vrst, vključno z rodovi Alternaria, Fusarium, Botrytis in Cladosporium (Kalinova in sod., 2004; Mills in Wallace, 1972; Singh in sod., 1984 cit. v Kovačec, 2016). Mnoge glive kot denimo Alternaria spp., Botrytis spp. in Fusarium spp. lahko sintetizirajo mikotoksine, ki so genotoksični in lahko pri človeku povzročijo obolenje krvnih celic in/ali so povezani z rakom požiralnika (Logrieco in sod., 2009; Miller, 1995; Soriano in Dragacci, 2004 cit. v Kovačec, 2016). Poleg proizvodnje teh toksinov in zunajceličnih encimov lahko glive zavirajo kalitev semen, poškodujejo celične membrane in povečajo iztekanje celičnih vsebin iz semen, s čimer se zmanjša kakovost skladiščenih semen in s tem poveča negativni vpliv teh gliv na pridelavo rastlin (Halloin, 1983 cit. v Kovačec, 2016).
Med endofitnimi glivami naj bi bile v ajdi pogosto prisotne Alternaria alternata, Fusarium oxysporum in Botrytis cinerea (Kalinova in sod., 2004; Mills in Wallace, 1972; Singh in sod., 1984; Zimmer, 1974; cit. v Kovačec, 2016), katerih prisotnost so potrdili tudi v semenih ajde v raziskavi Kovačec in sod. (2016). Ta raziskava je bila tudi prva, ki je dokazala prisotnost gliv Aureobasidium pullulans, Epicoccum nigrum in Stereum hirsutum bodisi v semenih bodisi v rastlini ajde. Obe glivi, E. nigrum in A. pullulans, sta kozmopolitski glivi, kar pomeni, da sta prisotni vsepovsod in pogosto kolonizirata semena različnih vrst žit (Flannigan, 1970; Kurowski in sod., 2012 cit. v Kovačec, 2016). Obsežna tkiva pod luščino semena tako navadne kot tudi tatarske ajde, namreč predstavljajo primerno okolje za glivno kolonizacijo, kar poveča potencial teh semen za prenos gliv med generacijami (Pongrac in sod., 2011, 2013, cit. v Kovačec, 2016).
Ob žetvi so bile prevladujoče glive izolirane iz semen obeh vrst ajd Alternaria sp., Botrytis sp.
in Epicoccum sp. (Kovačec, 2016). V drugih raziskavah so bile dominantne glive iz pripadajoče mikoflore semen ajde iz rodov Alternaria, Botrytis in Cladosporium, katerim je sledil rod Epicoccum, ter manj vrst iz rodov Fusarium, Gonatobotrys in Cephalosporium. A.
alternata je bila tudi dominantna gliva, izolirana iz nekaterih drugih semen, npr. ječmena, sirka, soje, riža in pšenice (Broggi in sod., 2007; Mills in Wallace, 1972; cit. v Kovačec, 2016), kar nakazuje na njeno uspešno širjenje na poljih ne glede na rastlinskega gostitelja, ki raste v monokulturi (Kovačec, 2016).
7
8 4. Vpliv hladne plazme na biološki material
Obdelava materialov s plazmo se uporablja tako za aktivacijo kot za dekontaminacijo površin.
Zadnja leta so bile te metode uspešno uporabljene v kmetijstvu in biomedicini za izboljšanje kakovosti semen in inaktivacijo patogenih mikroorganizmov. Glavne prednosti teh plazemskih tehnik v primerjavi s tradicionalnimi metodami, ki se uporabljajo za sterilizacijo in pred obdelavo semen (kot sta denimo termična in kemična obdelava ali izpostavitev ionizirajočemu sevanju), sta hitrejša obdelava, nizka temperatura, ki omogočata obdelavo toplotno občutljivih materialov (kakršni so biološki materiali), kar pomeni uporabnost za široko paleto različnih objektov, prav tako pa se izognemo nastanku možnih toksičnih stranskih produktov (Filatova in sod., 2009).
Učinkovitost dekontaminacije s tehnologijo HP je odvisna od različnih spremenljivk v procesu, vključno z vhodno močjo (napetost in frekvenca), časom obdelave, vrsto plina, pretokom in načinom izpostavljenosti. Večja frekvenca in vhodna napetost sta bili povezani z večjo učinkovitostjo inaktivacije mikroorganizmov s HP (Dasan, Mutlu & Boyaci, 2016;
Deng in sod., 2007; Liu, Hong, Guo, Zhang & Shi, 2013; Lu, Patil, Keener, Cullen & Bourke, 2014; Yun in sod., 2010 v Liao in sod., 2017). Deng in sod. (2007) (v Liao in sod., 2017) so ugotovili, da je bila večja učinkovitost dekontaminacije bakterije Escherichia coli na površini neolupljenih mandljev, obdelanih z DBD plazmo, dosežena z višjo napetostjo in frekvenco. V poskusu so ugotovili, da se je pod konstantno frekvenco in časom obdelave z DBD plazmo izhodne napetosti 20 kV in 25 kV zmanjšala kontaminacija za približno 2,43 log enote oziroma 4,12 log enote, medtem ko je obdelava s 16 kV povzročila le zmanjšanje rasti bakterij za 1,0 log enote, nakar so sklepali, da izpostavitev DBD plazmi z večjo izhodno napetostjo privede do boljše dekontaminacije bakterije Escherichia coli. Okoljski dejavniki, kot so pH, prehranska matrika (hranilne in nehranilne sestavine živil in njihove molekularne povezave, torej kemijske vezi med njimi ipd.) in relativna vlažnost, pomembno vplivajo na učinkovitost sterilizacije s HP (Liao in sod., 2017).
Da bi se lahko ta nova tehnologija uspešno in široko uporabljala v praksi, je ključna jasna razlaga njenih mehanizmov za inaktivacijo mikroorganizmov. Do danes so številne raziskave odkrile, da je HP lahko zelo učinkovita za inaktivacijo različnih mikroorganizmov (Boudam in sod., 2006; Deng in sod., 2007; Laroussi in Leipold, 2004; Lassen, Nordby & Grun, 2005;
Selcuk idr. 2008; van Gils, Hofmann, Boekema, Brandenburg, & Bruggeman, 2013; Yu, Huang, Hsieh, Huff & Duan, 2006). Kljub temu je poznavanje mehanizmov, na katerih temelji inaktivacija mikroorganizmov s pomočjo HP, še vedno precej pomanjkljivo, podatki pa neenotni in nedosledni zaradi zapletenih plazemskih procesov in različnih mikrobnih sistemov. Glede na raziskave lahko glavne mehanizme delovanja HP na mikroorganizme razdelimo na biološke in fizikalne (Liao in sod., 2017):
Mehanizmi delovanja HP (Liao in sod., 2017):
1. Biološki mehanizmi
a. Poškodovanje DNA z UV-sevanjem: V prvotnih raziskavah naj bi bila poškodba DNA neposredno povzročena zaradi sevanja plazme (UV-svetloba kot mehanizem za inaktivacijo mikrobov). Vendar so pozneje ugotovili, da
9
dosežene doze UV sevanja plazme niso dosegale minimalnih vrednosti za njeno protimikrobno delovanje (Liao in sod., 2017).
b. Lipidna peroksidacija: Možni mehanizmi uničenja bakterij s HP so oksidativne poškodbe membran ali znotrajceličnih komponent (npr. DNA, proteinov, ogljikovih hidratov itd.). Med prizadetimi komponentami, zlasti membranskimi lipidi, so izpostavljene predvsem polinenasičene maščobne kisline zaradi njihove lokacije v bližini celične površine in njihove občutljivosti na reaktivne kisikove zvrsti (ROS) (Alkawareek, Gorman, Graham & Gilmore, 2014; Joshi idr., 2011; Montie, Kelly-Wintenberg in Roth, 2000 cit. v Liao in sod., 2017).
c. Spremembe proteinov: Venezia in sod. (2008) so ugotovili, da so proteini, ki so bili neposredno izpostavljeni plazmi, pokazali spremembe v svojih elektroforetskih profilih. Ugotovili so tudi, da so se proteini na celični površini po izpostavljenosti plazmi spremenili, saj se bakteriofagi niso uspeli pritrditi na svoj specifični receptor (protein), ki leži na površini celic.
d. Indukcija apoptoze: Reaktivne kisikove spojine (ROS) igrajo pomembno vlogo v različnih celičnih metabolnih poteh kot signalne molekule. Znano je, da ROS lahko povzročijo znotrajcelični oksidativni stres in programirano celično smrt (PCD) (Ahn in sod., 2011; Dwyer, Camacho, Kohanski, Callura & Collins, 2012; Temkin & Karin, 2007).
2. Fizikalni mehanizmi
a. Elektrostatska motnja: Predvideva se, da elektrostatske sile, ki nastanejo s premikanjem nabitih delcev, ki se generirajo v plazmi, povzročijo razpad celičnih membran, čemur sledi celična smrt (Lunov in sod., 2015 v Liao in sod., 2017). Mendis in sod. (2000) so pojasnili, da bi morali elektrostatski odboji, ki nastanejo z bombardiranjem nabitih delcev na površini celic, preseči natezno trdnost celičnih membran, kar bi posledično pomenilo celično smrt (Liao in sod., 2017).
b. Elektroporacija: Predvsem zaradi električnega polja, ki se generira v plazmi v direktnem načinu, je mehanizem HP lahko podoben mehanizmu pulzirajočega električnega polja (PEF). V indirektnem (posrednem) načinu se namreč vzorci, ki jih obdelujemo, običajno nahajajo daleč od območja ustvarjanja plazme, ki je tudi oddaljeno od ustvarjenega električnega polja. Zato šibka jakost električnega polja skorajda nima protimikrobnega učinka. Nasprotno pa se v direktnem načinu zagotavlja dovolj močno električno polje, da lahko to učinkuje na mikrobe. Elektroporacija je najbolj sprejet mehanizem delovanja PEF in pomeni tvorbo por v celičnih membranah, kar vodi do uhajanja vsebine celic in dokončne smrti celic (Sale & Hamilton, 1967; Zimmerma, Pilwat &
Riemann, 1974 cit. v Liao in sod., 2017).
Protimikrobni mehanizmi HP so še vedno nejasni, kar ovira večji razvoj in širšo uporabo plazme za različne namene. Zato so potrebne sistematične in celovite raziskave vpliva HP na mikroorganizme. Poleg tega ima tehnologija HP svoje pomanjkljivosti, kot so razmeroma
10
kratka delovna razdalja in slabo prodiranje (penetracija) skozi snovi itd. Optimizacija same zasnove naprav, delovnih pogojev in parametrov je tako ključnega pomena za učinkovito uporabo HP v praksi (Liao in sod., 2017).
4.1. Vpliv hladne plazme na glivne združbe
Glive so evkariontski mikroorganizmi, ki so lahko enocelični ali kompleksni, večcelični. So heterotrofni organizmi, ki lahko živijo saprofitsko, parazitsko ali simbiontsko. Njihove celice so za razliko od rastlin brez plastidov in klorofila. V prehransko verigo vstopajo večinoma s kmetijskih površin (tla, okužena semena), vode ali preko spor v zraku. Tri glavne podskupine gliv so: večcelične nitaste plesni; makroskopske nitaste glive, pri katerih se trosovnik imenuje
»goba«; in enocelične mikroskopske glive – kvasovke. Strukturno so plesni sestavljene iz drobnih niti, imenovanih hife. Rastoče hife se pogosto razraščajo, kar ima za posledico dolge razvejane nitke, ki se prepletajo in tvorijo mrežo niti, imenovano micelij. Kadar glive okužijo živila, sprostijo encime iz konic hif, da lahko organsko snov razgradijo v manjše molekule, ki jih potrebujejo za svojo rast. Včasih hife rastejo v zrak in se na njih oblikujejo posebne reproduktivne in razmnoževalne strukture, imenovane spore. Spore imajo večplastno celično steno, ki jih ščiti pred neugodnimi okoljskimi razmerami, na primer pred izsušitvijo in visokimi temperaturami (Misra in sod., 2019).
Hayashi in sod. (2014) poročajo o inaktivaciji gliv Aspergillus oryzae in Penicillium digitatum s HP, pri čemer naj bi imel pomembno vlogo predvsem atomarni kisik (O).
Ugotovljeno je bilo, da delovanje kisika povzroči upad števila glivnih celic (preživijo, vendar jih je premalo, da bi jih lahko gojili naprej), spore nastalih hif pa se zdijo nagubane (Misra in sod., 2019). Suhem in sod. (2013) so poročali o rezultatih s svetlobnim mikroskopom narejene študije celic Aspergillus flavus, obdelanih z radiofrekvenčno plazmo. Opazili so, da so se po izpostavljenosti plazmi konidioforji in vezikli pretrgali, kar je povzročilo puščanje celic in smrt. Avramidis in sod. (2010) so uporabljali atmosfersko plazmo (DBD) za tretiranje gliv Ascochyta pinodella in Fusarium culmorum. S pomočjo svetlobne mikroskopije so opazili, da so po plazemski obdelavi poškodovane celične stene in strukture celičnih membran, kar je povzročilo puščanje citoplazme. Te spremembe so postale vidne šele po 60-sekundni izpostavitvi, po 180 s pa so bile celice povsem sploščene. Lee in sod. (2015) so s pomočjo vrstičnega elektronskega mikroskopa (SEM) opazili, da je izpostavitev atmosferski plazmi povzročila precejšnje morfološke spremembe v glivnih sporah vrste Cordyceps bassiana, in sicer pretrganje in spremembo morfologije celic. Opazovanja Dasana in sod. (2017) s SEM so prav tako pokazala, da spore A. parasiticus izgubijo svojo obliko po obdelavi s plazmo (30- sekundna izpostavitev plazmi), celična vsebina pa se razprši v grozdne skupke. Na podlagi teh opažanj je mogoče sklepati, da obdelava s plazmo povzroči uničenje celične stene, zaradi česar le-ta postane prepustna in omogoči izhajanje znotrajceličnih komponent. S krožnimi dikroizmi (CD) in fluorescentnimi študijami glivnih spor so delno tudi potrdili, da spektralni vrh, ki ustreza proteinu celične stene, razpade po obdelavi s plazmo (Misra in sod., 2019).
Opaženo je bilo tudi, da izpostavljenost plazmi povzroči uničenje DNA v glivnih sporah, kar je bilo potrjeno z zmanjšanjem spektralnega podpisa CD in izgubo intenzitete pasu po gelski elektroforezi (Lee in sod., 2015). Omeniti velja, da je obseg morfoloških sprememb spor
11
odvisen od dolžine izpostavljenosti plazmi. Panngom in sod. (2014) so na primer poročali, da z elektronskim mikroskopom niso opazili bistvenih sprememb v morfologiji spor Fusarium oxysporum, obdelanih s plazmo, čeprav se je stopnja delitve celic zmanjšala, celice pa so prešle v apoptozo. To je najverjetneje posledica uporabe argonske plazme, ki ima razmeroma nizko protimikrobno aktivnost. Tudi kadar gostota aktivnih zvrsti v plazmi ni dovolj visoka, da bi ta povzročila uničenje struktur spor, bi lahko celice zaradi začetnih procesov apoptoze doživele fiziološke spremembe, kar bi povzročilo povečano kopičenje lipidnih teles (Panngom in sod., 2014 v Misra in sod., 2019).
Inaktivacija gliv se običajno zgodi zaradi enega ali več sledečih učinkov na celice (Hashizume in sod., 2013, 2014, 2015; Iseki in sod., 2011; Ishikawa in sod., 2012):
poškodbe celične membrane: kratek čas izpostavitve plazmi (približno 30 s) je povzročil motnje v delovanju celične membrane, nadaljnja izpostavljenost pa popolno inaktivacijo;
morfološke spremembe, ki lahko vključujejo izrazite spremembe celične membrane in povečanje njene prepustnosti (Cerioni, Volentini, Prado, Rapisarda, & Rodriguez- Montelongo, 2010; Dasan, Mutlu & Boyaci, 2016; Kang in sod., 2014);
pri majhnih dozah plazme bi lahko glivne celice šle v proces apoptoze (Hashizume in sod., 2015);
drastična morfološka sprememba celičnih struktur ni nujna za inaktivacijo gliv, vendar so potem očitne znotrajcelične nanostrukturne spremembe;
ROS iz plazme povzročijo oksidacijo znotrajceličnih komponent, še posebej fosfolipidi oksidirajo z ROS skozi verižno reakcijo v peroksidirane lipide. V poznejših fazah lahko pride tudi do oksidacije DND (death end protein 1) in drugih celičnih proteinov (Kang in sod., 2014; Lu, Liu, Song, Zhou & Niu, 2014; Panngom in sod., 2014).
Zračna plazma je mešanica plinov, ki so v zraku (N2, O2, CO2 idr.). V njej imajo največjo protimikrobno učinkovitost ROS in RNS (reaktivne dušikove spojine). Vloge in prispevki RNS in UV-sevanja v hladni plazmi ostajajo manj raziskani, če upoštevamo težave pri ločevanju učinkov ROS in RNS. Za glive se predvideva, da jim zaščitni pigment melanin v plasteh celične stene daje odpornost na zunanje vplive okolja vključno z UV-sevanjem (Eisenman & Casadevall, 2012), vendar pa bi bilo za to treba opraviti še nadaljnje raziskave, da bi razumeli interakcije glivnega melanina z UV-sevanjem in RNS, ki se generirajo v plazmi (Misra in sod., 2019).
Kordas in sod. (2015) so dokazali, da se s podaljševanjem časa izpostavitve plazmi zmanjša število glivnih kolonij na semenih zimske pšenice. Prav tako pa so ugotovili, da je optimalni čas izpostavitve zimske pšenice plazmi 10 sekund (pri napetosti 8 kV). Uporaba hladne plazme namesto kemičnih sredstev je po njihovem mnenju smiselna in učinkovita. Metoda se tako lahko uporablja tudi kot metoda dekontaminacije semen pred shranjevanjem (Kordas in sod., 2015).
12 5. Materiali in metode
5.1. Kemikalije
Tabela 1: Seznam uporabljenih kemikalij, reagentov in encimov ter njihovih proizvajalcev
Kemikalija/reagent/encim Proizvajalec
10-kratni PCR pufer Thermo Scientific
Agaroza (SeaKem® LE Agarose) Lonza
Etanol (96 %) Stella Tech
Etidijev bromid Sigma
H2O2 (30 %) Sigma
Kloramfenikol Sigma
Komplet za izolacijo DNA (GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit) Sigma-Aldrich
Nukleotidi dNTP mix Thermo Scientific
PDA (potato dextrose agar) Biolife
Polimeraza Taq (Taq DNA Polymerase) Thermo Scientific
Trifenil tetrazolijev klorid Sigma-Aldrich
Velikostni standard (Gene Ruler™ 1 kb DNA Ladder) Fermentas
Začetni oligonukleotid ITS1-F Sigma-Aldrich
Začetni oligonukleotid ITS4 Sigma-Aldrich
5.2. Laboratorijska oprema
Centrifuga (Sigma 3K30)
PCR stroj »PTC-150 MiniCycler« (MJ Research, Biorad)
Sistem za elektroforezo (IEC 1010-1, Amersham pharmacia)
UV transluminator s kamero (UVtech)
Digestorij
Laminarij
Plastične petrijevke
Filter papir
Spatule
Bunsenov gorilnik
Tekoči dušik (N2)
Terilnice s pestili
Erlenmajerice
5.3. Obdelava semen navadne ajde
Semena so nam za namen raziskave obdelali s hladno plazmo na Institutu Jožef Stefan (IJS).
Uporabljen plin je bil kisik (O2) pri tlaku 50 Pa in delovni moči okrog 8 kW. Parametri so bili pri vseh obdelavah enaki, spreminjal se je le čas izpostavitve plazmi (0, 15, 30, 45, 60, 90 in 120 sekund). Čas izpostavitve 0 sekund je predstavljal kontrolno skupino poskusa. Za generacijo plazme je bil uporabljen induktivno sklopljen (IC) radiofrekvenčni (RF) napajalnik s frekvenco 27.12 MHz. Vzorce (semena ajde) smo za obdelavo položili na aluminijast
13
pladenj. S plazmo smo obdelali večje število – približno 180 – semen in jih razvrstili v sterilne vrečke, ki so bile primerno označene (0=(K), 15, 30, 45, 60, 90 in 120 sekund).
5.4. Kalitveni testi
S kalitvenimi testi ugotavljamo, kolikšno število semen bo vzklilo v določenih razmerah ter kako bodo te vplivale na njihov nadaljnji razvoj. Načrtujemo jih tako, da je ponovljivost čim večja. Običajno semena posadimo v pesek, prst ali pa položimo na filtrirni papir (Aswathaiah in sod., 1993 v Grašič, 2015). Vzgojimo jih lahko tudi na agarju ali hidroponsko (Zhang in sod., 2011 v Grašič, 2015). Izbor gojišča je odvisen od vrste semen, ki jih bomo uporabili. Pri samem izboru moramo biti pozorni tudi na to, da imajo različni tipi gojišč različno kapaciteto zadrževanja vode. Ta določa, v kakšnih količinah ter kako pogosto je med poskusom treba dodajati vodo (Karrfalt, 2008 cit. v Grašič, 2015). Kalitvene teste običajno pripravimo v petrijevkah. Za našo raziskavo smo izbrali kalitvene teste na filtrirnem papirju. Prednosti kalitvenih testov na filtrirnem papirju so predvsem preprostejša in hitrejša priprava (Rao in sod., 2006 v Grašič, 2015) ter manjša verjetnost pojavljanja okužb. V naši raziskavi smo kalitvene teste opravili tako, da smo v plastično petrijevko na dnu postavili filtrirni papir in nato nanj položili po 20 semen določene obdelave, nato pa smo enako ponovili še v štirih drugih petrijevkah, kar nam je skupno prineslo pet ponovitev (100 semen iz iste obdelave, ki so bila uporabljena v kalitvenih testih). Tako pripravljene petrijevke smo dobro navlažili z destilirano vodo. Kalitveni testi so potekali v rastnih komorah skupine za fiziologijo rastlin na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete v Ljubljani. Rastni pogoji so bili konstantna temperatura 23 C in približno 70–80 % relativna zračna vlažnost, semena smo kalili v temi.
Poskus je potekal teden dni. Število skaljenih semen smo prešteli prvi, drugi, tretji, četrti in sedmi dan poskusa ter si podatke zapisali. Kot skaljeno seme smo upoštevali tista semena, pri katerih je skozi semensko lupino prodrla radikula (koreninica).
5.5. Test viabilnosti
Test viabilnosti smo opravili z uporabo tetrazolijevega klorida, pri čemer smo določili odstotek viabilnih oz. potencialno kaljivih semen. Tetrazolijev test temelji na obarvanju semenskih tkiv z dehidrogenazno aktivnostjo. Dehidrogenaze sodelujejo v procesu dihanja, pri čemer se založne snovi v semenu ob prisotnosti kisika pretvarjajo v energijo, CO2 in vodo.
Ob reakciji dehidrogenaz s substratom se sproščajo vodikovi ioni, ki reducirajo trifenil tetrazolijev klorid (TTC), pri čemer nastane v vodi netopen rdeče obarvan formazan (cit. v Likar 2012). Biološka redukcija tetrazolijevih derivatov s celičnimi redoks sistemi se tudi sicer uporablja za merjenje sposobnosti preživetja številnih rastlinskih tkiv, vključno s semeni zamrznjenimi tkivi, toplotno obdelanimi listi in cvetnim prahom (Duncan & Widholm, 2004).
Naš test smo opravili tako, da smo na petrijevko postavili 25 semen iste obdelave, predhodno razrezanih na polovico (da smo celice kalčka čim bolj izpostavili kontaktu z raztopino TTC), v dveh paralelkah za vsako obdelavo. Nato smo jih zalili z raztopino TTC, počakali 24 ur, zatem pa prešteli obarvane kalčke v semenih v rdečeroza barvi, kar pomeni, da tam še vedno poteka celično dihanje in je posledično seme oz. kalček živ.
14 5.6. Priprava gojišč
V steklenico s širokim vratom smo zatehtali po 15 g gojišča PDA (krompirjev dekstrozni agar) in 35 mg antibiotika kloramfenikola. Nato smo do oznake 700 mL dolili destilirano vodo, dobro premešali in avtoklavirali. Gojišča smo nalili v označene plastične petrijevke (približno do polovice) in pustili v laminariju pod UV-lučjo, da se ohladijo. Tako pripravljena gojišča smo uporabili za nadaljnje poskuse.
Skupno smo za posamezno izpostavitev uporabili 10 plošč. Na sredino prvih petih plošč smo sterilno, v laminariju ob ognju, položili po eno celo seme, na sredino drugih petih plošč pa po eno polovico razrezanega semena, drugo polovico razrezanega semena smo zavrgli. Semena smo razrezali z namenom preučevanja endofitnih glivnih združb, ki se bodo potencialno razrastle in so prisotne v notranjosti semen. Ocenjevali smo torej tudi vpliv HP na glivne združbe, ki se nahajajo v notranjosti semen, zato smo semena razrezali na polovico ter tako omogočili razrast glivnih vrst v notranjosti semena.
Plošče smo nato ovili s folijo za živila in s tem preprečili morebitne naknadne okužbe oz.
kontaminacije plošč iz okolja ter izsuševanje gojišča. Tako pripravljena gojišča s semeni smo inkubirali v rastnih komorah v temi pri konstantni temperaturi 23 °C in 70–80 % relativni zračni vlažnosti en teden.
5.7. Spremljanje rasti glivnih združb
Plošče smo četrti in sedmi dan pregledali in jih poslikali. Opažanja rasti gliv smo zabeležili s številkami od 0 do 7 (kar predstavlja približno oceno premera glivne rasti, saj so bile uporabljene petrijevke velikosti 7 cm).
0 = rasti ni oz. je ni zaznati (0 % površine) 1 = rast do 1 cm (= ≤ 15 % površine) 2 = rast do 2 cm (= ≤ 30 % površine) 3 = rast do 3 cm (= ≤ 45 % površine) 4 = rast do 4 cm (= ≤ 55 % površine) 5 = rast do 5 cm (= ≤ 70 % površine) 6 = rast do 6 cm (= ≤ 90 % površine) 7 = rast do 7 cm (= > 90 % površine)
5.8. Izolacija gliv do čistih kultur
Plošče z glivami smo razporedili po pultu in združili tiste, na katerih so rastle na videz podobne glive, čemur pravimo »morfotipizacija« (razvrščanje gliv na osnovi morfoloških tipov – morfotipov). Za nadaljnjo izolacijo posameznih morfotipov smo izbrali po najmanj dve plošči z glivami istega morfotipa (v kolikor sta bila prisotna vsaj 2 enaka morfotipa), ki smo jih označili z enako črko abecede. Za zagotavljanje čistih kultur gliv smo nato vse glive še vsaj enkrat precepili do čistih kultur ter jih tako ločili med seboj, če je na enem gojišču zraslo več tipov gliv. Precepljanje je potekalo tako, da smo s spatulo izrezali približno 0,5 cm
15
x 0,5 cm velik košček gojišča s posamezno glivo (ob robu, kjer je bila gliva najmlajša) in jo prenesli na novo ploščo. Označene plošče smo nato spet ovili s folijo za živila in jih inkubirali v rastni komori pri zgoraj opisanih pogojih vsaj en teden.
5.9. Izolacija glivne DNA
Čiste glivne kulture smo nato postrgali iz agarnih plošč in jih strli v terilnicah s pomočjo tekočega dušika ter tako pripravljen glivni material shranili v mikrocentrifugirke pri –20 °C za nadaljnje analize. Vse vzorce smo ustrezno označili z novimi oznakami.
Izolacijo DNA iz zamrznjenega glivnega materiala smo opravili s pomočjo komercialnega kompleta »GenElute™ Plant Genomic DNA Miniprep Kit«. Glivno DNA smo izolirali po navodilih proizvajalca. V zadnjem koraku (spiranje DNA iz vezavne kolone) smo na vezavno kolono odpipetirali 50 uL predhodno na 65 °C segrete Elution Solution in centrifugirali 1 minuto pri 16.000 g ter postopek ponovili še enkrat, tako da smo pridobili 100 uL eluata. Nato smo vsebino v mikrocentrifugirki (eluat) shranili. Tako izolirane vzorce DNA smo shranili na –20 °C do nadaljnje uporabe.
5.9.1. Pomnoževanje izolirane DNA s PCR
Izolirano glivno DNA iz posameznih morfotipov smo pomnoževali z verižno reakcijo s polimerazo (PCR), in sicer ITS (Internal transcribed spacer) odsek (Gardens in Bruns, 1993).
Za pomnoževanje glivne DNA smo uporabili za glive specifična univerzalna oligonukleotidna začetnika ITS1-f in ITS4 (White s sod., 1990; Gardens in Bruns, 1993 v Mravlje, 2019), katerih zaporedji sta sledeči:
ITS1-f: 5' – 'CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA' – 3' ITS4: 5' – 'TCCTCCGCTTATTGATATGC' – 3'
Mešanice za verižno reakcijo s polimerazo (PCR) smo pripravili v 500 uL mikrocentrifugirkah s tanko steno. Najprej smo si v 2 mL mikrocentrifugirko pripravili mešanico PCR reagentov za večje število vzorcev. Potem smo v posamezno 500 uL mikrocentrifugirko odpipetirali 12,5 uL PCR mešanice in 12,5 uL vzorca. Ob vsaki PCR reakciji smo dodali tudi pozitivno in negativno kontrolo, da smo lahko preverili zanesljivost oziroma verodostojnost dobljenih rezultatov. Za pozitivno kontrolo smo uporabljali znan glivni izolat, ki nam je v preteklosti že dal uspešen PCR produkt, za negativno kontrolo pa smo vzorec nadomestili z avtoklavirano bidestilirano vodo (Mravlje, 2019).
Vzorce DNA smo predhodno razredčili z bidestilirano vodo v različnih odmerkih (neredčeno, 2-kratno, 50-kratno …) ter tako poskušali zagotoviti optimalno pomnožitev DNA s PCR reakcijo naših vzorcev. V večini primerov smo bili uspešni z neredčeno izolirano DNA, v manj primerih s 50-krat redčeno. Razlog je verjetno ta, da smo poleg gliv z agarnih plošč najbrž postrgali tudi nekaj agarja z gojišča, katerega komponente lahko motijo proces pomnoževanja DNA v PCR reakciji.
Po izvedeni verižni reakciji s polimerazo (PCR) smo uspešnost reakcije preverjali z elektroforezo na agaroznem gelu.
Pripravili smo 1 % agarozni gel za elektroforezo, in sicer tako, da smo v erlenmajerico natehtali 400 mg agaroze in dolili 40 mL 0,5 x TBE pufra. Agarozo smo v pufru raztopili z
16
dvakratnim segrevanjem do vrenja. Počakali smo, da se je raztopljena agaroza nekoliko ohladila, nato pa smo odpipetirali še 1,5 uL etidijevega bromida in pomešali ter vse skupaj razlili na nosilec velikosti 10 x 6 cm. V gel smo postavili glavniček s 16 razdelki ter tako oblikovali jamice za vzorce. Počakali smo 15 minut, da se je gel strdil, in odstranili glavniček.
V prvo jamico smo nanesli 1,5 uL velikostnega standarda (1 kbp), v ostale jamice pa smo nanesli vzorce PCR produktov (2.5–3 uL vzorca) ter na koncu še pozitivno in negativno kontrolo (prav tako po 2,5 uL). Jamice smo na koncu zapolnili do vrha z 0,5 x TBE pufrom.
Sledila je 30-minutna elektroforeza v 0,5 x TBE pufru pri napetosti 100 V. Po končani elektroforezi smo gel slikali pod ultravijolično svetlobo (z UV-transluminatorjem) s programom UVI-Photo ter preverili uspešnost PCR reakcije (prisotnost PCR produktov). V kolikor smo opazili, da je produkt pričakovane velikosti (600–900 bp), smo mešanico s PCR produktom shranili za sekvenciranje, v nasprotnem primeru smo ponovili PCR reakcijo z drugačno redčitvijo in novim ponovljenim PCR vzorcem (Mravlje, 2019).
5.9.2. Sekvenciranje
Sekvenciranje pridobljenih DNA pomnožkov je bilo opravljeno pri komercialnem ponudniku Macrogen Europe Inc. (Amsterdam, Nizozemska).
5.9.3. Identifikacija nukleotidnih zaporedij
Pridobljena nukleotidna zaporedja smo obdelali s pomočjo programa MEGA-X in jih bioinformatsko analizirali oziroma poiskali najboljša ujemanja v NCBI GenBank bazi s spletnim orodjem Nucleotide BLAST®.
5.10. Statistična analiza
Naše pridobljene rezultate smo analizirali z nekaterimi standardnimi statističnimi metodami.
Pri analizi smo si pomagali z MS Excel 2013 in programskim kompletom Statistica (Statsoft 7.0.61.0 EN). Statistično značilne razlike smo izračunali s pomočjo programa enosmerna ANOVA + post-hoc testom. Grafe smo narisali v Excelu in interpretirali rezultate.
17 6. Rezultati
6.1. Kalitveni testi
Kalitvene teste smo opravili dvakrat. Prvi poskus je potekal marca, drugi poskus pa junija. Na grafih je prikazana kaljivost semen v odstotkih glede na čas oz. zaporedni dan spremljanja kalitve. Primerjali smo kaljivost semen med različnimi obdelavami, ki so prikazane z različnimi barvami.
Na sliki 3 lahko vidimo, da se je kontrolna skupina statistično značilno razlikovala od vseh drugih obdelav na prvi in drugi dan opazovanja. Prav tako sta se prva dva dneva poskusa 15 s in 30 s izpostavitev statistično značilno razlikovala tako od kontrolne skupine kakor tudi od najvišjih dveh izpostavitev (90 s in 120 s). Pri najvišjih dveh izpostavitvah (90 s in 120 s) tudi sicer do konca poskusa (7. dan) ni vzkalilo nobeno seme. Četrti dan opazovanja med kontrolno skupino in 15-sekundno izpostavitvijo ni bilo več statistično značilnih razlik v deležu kalitve. Na koncu poskusa (7. dan) pa je bila kalitev semen tako kontrolne skupine, 15 s, 30 s in 45 s izpostavitve že primerljiva (v povprečju okoli 60–65 %), saj med omenjenimi obdelavami ni bilo več statistično značilnih razlik. Slabše kaljiva so bila semena pri 60- sekundni izpostavitvi (okoli 20 %), medtem ko semena pri najvišjih izpostavitvah (90 s in 120 s) sploh niso kalila.
Slika 3: Kaljivost semen navadne ajde – prvi poskus (povprečje ± standardna napaka, n = 100). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilne razlike med izpostavitvami (p < 0,05, enosmerna ANOVA, Duncanov post – hoc test). K – kontrola; 15s – 15-sekundna izpostavitev plazmi; 30s – 30-sekundna izpostavitev plazmi;
45s – 45-sekundna izpostavitev plazmi; 60s – 60-sekundna izpostavitev plazmi; 90s – 90-sekundna izpostavitev plazmi; 120s – 120-sekundna izpostavitev plazmi.
Na sliki 4 opazimo, da se na prvi, drugi in tretji dan poskusa statistično značilno razlikuje le kontrolna skupina (K) od vseh drugih izpostavitev, saj ima ta daleč najvišji odstotek
18
vzkaljenih semen ves čas poskusa. Četrti dan opazimo, da ima K še vedno najvišji odstotek vzkaljenih semen in se statistično značilno razlikuje od vseh drugih izpostavitev. Izpostavitve 15 s, 30 s in 45 s se prav tako statistično značilno razlikujejo od izpostavitev 60 s, 90 s in 120 s, ki imajo najnižji delež kalitve. Tudi zadnji (sedmi) dan poskusa lahko vidimo, da je situacija podobna kot četrti dan. Najbolj kaljiva so bila semena v skupini K (v povprečju približno 55 %), sledijo izpostavitve od 15 do 45 s (s povprečji kalitve okoli 25–30 %), najslabšo kalitev pa smo opazili pri najdaljših izpostavitvah, torej 60 s (približno 6 % vzkaljenih semen), 90 s in 120 s (1 %).
Slika 4: Kaljivost semen navadne ajde – drugi poskus (povprečje ± standardna napaka, n = 100). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilne razlike med izpostavitvami (p < 0,05, enosmerna ANOVA, Duncanov post – hoc test). K – kontrola; 15s – 15-sekundna izpostavitev plazmi; 30s – 30-sekundna izpostavitev plazmi;
45s – 45-sekundna izpostavitev plazmi; 60s – 60-sekundna izpostavitev plazmi; 90s – 90-sekundna izpostavitev plazmi; 120s – 120-sekundna izpostavitev plazmi.
6.2. Viabilnost
Delež viabilnosti semen po opravljenih testih s tetrazolijevim tetrakloridom (TTC) je prikazan v tabeli 2. Viabilnost semen smo spremljali le pri prvem poskusu kalitve. V tabeli 2 lahko opazimo, da je bil najvišji delež viabilnih semen pri 15- in 45-sekundni izpostavitvi, kjer je bilo 92 % preživelih semen. Nato sledita K (kontrola) in 30-sekundna izpostavitev s po 82 % oziroma 86 % preživelih semen. Precej slabša je bila viabilnost semen pri 90-sekundni izpostavitvi (le še 12 % viabilnih semen). Pri 120-sekundni izpostavitvi pa ni več preživelo nobeno seme. V tabeli 2 opazimo, da se med seboj statistično značilno razlikujejo le obdelave 90 s in 120 s od vseh drugih obdelav (K, 15 s, 30 s, 45 s in 60 s).
19
Tabela 2: Viabilnost semen navadne ajde
Viabilnost Obdelava 1.
ponovitev 2.
ponovitev
povprečje delež Standardna deviacija
Oznaka statistično različnih povprečij
K 21 20 20,5 82,0 % 0,707107 ab
15s 23 23 23 92,0 % 0,000000 a
30s 22 21 21,5 86,0 % 0,707107 ab
45s 25 21 23 92,0 % 2,828427 a
60s 18 20 19 76,0 % 1,414214 b
90s 4 2 3 12,0 % 1,414214 c
120s 0 0 0 0,0 % 0,000000 c
6.3. Stopnja rasti glivnih hif
Spodnji grafi prikazujejo stopnjo rasti glivnih hif 4. in 7. dan poskusa. Slika 5 prikazuje stopnjo glivne rasti vseh semen skupaj (tako celih kot rezanih semen) pri določenih obdelavah.
Na sliki 5 lahko vidimo, da je bila skoraj pri vseh izpostavitvah opažena glivna rast. Četrti dan gojenja semen na agarnih ploščah je bila najvišja stopnja rasti glivnih hif opažena pri 30- sekundni izpostavitvi (okoli 30 % celotne plošče), vendar te razlike niso bile statistično značilno različne od kontrolne, 15- in 60-sekundne izpostavitve. Zadnji dan poskusa (po 7- dnevnem gojenju) je bila v povprečju največja glivna rast opažena pri kontrolni skupini (ta je znašala okoli 45 % celotne plošče), vendar te razlike niso bile statistično značilno različne od 15-, 30-, 45- in 60-sekundnih izpostavitev. V povprečju je bila najnižja rast pri 120-sekundni izpostavitvi (malo več kot 5 % celotne plošče) in pri sterilizirani kontroli (manj kot 5 % celotne plošče), vendar razlike niso bile statistično značilno različne od 90-sekundne izpostavitve.
20
Slika 5: Stopnja rasti glivnih hif (skupaj cele in rezane semena) (povprečje ± standardna napaka, n = 10).
Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilne razlike med izpostavitvami (p < 0,05 enosmerna ANOVA, Duncanov post – hoc test). K – kontrola; 15s – 15-sekundna izpostavitev plazmi; 30s – 30-sekundna izpostavitev plazmi; 45s – 45-sekundna izpostavitev plazmi; 60s – 60-sekundna izpostavitev plazmi; 90s – 90- sekundna izpostavitev plazmi; 120s – 120-sekundna izpostavitev plazmi. KS – sterilizirana kontrola.
6.4. Diverziteta glivnih morfotipov
V tabeli 4 so opisani glivni morfotipi, ki smo jih izolirali iz semen navadne ajde, zraslih na PDA gojiščih. Na 80 agarnih gojiščih je skupaj zraslo 76 gliv, ki smo jih na podlagi morfoloških lastnosti (kot so barva, oblika in površina) razdelili v 12 oziroma 19 morfotipov.
12 »širših« morfotipov smo označili s črkami abecede, pri tistih, kjer so bile glive med seboj kljub temu dokaj različne, pa smo uvedli še številčne oznake (npr. A1); tako smo dobili 19
»ožjih« morfotipov. Pri vsakem morfotipu smo določili zgornjo in spodnjo obarvanost, obliko rasti glivnega micelija ter površino oziroma teksturo glive. Morfotipe smo tudi fotografirali na beli podlagi. Fotografije posameznih morfotipov se nahajajo v tabeli 3.
21
Tabela 3: Opis glivnih morfotipov, izoliranih iz semen navadne ajde, zrastlih na PDA gojišču
Morfotip Obarvanost (zgoraj)
Oblika rasti
Površina in tekstura
Obarvanost (spodaj)
Fotografija morfotipa A svetlorjava
in
marmorirana
pravilna okrogla
gladka, mat svetlorjava in
marmorirana
A1 svetlorjava in
marmorirana
pravilna okrogla
gladka, mat svetlorjava in
marmorirana
A2 svetlorjava skoraj temno zelena in marmorirana
pravilna okrogla
gladka, mat svetlorjava in
marmorirana
B rumenkasta
v centru prehaja do temno
vijolične, rdečkaste na robu
pravilna okrogla
puhasta, mat
rdečkasta
B1 rumenkasta
v centru prehaja do temno
vijolične, rdečkaste na robu
pravilna okrogla
puhasta, mat
rumenkasta
22
B2 rumenkasta
v centru prehaja do temno
vijolične, rdečkaste na robu
pravilna okrogla
puhasta, mat
rumenkasta do temno vijolična
C vijoličasta pravilna okrogla
puhasta, mat
svetlo vijoličasta
D sivkasto
svetlo zelena
pravilna okrogla
puhasta, mat
belkasta
E temno siva
marmorirana
pravilna okrogla
puhasta, svetleča, granulirana
zelena
E1 temno siva
marmorirana
pravilna okrogla
lepo okroglo, svetleča, granulirana
zelena
F svetlorjava pravilna okrogla
gladka, mat marmorirast vzorec (svetlorjava -temno rjava)
23 G zelenosiva pravilna
okrogla
puhasta, svetleča
temnozelena
H belkasto
rumena
pravilna okrogla
gladka, mat svetlo zelena
I roza pravilna
okrogla zelo puhasta, mat
rumena
J Zelenomodra
(bolj zelena), bela obroba
pravilna okrogla
puhasta, granulirana, mat
zelena
J1 Zelenomodre
(bolj modra), bela obroba
pravilna okrogla
puhasta, mat
rumena
K roza pravilna
okrogla
gladka in sluzasta, svetleča
roza
24
L svetla,
rumenkasta do
bledorjava
pravilna okrogla
gladka in sluzasta, svetleča
svetla, rumenkasta do
bledorjava
Iz slike 7 je razvidno, da smo največ različnih glivnih morfotipov izolirali iz kontrolne skupine (neobdelana semena), in sicer 9 različnih morfotipov. Iz semen po 45-sekundni obdelavi smo izolirali 8 različnih morfotipov, sledile so 60- in 30-sekundna obdelava s po 6 morfotipi ter 15- in 90-sekundna obdelava s po 5 različnimi morfotipi. Najmanj različnih glivnih morfotipov smo izolirali iz 120-sekundne obdelave ter sterilizirane kontrole, in sicer v vsaki od obeh izpostavitev le po 2 različna glivna morfotipa.
Slika 6: Skupno število glivnih morfotipov po izpostavitvah, združeno za cela in rezana semena (n = 10).
Oznake: K – kontrola; 15s – 15-sekundna izpostavitev plazmi; 30s – 30-sekundna izpostavitev plazmi; 45s – 45- sekundna izpostavitev plazmi; 60s – 60-sekundna izpostavitev plazmi; 90s – 90-sekundna izpostavitev plazmi;
120s – 120- sekundna izpostavitev plazmi.
