Poučevanje - Predmetno poučevanje Biologija in kemija
Tanja MURN
VLOGA ANTIOKSIDANTOV IN SELENOVIH SPOJIN V LISTIH NAVADNE IN TATARSKE AJDE NA PRENOS IN UČINKE ŽIVEGA SREBRA VZDOLŽ
PREHRANJEVALNE VERIGE
Magistrsko delo
PEDAGOŠKA FAKULTETA Poučevanje - Predmetno poučevanje
Biologija in kemija
Tanja MURN
VLOGA ANTIOKSIDANTOV IN SELENOVIH SPOJIN V LISTIH NAVADNE IN TATARSKE AJDE NA PRENOS IN UČINKE ŽIVEGA SREBRA VZDOLŽ
PREHRANJEVALNE VERIGE
Magistrsko delo
Mentor: izr. prof. dr. Katarina Vogel-Mikuš
POVZETEK
Idrija je majhno mesto, znano po neprekinjenem petstoletnem rudarjenju živega srebra (Hg).
Kar četrtina celotne proizvodnje Hg se je med pridobivanjem sprostila v okolje, kar je in še vedno negativno vpliva na tamkajšnje organizme. Rastline so v neposrednem stiku s prstjo in lahko kot primarni vir hrane Hg iz tal in zraka posredujejo iz neživega okolja v prehranjevalne verige ljudi in živali. Namen magistrske naloge je bil preučiti kako sekundarni metaboliti (polifenolne spojine) navadne (Fagopyrum esculentum) in tatarske (Fagopyrum tataricum) ajde vplivajo na prenos in učinke Hg v kombinaciji s selenom (Se) pri rastlinah in naprej v prehranjevalni verigi. Sekundarni metaboliti so namreč ključne komponente obrambnih mehanizmov pred oksidativnim stresom, ki ga lahko povzročijo različne okoljske razmere, kot so npr. UV-sevanje, kovine ali mikroorganizmi. Ti lahko v stiku z organizmom tvorijo reaktivne kisikove spojine (ROS), ki poškodujejo celične strukture. Znano je, da ima tatarska ajda večji antioksidativni potencial od navadne ajde. To lahko pripišemo višji vsebnosti nekaterih flavonoidov, ki oksidativni stres preprečujejo z lovljenjem prostih radikalov in večji reducirajoči moči. Tudi Se pozitivno vpliva na rast in preživetje rastlin ter na obrambo pred oksidativnim stresom, saj lahko reagira s Hg in tako zmanjša negativne vplive Hg na rastline.
Kot testni rastlinski vrsti smo izbrali navadno in tatarsko ajdo, kot testno žival pa polža španskega lazarja (Arion vulgaris). Navadno in tatarsko ajdo smo gojili v zemlji, onesnaženi s Hg. Polovico rastlin smo listno obogatili s Se, ki smo ga nanesli kot raztopino dikalijevega selenata (K2SeO4). Spektrofotometrično smo določili, kako kopičenje Hg (v kombinaciji s Se) vpliva na vsebnost fotosinteznih pigmentov, stopnjo lipidne peroksidacije ter vsebnost polifenolnih spojin v navadni in tatarski ajdi. Z vzgojenimi rastlinami smo hranili polže španske lazarje. Z rentgensko fluorescenčno spektrometrijo smo določili, v kolikšni meri so ajde privzemale Hg iz idrijske zemlje ter listno dodan Se in v kolikšni meri so polži privzemali Hg in Se iz rastlinskega materiala. Pri polžih smo spektrofotometrično določili tudi stopnjo lipidne peroksidacije prebavne žleze ter mišičnega tkiva. Rezultati so pokazali, da je kombinacija Hg in Se različno vplivala na fiziološke lastnosti obeh vrst ajd. Obe vrsti ajd sta v kombinaciji s Se različno privzemali Hg. Transport Hg vzdolž prehranjevalne verige je bil v kombinaciji s Se vrstno specifičen. Ker so rastline rasle v kontroliranih pogojih, večje razlike v antioksidativnem potencialu med obema vrstama niso bile opazne, prav tako niso bili opazni antioksidativni učinki na polžja tkiva v prisotnosti Hg. Živo srebro se je večinoma kopičilo v koreninah navadne in tatarske ajde ter v prebavni žlezi polžev španskih lazarjev, medtem ko se je Se kopičil v poganjkih navadne in tatarske ajde ter v mišičnem tkivu polžev španskih lazarjev.
Ključne besede: onesnaženost tal, Idrija, živo srebro, selen, navadna ajda, tatarska ajda, prehranjevalna veriga, polži
ABSTRACT
Idrija is a small city known for its continuous five-hundred-year long mercury (Hg) mining.
During the process, a quarter of the processed Hg was released in the surrounding environment, which had and is still having a negative impact on the local organisms. Plants are first in direct contact with the soil and they can as a primary source of nourishment to people and animals, transfer the accumulated Hg from the ground and air to the food chain. The goal of this master thesis was to investigate how the secondary metabolites (polyphenolic compounds) of the common (Fagopyrum esculentum) and Tartary (Fagopyrum tataricum) buckwheat affect the transfer and effects of Hg in combination with selenium (Se) in plants and further on through the food chain. Secondary metabolites are the main components of defence mechanisms against oxidative stress, which can be caused by different environmental conditions, such as UV radiation, metals or microorganisms. In contact with the organism, they can form reactive oxygen compounds (ROS) and can therefore damage cellular structures. It is known that the Tartay buckwheat has higher antioxidant potential than common buckwheat. This can be attributed to the higher content of some flavonoids, which prevent oxidative stress by catching free radicals and greater reducing power. Selenium also has a positive influence on the growth and survival of plants and on the defence against oxidative stress, because it can react with Hg and reduce negative effects of Hg on plants. As test plants a common and Tartary buckwheat were used and as a test animal the snail, Spanish lazarus (Arion vulgaris) was used. Common and Tartary buckwheat were grown in the soil, contaminated with Hg. Half of them were foliarly enriched with Se, which was applied as a prepared solution of dipotassium selenate (K2SeO4). The effects of Hg accumulation (in combination with Se) on the content of photosynthetic pigments, level of lipid peroxidation and the content of polyphenolic compounds in the common and Tartary buckwheat were spectrophotometrically measured. The grown plants were used to feed the snails from the family Spanish Lazarus (Arion vulgaris).
With the use of X-Ray fluorescent spectrometry, we defined to what extent the buckwheats accumulated the Hg and Se from the plant material. The level of lipid peroxidation of the digestive gland and muscle tissue in snails was spectrophotometrically defined. The results showed that the combination of Hg and Se had a different effect on the physiological properties on both types of buckwheat. Both species of buckwheat in combination with Se accumulated Hg differently. The transport of Hg along the food chain was in combination with Se specific to the species. Because plants were grown under controlled conditions, there was no significant difference in the antioxidant potential between the two species and no antioxidants effects on the snail’s tissue in the presence of Hg were observed. Mercury has mostly accumulated in the roots of common and Tartary buckwheat and in the digestive gland of the Spanish Lazarus snails, while Se accumulated in the sprouts of the common and Tartary buckwheat and in muscle tissue of the Spanish Lazarus snails.
Keywords: soil pollution, Idria, mercury, selenium, common buckwheat, Tartary buckwheat, food chain, snail
KAZALO VSEBINE
1 UVOD ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 ŽIVO SREBRO... 3
2.1.1 FIZIKALNE IN KEMIJSKE OBLIKE ŽIVEGA SREBRA ... 3
2.1.2 IDRIJA KOT ANTROPOGENI VIR ŽIVEGA SREBRA V OKOLJU ... 3
2.1.3 ŽIVO SREBRO V IDRIJSKIH TLEH ... 3
2.1.4 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA RASTLINE ... 4
2.1.5 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA ŽIVALI ... 5
2.2 SELEN ... 6
2.2.1 FIZIKALNE IN KEMIJSKE OBLIKE SELENA ... 6
2.2.2 VPLIV SELENA NA ORGANIZME ... 6
2.3 INTERAKCIJE ŽIVEGA SREBRA IN SELENA ... 7
2.4 AJDA... 8
2.4.1 NAVADNA AJDA ... 8
2.4.2 TATARSKA AJDA ... 8
2.5 KEMIJSKA SESTAVA NAVADNE IN TATARSKE AJDE... 9
2.6 RASTLINE IN OKSIDATIVNI STRES ... 9
2.7 ANTIOKSIDANTI ... 10
2.7.1 POLIFENOLNE SPOJINE ... 10
2.7.2 ANTIOKSIDATIVNA FUNKCIJA POLIFENOLOV IN KOVINE ... 11
3 METODE DELA ... 13
3.1 RASTLINE ... 13
3.1.1 PRIPRAVA SUBSTRATA ... 13
3.1.2 GOJENJE RASTLIN ... 13
3.1.3 IZPOSTAVITEV RASTLIN SELENU... 13
3.1.4 DOLOČANJE SUHE BIOMASE ... 13
3.1.5 MERJENJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV ... 14
3.1.6 DOLOČANJE STOPNJE LIPIDNE PEROKSIDACIJE ... 14
3.1.7 DOLOČANJE VSEBNOSTI FENOLNIH SPOJIN... 14
3.1.7.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin ... 15
3.1.7.2 Določanje vsebnosti flavonoidov ... 15
3.1.7.3 Določanje antioksidativnega potenciala ... 15
3.2 ŽIVALI ... 16
3.2.1 PRIPRAVA POLŽEV IN LONČKOV ZA POSKUS ... 16
3.2.2 PRIPRAVA HRANE IN HRANJENJE POLŽEV ... 16
3.2.3 PRIPRAVA POLŽEV ZA MERITVE ... 16
3.3 DOLOČANJE KONCENTRACIJ ELEMENTOV V VZORCIH ... 17
3.4 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV... 18
4 REZULTATI ... 19
4.1 RASTLINE ... 19
4.3.1 BIODOSTOPNOST ŽIVEGA SREBRA V ZEMLJI ... 23
4.3.2 KONCENTRACIJA ŽIVEGA SREBRA V KORENINAH IN POGANJKIH ... 23
4.3.3 VSEBNOST ŽIVEGA SREBRA V KORENINAH IN POGANJKIH ... 24
4.3.4 KONCENTRACIJA SELENA V KORENINAH IN POGANJKIH ... 25
4.3.5 VSEBNOST SELENA V KORENINAH IN POGANJKIH ... 25
4.4 ANALIZA ŽIVEGA SREBRA IN SELENA V ŽIVALIH ... 26
4.4.1 ANALIZA POJEDENE HRANE ... 26
4.4.2 BIODOSTOPNOST ŽIVEGA SREBRA V AJDAH ... 26
4.4.3 BIODOSTOPNOST SELENA V AJDAH ... 27
4.4.4 LIPIDNA PEROKSIDACIJA ... 27
4.4.5 VSEBNOST ŽIVEGA SREBRA V POLŽJIH TKIVIH ... 28
4.4.6 VSEBNOST SELENA V POLŽJIH TKIVIH ... 29
4.4.7 TRANSLOKACIJSKI FAKTOR PRENOSA ŽIVEGA SREBRA V POLŽJIH TKIVIH ... 29
4.4.8 TRANSLOKACIJSKI FAKTOR PRENOSA SELENA V POLŽJIH TKIVIH .. 30
5 DISKUSIJA ... 31
5.1 RAST IN BIOKEMIJSKI PARAMETRI RASTLIN ... 31
5.2 FOTOSINTEZNI PIGMENTI ... 31
5.3 LIPIDNA PEROKSIDACIJA ... 32
5.4 VSEBNOST POLIFENOLNIH SPOJIN... 32
5.5 ANALIZE ŽIVEGA SREBRA V RASTLINAH ... 33
5.6 ANALIZE SELENA V RASTLINAH ... 34
5.7 ANALIZA ELEMENTOV V ŽIVALIH... 34
6 SKLEPI... 36
7 VIRI ... 37
ZAHVALA ... 46
PRILOGE ... 47
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Koncentracije elementov v zemlji, nabrana okoli dimnika nekdanjega delujočega rudnika in talilnice Hg v Idriji, v kateri smo gojili navadno in tatarsko ajdo (µg/g) ... 22 Preglednica 2: Koncentracija Se v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se (µg/g SM).. ... 25 Preglednica 3: Vsebnost Se v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se (µg/rastlino). ... 25 Preglednica 4: Vsebnost elementov (µg/pojedeno hrano) ter vsebnost fenolnih spojin in flavonoidov (mg/pojedeno hrano) v pojedeni hrani polžev španski lazar (Arion vulgaris) po 7 – dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se ... 26 Preglednica 5: Biodostopnost Se v prebavni žlezi in mišičnem tkivu polžev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z dodanim Se (%).. ... 27 Preglednica 6: Translokacijski faktor prenosa Se iz prebavne žleze v mišično tkivo polžev španskih lazarjev, hranjenih z navadno in tatarsko ajdo z dodanim Se ... 30
KAZALO SLIK
Slika 1: Suha masa korenin in poganjkov ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. ... 19 Slika 2: Koncentracija klorofila a, b in karotenoidov ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ... 20 Slika 3: Koncentracija MDA ekvivalenta v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. ... 21 Slika 4: Vsebnost fenolov v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ... 21 Slika 5: Antioksidativna učinkovitost v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se po 20 min.. ... 22 Slika 6: Biodostopnost Hg za korenine in poganjke ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ... 23 Slika 7: Koncentracija Hg v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. ... 24 Slika 8: Vsebnost Hg v koreninah in poganjkih ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ... 24 Slika 9: Biodostopnost Hg v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ... 27 Slika 10: Koncentracija MDA ekvivalenta v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. ... 28 Slika 11: Vsebnost Hg v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. ... 28 Slika 12: Vsebnost Se v prebavni žlezi in mišičnem tkivu pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. ... 29 Slika 13: Translokacijski faktor prenosa Hg iz prebavne žleze v mišično tkivo pri polžih španski lazar (Arion vulgaris) po 7-dnevnem hranjenju z ajdami, izpostavljenih zemlji nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se.. ... 30
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
A (λ) absorbanca
ADP adenozin difosfat
ATP adenozin trifosfat
Al aluminij
AlCl3 aluminijev klorid
Ca(NO3)2 x 7 H20 kalcijev nitrat heptahidrat
CH3- metilni anion
Cr krom
Cu+ bakrov ion
Ca kalcij
Ca(NO3)2 kalcijev nitrat(V) CaCl2 kalcijev klorid Ca3(PO4)2 kalcijev fosfat(V) CaCO3 kalcijev karbonat -COOH karboksilna skupina DMHg ((CH3)2Hg) dimetil živo srebro
DNA deoksiribonukleinska kislina DPPH• 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil
FC Folin-Ciolalteu reagent
Fe2+ železov ion
FeNaEDTA železo natrijev etilendiamintetraocetna kislina
H2O voda
Hg živo srebro
Hg0 elementarno živo srebro
Hg+ enovalentno živo srebro
Hg2+ dvovalentno živo srebro HgCl2 živosrebrov(II) klorid Hg(OH)2 živosrebrov hidroksid
HgS živosrebrov sulfid (cinabarit) H2O2 vodikov peroksid
KH2PO4 dihidrogen kalijev fosfat(V)
KNO3 kalijev nitrat(V)
K2SeO4 dikalijev selenat
KCl kalijev klorid
M mišica
MeHg (CH3Hg+) metil živo srebro
MDA manondialdehid
Mg magnezij
MgSO4 x 7 H2O magnezijev sulfat(VI)
MgCl2 magnezijev klorid
ROS prosti kisikovi radikali
SM suha masa
S žveplo
Se selen
Se0 elementarni selen
Se2- selenid
SeO32- - Se4+ selenit SeO42- - Se6+ selenat
Se-Cys selenocistein
Se-Met selenometionin
SM suha masa
TBA 2-tiobarbitudna kislina TCA trikloroocetna kislina
Te telur
-SH tiolna oz. sulfhidrilna skupina
UV ultravijolično sevanje
µg mikrogram
1 UVOD
V poznem srednjem veku je bila, po legendi pripovedujoč, pod curkom idrijske studenčnice odkrita neznana tekoča snov, kasneje poimenovana živo srebro (Hg). Kljub ozaveščenosti ljudi o strupenosti Hg tamkajšnjim prebivalcem izkopavanje živosrebrove rude ni predstavljalo težave, saj je večini ljudi prinašalo kruh za preživetje. Neprekinjeno petstoletno rudarjenje je povzročilo znatno onesnaževanje idrijske kotline s Hg, kar se kljub zaprtju rudnika odraža še danes. Nekatere kemijske oblike Hg v tleh se tako vnašajo v rastline in s tem v višje trofične nivoje v prehranjevalni verigi ter povzročajo oksidativni stres v organizmih (Zidar in sod., 2010; Navarro in sod., 2008).
Za obrambo pred oksidativnim stresom organizmi izrabljajo lastne antioksidativne mehanizme (Navarro in sod., 2008). Med antioksidativne mehanizme prištevamo encime ter antioksidativne snovi, ki jih zaužijemo s prehrano. Ti organizem zaščitijo z odstranjevanjem in lovljenjem prostih radikalov (Hegedus in sod., 2001; Cao in sod., 2008).
Ajda je skromna poljščina, cenjena kot zdravilna rastlina, ki ima poleg hranilnih snovi, kot so kakovostne beljakovine, surove vlaknine, mineralne snovi in vitamine, tudi veliko antioksidantov, med katere prištevamo rutin, polifenolne spojine in podobno (Chao in sod., 2008). Kreft (1995) navaja, da pri nas poznamo dve vrsti ajde: navadno (Fagopyrum esculentum) in tatarsko (Fagopyrum tataricum) ajdo. Sama sestava v hranilni snovi navadne in tatarske ajde se ne razlikuje, znano pa je, da tatarska ajda vsebuje večje količine vitaminov iz skupine B ter še več antioksidantov v primerjavi z navadno ajdo (Bonafaccia in sod., 2003a).
Tudi številne raziskave o Se potrjujejo njegovo antioksidativno vlogo, saj pri mnogih rastlinah omili stres ter zmanjša upad biomase (Breznik in sod., 2005a; Breznik in sod., 2005b). Študije tudi kažejo (Shanker in sod., 1996; Mounicou in sod., 2006; Zhang in sod., 2012), da lahko njegova povečana raven v tleh zmanjša privzem Hg v rastline, vendar le malo študij obravnava nadaljnji prenos Hg na višje trofične nivoje.
Interakcije Hg z antioksidanti in s Se pri rastlinah so le slabo raziskane, prav tako pa ni podatkov, kako antioksidanti in Se vplivajo na učinke in prenos Hg vzdolž prehranjevalne verige. V naši magistrski nalogi, smo navadno in tatarsko ajdo gojili v zemlji, onesnaženi s Hg.
Polovico rastlin smo listno obogatili s Se, ki smo ga nanesli kot raztopino dikalijevega selenata (K2SeO4). V magistrskem delu smo določali vplive kopičenja Hg (v kombinaciji s Se) na biomaso in izbrane fiziološke parametre navadne in tatarske ajde - vsebnost fotosinteznih pigmentov, stopnjo lipidne peroksidacije, vsebnost polifenolnih spojin. Z vzgojenimi rastlinami smo nato hranili polže španske lazarje (Arion vulgaris), kjer smo določali, v kolikšni meri so polži privzemali Hg iz rastlinskega materiala in fiziološke parametre prebavne žleze ter mišičnega tkiva (stopnja lipidne peroksidacije).
HIPOTEZI
• Selen in antioksidanti v ajdi bodo vplivali na privzem Hg v rastline in naprej na višji trofični nivo
• Selen in antioksidanti v ajdi bodo omilili negativne učinke Hg v ajdi in naprej v prehranjevalni verigi
2 PREGLED OBJAV
2.1 ŽIVO SREBRO
2.1.1 FIZIKALNE IN KEMIJSKE OBLIKE ŽIVEGA SREBRA
Živo srebro, ki izhaja iz grške besede hydrargyrum (hidros - voda in agyrum - srebro) je edini prehodni element, ki je pri sobni temperaturi tekočina in je srebrno-bele barve. Nahaja se v II.
stranski skupini periodnega sistema s kemijskim simbolom Hg, atomskim številom 80 in relativno atomsko maso 200,59 (Brenčič in Lazarini, 1995).
V naravnem okolju lahko Hg zaradi številnih biokemijskih pretvorb, hlapnosti večine oblik Hg in raznovrstnih geokemijskih sprememb nastopa v treh oksidacijskih stanjih: samorodno živo srebro (Hg0) v elementarnem stanju, enovalentno živo srebro (Hg+) in dvovalentno živo srebro (Hg2+). Samorodno Hg0 je večinoma prisotno v atmosferi in na mineraliziranih cinabaritnih tleh z aktivno predelavo rude, medtem ko imata Hg+ in Hg2+ veliko afiniteto do tvorbe vezi z mnogimi anorganskimi in organskimi ligandi v vodi, tleh in sedimentih. Med najpogostejše anorganske spojine v okolju prištevamo živosrebrov klorid (HgCl2), živosrebrov hidroksid (Hg(OH)2) in živosrebrov sulfid (HgS). Slednji je kot cinabarit, poleg samorodnega Hg0, prisoten v Idriji. Organske Hg spojine pa predstavljajo tiste spojine, kjer je Hg2+ ion neposredno vezan s kovalentno vezjo na vsaj en C atom, najpogosteje na C atom iz metilne skupine (CH3-
). Najpomembnejši organski spojini sta metil-Hg – MeHg (CH3Hg+) in dimetil-Hg – DMHg ((CH3)2Hg), ki imata veliko nagnjenost k vezavi na različne biotsko aktivne makromolekule, preko katerih se akumulirata naprej v višje trofične nivoje v prehranjevalni verigi (EPA, 1997;
Robinson in Tuovinen, 1984).
2.1.2 IDRIJA KOT ANTROPOGENI VIR ŽIVEGA SREBRA V OKOLJU
Emisije Hg in njegovih spojin v okolju so naravnega in antropogenega izvora. Največji naravni vir Hg v atmosferi predstavlja izhlapevanje Hg iz površine zemlje ob preperevanju kamnin, bogatih s Hg, t. i. cinabaritnih območjih ter ob vulkanskih izbruhih. Naravni viri prispevajo le majhen delež k emisiji Hg, saj gre povišane koncentracije Hg pripisati antropogenim virom Hg, kot so izkopavanje in predelava Hg rude, izhlapevanje Hg iz žgalniških ostankov, zažiganje odpadkov, izgorevanje fosilnih goriv, gnojila, industrija in drugo (Fitzgerald, 1995). Rudnik v Idriji, katerega je prekašal le španski Almaden, je veljal za drugi največji rudnik na svetu, z več kot 13 % svetovne proizvodnje Hg. Tekom 500-letnega neprekinjenega rudarjenja je bilo izkopane več kot 12 milijonov ton živosrebrove rude, od tega se je tekom pridobivanja v okolje izgubilo okoli 37.000 ton Hg (Gnamuš in Horvat, 1999). Idrija je zato torej odlično vzorčno mesto za raziskovanje vpliva dolgotrajnega onesnaževanja Hg na ekosistem (Gnamuš, 2002).
2.1.3 ŽIVO SREBRO V IDRIJSKIH TLEH
Vsebnosti Hg v tleh lahko različno vplivajo na prenos kovin v talno favno, rastline in naprej v kopenske prehranjevalne verige. Vezave in sproščanje Hg v tleh in s tem biodostopnost Hg
Kemizem tal - pH
Pri nižjih pH vrednostih (pH<4) Hg v tleh pogosto tvori slabo topne obstojne komplekse z žveplom (S) - HgS, zaradi česar je ovirana mobilnost Hg v prsti ter njegova biodostopnost rastlinam. Pri pH>4 so prisotne rastlinam bolj dostopne in mobilne oblike Hg - predvsem HgCl2
in Hg(OH)2. Vrednost pH je ob topilniškem dimniku v Idriji 6,8.
Količina organske snovi
Kompleksi Hg s huminskimi in fulvinskimi kislinami povzročijo vezavo Hg na talne delce in posledično zmanjšajo privzem Hg v rastline. Yin in sod. (2005) so dokazali močno korelacijo tvorbe kompleksov Hg2+ s povečevanjem organskih snovi v tleh. Za privzem Hg iz tal skozi korenine je za rastline pomemben predvsem Hg2+. Dostopnost tega je večja v spodnjih mineralnih horizontih tal z malo organske snovi. Tla ob topilniškem dimniku v Idriji vsebujejo visoko vsebnost organske snovi (0-5 cm globine 38 % in 5-10 cm globine 10 %).
Tekstura tal oz. delež gline
Tekstura tal pomembno vpliva na privzem kovin v rastline. Tla, ki jih sestavljajo pretežno glineni delci, imajo veliko afiniteto do vezave kovin, medtem ko peščena tla vodijo v izpiranje kovin v podtalnico. V mineralnih horizontih tal, glina prevzema funkcijo huminskih in fulvinskih kislin, ki s tvorbo kompleksov s Hg zmanjšuje biorazpoložljivost in biodostopnost Hg. Tla ob topilniškem dimniku v Idriji so pretežno meljasta (46,5 %) in vsebujejo majhen delež gline (18,8 %). Vpliv vezave Hg na glino je v idrijski zemlji torej majhen, kar posledično poveča razpoložljivost za sprejem Hg v rastline. Vendar so horizonti tal ob topilniškem dimniku razmeroma bogati z organsko snovjo, ki prispeva pri vezavi Hg in zmanjšuje sprejem kovine v rastline.
Kationska izmenjevalna kapaciteta
Kationska izmenjevalna kapaciteta je vsota izmenljivih kationov, ki jih tla lahko zadržijo. Večjo kationsko izmenjevalno kapaciteto imajo tla z velikim deležem glinenih delcev, ki na svoji površini zadržujejo katione kovin. Raziskave idrijske zemljo ob topilniškem dimniku so pokazale, da kationi ne vplivajo na vezavo Hg v tleh. Pomen pripisujejo drugim vezavnim mehanizmom Hg v tleh.
2.1.4 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA RASTLINE
Rastline zasedajo pomembno mesto v ekosistemih, saj so v neposrednem stiku s prstjo, hkrati pa predstavljajo hrano za živali in ljudi. So prve, ki sprejemajo kovine in delujejo kot vezni člen, ki privzeto Hg iz tal in zraka posredujejo iz neživega okolja v prehranjevalne verige (Gnamuš, 2002). Živo srebro v rastlinah nima znane biološke vloge, lahko pa že pri zelo nizkih koncentracijah negativno vpliva na njihovo rast in razvoj (Patra in Sharma, 2000). Posledično je bil v zadnjih desetletjih velik poudarek na raziskovanju biodostopnosti in strupenosti Hg za višje rastline ter njihovih obrambnih strategijah.
Privzem Hg v rastline je poleg okoljskih dejavnikov, kot so stopnja obremenjenosti okolja, meteorološki pogoji, kamninska sestava in način ter obseg izpostavljenosti rastline in ostale značilnosti rastišča, odvisen od metabolnih lastnosti in razvojne stopnje rastline (Zyrin in Obukhovskaya, 1980). Na splošno je dostopnost Hg za rastline iz tal nizka, saj se Hg v tleh veže na organske in mineralne snovi (Patra in Sharma, 2000). Poleg tega se večina privzetega Hg zadrži v koreninah, točneje v celični steni, saj Hg težko vstopa preko celične membrane v celice korenin. Korenine tako služijo kot zadrževalnik pred prenosom Hg iz zemlje v nadzemne dele rastlin (Debeljak in sod., 2013).
Strupenost Hg se odraža tako na nivoju celotne rastline, kot tudi na celičnem nivoju. Ob močno povišanih koncentracijah rastlina zmanjša intenzivnost rasti in reprodukcijsko sposobnost, poškodbe membran pa blokirajo nekatere procese v celici (Prasad, 1997). Privzem Hg je najbolj učinkovit pri mladih rastlinah, na rastlinskem zarodku in semenskem endospermu. Strupenost Hg se kaže predvsem v njegovi afiniteti do tiolnih skupin (-SH), ki so sestavni del aminokislin, predvsem cisteina in metionina in posledično proteinov. Živo srebro v mladih rastlinah, ki so bogate s -SH skupinami, tvori komplekse z biološkimi molekulami preko tvorbe mostu -S-Hg- S- in tako ovira kalitev in posledično rast mlade rastline (Carrasco-Gil in sod., 2013; Rajan in sod., 2008; Kodre in sod., 2017). Živo srebro ima tudi veliko afiniteto do fosfatnih skupin (PO4-
) v ADP, ATP in DNK. Velikokrat nadomesti atome magnezija (Mg) v molekuli klorofila, s čimer zavira fotosintezno aktivnost. Kovina lahko v tkivih rastlin inhibira odpiranje rež ter blokira aktivnost številnih encimov, med drugimi tudi hidrolitične encime, odgovorne za mobilizacijo hranil (Patra in Sharma, 2000).
2.1.5 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA ŽIVALI
Onesnažena območja zaradi neposredne okolice rudnikov, topilnic in odlagališč odpadkov, pomembno prispevajo h kopičenju Hg v kopenskih organizmih. Vdihovanje Hg0 skozi pljuča in vstop anorganskih in organskih Hg spojin s hrano in vodo skozi prebavila, predstavljata dve glavni poti vnosa Hg v višje kopenske vretenčarje. Razlike v privzemu, metabolizmu, strupenosti in zadrževalnih časih so močno pogojeni s topnostjo različnih Hg spojin v vodi in notranjih telesnih tekočinah (Gnamuš, 2002).
V organizmih hlapni Hg0 zaradi svoje velike difuzibilnosti in topnosti v lipidih intenzivno prehaja preko celičnih membran. Po inhalaciji se nekaj Hg0 raztopi v plazmi, preostali del pa se absorbira v kri. V rdečih krvnih celicah se manjša količina Hg0 veže na hemoglobin, večji del pa se s pomočjo tkivnih katalaz oksidira do Hg2+ ionov. Ti tvorijo komplekse z različnimi ligandi, predvsem s -SH skupinami, ki so v tkivih pogosto gradniki proteinov (MacGregor in Clarkson, 1974).
V primerjavi z dobro topnim elementarnim Hg0 je absorpcija anorganskih Hg spojin s hrano in vodo skozi prebavila zelo majhna - komaj 7 % (Clarkson, 1972). Večjo težavo predstavljajo lipidotopne organske Hg spojine, saj je njihova absorpcija iz prebavnega trakta popolna (Gnamuš, 2002). Znan je privzem MeHg s hrano živalskega izvora v živali in človeka, medtem ko privzem MeHg iz rastlinske hrane ostaja slabo raziskan (WHO, 1976, Gnamuš in sod., 2000). Obstaja možnost, da lahko na močno onesnaženih območjih, rastline kopičijo večje količine anorganskih in le 2 % organskih Hg spojin. Pri kopenskih rastlinojedih sesalcih je absorpcija anorganskih Hg spojin v telo omejena, absorpcija ostalih 2 % organskih Hg spojin pa celostna. MeHg se iz hrane skupaj z vezavo na beljakovinske komponente absorbira iz prebavnega trakta v kri. Po krvožilnem sistemu se MeHg prenaša do telesnih tkiv, se veže na - SH skupine različnih makromolekul in povzroča mutagene ter rakotvorne učinke (Gnamuš, 2002).
2.2 SELEN
2.2.1 FIZIKALNE IN KEMIJSKE OBLIKE SELENA
Selen je leta 1817 odkril švedski kemik Jons Jakob Berzelius - na dnu svinčevih komor v tovarni žveplove kisline. Zaradi podobnosti z elementom telurjem (Te) ga je kemik poimenoval po luni, grško »selene«. Nahaja se v VI. skupini periodnega sistema s kemijskim simbolom Se in atomskim številom 79 (Brenčič in Lazarini, 1995). Selen ima veliko afiniteto do tvorbe vezi z mnogimi anorganskimi in organskimi ligandi. V anorganskih spojinah lahko nastopa v štirih oksidacijskih stanjih, in sicer kot elementarni selen (Se0), kot selenid (Se2-), kot selenit (Se4+ - SeO32-) ali kot selenat (Se6+- SeO42-), v organskih spojinah pa se nahaja kot selenocistein (Se- Cys) in selenometionin (Se-Met) (Pyrzyńska, 2002). Organske Se spojine imajo v primerjavi z anorganskimi v telesu daljši zadrževalni čas, so bolj biološko razpoložljive in manj strupene (Hall in sod., 2014).
Njegove kemijske lastnosti so analogne žveplovim, zato Se pogosto zamenjuje S. Pri asimilaciji tako selenovih kot žveplovih anorganskih spojin sodelujejo isti encimi, zato oba elementa tekmujeta v biokemijskih procesih. Ob povišanih koncentracijah Se lahko pride do vključitve Se na mesto v molekuli, kjer je običajno vezano S. Na tak način prihaja do nastanka Se-Cys in Se-Met, kar vodi v napačno zvijanje proteinov in posledično nefunkcionalnost proteinov (Minorsky, 2003, Germ in Stibilj, 2007).
2.2.2 VPLIV SELENA NA ORGANIZME
Selen je eden izmed esencialnih elementov za mnoge organizme, vključno z živalmi in ljudmi.
V majhnih koncentracijah ima pomembno vlogo za normalno delovanje vseh fizioloških funkcij v organizmih, medtem ko je v velikih koncentracijah strupen. Esencialnost tega elementa za višje rastline še vedno ni dokazana (Hasanuzzaman in sod., 2014). Primarni vir Se za človeka predstavljajo rastline. Težava nastane, če ljudje v želji po vnosu zadostnih količin Se v telo, uživajo pretežno rastlinsko hrano, ki uspeva v tleh, onesnaženih s kovinami (Zhang, 2014).
Kopičenje Se v tleh je odvisno od vrste in strukture tal, vsebnosti organskih snovi in od količine padavin. Slednja z izpiranjem zmanjša količino Se v tleh. Povprečna koncentracija Se v tleh se giblje od 0,1 do 0,7 mg kg-1 zemlje, večje koncentracije pa že lahko povzročajo negativne učinke na organizme (Martens in sod., 1996; Barceloux, 1999).
Največ Se v tleh se nahaja v obliki selenita (SeO42-) in selenata (SeO32-). Slednjega rastline privzemajo največ, saj je dobro topen v vodi in tako rastlinam lahko dostopen. Zaradi kemijske podobnosti s sulfatom se transportira v kloroplaste preko sulfatnih transporterjev v membrani celic korenin (Terry in sod., 2000). Selenat se zaradi dobre topnosti v vodi akumulira v poganjkih, medtem ko se slabše topni selenit in organske oblike Se zadržujejo predvsem v koreninah (Terry in sod., 2000). Znano je, da lahko rastline sprejemajo Se tudi iz ozračja preko površine listov. To so dokazali tudi Wang in sod. (2013), kjer je bila koncentracija Se v zrnju koruze v primeru foliarnega nanosa večja kot koncentracija Se v zrnju koruze, ki je kalilo v substratu z dodanim Se.
Selen ima na rastline pozitivne in negativne učinke. V nižjih koncentracijah Se deluje kot antioksidant, ki ščiti rastline pred oksidativnim stresom, poleg tega pa pospeši rast sadik, upočasni njihovo staranje, pozitivno vpliva na biomaso rastlin ter zmanjša transpiracijo v sušnih obdobjih (Xue in sod., 2001; Pennanen in sod., 2002; Germ in sod., 2005). V primeru povečane koncentracije Se v rastlinah lahko upočasni rast, zmanjša sintezo proteinov, povzroči ovenelost listov ter s tem hitrejši propad rastline (Terry in sod. 2000).
Tudi živalske vrste so v primeru prevelike zaužite količine Se dovzetne za zastrupitev z njim.
Zastrupitev je pogosta pri pašnih živalih (ovce, goveda, konji), saj jim glavni vir hrane predstavljajo rastline, ki lahko kopičijo povišane koncentracije Se (Hall in sod., 2014).
2.3 INTERAKCIJE ŽIVEGA SREBRA IN SELENA
Zaščitne vloge Se pred strupenimi učinki Hg segajo že v leto 1967, ko sta Pařizek in Ošťadalova (1967) na svojih poskusnih organizmih (podgane) dokazala, da Se v obliki selenita zmanjšuje črevesne in ledvične nekroze, povzročene z vbrizgano anorgansko Hg spojino (HgCl2). Leta 1972 so Ganther in sod. ob prisotnosti Se pokazali tudi zmanjšano strupenost MeHg v ribah.
Od takrat naprej so študije na mikroorganizmih, ribah, perutnini, ljudeh in drugih sesalcih še dodatno potrdile pozitivne učinke Se in s tem odprle možnost, da je Se-Hg antagonizem splošno razširjen med organizmi, če ne celo univerzalen (McNear in sod., 2012).
Prvi, ki so proučevali interakcije Hg-Se v rastlinah so bili Shanker in sod. (1996). Njihove testne rastline so bile redkvice (Raphanus sativus), ki so bile izpostavljene Hg v kombinaciji dodajanja selenata ali selenita v dveh različnih substratih, v prsti in pesku. Opazili so zmanjšanje privzema Hg v redkvice z naraščajočimi koncentracijami Se ne glede na anorgansko obliko Se. Opazili so, da je zmanjšan privzem Hg v rastline rezultat tvorbe kompleksa Hg-Se v rizosferi. Varovalni učinki rastline se kažejo v znižanem pH okoli korenin, ki je posledica sproščanja organskih kislin iz korenin. Znižan pH okoli korenin povzroči redukcijo selenata in selenita do elementarnega Se0, ki se poveže s Hg2+ v stabilen, netopen in zato rastlinam nedostopen Hg-Se kompleks.
Prvi poskus določitve kompleksov Hg-Se v rastlinah so izvedli Mounicou in sod. (2006), ki so indijsko ogrščico (Brassica juncea) na hidroponiki izpostavili Hg in Se. Ugotovili so, da se je v koreninah, izpostavljenih Hg, akumuliralo več Hg, kot pa v koreninah, izpostavljenih Hg in Se. Pri slednjih se Hg ni translociral v nadzemne dele rastlin, čemur so vzrok pripisali najverjetnejši vezavi Hg in Se na vodotopne polisaharidne ali proteinske biomolekule z visoko molekulsko maso ali pa tvorbi netopnih Hg-Se kompleksov. Ti izsledki bi bili lahko izredno pomembni v smislu uživanja nadzemnih delov nekaterih rastlin, gojenih na s Se bogatih ter s Hg onesnaženih tleh. Njihove raziskave so leta 2012 potrdili tudi Zhang in sod., ki so zmanjšan privzem Hg2+ iz zemlje v korenine riža pripisali tvorbi netopnega Hg-Se kompleksa v rizosferi in/ali na površini korenin. Tako so pokazali, da v riževih zrnih Se igra pomembno vlogo v omejevanju biorazpoložljivosti, biodostopnosti, privzema in bioakumulacije Hg2+ iz zemlje v podzemne in naprej v nadzemne dele riža.
Kljub hitremu širjenju Hg-Se antagonizma med organizmi, je še veliko kraljestev neraziskanih.
Tako je še danes vloga Se na sam privzem Hg v rastline tako v vodnih kot tudi v terestričnih ekosistemih slabo raziskana.
2.4 AJDA
Ajda je starodavna rastlina, ki je bila nekoč v Sloveniji in ponekod drugje hrana kmečkih delavcev in revnih ljudi. Vsebuje zelo kakovostne beljakovine, ki so ljudi v starih časih, ko si niso mogli privoščiti mesa, nasitile, poleg tega pa jim zagotovile tudi druge nujno potrebne snovi (Vombergar in sod., 2012). Njeno ime, kot ga poznamo v Sloveniji, izhaja iz nemške besede Heide, z drugo besedo »ajd, pogan«, saj so jo v 12. stoletju križarji prinesli iz poganskih krajev jugozahodne Kitajske, Junan. Od tam se je postopoma širila proti severu Kitajske, se preko Rusije in Ukrajine razširila v srednjo Evropo in potem naprej proti zahodni Evropi (Kreft, 1995).
Ajda po botaničnih lastnostih ni uvrščena med prava žita, ki so enokaličnice (Poaceae), temveč v družino dresnovk (Polygonaceae), ki so dvokaličnice (Bonafaccia in Fabjan, 2003). Kljub tej botanični razliki pa jo v kmetijstvu in trgovini skupaj z žiti uvrščamo v isto skupino, saj jo pridelujemo na podoben način kot žita in njena mleta zrna uporabljamo za moko (Kreft, 1995).
Je zelo nezahtevna poljščina, skromna glede potreb po hranilih. Zaradi sposobnosti korenin, da lahko izkorišča snovi, ki drugim rastlinam niso dostopne, gnojenje sploh ni potrebno. Je neobčutljiva na bolezni in škodljivce in deluje kot naravni herbicid. V primerjavi z drugimi žiti vsebuje določene snovi, t.i. naravne antioksidante, ki v rastlini služijo kot naravni obrambni mehanizmi, imajo pa tudi ugoden učinek na zdravje ljudi (Kreft, 1995; Kreft, 2010).
Slovenija je od nekdaj poznana po ajdovih žgancih, kruhu, štrukljih in kaši ter zagotovo je ajda rastlina, s katero si lahko popestrimo vsakdanjo prehrano. V zadnjih letih se počasi, a vztrajno vrača na slovenska polja. Poleg tega, da lahko njeno uživanje prispeva k ohranjanju našega zdravja, so cvetoča polja ajde ne samo paša za čebele, temveč tudi prispevek k ohranjanju lepe slovenske kulturne krajine.
Kreft (1995) navaja, da pri nas poznamo dve vrsti ajdi: navadno (Fagopyrum esculentum) in tatarsko (Fagopyrum tataricum) ajdo.
2.4.1 NAVADNA AJDA
Navadna ajda (Fagopyrum esculentum Moench) je enoletna rastlina, ki lahko v nižinskih predelih, pod pogojem, da ima na voljo dovolj hranil, vlage in časa za rast, doseže tudi do 150 cm. V skromnih razmerah njena višina doseže le okoli 30 cm, v hribovitih območjih pa do 70 cm. Korenine ajde se z dolgimi koreninskimi laski v zemlji razraščajo zelo plitvo. Stebla navadne ajde so zelena, na osončeni strani pa pogosto rdečkasto obarvana. Steblo ajde je sočno in zaradi vsebnosti oksalne kisline kiselkastega okusa. Listi so srčasto puščičasti in skoraj tako široki kot dolgi (Kreft, 1995). V mesecu avgustu so dišeče cvetoči beli, rožnati ali rdečkasti cvetovi ajde vaba za čebele, ki nabirajo medičino in s tem prenašajo pelod iz rastline na rastlino.
Semena navadne ajde so gladka, triroba, svetlo sive do srebrne barve (Vombergar in sod., 2014).
2.4.2 TATARSKA AJDA
Tatarska ajda (Fagopyrum tataricum Gaertn.) znana tudi kot zelena ali grenka ajda je zelo podobna navadni ajdi, vendar je opaznih nekaj morfoloških razlik. V primerjavi z navadno ajdo so stebla navadno zelena, cvetovi so manjši, skoraj neopazni, zeleno ali zeleno rumene barve.
Prav zaradi tega se cvetovi samooprašijo, obiskujejo jih le nekatere manjše žuželke. Semena tatarske ajde so triroba, robovi niso gladki, temveč nagubani in nekoliko zaobljeni. So zelene ali rjave barve (Vombergar in sod., 2014).
2.5 KEMIJSKA SESTAVA NAVADNE IN TATARSKE AJDE
V starih časih so bila ajdova zrna primarni vir prehrane ljudi. Ajdovo zrno vsebuje različne hranilne snovi, ki pozitivno vplivajo na naše zdravje. Mednje prištevamo proteine, polisaharide, prehranske vlaknine, lipide, antioksidante in mikrohranila (Kim in sod., 2004). Vsebnost posameznih snovi je odvisna od sorte ajde in okoljskih dejavnikov (Barta in sod., 2004).
Škrob predstavlja glavno komponento v semenu ajde, saj zavzema kar 70 % v suhi snovi.
Kemijsko je sestavljen iz dveh strukturnih komponent, amiloze, kjer so glukozne enote povezave v nerazvejane verige in amilopektina, kjer so glukozne enote povezane v razvejane verige (Zhu, 2016). Zaradi večje vsebnosti nerazvejanega škroba, ki se prebavlja bistveno počasneje, je ajda primerna za bolnike s sladkorno boleznijo ter za ljudi s celiakijo, saj ne vsebuje glutena (Kreft, 1995).
Ajda vsebuje veliko vlaknin, ki lahko prispevajo k zmanjšanju črevesnega raka in debelosti.
Bonafaccia in sod. (2003) so ugotovili, da navadna in tatarska ajda vsebujeta enake količine vlaknin, le da so pri tatarski ajdi nekoliko bolj topne, odvisno od tipa, rastnih razmer in metode mletja ajde. Z vlakninami izredno bogate snovi so ajdovi otrobi, ki predstavljajo 21 % proteinov v navadni ajdi in 25 % proteinov v tatarski ajdi. Proteini v ajdi so zelo kakovostni, saj vsebujejo vseh osem esencialnih aminokislin (Kreft, 1995). Otrobi navadne in tatarske ajde so tudi znani po visoki vsebnosti vitamina B2. Vsebnost ostalih vitaminov B, vitamin B1 (tiamin) in B2
(riboflavin) je v primerjavi z navadno ajdo, večja v tatarski. Dokazali so tudi, da tatarska ajda vsebuje 6 % več vitamina B12 (Bonafaccia in sod., 2003).
Čeprav ajdovo zrno vsebuje različne hranilne snovi, težava nastane pri uživanju nadzemnih delov ajde. Namreč zeleni deli ajde vsebujejo fluorescenten rdeč pigment t.i. fagopirin, ki pri ljudeh in živali povzroča občutljivost na svetlobo. Ob preveliki količini zaužitih zelenih delov rastlin ajde in ob hkratni izpostavljenosti sončni svetlobi, lahko pride do fagopirizma. Bolezen se kaže v obliki srbečice in vnetja na neporaščenih predelih telesa (Benković in Kreft, 2015).
2.6 RASTLINE IN OKSIDATIVNI STRES
Rastline so izpostavljene različnim stresnim dejavnikom. Naj bo to izpostavljenost patogenim mikroorganizmom oziroma izpostavljenost neugodnim okoljskim dejavnikom, se bo rastlina na stres ali prilagodila ali pa bo stres zanjo premočan in ji bo tako onemogočil rast in razvoj.
Kisik je ključnega pomena za preživetje rastlin, vendar lahko zanje predstavlja tudi velik problem, če se pretvarja v reaktivne oblike kisika (ROS) (Jovanovic in Simic, 2000). Reaktivne kisikove spojine (ROS) so prosti radikali oz. atomi, molekule ali ioni z vsaj enim prostim elektronom brez para (Korošec, 2000). Glavni vir nastanka ROS predstavlja mitohondrijska elektronska transportna veriga, ki za produkcijo energije v celici porabi več kot 90 % kisika (Lushchak, 2011). Energija se sprošča ob redukciji kisika v vodo. Ob nepopolni redukciji nastajajo delno reducirane oblike kisika, ki imajo težnjo po stabilnosti. Med njih prištevamo reaktivne superoksidne anione (O •-), vodikove perokside (H O ) in hidroksilne radikale (OH•).
2.7 ANTIOKSIDANTI
V organizmu homeostazno neškodljivo koncentracijo ROS uravnavajo antioksidanti. V tem primeru ROS pozitivno delujejo kot signalne molekule, ki so vključene v razvojne procese in rast celic ter imajo obrambne odzive na patogene, saj omejijo širitev okužbe z okrepitvijo celičnih sten. Ko nastanek ROS preseže antioksidativno kapaciteto, nastane za organizem neugodno stanje, imenovano oksidativni stres. Oksidativni stres se kaže v poškodbah celičnih struktur, vključno z nukleinskimi kislinami, beljakovinami in proteini (Apel in Hirt, 2004).
Spremembe lahko privedejo do mutacij, kot so delecije in substitucije v molekuli DNK, kar je povod za razvoj rakastih obolenj (Cao in sod., 2008).
Med antioksidante prištevamo encime, vitamine (vitamin A, C in E), karotenoide (beta karoten, alfa karoten, lutein, likopen) in polifenolne spojine, vključno s flavonoidi (katehini, flavonoli, flavoni in izoflavonoidi) (Cao in sod. 2008). Ti organizem pred oksidativnim stresom zaščitijo z lovljenjem prostih radikalov, s keliranjem kovinskih ionov, lahko pa tudi z odstranjevanjem in popravilom oksidativno poškodovanih biomolekul. Prosti radikali na ta način pridobijo manjkajoče elektrone in se pretvorijo v stabilno, neškodljivo obliko (Hegedus in sod., 2001;
Cao in sod., 2008).
2.7.1 POLIFENOLNE SPOJINE
Fenolne spojine so neencimski antioksidanti, sestavljene iz najmanj enega aromatskega obroča in najmanj ene hidroksilne (-OH) skupine, vezane na obroč. V naravi so spojine običajno prisotne z več -OH skupin, od tod ime polifenolne spojine. Znano je, da se njihova antioksidativna učinkovitost povečuje z naraščanjem števila -OH skupin. So sekundarni rastlinski metaboliti, ki sodelujejo pri reprodukciji rastlin in njihovi rasti. Pomembno vlogo imajo tudi pri preprečevanju bioloških razkrojev ter pred vdorom patogenov in plenilcev (Bravo, 1998 in Chao in sod., 2002). Polifenolne spojine delimo na hidrolizirajoče tanine, lignine, stilbene, tripolene in flavonoide. Slednji so najbolj razširjeni sekundarni metaboliti v rastlinskih celicah (Luthar, 1992).
Flavonoidi
Flavonoidi so najpogostejša in najbolj razširjena skupina rastlinskih vodotopnih polifenolnih spojin s strukturno formulo C6C3C6. Nahajajo se v vakuolah vsake rastlinske celice in ščitijo rastline pred različnimi biotskimi (virusi, bakterije, glive) in abiotskimi (odpornost na mraz, sušo) dejavniki. Hkrati delujejo kot signalne in obrambne molekule pred UV-sevanjem ter so odgovorni za barvo cvetov, s katerimi privabljajo insekte za opraševanje (Samantha in sod., 2011).
Najbolj poznani rastlini, bogati s flavonoidi sta navadna in tatarska ajda. Vsebnost in sestava flavonoidov v semenih ajde je odvisna od vrste le-te in razvojne faze. Holasova in sod. (2002) so dokazali, da ima ajda večjo antioksidativno učinkovitost na račun do 5-krat večje vsebnosti polifenolnih spojin v primerjavi z ovsom in ječmenom.
Najpomembnejši flavonoidi v ajdi so rutin, kvercetin in kvercetrin. Fabjan in sod. (2003) so v svojih raziskavah ugotovili, da zrnje tatarske ajde vsebuje več rutina kot zrnje navadne ajde.
Vsebnost rutina in kvercetina je odvisna od genotipa ajde, rastnih pogojev, razvojne faze, dela rastline, leta žetve ter okoljskih dejavnikov. Največ rutina je v socvetju, v steblih in zgornjih listih (Hagels, 1999).
2.7.2 ANTIOKSIDATIVNA FUNKCIJA POLIFENOLOV IN KOVINE
Kovine pomembno prispevajo k onesnaževanju okolja, ki so posledica človekovih dejavnosti, kot so rudarstvo, taljenje, galvanizacija, proizvodnja energije in goriva, intenzivno kmetijstvo, odlaganje odpadkov in podobno (Nedelkoska in Doran, 2000). Kopičenje kovin v zemlji lahko privede do njihove bioakumulacije v rastline, kar predstavlja veliko tveganje za zdravje živali in potencialno tudi ljudi (Kabata-Pendias in Pendias, 2001).
Dietz in sod. (1999) so poročali, da lahko kovine povzročijo oksidativni stres v celicah in tkivih na več načinov:
1. H2O2 difundira skozi celične membrane. Ob prisotnosti železovih (Fe2+) ali bakrovih (Cu+) ionov pride do reakcije, kjer se kovinski ion oksidira, H2O2 pa pretvori v hidroksilni radikal (OH•), ki je najbolj reaktiven prosti radikal.
2. Kovine motijo metabolične poti, še posebej v tilakoidnih membranah, kjer prihaja do povečane tvorbe prostih radikalov.
3. Kovine večinoma inaktivirajo antioksidativne encime (glutation peroksidaze, katalaze, superoksid dismutaze), ki so odgovorni za razstrupljanje prostih radikalov.
4. Akumulacija kovin povzroči izčrpanost antioksidantov z nizko molekulsko maso, npr.
glutationa.
Rastline so razvile različne antioksidativne mehanizme za obrambo pred kovinami. Eden izmed njih je tvorba fenolnih spojin, ki oksidacijo lipidov, zaradi kovin, zmanjšajo s kelacijo ionov kovin. Sestavni del fenolov so hidroksilne (-OH) in karboksilne (-COOH) skupine, ki so sposobne vezave kovinskih ionov, še posebno Cu+ in Fe2+ v kelatne spojine (Jung, 2003).
Dokazano je bilo, da korenine koruze, izpostavljene aluminiju (Al), izločajo velike koncentracije fenolnih spojin (Winkel-Shirley, 2002). Lavid in sod. (2001) so v metanolnih ekstraktih lokvanjevk (Nympheaeceae) dokazali kelacijo Cr, Pb in Hg oz. vezavo le-teh na polifenole. Morgan in sod. (1997) kelacijo pripisujejo visokim nukleofilnim značajem aromatskega obroča in ne specifičnim kelatnim skupinam znotraj molekule.
Ioni kovin lahko reagirajo z lipidnimi hidroperoksidi, ki so produkti lipidne peroksidacije. S cepitvijo vezi med O-O nastanejo alkoksilni radikali, ki sprožijo verižno reakcijo lipidne peroksidacije. Fenolne spojine preprečujejo lipidno peroksidacijo z lovljenjem alkoksilnih radikalov. Reakcija je pogojena s strukturo molekule ter številom in položajem hidroksilnih skupin v molekulah fenolnih spojin (Millic in sod., 1998). Bors in sod. (1990) opišejo tri karakteristike za determinacijo močnih antioksidantov: (i) prisotnost orto-dihidroksi oziroma kateholne skupine na obroču B, (ii) 2,3-dvojno vez na obroču C ter (iii) hidroksilni skupini na mestih 3 in 5.
Raziskave so tudi pokazale, da lahko flavonoidi delujejo kot donorji elektronov ali atomov vodika (Arora, 1998). Atom vodika se poveže z reaktivnim radikalom. Na ta način se radikali stabilizirajo, sam radikal antioksidanta pa še lahko reagira z naslednjim reaktivnim radikalom.
Ena molekula antioksidanta lahko torej stabilizira dva prosta radikala (Fuhrman in Aviram, 2002).
3 METODE DELA
3.1 RASTLINE
3.1.1 PRIPRAVA SUBSTRATA
Za poskus smo uporabili zemljo, nabrano okoli dimnika nekdanjega delujočega rudnika in talilnice Hg v Idriji. Nabrano zemljo smo razporedili na vrečki za smeti, jo 3 dni sušili na zraku pri sobni temperaturi ter jo presejali. Na ta način smo se izognili morebitnim prisotnim koreninam, kamenju in drugim. Zemljo smo nato enakomerno razdelili v 4 različna korita za rože, v vsakega izmed njih po približno 3 kg.
3.1.2 GOJENJE RASTLIN
Za poskus smo si izbrali dve vrsti ajde, in sicer navadno (Fagopyrum esculentum) ter tatarsko (Fagopyrum tataricum) ajdo. Imeli smo 4 različne izpostavitve, od tega 2 izpostavitvi navadne in 2 izpostavitvi tatarske ajde. Semena dveh vrst ajd smo enakomerno razporedili po zemlji ter jih zalili z vodo.
Ajde smo gojili 7 tednov v kontroliranem okolju, v rastnih komorah pri 60 % relativni zračni vlagi, 16/8 dnevno/nočni periodi in temperaturi 19 °C. Zalivanje ajd je potekalo dvakrat tedensko, od tega smo jo enkrat tedensko za boljšo rast zalivali s hranilno Hoglandovo raztopino (sestava: 250 mM Ca(NO3)2, 250 mM KNO3, 250 mM MgSO4, 250 mM KH2PO4,50 µM FeNaEDTA, mikroelementi, destilirana H2O) (Machils in Torrey, 1965).
3.1.3 IZPOSTAVITEV RASTLIN SELENU
Po treh tednih gojenja ajd, ko so bile velike približno 10 cm, smo eno korito navadne in eno korito tatarske ajde listno obogatili s Se. Pripravili smo 5 µM raztopino K2SeO4 (Alfa aesar) in s pripravljeno raztopino poškropili liste ajd. Ostali dve koriti smo škropili z navadno destilirano vodo. Ajde smo s Se škropili dvakrat tedensko, do konca poskusa.
3.1.4 DOLOČANJE SUHE BIOMASE
Po sedmih tednih smo poskus končali. Najprej smo zemljo v posameznem koritu razrezali na 10 enakih delov. V vsakem delu je bilo od 30 do 50 rastlin ajde. Nadzemne dele rastlin smo ločili od korenin in jih sprali z destilirano H2O za odstranitev morebitno prisotnega Se.
Korenine smo za lažjo odstranitev iz substrata namočili v vodovodno vodo, jih sprali z destilirano H2O ter jih osušili s pomočjo papirnatih brisač. Nato smo zatehtali po 80 mg svežih korenin in 80 mg svežih poganjkov, ki smo jih uporabili za določanje stopnje lipidne peroksidacije. Material smo strli v terilnici s pomočjo tekočega dušika ter jih shranili v 2 ml epice. Epice smo takoj prenesli v tekoči dušik ter jih do nadaljnje analize hranili v zamrzovalniku na -80 °C. Preostanek posameznega rastlinskega materiala smo ločeno zavili v aluminijasto folijo, vsak paket ustrezno označili in jih prav tako zmrznili v tekočem dušiku.
3.1.5 MERJENJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV
Za merjenje fotosinteznih pigmentov smo uporabili liofilizirane poganjke. V steklene centrifugirke smo zatehtali po 30 mg uprašenih liofiliziranih poganjkov, vzorcu dolili 5 ml 80
% acetona (Empatra, ASC Nemčija) ter premešali na vorteksu. Na centrifugirkah smo označili nivo acetona, jih pokrili z gumijastimi pokrovčki, da smo se izognili izhlapevanju acetona ter jih čez noč shranili v hladilniku. Naslednji dan smo do označene črte vzorca dopolnili z 80 % acetonom, ki je med nočjo kljub zamaškom izhlapel. Vzorce smo ponovno premešali na vorteksu in centrifugirali 2 minuti pri 2500 obratih/minuto pri sobni temperaturi.
Tako pripravljenim vzorcem smo s pomočjo spektrofotometra 8452A (HP-Hewlett Packard) izmerili absorpcijo pri valovnih dolžinah 470, 647 in 664 nm. Spektrofotometer smo umerili z 80 % acetonom, katera vrednost se je odštela od vsakega izmerjenega vzorca posebej (Monni in sod., 2001).
Iz dobljenih absorpcij smo preko enačb preračunali koncentracijo posameznih pigmentov v µmol/l za klorofil a, klorofil b in karotenoide (Graan in Ort, 1984). Na koncu smo izračunali še končne koncentracije fotosinteznih pigmentov v mg/g suhe mase, pri čemer smo upoštevali še maso rastlinskega materiala in volumen ekstrakta.
3.1.6 DOLOČANJE STOPNJE LIPIDNE PEROKSIDACIJE
Stopnjo lipidne peroksidacije se določa preko indikatorja malondialdehida (MDA), ki je sekundarni produkt oksidacije in encimske razgradnje večkrat nasičenih maščobnih kislin.
Metoda temelji na kislinski razgradnji lipidnih hidroperoksidov v MDA. MDA reagira s tiobarbiturno kislino v rožnato rdeč produkt, TBA-MDA kompleks, ki ga lahko spektrofotometrično pomerimo z določitvijo absorpcije pri valovni dolžini 532 nm (Hodges in sod., 1999).
Zatehtali smo 80 mg svežega rastlinskega materiala (korenine, poganjki) in ga homogenizirali v 2 ml 80 % etanola. Pripravljene epice smo centrifugirali 10 min na 3000 obratih (centrifuga tip 3K30, Sigma). S tem smo pelet ločili od supernatanta, ki smo ga uporabili za nadaljnji postopek. Iz vsake epice smo prenesli dvakrat po 800 µl supernatanta v dve novi epici. V eno izmed epic istega vzorca smo odpipetirali 800 µl +TBA, v drugo pa 800 µl -TBA. Vzorce smo ponovno zvorteksirali, pokrovčke epic s pomočjo segrete ostre kovinske konice preluknjali, jih razporedili na stojala ter segrevali 25 min v pečici (pečica Semlab) na 95 °C. Po preteklih minutah smo vzorce postavili na led ter tako reakcijo ustavili. Ohlajene vzorce smo ponovno centrifugirali 10 min na 3000 obratih. Zaradi bolj zanesljivih rezultatov smo v vsako kiveto odpipetirali po 1 ml posameznega vzorca. Vzorcem smo nato spektrofotometrično pomerili absorpcijo pri valovnih dolžinah 440, 532 in 600 nm. Iz izmerjenih absorpcij smo ob dodatnem upoštevanju volumna in mase rastlinskega vzorca izračunali količino MDA ekvivalenta (Hodgens in sod., 1999).
3.1.7 DOLOČANJE VSEBNOSTI FENOLNIH SPOJIN
Vsebnost fenolnih spojin, flavonoidov in antioksidativne učinkovitosti smo določili spektrofotometrično. Najprej smo si pripravili ekstrakte iz uprašenega rastlinskega materiala.
V 2 ml epico smo zatehtali po 30 mg prahu korenin in poganjkov ajde, dodali 1,5 ml 60 % etanola ter stresali preko noči na stresalniku (Eppendorf). Ekstrakt smo nato centrifugirali pri 4000 obratih 10 minut in bister supernatant uporabili za nadaljnje analize (Kreft in sod., 2013).
3.1.7.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin
Vsebnost skupnih fenolnih spojin smo določili s Folin-Ciocalteu metodo. Folin-Ciocalteu (FC) reagent vsebuje fosmolibdenski/fosfovolframov kompleks. Metoda temelji na redukciji le-tega v prisotnosti fenolnih spojin, ki se kaže v modri obarvanosti raztopine (Magalhaes in sod., 2008).
Posamezen supernatant smo v treh ponovitvah po 20 µl nanesli v mikrotitrsko ploščico. Dodali smo 150 µl H2O ter 10 µl FC reagenta. Vzporedno smo naredili tudi tri kontrole, kjer smo uporabili supernatant in 160 µl H2O. Po 3 minutah smo povsod dodali 20 µl 20 % Na2CO3, raztopljenega v vodi. FC reagent ob dodatku Na2CO3 oksidira fenolne spojine. Po 60 min smo pri valovni dolžini 750 nm pomerili absorbanco nastalega kompleksa. Večja absorbanca pomeni večjo koncentracijo fenolnih spojin (Kreft in sod., 2013; Košmerl in Kač, 2007).
Pomerili smo tudi standardno raztopino pirogalol (determinacijski koeficient R2= 0,997) pri različnih koncentracijah.
Vsebnost skupnih fenolov v vzorcu smo izračunali po enačbi 1:
ܸݏܾ݁݊ݏݐ ݂݈݁݊ݒ (
) =((భି)ି,ଷଵ)∗ೖೞೝೌೖೌ
ଶ,∗ೌೌ (1) A1 - absorbanca vzorca (ekstrakt vzorca + reagent)
A0 - absorbanca slepega vzorca (ekstrakt vzorca + voda).
3.1.7.2 Določanje vsebnosti flavonoidov
Določanje vsebnosti flavonoidov temelji na reakciji flavonoidov in AlCl3, pri čemer se tvori kompleks, ki raztopino obarva rumeno (Bohm, 1998). Po ekstrakciji in centrifugiranju smo posamezen supernatant v treh ponovitvah po 180 µl nanesli v mikrotitrsko ploščico. Vsem trem ponovitvam smo dodali 20 µl 5 % AlCl3 raztopljenega v 100 % etanolu. Po 30 minutah, ko je reakcija potekla, smo na spektrofotometru izmerili absorbanco pri 425 nm. Vzporedno smo naredili tudi kontrolo, kjer smo uporabili supernatant in 100 % etanol (A0). Pomerili smo tudi standardno raztopino rutin (determinacijski koeficient R2= 0,9962) pri različnih koncentracijah.
Vsebnost flavonoidov v vzorcu smo izračunali po enačbi 2:
ܸݏܾ݁݊ݏݐ ݂݈ܽݒ݊݅݀ݒ (
) =((భି)ି,ଷଽଷ)∗ೖೞೝೌೖೌ
,ଶଷ∗ೌೌ (2) A1 - absorbanca vzorca (ekstrakt vzorca + reagent)
A0 - absorbanca slepega vzorca (ekstrakt vzorca + 100 % etanol).
3.1.7.3 Določanje antioksidativnega potenciala
Antioksidativni potencial smo določili s pomočjo meritve koncentracije DPPH* radikala.
Molekula 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH*) je stabilen radikal, ki lahko reagira s spojinami,
kontrolo, kjer smo uporabili supernatant in 100 µl etanola. Po 20 minutah smo pomerili absorbanco (A1) pri valovni dolžini 520 nm.
Skupno antioksidativno aktivnost posameznega vzorca smo določili preko izmerjene stopnje inhibicije DPPH*, ki je premo sorazmerna s količino antioksidantov v vzorcu (Brand-Williams in sod., 1995). Stopnjo inhibicije DPPH*smo določili po 20 min. Delež inhibicije DPPH je bil določen po enačbi 3 in je izražen v odstotkih:
ܫ݊ℎܾ݆݅݅ܿ݅ܽ ܦܲܲܪ (%) =(బି(భିమ) ,ଷଵ
బ ∗ 100 (3) A0 - absorbanca slepega vzorca (100 % etanol + DPPH*)
A1 - absorbanca vzorca (ekstrakt vzorca + DPPH*)
A2 - absorbanca vzorca brez DPPH* (ekstrakt vzorca + 100 % etanol)
3.2 ŽIVALI
3.2.1 PRIPRAVA POLŽEV IN LONČKOV ZA POSKUS
Polže španske lazarje (Arion vulgaris) smo nabrali po okoliških vrtovih. Polže smo v poskusu gojili v veliki plastični posodi. Spodnjo četrtino posode je prekrival mavec, zmešan z vodo in aktivnim ogljem v prahu. Nanj smo položili še filter papir ter ga navlažili z destilirano vodo.
Dodatek aktivnega oglja je preprečeval razvoj plesni in bakterij, zaradi katerih bi polži lahko zboleli, mavec in filter papir pa sta služila kot dober nadomestek zemlje. Slednja tudi dobro zadržujeta vlago, ki jo polži nujno potrebujejo, hkrati pa ne vsebujeta potencialno strupenih elementov, ki bi motili potek poskusa. V vsak primerno označen lonček smo dali po enega polža, katerega smo osušili s papirnato brisačo. Imeli smo 8-10 polžev na izpostavitev.
3.2.2 PRIPRAVA HRANE IN HRANJENJE POLŽEV
Pripravili smo mešanico korenin in poganjkov ajd v razmerju 1:3. Mešanici smo dodali še uprašeno proteinsko mešanico, primerno za presnovne potrebe polžev španski lazar (Arion vulgaris). Proteinska mešanica je vsebovala koruzno moko, sojine kosmiče, ribjo hrano, natrijev klorid (NaCl), sončnična semena, liofilizirane nadzemne dele solate in podzemne dele korenja ter kalcijev fosfat(V) (Ca3(PO4)2) in kalcijev karbonat (CaCO3) v obliki krede.
Proteinsko mešanico smo v terilnici strli s pomočjo tekočega dušika na delčke, manjše od 2 mm in s tem zagotovili večjo absorpcijo med samim procesom prebave. Skupaj z uprašenimi koreninami in poganjki smo iz pripravljene končne mešanice s pomočjo hidravlične stiskalnice naredili 150 mg tabletke. Polži so se hranili 7 dni tako, da je vsak polž na dan dobil po eno 150 mg tabletko. Tabletko smo položili v malo petrijevko znotraj plastične posode, da se le ta ne bi prehitro razmočila na vlažnem filter papirju. Preden je vsak polž prejel novo tabletko hrane, smo njegovo posodo vsakodnevno očistili iztrebkov in zamenjali filter papir. S tem smo zagotovili dobro počutje polžev, kar se je odražalo tudi v njihovi stopnji prehranjevanja. Zadnji dan, 8. dan, polžev nismo hranili, da so čim bolj izpraznili črevo tekom noči. S tem smo preprečili prepolno črevo, ki ga bi lahko zaradi neprevidnosti prebodli med sekcijo. Vsebina bi se lahko izpraznila na tkiva, v katerih smo želeli analizirati mineralne snovi in jih tako onesnažila.
3.2.3 PRIPRAVA POLŽEV ZA MERITVE
Po 9 dneh poskusa smo polže žrtvovali. S pomočjo igle smo jih pritrdili na stiropor in s skalpelom vzdolžno zarezali v smeri od glave proti koncu mišičaste noge. Za nadaljnje analize
imenovana Ringer raztopina (sestava: 80 mM NaCl, 4 mM KCl, 7 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES pufer, pH smo uravnali na 7,5 z NaOH) (Thomas in Postma, 2007). Po 80 mg sveže prebavne žleze smo shranili v že predhodno označene epice, jih zamrznili v tekočem dušiku in jih uporabili za določanje stopnje lipidne peroksidacije celičnih membran, po postopku, ki je opisan za rastline. Preostanek prebavne žleze smo zavili v aluminijasto folijo, ga ravno tako zamrznili v tekočem dušiku in liofilizirali. Postopek smo ponovili tudi za mišico.
Posušen živalski material smo stehtali in na ta način pridobili podatke o suhi masi. Liofiliziran živalski material smo strli v terilnici z dodanim tekočim dušikom. Uprašen liofiliziran živalski material smo nato uporabili za merjenje koncentracij elementov.
3.3 DOLOČANJE KONCENTRACIJ ELEMENTOV V VZORCIH
Iz 0,5 - 1,5 g liofiliziranega uprašenega rastlinskega in živalskega materiala smo s pomočjo nerjavečega modela za izdelavo tabletk in hidravlične stiskalnice stisnili tabletke ter jih stehtali.
Med izdelavo tabletk različnih izpostavitev smo uporabljen model čistili z etanolom in s tem preprečili možnost kontaminacije med vzorci. Tabletke smo do meritev shranili v čistih plastičnih posodicah.
Za analize rastlinskih (korenine in poganjki) ter živalskih vzorcev (prebavna železa in mišica) smo uporabili rentgensko fluorescenčno spektrometrijo (XRF). Metoda je v primerjavi z drugimi tehnikami enostavna v pripravi vzorca, hitra (nekaj 100 do nekaj 1000 sekund), hkrati lahko analizira več elementov ter ima široko koncentracijsko območje analize (Kump, 2005).
Metoda XRF temelji na vzbujanju (ionizaciji) atomov iz osnovnega stanja v vzbujeno stanje, pri čemer so elektroni atomov trdno vezani v K in L lupinah. Prehod v energijsko manj ugodno stanje (vzbujeno stanje) dosežemo s fotoni rentgenske svetlobe iz radioaktivnih izvorov, v našem primeru 109Cd (Nečemer in sod., 2003). Kadar je vzbujevalna energija podobna vezavni energiji elektronov v posamezni lupini, je vzbujanje elektronov najbolj uspešno (Nečemer in sod., 2011). Vzbujeni elektroni pri prehodu nazaj v stabilno osnovno stanje oddajajo odvečno energijo v obliki rentgenske svetlobe, ki je enaka razliki vezavnih energij obeh lupin.
Rentgenska svetloba se v vzorcu absorbira in vzbudi fluorescenčno sevanje, katerega spekter izmerimo z rentgenskim spektrometrom. Izsevano fluorescenčno sevanje je po energiji karakteristično za določen atom, kar nam omogoča določitev elementarne sestave vzorca (Kump, 2005). Iz dodatnih meritev intenzitete oddanega sevanja lahko določimo tudi koncentracije elementa v vzorcu (Kump, 2005; Nečemer in sod., 2011).
Kot primarni vir sevanja za določanje koncentracij Hg in Se smo uporabili radioizotop 109Cd (Isotope Products Laboratories, ZDA). Rentgenska svetloba je obsevala vzorec, izsevano fluorescenčno sevanje smo izmerili z energijsko disperzijskim spektrometrom (EDS), ki je sestavljen iz SDD (silicon drift diode) detektorja (Amptek) in digitalnega multikanalskega analizatorja (Amptek).
Energijska ločljivost rentgenskega spektrometra je bila 140 eV pri 5900 eV (Nečemer in sod.,
Koncentracije Hg in Se smo izrazili v µg g-1 suhe mase za posamezen rastlinski in živalski material, medtem ko smo vsebnost izrazili v µg na rastlinski oz. živalski organ.
Vsebnosti Hg v rastlinskem materialu smo v nadaljevanju uporabili za izračun biodostopnosti Hg za korenine in poganjke. Z biodostopnostjo smo določili, kolikšen delež Hg se je iz zemlje absorbiral v rastline. Biodostopnost Hg smo izračunali tako, da smo vsebnost Hg v koreninah (µg/korenino) oz. poganjkih (µg/poganjek) delili z vsebnostjo Hg v zemlji (µg/korito).
Poleg biodostopnosti Hg za rastlino smo izračunali tudi biodostopnost Hg in Se za prebavno žlezo in mišično tkivo, to je razmerje med količino pojedene hrane in v tkivih nakopičenega posameznega elementa. Biodostopnost smo izračunali tako, da smo vsebnost Hg oz. Se v prebavni žlezi (µg/prebavno žlezo) oz. mišičnem tkivu (µg/mišico) delili z vsebnostjo Hg oz.
Se v pojedeni hrani (µg).
Izračunali smo tudi translokacijski faktor prenosa Hg in Se iz prebavne žleze v mišično tkivo, in sicer tako, da smo vsebnost Hg oz. Se v prebavni žlezi posameznega polža (µg/prebavno žlezo), delili z vsebnostjo Hg oz. Se v mišičnem tkivu istega polža (µg/mišico).
3.4 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV
Za analizo podatkov smo uporabili standardne statistične metode. Podatke smo obdelali v programu MS Excel 2007 in programu Statistica (Statsoft 7.0.61.0.). Statistično značilne razlike smo določili v programu enosmerna ANOVA, Duncanov test (p < 0,05), pri čemer smo predpostavili, da so vzorci normalno porazdeljeni.
4 REZULTATI
4.1 RASTLINE
4.1.1 SUHA BIOMASA
Biomasa korenin je bila pri navadni in tatarski ajdi brez ali z dodanim Se primerljiva. Biomasa poganjkov je bila večja od biomase korenin pri obeh vrstah ajde. Pri navadni ajdi brez ali z dodanim Se ni bilo statistično značilnih razlik, medtem ko je bila biomasa poganjkov tatarske ajde z dodanim Se statistično značilno večja od biomase poganjkov tatarske ajde brez Se (Slika 1).
Slika 1: Suha masa korenin in poganjkov ajd, izpostavljenih zemlji, nabrani v Idriji, brez in s foliarno dodanim Se. Legenda: NA - navadna ajda, NA + Se - navadna ajda s foliarno dodanim Se, TA - tatarska ajda, TA + Se - tatarska ajda s foliarno dodanim Se. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
a a m m
a a
m
n
0 0.5 1 1.5 2 2.5
NA NA + Se TA TA + Se
SM korenin in poganjkov (g)
Izpostavitev
KORENINE POGANJKI
