UGOTAVLJANJE SORODSTVENIH ODNOSOV V PODRODU METULJEV AGRODIAETUS NA BALKANSKEM POLOTOKU

(1)

PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO NAROVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA

Študijski program: Kemija in Biologija

UGOTAVLJANJE SORODSTVENIH ODNOSOV V PODRODU METULJEV AGRODIAETUS NA BALKANSKEM POLOTOKU

DIPLOMSKO DELO

INFERRING THE RELATIONSHIP BETWEEN BUTTERFLY SPECIES IN THE SUBGENUS AGRODIAETUS ON BALKAN

PENINSULA GRADUATION THESIS

Mentor: dr. Rudi Verovnik

Kandidat: Tom Koritnik LJUBLJANA, oktober, 2014

(2)

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa Kemija in Biologija.

Opravljeno je bilo na Katedri za zoologijo Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Komisija za dodiplomski študij Oddelka za biologijo je za mentorja diplomskega dela imenovala doc. dr. Rudija Verovnika. Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: doc. dr. Primoţ ZIDAR

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta

Član: doc. dr. Cene FIŠER

Mentor: doc. dr. Rudi VEROVNIK

Datum zagovora:

Podpisani se strinjam z objavo svojega diplomskega dela v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjiţnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je diplomsko delo, ki sem ga oddal v elektronski obliki, identično tiskani verziji.

Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Tom Koritnik

(3)

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn DK

KG metulji /Lepidoptera /modrini /Polyommatus /Agrodiaetus /Polyommatus admetus /Polyommatus ripartii /Polyommatus eleniae /Polyommatus aroaniensis /Polyommatus orphicus /kriptične vrste /PCR /filogenetska analiza /morfologija kril /fenotipski znaki AV KORITNIK, Tom

SA VEROVNIK, Rudi (mentor)

KZ SI-1261Dobrunje, Pot v Podgorje 3a

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta LI 2014

IN UGOTAVLJANJE SORODSTVENIH ODNOSOV V RODU METULJEV

AGRODIAETUS NA BALKANSKEM POLOTOKU TD Diplomsko delo (univerzitetni študij)

OP VII, 45 str., 3 preg., 6 sl., 49 virov IJ sl

JI sl/en

AI V diplomskem delu smo raziskovali sorodstvene odnose in vrstno pripadnost v podrodu modrinov Polyommatus (subgenus Agrodiaetus) na Balkanskem polotoku. Metulje smo predhodno določili na podlagi fenotipskih znakov. Vse osebke smo nato poskusili tudi natančneje uvrstiti glede na širši nabor morfoloških znakov, ki se uporabljajo v taksonomiji tega podroda. Vrstno pripadnost smo ugotavljali na podlagi primerjave zaporedij mitohondrijskega gena COI, ki se uporablja kot genetska črtna koda. Filogenetske odnose smo ugotavljali z Bayesovo analizo in jih primerjali z morfološkimi določitvami osebkov in njihovo razširjenostjo. Glede na fenotipske znake smo lahko z gotovostjo uvrstili le osebke vrste Polyommatus admetus, pri ostalih vrstah pa je variabilnost fenotipskih znakov prevelika za nedvoumno določitev. Filogenetski rezultati so potrdili prisotnost vsaj petih vrst (P.

admetus, P. ripartii, P. aroaniensis, P. orphicus in P. eleniae) med našimi vzorci. Glede na geografsko razširjenost osebkov posameznih vrst nismo potrdili alopatrije oţje sorodnih vrst.

Simpatrija med bolj sorodnimi vrstami kaţe na reproduktivne bariere tudi med morfološko zelo podobnimi vrstami. Ugotovili smo tudi, da je območje razširjenosti vrste P. orphicus večje, kot je navedeno v literaturi.

(4)

KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)

DN dn DC

CX butterflies /Lepidoptera /blues /Polyommatus /Agrodiaetus /Polyommatus admetus / Polyommatus ripartii /Polyommatus eleniae /Polyommatus aroaniensis /Polyommatus orphicus /cryptic species /PCR /philogenetic analisys /wing morphology /fenotype characteristics

AU KORITNIK, Tom

AA VEROVNIK, Rudi (supervisor) PP SI-1261 Dobrunje, Pot v Podgorje 3a

PB University of Ljubljana, Faculty of Education, Biotechnical faculty PY 2014

TI Inferring the relationship between butterfly species in the subgenus Agrodiaetus on Balkan Peninsula

DT Graduation Thesis (University studies) NO VII, 45 p., 3 tab., 6 fig., 49 ref.

LA sl AL sl/en

AI We studied the phylogenetic relationships in the subgenus of the Polyommatus (subgenus Agrodiaetus) butterflies in the Balkan Peninsula. Preliminarily identifications of all specimens were based on their wing morphology. In turn, all individuals were examined for a larger number of morphological characters, that proved useful in taxonomy of the subgenus.

Phylogenetic relationships were reconstructed using the mitochondrial DNA gene COI, used as a DNA barcodes. We reconstructed phylogeny with the Bayesian analysis and then compared these results with the morphological characteristics and distribution ranges of studied species. Only Polyommatus admetus can be unambigously identified using morphological traits; the identiy of other herein studied species cannot be inferred from morphology alone due to high intraspecific variation. The phylogentic confirmed the presence of at least five species (P. admetus, P. ripartii, P. aroaniensis, P. orphicus in P. eleniae) in our samples. According to the geographical distribution of the samples, we could not confirm alopatry of closely related species. Simpatry between more closely related species suggests that even morphologically similar species are reproductively isolated. We also found that the distribution range of the P. orphicus species is larger than previously thought.

(5)

Kazalo vsebine

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... II KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD) ... III Kazalo vsebine ... IV Kazalo preglednic: ... VI Kazalo slik: ... VI Okrajšave ... VII

1 UVOD ... 1

2 PREGLED OBJAV ... 2

2.1 Ţuţelke ... 2

2.2 Metulji ... 2

2.3 Druţina modrinov (Lycaenidae) ... 4

2.4 Rod Polyommatus ... 5

2.5 Podrod Agrodiaetus ... 5

2.5.1 Polyommatus admetus (Esper, 1783) ... 6

2.5.2 Polyommatus ripartii (Freyer, 1830) ... 6

2.5.3 Polyommatus aroaniensis (Brown, 1976) ... 7

2.5.4 Polyommatus eleniae (Coutsis in De Prins, 2005) ... 7

2.5.5 Polyommatus orphicus (Kolev, 2005) ... 7

2.6 Kriptične vrste ... 8

2.7 Črtne kode DNK ... 8

2.8 Reakcija PCR ... 9

3 MATERIALI IN METODE ... 10

3.1 Vzorci ... 10

(6)

SEZNAM VZORCEV IN LOKALITET ... 11

3.2 Morfologija kril ... 13

3.3 MOLEKULARNOBIOLOŠKA ANALIZA ... 15

3.3.1 Kemikalije, potrošni material in naprave ... 15

3.3.2 Izolacija DNK ... 15

3.3.3 Pomnoţevanje DNK ... 18

3.3.4 Postopek izdelave filogenetskih dreves in Bayesova analiza ... 22

4 REZULTATI ... 26

4.1 Morfologija barvnih vzorcev na krilih ... 26

4.1.1 Preglednica opazovanih fenotipskih znakov ... 28

4.2 Genetska podobnost med osebki ... 30

5 RAZPRAVA ... 33

5.1 Primernost fenotipskih znakov na krilih za ločevanje vrst ... 33

5.2 Določitev vzorcev s filigenetsko analizo ... 34

5.3 Alopatrija in razširjenost vrst ... 35

6 SKLEPI ... 37

7 POVZETEK ... 38

8 VIRI ... 40

Zahvala ... 45

(7)

Kazalo preglednic:

Preglednica 1: Preglednica vzorcev uporabljenih v diplomski nalogi. ... 11

Preglednica 2: Seznam referenčnih in zunanjih vzorcev vključenih v filogenetsko drevo ... 24

Preglednica 3: Seznam vzorcev s pripadajočimi opazovanimi fenotipskimi znaki ... 28

Kazalo slik:

Slika 1: Zemljevid juţnega Balkana z označenimi lokacijami ulova vzorcev in unikatnimi kodami vzorcev. ... 13

Slika 2: Shematski prikaz strukture krila metulja z označbami ... 14

Slika 3: Vzorci LA38, LA53, LA60. ... 15

Slika 4: Vzorec LA62, na podlagi morfologije določen kot vrsta P. admetus. ... 15

Slika 5: Filogenetsko drevo podobnosti izračunano po metodi Bayes ... 32

Slika 6: Zemljevid območja Makedonije, severne Grčije in Bolgarije z označenimi lokacijami vzorcev LA37, LA38, LA39 in LA60 ... 36

(8)

Okrajšave

DNK deoksiribonukleinska kislina COI citokrom oksidaza I

m meter

PRC polymerase chain reaction dNTP deoksiribonukleotidni trifosfat TAE tris-acetatni-EDTA pufer EDTA etilendiaminotetraična kislina

W watt

V volt

Ω-voda ultračista voda

µl mikroliter

ml mililiter

UV ultravijolično

(9)

1 UVOD

Metulji iz druţine Lycaenidae so velika skupina metuljev, ki ţivi po celem svetu. Znotraj druţine ločimo mnogo rodov, sorodnost katerih zadnja leta proučujejo z genetskimi metodami (Kandul in sod., 2004). Teţavna je tudi neurejena vrstna problematika. Trenutno ima status vrste pribliţno 50 taksonov. Mnoge od teh vrst so razširjene le lokalno (Vila in sod., 2010).

Klasifikacija rodov v druţini Lycaenidae je teţavna. Največji rod v druţini je rod Polyommatus, znotraj katerega je največ vrst uvrščenih v podrod Agrodiaetus (Kandul in sod., 2004). Slednji je bil sprva opisan kot samostojen rod (Elliot, 1973), a so ga kasnejše analize uvrstile kot podrod v rodu Polyommatus (Dantchenko in Lukhtanov, 1994; Vila in sod., 2010).

Mnoge vrste iz podrodu Agrodiaetus so spolno dimorfne. Pri teh so samci modri, samice pa različnih rjavih odtenkov. Pri številnih vrstah spolni dimorfizem ni tako izrazit. Ker je vrst znotraj podrodu Agrodiaetus več, kot je znanih različnih vzorcev na krilih pri samcih, lahko domnevamo, da je v podrodu večje število kriptičnih vrst. Poleg nejasnosti glede morfologije imajo vrste znotraj podrodu tudi veliko diverziteto v kariotipih, verjetno celo največjo v ţivalskem kraljestvu (Vila in sod., 2010). Teţave s klasifikacijo te skupine metuljev je opazil ţe Elliot (1973), ko je zapisal: »Priznati moram popolno neuspešnost pri poskusih razdelitve rodu Agrodiaetus v naravne skupine, zato smo vrste organizirali v 30 sekcij.« Ločevanje med vrstami oteţujejo tudi le neznatne razlike v genitalnih strukturah, ki so sicer pomemben določevalni znak pri metuljih (Wiemers, 2003).

Z razvojem molekulsko genetskih postopkov sekvenciranja DNK se je v zadnjih dveh desetletjih odprla moţnost identifikacije osebkov z genetskimi markerji − s črtnimi kodami DNK. Ta postopek omogoča identifikacijo vrst na podlagi unikatnega zaporedja nukleotidov standardnih delov genoma. Ta postopek pogosto ni dovolj za končno identifikacijo, zato večinoma uporabljamo še druge metode identifikacije, kot so morfološki znaki, kariotipske raziskave, študije vedenjskih vzorcev ipd. Metulji znotraj podrodu Agrodiaetus se po fenotipskih znakih slabo razlikujejo, prav tako imajo za določevanje neuporabne genitalije. V

(10)

praksi se uporablja kombinacija morfoloških znakov in genetskih markerjev oz. kombinacija več različnih genetskih markerjev in kariotipizacija (Ajmal Ali in sod., 2014).

Našo raziskavo so vodili naslednji cilji:

- ugotoviti, ali se morfološki znaki, ki jih uporabljamo za ločevanje vrst, ujemajo z molekulsko ugotovljeno filogenijo;

- ugotoviti sorodstvene odnose med vrstami Polyommatus admetus, Polyommatus ripartii, Polyommatus aroaniensis, Polyommatus nephohiptmenos, Polyommatus eleniae in Polyommatus orphicus na Balkanskem polotoku;

- dopolniti poznavanje razširjenosti zgornjih vrst na podlagi zbranega materiala s klasičnimi morfološkimi in z genetskimi metodami.

V delu smo testirali dve hipotezi:

 Morfološko definirane vrste iz podrodu Agrodiaetus na Balkanskem polotoku so tudi genetsko med seboj različne.

 Genetsko med seboj bolj sorodne vrste iz podrodu Agrodiaetus se na Balkanskem polotoku pojavljajo alopatrično, torej geografsko ločeno.

V diplomskem delu smo opravili molekulske raziskave na mitohondrijskem citokromu C oksidaznem genu podenote I (COI) gena in kvalitativno analizo morfoloških vzorcev na krilih.

(11)

2 PREGLED OBJAV

2.1 Žuželke

Ţuţelke so najštevilčnejša skupina metazojev na zemlji. Opisanih je več kot en milijon vrst ţuţelk (Chapman, 2006), ocene številčnosti celotne skupine pa se gibljejo od 2 milijonov (Nielsen in Mound, 2000) do skoraj 6 milijonov vrst (Novotny, 2002).

Najstarejši fosili, ki jih lahko prištevamo k ţuţelkam, so stari 250 milijonov. Te ţivali so ţe imele kompleksno strukturo ţuţelčjega telesa, iz česar lahko sklepamo, da je skupina Insecta mnogo starejša. Fosili, stari od 25 do 35 milijonov let, ţe kaţejo podobnost današnjim ţuţelkam (Klots in Klots, 1970).

Ţuţelke (Insecta) spadajo v deblo členonoţcev (Arthropoda) in poddeblo šesteronoţcev (Hexapoda). Razred ţuţelk se nato razdeli v mnogo redov, eden izmed njih je red metuljev (Lepidoptera) (Štrus in sod., 2002).

Vse ţuţelke imajo telo iz členov. Oporo telesu daje zunanji skelet, ki je iz hitina in sklerotina.

Telo se deli v tri telesne regije: glavo, oprsje in zadek. Na glavi ločimo več struktur, kot so tipalnice, oči in obustni aparat. Na oprsju so trije pari členjenih nog, navadno tudi dva para kril. Zadek ima med drugim odprtine trahej in strukture za izleganje zaroda (leglica ali preobraţena leglica npr. v ţelo) (Daccordi in sod., 1987).

2.2 Metulji

Metulji (red Lepidoptera) so se pojavili pred 100 do 130 milijoni let, kar sovpada z razvojem kritosemenk, ki predstavljajo primaren vir hrane za večino vrst metuljev (Preston-Mafham, 1988).

Poznamo okoli 160.000 opisanih vrst metuljev, vendar je ocena končnega števila vsaj okrog 500.000 vrst. Kljub velikemu številu vrst in razširjenosti na vseh kontinentih so metulji

(12)

strukturno in ekološko homogena skupina v primerjavi z drugimi velikimi skupinami ţuţelk (Kristensen in sod., 2007).

Metulji imajo popolno preobrazbo, kar pomeni, da imajo 4 faze razvoja: jajčece, larva, buba in odrasel osebek. Takšen ţivljenjski cikel pomeni, da larve in odrasli osebki med seboj ne tekmujejo za isti vir hrane (Preston-Mafham, 1988).

Metulje lahko razdelimo v dve skupini: dnevne metulje in vešče, ki veljajo za nočne metulje.

Ta delitev je umetna, saj so pri nekaterih vrstah razlike med skupinama le majhne (Preston- Mafham, 1988).

Metulji se med ţuţelkami s popolno preobrazbo najbolj razlikujejo po luskah na svojih dveh parih kril. Barvila, ki se kopičijo v teh luskah, dajejo metuljem barvo. Luske se ne nahajajo le na krilih, ampak pogosto pokrivajo celotno telo (Daccordi in sod., 1988). Dolge so pribliţno 100 μm in široke okrog 50 μm. Gostota lusk se giblje med 200 do 600 lusk na mm². Barva metuljev je posledica mozaične sestave lusk, katerih barva in intenziteta barve se razlikujeta (Burghardt in sod., 2000). Vzorci na krilih so najpogosteje iz treh, štirih ali petih barv. K pestrosti vzorcev prispeva tudi oblika in zgradba luske same, ki daje vtis bleščečih barv zaradi odboja svetlobe (Preston-Mafhan, 1988). Na glavi je par sestavljenih oči in pri nekaterih vrstah tudi par ocelov, katerih vloga je le delno raziskana. Pomemben organ na glavi so tipalnice, ki nosijo receptorje za voh. Receptorji za voh pa niso omejeni le na antene, ampak jih lahko najdemo tudi drugje po telesu, predvsem na nogah. Dolţina in oblika tipalnic je vrstno specifična, pri tem pa je treba omeniti, da se oblika in velikost anten razlikujeta tudi med spoloma iste vrste. Antene samcev so navadno kompleksnejše, saj jih uporabljajo primarno za iskanje samic (Daccordi in sod., 1988). Obustni aparat je večinoma v obliki rilčka, ki ga tvorita preobraţeni maksili v obliki kanalčka za sesanje tekoče hrane. Ko rilčka ne uporabljajo, ga lahko zvijejo s pomočjo mišic in tlaka v miksocelu. Krila so derivat epidermisa. Oporo jima dajejo hitinaste cevke, ki jim rečemo ţile. Noge imajo tipično ţuţelčjo strukturo, pri nekaterih vrstah pa so reducirane do te mere, da so skoraj neuporabne za premikanje (Lewis, 1985). Zadek je relativno preprost. Sestavljen je iz desetih segmentov, kjer sta zadnja dva segmenta spremenjena. Samci imajo strukturo, s katero primejo samico med parjenjem, samice pa imajo leglico (Preston-Mafham, 1988).

V redu Lepidoptera je mnogo druţin. V nadaljevanju se bomo osredotočili na druţino Lycaenidae, s katero smo se tudi ukvarjali.

(13)

2.3 Družina modrinov (Lycaenidae)

Modrini so druga največja druţina dnevnih metuljev. V primerjavi z drugimi druţinami dnevnih metuljev je večina vrst majhnih. Gosenice modrinov so različne. Najpogosteje so gosenice kratke in čokate. Imajo kratke noge. Glava je skoraj skrita pod oprsjem in nekatere vrste jo lahko potegnejo pod oprsje. Pri večini vrst imajo gosenice na zadku dobro izoblikovane ţleze, ki izločajo sladke tekočine (Preston-Mafham, 1988; Bálint, 1993). Ta izloček je priljubljena hrana nekaterih vrst mravelj, zato mravlje pogosto liţejo sladki izloček in v zameno branijo gosenico pred plenilci. Gosenice nekaterih vrst mravlje odnesejo v mravljišče in jih tam gojijo (Klots in Klots, 1970).

Gosenice te druţine so v načinu ţivljenja močno raznolike. Prehrana gosenic pri modrinih se razlikuje med poddruţinami. Dve največji poddruţini, Theclinae in Polymmmatinae, sta fitofagni in oportunistično kanibalski, odvisno od zunanjih dejavnikov. Hranilne rastline gosenic se razlikujejo med skupinami, raziskovanje in določitev tipičnih hranilnih rastlin pa je teţavno (Klots in Klots, 1970). Teţave povzročajo tudi velike razlike v izbiri hranilne rastline znotraj skupin, saj se npr. Polyommatus icarus v Britaniji pojavlja v eni generaciji na leto, v Španiji pa tudi v štirih generacijah. Slednji tako uporabljajo skozi sezono različne hranilne rastline ţe znotraj ene populacije (Artemyeva, 2005).

V Evropi ţivijo številne vrste iz druţine modrinov, vendar je poddruţina Polyommatini vrstno najštevilčnejša. Samci so večinoma značilne modre barve, so pa samice rjavih odtenkov (Dinca in sod., 2013). Pri nekaterih vrstah takšne razlike v barvi ne opazimo. Mednje sodijo tudi vrste, ki smo jih analizirali v diplomskem delu (Preglednica 3).

Poddruţino Polyommatini sestavlja več rodov, vključno rod Polyommatus (Talavera in sod., 2012). V diplomskem delu smo se ukvarjali z rodom Polyommatus, zato se bomo osredotočili le na opis tega rodu.

(14)

2.4 Rod Polyommatus

Rod Polyommatus je vrstno najbogatejši rod modrinov in šteje pribliţno 460 vrst, četudi je razmeroma mlad. Je splošno razširjena skupina z največ predstavniki v palearktičnih, neotropskih in nearktičnih regijah (Talvera in sod., 2012; Leimar, 1996).

Večina modrinčkov (Polyommatus) se hrani na rastlinah iz druţine Fabaceae (metuljnice) (Wiemersin sod., 2010). Gosenice se po morfoloških znakih med vrstami neznatno razlikujejo.

Rod modrinčkov (Polyommatus) vključuje navadno modro obarvane metulje (samice so rjavih odtenkov), vendar je nekaj vrst tudi takih, kjer spolnega dimorfizma v barvi skoraj ne opazimo. Tipska vrsta znotraj rodu je Polyommatus icarus, ki je tudi najbolj geografsko razširjena vrsta znotraj rodu (Wiemers in sod., 2010; Artemyeva, 2005). Vrste znotraj rodu Polyommatus imajo različno število kromosomov. Poleg različnega števila se kromosomi vrste razlikujejo tudi po velikosti (Wiemers, 2003). Zaradi nestalnih kariotipov je klasifikacija tega rodu problematična.

Druţina Lysandra je bila v preteklosti razdeljena na mnogo rodov, novejše raziskave pa so pokazale drugačno sorodnost. Taksonomsko se danes druţina deli na manjše število rodov v primerjavi z delitvijo v preteklosti, ki se naprej delijo na več podrodov (Agrodiaetus, Lysandra, Plebicula itd.) (Wiemers, 2003; Kandul in sod., 2004; Talvera in sod., 2012).

2.5 Podrod Agrodiaetus

Podrod Agrodiaetus vključuje okrog 130 vrst morfološko precej enotnih metuljev; morfološke razlike med vrstami so neznatne (Talvera in sod., 2012). Vrste se najpogosteje pojavljajo v dveh barvah, modri in rjavi. Samci so po navadi obarvani modro (lahko tudi vijolično ali sivo oranţno), samice pa so rjavih barv. Pri nekaterih vrstah sta oba spola rjava. Ker je vrst znotraj podrodu več, kot je barvnih vzorcev, lahko pričakujemo veliko morfološko kriptičnih vrst (Vila in sod., 2010). V zadnjih desetletjih so številne morfološko identične vrste popisali s pomočjo kariotipov (Wiemers, 2003).

(15)

Podrod Agrodiaetus je razširjen med zahodno Palearktiko in centralno Azijo. Največja pestrost vrst je v Kavkaškem gorovju, Iranu in Sredozemlju (Dinca in sod., 2013).

Hranilne rastline vseh vrst podrodu Agrodiaetus so iz rodov Onobrychis in Hedysarum (druţina Fabaceae). Določevanje vrste metuljev glede na hranilno rastlino je teţavno, saj je določevanje vrste rastline znotraj rodov metuljnic teţko (Wiemers, 2003).

V diplomskem delu smo obravnavali vrste iz podrodu Agrodiaetus: P. admetus, P. ripartii, P.

eleniae, P. aroaniensis in P. orphicus, ki so podrobneje predstavljene v nadaljevanju.

2.5.1 Polyommatus admetus (Esper, 1783)

Naseljuje stepe, predvsem pobočja in pašnike. Razširjen je na Balkanskem polotoku od Madţarske do Grčije. Gosenice prezimijo in se kot odrasli osebki pojavljajo od junija do julija (Tolman in Lewington, 2008). Različne vrste mravelj redno obiskujejo gosenice. Hranilni rastlini sta Onobrychis viciifolia in Onobrychis caput-galli iz druţine metuljnic (van Swaay in sod., 2010a). Odrasli osebki imajo šibko razvito belo črto na krilih in prisotne ter dobro razvite submarginalne pike na krilih (Tolman in Lewington, 2008).

2.5.2 Polyommatus ripartii (Freyer, 1830)

Najdemo ga na travnatih površinah, hribovitih pobočjih in med grmovnatim rastjem.

Razširjenost je precej razdrobljena, saj ga najdemo v severni Španiji, jugovzhodni Franciji, na juţnem Balkanskem polotoku, Turčiji in na območju od juţnega Urala do Altajskega gorovja.

Gosenica prezimi in se hrani spomladi, odrasle metulje pa lahko opazimo v poletnih mesecih.

Gosenice pogosto obiskujejo mravlje različnih rodov. Hranilne rastline so Onobrychis viciifolia, O. arenaria, O. saxatillis in O. alba (van Swaay in sod., 2010b). Odrasli osebki imajo dobro razvito belo črto na krilih, vendar se pri nekaterih grških populacijah pojavljajo variacije v debelini in intenziteti črte (Tolman in Lewington, 2008; Pamperis, 2009).

(16)

2.5.3 Polyommatus aroaniensis (Brown, 1976)

Pojavlja se na suhih travnatih površinah, v grmičevju ob gozdovih, na kamnitih pobočjih in na gozdnih travnikih. Letno se izmenja ena generacija osebkov, prezimijo pa v stadiju ličinke.

Zaradi sladkega izločka gosenice pogosto obiskujejo mravlje. Hranilna rastlina je Onobrychis arenaria iz druţine metuljnic. Vrsta je endemična za Evropo. Najdemo jo v gorah v Grčiji in v juţni Bolgariji na nadmorski višini 400−1500 metrov (van Swaay in sod., 2010e; Melovski in Bozhinovsk, 2014). Bele črte na krilih pri 60−70 % osebkov ni (Tolman in Lewington, 2008; Lukhtanov in sod., 2003). Vrsto P. aroaniensis nekateri avtorji obravnavajo kot kompleks vrst, saj genetske preiskave kaţejo moţno prisotnost več vrst (Coutsis in De Prins, 2005).

2.5.4 Polyommatus eleniae (Coutsis in De Prins, 2005)

Vrsta se pojavlja na travnatih površinah. Je endemit iz gorovja Falakro v severovzhodni Grčiji. Hranilne rastline so Onobrychis spp. Podrobnosti o habitatu in nahajališčih niso znane, saj je vrsta redka (van Swaay in sod., 2010d). Morfološko je vrsta zelo podobna vrsti P. aroaniensis. Črna pika v celici na sprednjih krilih je komaj vidna ali manjka. Bela črta na krilih je slabo vidna ali manjka. Samci imajo razvito belo črto bolje kot samice, a slabše kot vrsta P. ripartii (Coutsis in De Prins, 2005).

2.5.5 Polyommatus orphicus (Kolev, 2005)

Velja za zelo ogroţeno vrsto. Omejena je na Rodopsko gorovje na meji med Grčijo in Bolgarijo. Glavni dejavnik, ki omejuje razširjenost te vrste, je lokalno razširjena hranilna rastlina Onobrychis alba. Osebke najdemo na suhih in kamnitih pobočjih (van Swaay in sod., 2010c). Po morfoloških znakih spominja na vrsti P. aroaniensis in P. dantchenkoi. Bela črta na krilih je dobro razvita. Submarginalne pike na krilih so slabo vidne ali jih ni, ukrivljenost

(17)

pik na krilih pa je močnejša od sorodnih vrst (Kolev, 2005). Kolev (2005) vrsto P. orphicus obravnava kot podvrsto Polyommatus dantchenkoi (P. dantchenkoi orphicus ssp.) zaradi enakega števila kromosomov.

2.6 Kriptične vrste

V literaturi najdemo več definicij kriptičnih vrst. Poenostavljeno lahko kriptične vrste razloţimo kot skupino vrst, ki so bile na podlagi morfoloških znakov v preteklosti prepoznane kot ena vrsta (Trontelj in Fišer, 2009; Bickford in sod., 2007). Kriptične vrste predstavljajo problem, saj smo v percepciji močno omejeni na uporabo vizualne informacije, ne pa tudi drugih signalov (kemični, zvočni), ki jih uporabljajo nevretenčarji. Zato bi morali poleg morfoloških znakov vključevati tudi molekulske (genetske) in druge znake (npr. zvočne, vedenjske) ţe v alfa taksonomijo (opisovanje in poimenovanje novih vrst). Prav tako bi se morali genetski vzorci novo odkritih vrst rutinsko shranjevati. Tako se v zadnjih letih spodbuja ponovno vzorčenje ţe znanih vrst, kar je privedlo do odkritja mnogih kriptičnih vrst (Bickfordin sod., 2007). Kriptične vrste so pogoste zlasti pri morskih organizmih, raziskave pa kaţejo, da so kriptične vrste pogoste tudi pri ţuţelkah (Bickford in sod., 2007). Dober primer prisotnosti kriptičnih vrst je obravnavani podrod Agrodiaetus (Vershinina in Lukhanov, 2010).

2.7 Črtne kode DNK

Črtne kode DNK oz. »barcoding« temelji na predpostavki, da lahko na podlagi kratke standardizirane sekvence ločimo vrste med seboj, saj so genetske razlike med vrstami večje kot znotraj njih (Hajibabaei in sod., 2007; Wilson, 2004). Identifikacijo vrst s pomočjo

»barcodinga« omogoča uporaba kratkega odseka DNK (pribliţno 650 baznih parov) na standardiziranem odseku genoma. Pri ţuţelkah je to najpogosteje citokrom C oksidazni gen podenote I (COI) genu, ki ga lahko rutinsko pomnoţimo s postopkom PCR (Frézal in Leblois, 2008; Ajmal Ali in sod., 2014). Morfološko lahko prepoznavne vrste običajno določimo s pomočjo morfoloških znakov; nasprotno pa v številnih primerih morfologija za točno

(18)

identifikacijo vrste ne zadošča, zato se moramo zateči k uporabi črtne kode (Floyd in sod., 2002).

2.8

Reakcija PCR

Reakcija PCR (Polymerase Chain Reaction) je metoda pomnoţevanja verige DNK s pomočjo polimeraze DNK. Metodo je razvil Kary Mullis leta 1985. Metoda pomnoţi zelo majhne koncentracije DNK do te mere, da so uporabni za različne analize. Encim DNK polimeraza spodbudi nastanek komplementarne verige ţe obstoječi verigi DNK, vendar se izgradnja verige lahko začne le na ţe obstoječem 3^'-OH mestu. Za to je potreben začetni oligonukleotid, na katerega se nato veţejo nadaljnji nukleotidi. Pri reakciji PCR ločimo 3 glavne faze: fazo denaturacije, fazo pripenjanja in fazo podaljševanja. Za uspešno reakcijo potrebujemo vzorčno DNK, DNK polimerazo, začetne nukleotide, dNTP (posamezni nukleotidi, iz katerih polimeraza sestavi novo komplementarno verigo DNK) in pufre, ki reakcijo stabilizirajo in vzdrţujejo optimalne pogoje za delovanje polimeraze. V prvi fazi reakcije, fazi denaturacije, reakcijsko zmes segrejemo na 90−97 °C. S tem dvojno vijačnico DNK razklenemo in omogočimo nadaljnje faze. V fazi pripenjanja se začetni oligonukleotidi veţejo na komplementarno mesto na verigi DNK, ki je enoveriţna. Ta faza poteka pri 50−60 °C. V tretji fazi, fazi podaljševanja, polimeraza DNK podaljšuje verigo DNK naprej od mesta, ki ustreza začetnemu oligonukleotidu. Faza poteka pri 72 °C. Pomembno je, katero DNK polimerazo uporabljamo, saj je npr. DNK polimeraza I nestabilna pri visokih temperaturah. Večinoma se uporablja Taq polimeraza, ki ima optimum delovanja pri okrog 70 °C. Vse tri faze so del enega cikla. Število ciklov je odvisno od koncentracije DNK, ki jo ţelimo imeti v končni reakcijski zmesi. Po zadnjem ciklu po navadi sledi inkubacija reakcijske zmesi na 72 °C, zato da se konci novonastalih verig zaključita (Mohini in Deshpande, 2010).

(19)

3 MATERIALI IN METODE

3.1 Vzorci

Vzorci so bili nabrani na različnih lokacijah v juţnem delu Balkana med leti 2010 in 2013 (Preglednica 1, Slika 1). Večina primerkov, na katerih smo opravljali genetske in morfološke preiskave, je samcev. Preliminarna določitev vzorcev je potekala ţe na terenu. Podrobnejšo določitev smo lahko opravili le po podrobnejši analizi genetskih in morfoloških razlik med vzorci in s primerjavo z drugimi vrstami.

Ulovljeni osebki so shranjeni v papirnatih vrečkah, ki imajo dopisano kodo vzorca, datum in lokacijo ulova metuljev.

Za veljavno ugotavljanje sorodstvenih odnosov smo potrebovali tudi zunanje in referenčne vzorce. Kot zunanje vzorce smo uporabili metulje iz podrodu Lysandra, ki smo jih v filogenetskem drevesu uvrstili v rod Polyommatus (P. belargus), tako kot kaţe večina recentnih raziskav (Kandulin sod., 2004; Wiemers in sod., 2010), in metulje iz samostojnega rodu Cyaniris (C. semiargus) (Talavera in sod., 2012). Referenčni vzorci spadajo v podrod Agrodiaetus in pripadajo istim vrstam kot naši vzorci (P. admetus, P. ripartii, P. orphicus, P. eleniae in P. aroaniensis) ali pa sorodnim vrstam, ki niso bile vzorčene (P. nephohiptamenos, P. danchenkoi, P. humedasae). S takšno zastopanostjo bolj ali manj sorodnih vrst smo poskušali doseči čim boljšo uvrstitev naših vzorcev v filogenetsko drevo.

(20)

SEZNAM VZORCEV IN LOKALITET

Preglednica 1: Preglednica vzorcev, uporabljenih v diplomski nalogi.

Koda vzorca Lokacija ulova* Drţava ulova Datum ulova Predhodna določitev vrste

LA35 Mavrovo; Debar,

Rosoki; 910 m Makedonija 30.7.2012 Polyommatus ripartii LA36 Cer; Kićevo; 1100 m Makedonija 28.6.2012 P. ripartii

LA37 Cer; Kićevo; 1100 m Makedonija 28.6.2012 P. aroaniensis

LA38 Kozjak; Skopje, Nova

Breznica; 1070 m Makedonija 13.7.2013 P. aroaniensis

LA39 Kozjak; Skopje, Nova

Breznica; 1070 m Makedonija 13.7.2013 P. aroaniensis

LA50 Brajićino Bosna in

Hercegovina 9.7.2010 P. ripartii

LA51 Jelašnica Srbija 5.7.2010 P. admetus

LA52 Pletvar Makedonija 14.7.2010 P. orphicus

LA53 Pletvar Makedonija 14.7.2010 P. ripartii

LA54 Vzhodno od Kelli Grčija 13.7.2010 P. ripartii

LA55 Lavdar Albanija 21.7.2013 P. ripartii

LA56 Lavdar Albanija 21.7.2013 P. admetus

LA57 Vzhodno od Drenove Makedonija 21.7.2013 P. ripartii

LA58 Cajupi; 1000 m Albanija 27.7.2013 P. admetus

LA59 Sheper; 1290 m Albanija 27.7.2013 P. ripartii

LA60 Siatista Grčija 26.7.2013 P. ripartii

LA61 Siatista Grčija 26.7.2013 P. aroaniensis

(21)

LA62 Granitis Grčija 27.7.2013 P. admetus

LA63 Granitis Grčija 27.7.2013 P. eleniae

LA64 Gacko Bosna in

Hercegovina 27.7.2013 P. ripartii

LA65 Falakron Grčija 22.7.2013 P. neptohiptamenos

LA66 Devoll Albanija 22.7.2013 P. ripartii

LA67 Devoll Albanija 22.7.2013 P. admetus

LA68 sever Drenove Makedonija 21.7.2013 P. admetus

LA69 Gacko Bosna in

Hercegovina 19.7.2013 P. aroaniensis

* Pri nekaterih vzorcih je označena nadmorska višina v metrih: pri drugih vzorcih ta podatek ni znan.

(22)

Slika 1: Zemljevid južnega Balkana z označenimi lokacijami ulova vzorcev in unikatnimi kodami vzorcev.

3.2 Morfologija kril

Kot del morfoloških razlik med vrstami metuljev iz podrodu Agrodiaetus smo preučili tudi vzorce kril na način, ki ga predlaga Pamperis (2009).

Uporabljali smo stereomikroskop z merilcem in pinceto.

Pregledali smo 8 fenotipskih znakov, po katerih naj bi se vrste razlikovale, in sicer:

(23)

 barvo resic;

 prisotnost bele črte;

 prisotnost submarginalne pike na zadnjih krilih;

 osnovno barvo;

 prisotnost črne pike;

 ukrivljenost subkostalnih pik (a/b);

 prisotnost modrikastega sijaja bazalno;

 prisotnost pike v S1 (Slika 2).

Slika 2: Shematski prikaz strukture krila metulja z označbami. Krilo je razdeljeno na več delov, ki so poimenovani s črkami in številkami (slika povzeta po Tolman in Lewington, 2008).

(24)

Slika 3: Vzorci LA38, LA53 in LA60. Na slikah so vidni primeri intenzitete bele črte na krilih. Osebek levo (LA38) črte nima, pri srednjem osebku (LA53) je črta šibka, desni osebek (LA60) pa ima izrazito belo črto.

Slika 4: Vzorec LA62, ki je na podlagi morfologije določen kot vrsta P. admetus. Za to vrsto so značilne močne submarginalne pike.

3.3 MOLEKULARNOBIOLOŠKA ANALIZA

3.3.1 Kemikalije, potrošni material in naprave

3.3.1.1 Začetni oligonukleotidi za PCR

Začetni oligonukleotidi za odsek gena COI (Folmel in sod., 1994) LCO: 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATTGG-3'

HCO: 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'

3.3.2 Izolacija DNK

DNK smo izolirali iz noge vzorčnih metuljev (Gen Elute^TM, Mammalian genomic DNA Miniprep Kit, Sigma-Aldricht, ZDA). Navzkriţno kontaminacijo vzorcev smo preprečili tako, da smo po rokovanju z vzorcem secirno orodje razkuţili v 96-odstotnem etanolu in ga obrisali s papirnato brisačko.

Nogo vsakega metulja smo dali v svojo mikrocentrifugirko, ki smo jo označili s pripadajočo kodo vzorca.

(25)

Del izolacij DNK smo delali z izolacijskim kompletom kemikalij Sigma-Aldricht, del izolacij pa s kompletom kemikalij Smart Helix.

Protokol Sigma-Aldricht:

 Nogo vsakega vzorčnega metulja poloţimo v svojo mikrocentrifugirko, ki je primerno označena. V vsako dodamo 180 µl raztopine Lysis T.

 V vsako mikrocentrifugirko dodamo 15 µl proteinaze K.

 Mikrocentrifugirke inkubiramo v stresalniku pri 58 °C uro in 20 minut.

 Vzorce maceriramo z macerirno palčko in pri tem pazimo, da med maceriranjem vsakega vzorca palčko razkuţimo v 96-odstotnem etanolu in obrišemo s papirnato brisačko.

 V vsako mikrocentrifugirko ponovno dodamo 15 µl proteinaze K.

 Vzorce ponovno inkubiramo v stresalniku 1−2 uri pri 58 °C.

 Vzorce centrifugiramo 3 minute pri 14000 obratih.

 Tekočino odpipetiramo v nove primerno označene mikrocentrifugirke in pri tem pazimo, da koščki maceriranega vzorca ostanejo v stari mikrocentrifugirki.

 V vsako mikrocentrifugirko s supernatantom dodamo 300 µl hladnega 96-odstotnega etanola in 10 sekund vorteksiramo.

 Vsebino vsake mikrocentrifugirke prepipetiramo v svojo mikrocentrifugirko s filtrom, ki je primerno označena.

 Mikrocentrifugirke s filtrom centrifugiramo 1 minuto pri 14000 obratih.

 Supernatant odlijemo in v vsako mikrocentrifugirko s filtrom odpipetiramo 500 µl Wash solutiona.

 Mikrocentrifugirke ponovno centrifugiramo 1 minuto pri 6900 obratih.

 Supernatant odlijemo.

(26)

 Ponovno odpipetiramo 500 µl Wash solutiona v vsako mikrocentrifugirko.

 Centrifugiramo 3 minute pri 14000 obratih. Supernatant odlijemo in ponovno centrifugiramo 2 minuti pri 14000 obratih.

 Filtre iz mikrocentrifugirk prestavimo v nove mikrocentrifugirke, ki so primerno označene.

 V vsako mikrocentrifugirko dodamo 30 µl Elution solutiona in pustimo 5 minut, da se filter omoči.

 Centrifugiramo 1 minuto pri 6500 obratih.

 Ponovno dodamo 30 µl Elution solutiona in centrifugiramo 1 minuto pri 6500 obratih.

 Supernatant shranimo v zamrzovalnik za nadaljnje raziskave.

Protokol Smart Helix:

 Nogo vsakega vzorčnega metulja poloţimo v svojo mikrocentrifugirko, ki je primerno označena. V vsako dodamo 380 µl pufra D.

 Vzorce maceriramo z macerirno palčko.

 Dodamo po 20 µl proteinaze K in vzorce inkubiramo v stresalniku dve uri pri 58 °C, na koncu pa še 10 minut na 99 °C.

 Vzorce centrifugiramo v centrifugi 5 minut pri 10000 obratih.

 S pipeto odstranimo supernant in ga prepipetiramo v sveţe mikrocentrifugirke, ki so primerno označene.

 Dodamo B-pufer (toliko, da je mikrocentrifugirka napolnjena skoraj do vrha) in vorteksiramo, da se supernant in B-pufer dobro premešata.

 700 µl mešanice odpipetiramo v mikrocentrifugirko s filtrom.

(27)

 Supernant odlijemo in v isto mikrocentrifugirko s filtrom prepipetiramo še preostalo mešanico z vzorcem.

 Centrifugiramo 1 minuto na 14000 obratih in ponovno odlijemo supernant.

 V mikrocentrifugirko s filtrom odpipetiramo 600 µl W-pufra.

 Centrifugiramo 1 minuto na 14000 obratih in odlijemo supernant.

 V mikrocentrifugirko s filtrom odpipetiramo 500 µl W-pufra.

 Centrifugiramo 1 minuto pri 14000 obratih in odlijemo supernant.

 Filtre iz mikrocentrifugirk s filtri prestavimo v nove mikrocentrifugirke, ki so primerno označene.

 Na filtre odpipetiramo po 30 µl E-pufra in počakamo 5 minut, da se filter omoči.

 Ponovno dodamo 30 µl E-pufra in centrifugiramo 1 minuto pri 14000 obratih.

 Supernant, ki vsebuje DNK, odpipetiramo v nove primerno označene epice in jih shranimo v zamrzovalniku za nadaljnje preiskave.

3.3.3 Pomnoževanje DNK

3.3.3.1 Reakcija PCR

Pri pripravi vzorcev za postopek PCR smo vsak vzorec pripravili z naslednjimi kemikalijami:

 2,5 µl PCR-pufra;

 2,5 µl dNTP;

 18,3 µl Ω-vode;

(28)

 0,33 µl začetnega oligonukleotida 1 (LCO);

 0,33 µl začetnega oligonukleotida 2 (HCO);

 0,12 µl Taq-DNK polimeraze.

To kombinacijo in volumen kemikalij smo uporabili v vseh reakcijah, ki smo jih izvajali.

Poleg tega smo pripravili 1 volumen te mešanice za slepi vzorec, ki smo ga uporabili za kontrolo.

Pri reakcijah PCR smo zaradi neuspelih reakcij pri določenih vzorcih spreminjali 2 parametra:

volumen vzorca in protokol PCR.

a) Prvič smo pri PCR postopku uporabili protokol COI:

 4 minute pri 95 °C − denaturacija DNK;

 1 minuta pri 95 °C;

 1 minuta pri 45 °C − hibridizacija; ta cikel se ponovi 40-krat

 2,5 minute pri 72 °C − pomnoţevanje;

 7 minut pri 72 °C − podaljšana sinteza.

Ta protokol smo uporabili pri vzorcih LA35, LA36, LA37, LA55, LA56, LA57, LA58, LA59 LA62, LA64, LA65, LA66, LA67, LA68 in LA69. Uporabili smo po 2 µl vzorcev. Pri vzorcu LA54 smo uporabili 3 µl vzorca.

b) Drugič smo pri postopku PCR uporabili spremenjen protokol COI:

(29)

Ta protokol smo uporabili pri vzorcih LA38, LA39, LA50, LA51, LA52, LA53 in LA61.

Vseh vzorcev smo uporabili po 2 µl.

c) Tretjič smo pri postopku PCR uporabili spremenjen protokol COI:

Ta protokol smo uporabili pri vzorcih LA60, kjer smo uporabili 3 µl vzorca, in LA63, kjer smo uporabili 2 µl vzorca.

3.3.3.2 Elektroforeza

Pred izvajanjem elektroforeze smo pripravili agarozni gel.

Priprava gela:

1 gram agaroznega gela v prahu smo v erlenmajerici zmešali s 100 ml 1xTAE-pufra. V erlenmajerico smo dali mešalni magnet in vse skupaj postavil v mikrovalovno pečico.

Mešanico smo v mikrovalovni pečici segrevali pri nastavitvi 700 W pribliţno 1 minuto oz.

dokler se ves agarozni gel v prahu ni raztopil.

Pripravili smo elektroforezno banjico, ki smo jo opremili z vsemi potrebnimi deli (plastične pregrade), da gel ni prišel v stik z ţicami v banjici. V pipeto smo pripravili 2 µl etidijevega bromida. Gel smo nato počasi vlivali v banjico, istočasno pa smo s pipeto dodali tudi etidijev bromid in dobro premešali. Pazili smo, da v gelu ni bilo mehurčkov, ki bi lahko kasneje pri elektroforezi ovirali potovanje molekul DNK. Ko je bila banjica zalita pribliţno do polovice, smo vstavili plastični glavniček in dolili toliko gela, da so bili zobci glavnička potopljeni vanj.

(30)

Elektroforezno banjico smo nato pustili vsaj 1 uro v digestoriju, da se je gel strdil in popolnoma ohladil.

Postopek elektroforeze:

S pipeto smo odmerili 5 µl vzorca, ki je bil pomnoţen s postopkom PCR, in ga premešali s kapljico Loading-pufra, tako da smo vzorec in Loading-pufer večkrat posrkali s pipeto.

Mešanico smo nato s pipeto prenesli v prvo luknjico v gelu. Pri tem smo pazili, da gela nismo prebodli ali kako drugače poškodovali. Postopek smo ponovili za vse vzorce in pri tem menjali nastavke za pipetiranje, da ni prišlo do kontaminacije. V predzadnjo luknjico smo po enakem postopku odmerili slepi vzorec, v zadnjo luknjico pa smo dali 1,7 µl mešanice 100 baznih parov.

Banjico smo nato pokrili s pokrovom in jo preko adapterja priklopil na napetost 45 V za 5−10 minut. Po tem času smo napetost povečali na 60 V. Ko je fronta pripotovala do pribliţno polovice gela, smo napetost izklopili.

Z banjice smo odstranili pokrov, odlil TAE-pufer in vse skupaj splaknil z malo vode.

Banjico smo nato odnesli do UV-kamere, kjer smo gel slikali in tako preverili prisotnost zadostne količine DNK v vzorcu. DNK na sliki pod UV-svetlobo izgleda kot svetleča črtica.

Močnejši kot je sijaj, več DNK je v vzorcu.

3.3.3.3 Čiščenje DNK

Vzorce, ki so imeli dovolj veliko koncentracijo DNK po postopku PCR, smo očistili in poslali na sekvenciranje.

Čiščenje je potekalo v napravi PCR. Po izvedbi elektroforeze je vsakega vzorca ostalo pribliţno 20 µl.

(31)

Postopek čiščenja:

V vsako epico smo dodali 0,4 µl eksonukleaze 1-EXO I in 2 µl alkalne fosfataze FAST AP.

Vzorce smo nato prestavili v napravo PRC in vklopili program čiščenja: 47 minut pri 37 °C in 15 minut pri 80 °C.

Po sekvenciranju v tujini smo nazaj dobili sekvence vzorcev v elektronski obliki.

3.3.4 Postopek izdelave filogenetskih dreves in Bayesova analiza

Sekvence, ki smo jih po pošiljanju na sekvenciranje dobili nazaj v elektronski obliki, smo obdelali z naslednjimi programi:

 ChromasPro (verzija 1.7.6);

 BioEdit Sequence Alignment Editor (verzija 7.2.5);

 NotePad (verzija 7.1 build 7600);

 ClustalX2 (verzija 2.1);

 MEGA (verzija 6.05(6140107));

 Model Generator (verzija 82);

 REDSECQ;

 MrBayes (verzija 3.2.0);

 FigTree (verzija 1.4.0);

 CorelDraw X6 (verzija 16.0.0.707).

(32)

Sekvence, ki smo jih dobili, so bile v formatu .ab1. Vsako datoteko smo odprli v programu ChromasPro in jo pregledali. Za vsak vzorec smo dobili sekvence iz obeh smeri branja. V istem programu smo obe datoteki zdruţili v komplementarno sekvenco. Datoteko smo shranili v formatu .gpj. Postopek smo ponovili za vse vzorce. Sekvenco vsakega vzorca smo skopirali v program NotePad, kjer smo dobili zaporedje nukleotidov, ki se pojavljajo v vzorcih.

Poleg naših vzorcev smo na spletni bazi podatkov NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) poiskali sekvence vrst, ki so filogenetsko sorodni rodu Polyommatus in vrstam iz podrodu Agrodiaetus (Preglednica 2). Sekvence smo skopirali v program NotePad. Vzorce, ki smo jih dobili s te spletne strani, smo uporabljali kot zunanjike in referenčne vzorce v filogenetskem drevesu, ki je končni produkt te obdelave.

Datoteke smo nato odprli v programu ClustalX2. Vse sekvence so bile enakih dolţin in smo jih poravnali brez presledkov. Iz poravnave so bili razvidni odstopanja in napake, ki so nastale pri sekvenciranju. Nekatere napake smo lahko popravili ročno glede na ostala zaporedja, nekatere pa smo pustili nepopravljene zaradi moţnih razlik v sekvencah vzorcev DNK.

Urejene, popravljene in poravnane sekvence smo nato shranili v formatu .fasta.

Preden smo začeli z Bayesovo analizo, smo v programu MEGA izrisali preliminarno filogenetsko drevo na podlagi metode največjega verjetja »maximum likelihood«, iz katerega smo lahko videli pribliţno porazdelitev vzorcev glede na referenčne sekvence. V programu MEGA smo uporabili naslednje parametre: metodo Bootstrap s 100 ponovitvami, nastavitev GTR (nastavitev general time reversible) in nastavitev G + I (gamma distributed with invariable sites). Nukletotide, ki niso bili jasno odčitani, smo izključili iz analize (complete deletion). Program je izrisal filogenetsko drevo, ki smo ga shranili v formatu .emf.

V naslednjem koraku smo datoteko .fasta uvozili v program Model Generator, ki za izbrani niz podatkov preverja ustreznost različnih evolucijskih modelov in izmed 56 moţnosti izbere najprimernejšega. Program je za moţne modela predlagal: GTR + I + G in TIM + I + G. Za nadaljevanje analize smo izbrali model TIM + I + G (transition model + invarient sites + gamma distrtibuted), ker se je kot predlog pojavil pri več različnih pristopih iskanja.

Datoteko .fasta smo nato v programu REDSECQ pretvorili v datoteko formata .nexus, ki se uporablja pri Bayesovi analizi.

(33)

Nadaljevali smo z Bayesovo analizo, ki se izvaja s programom MrBayes. Po uvozu datoteke .nexus v program MrBayes smo določili parametre, po katerih je potekal izračun filogenetskega drevesa, in sicer: NST = 6, rec = gamma (definira, po katerem modelu evolucije naj program generira drevo), ngen = 2000000 in savebrlens = yes (2 milijona ponovitev z moţnostjo shranjevanja dolţine vej). Po vseh ponovitvah se vsa drevesa med seboj primerjajo. Izbrisali smo prvih 5000 dreves, ostala pa so vključena v končno filogenetsko drevo. Pri tem so vrednosti na vejah posteriorne verjetnosti, ki povedo, kolikokrat se posamezna veja ponovi (Ronquist in sod., 2011).

Dobljeno datoteko smo nato odprli s programom FigTree, v katerem smo lahko drevo tudi urejali. Za urejanje smo uporabljali program CorelDraw.

Preglednica 2: Seznam referenčnih in zunanjih vzorcev, vključenih v filogenetsko drevo, s pripadajočimi unikatnimi kodami v bazi podatkov NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

VRSTA KODA VZORCA

P. admetus MW98084

P. admetus 09-V962

P. admetus AY556986

P. admetus 09-V963

P. admetus AY556867

P. admetus JC01014

P. ripartii HM210168

P. ripartii 11-G195

P. ripartii EF104603

P. ripartii AY556962

P. ripartii AY556858

P. ripartii 12-M016

(34)

P. ripartii J903

P. ripartii 12-M017

P. nephohiptamenos JC00045 P. nephohiptamenos AY556860 P. nephohiptamenos 09-V964 P. nephohiptamenos AY556859 P. nephohiptamenos JC00046

P. humedasae HM210169

P. dantchenkoi AY557081

P. dantchenkoi MW99276

P. dantchenkoi MW99319

P. dantchenkoi AY557073 P. dantchenkoi AY557072 P. aroaniensis JC00040 P. aroaniensis AY556856

P. icarus MW98133

P. icarus MW00412

P. bellargus RV-07-D435 P. bellargus RV-07-D149

C. semilargus MW00525

C. semilargus MW02034

(35)

4 REZULTATI

Analizirali smo 25 osebkov, ki glede na molekularne analize pripadajo petim vrstam:

Polyommatus ripartii, Polyommatus admetus, Polyommatus eleniae, Polyommatus orphicus in Polyommatus aroaniensis. Ti rezultati niso skladni s fenotipskimi lastnostmi analiziranih osebkov. V nadaljevanju povzemamo fenotipske razlike med osebki in rezultate filogenetske analize.

4.1 Morfologija barvnih vzorcev na krilih

Pri morfološki diferenciaciji osebkov smo uporabljali znake na krilih, ki so v literaturi uporabljeni za diferenciacijo vrst po zunanjih znakih (Lukhtanov in sod., 2003; Coutsis in De Prins, 2005; Kolev, 2005; Tolman in Lewington, 2008; Pamperis, 2009). Za določanje vrst naših vzorcev smo uporabili tudi genetske markerje, ki so vzorce razvrstili v monofiletske skupine, ki ustrezajo zgoraj naštetim vrstam. Delitev na osnovi filogenetskih odnosov smo uporabili za analizo morfoloških razlik med osebki.

V nadaljevanju primerjamo preliminarno uvrstitev vzorcev s tabelo opazovanih fenotipskih znakov (Preglednica 3).

Značilni znaki za vrsto P. admetus so prisotna črna pika v celici in močno vidne (dvojne) submarginalne pike (Pamperis, 2009) (Slika 4). Oba znaka se pojavljata pri vzorcih LA51, LA56, LA58, LA62, LA67 in LA68. Vsi navedeni vzorci so bili na podlagi morfologije pravilno uvrščeni.

Eden glavnih določevalnih znakov za vrsto P. ripartii je prisotna močna bela črta z variacijami v dolţini in intenziteti pri nekaterih grških populacijah (Tolman in Lewington, 2008; Pamperis, 2009) (Slika 3). Temu kriteriju ustrezajo vzorci LA36, LA50, LA53, LA54, LA55, LA57, LA59, LA60, LA64 in LA66. Za navedene vzorce predvidevamo, da spadajo v vrsto P. ripartii. Iz Preglednice 3 je razvidno, da je bela črta prisotna ne le pri P. ripartii, temveč tudi pri drugih vrstah. Diagnostična vrednost tega znaka je vprašljiva.

(36)

Za vrsto P. aroaniensis so značilni naslednji znaki: bela črta šibko vidna ali manjka, submarginalnih pik ni in črne pike v celici, ki pa lahko manjkajo (Tolman in Lewington, 2008; Pamperis, 2009). Tem kriterijem delno ustrezajo vzorci LA37, LA38, LA39, LA61 in LA69. Slednji je edini iz klada, ki ima celico s črno piko. Četudi so bili nekateri izmed teh vzorcev predhodno določeni pravilno, se niti en osebek v celoti ne ujema z diagnostičnimi znaki.

P. eleniae je lokalizirana vrsta, ki se nahaja v okolici gore Falakron v Grčiji. Značilna fenotipska znaka sta komaj vidna oz. odsotna črna pika v celici na sprednjih krilih in slabo vidna oz. odsotna bela črta na krilih (Tolman in Lewington, 2008; Pamperis, 2009). Tem kriterijem odgovarja vzorec LA63, ki je skladen z vsemi tipičnimi fenotipskimi znaki za to vrsto. Tudi lokacija ulova je v območju znane razširjenosti vrste (Coutsis in De Prins, 2005).

Vrsta, ki smo jo glede na morfologijo poimenovali P. orphicus, bi bila lahko tudi podvrsta vrste P. dantchenkoi (Pamperis, 2009; Kolev, 2005). Pri poimenovanju smo se sklicevali na morfologijo, saj v bazi GenBank ni bilo referenčnega taksona. Kot P. orphicus smo preliminarno določili vzorec LA52. Iz Preglednice 3 je razvidno, da se vzorec le delno ujema z značilnimi fenotipskimi znaki za to vrsto. Submarginalne pike so odsotne, bela črta pa je močna in dobro vidna. Preliminarna določitev je v tem primeru vprašljiva.

Vzorec LA65 je po morfologiji in lokaciji preliminarno uvrščen k vrsti P. neptohiptamenos (tipična fenotipska znaka sta široka bela črta in črna pika v celici) (Pamperis, 2009), vendar rezultati filogenetske analize niso potrdili te trditve. Moţna je napačna uvrstitev ali napaka v postopku PCR. Tudi fenotipsko vzorec ni povsem skladen s to vrsto, saj manjka črna pika v celici.

Večina preliminarnih uvrstitev je vprašljiva in nezanesljiva zaradi velike variabilnosti fenotipskih znakov. To variabilnost dobro ponazarja primer vrste P. eleniae, kjer so lahko vsi tipični fenotipski znaki tudi odsotni.

Za natančnejšo uvrstitev smo opravili filogenetske raziskave, ki so pokazale dejansko vrstno pripadnost.

(37)

4.1.1 Preglednica opazovanih fenotipskih znakov

Preglednica 3: Seznam vzorcev s pripadajočimi opazovanimi fenotipskimi znaki. Vrednosti v tabeli so kvalitativne. ^*Podani sta 2 barvi; prva barva predstavlja barvo resic pri proksimalnem delu resice, druga barva pa predstavlja barvo resic pri distalnem delu resice. ^**Ukrivljenost subkostalnih pik je vrednost, ki predstavlja razdaljo od roba krila do ocelne točke (b) in razdaljo od ocelne točke do celice (a) (Pamperis, 2009).

Koda

vzorca Barva resic* Bela črta Submarginalne pike na zadnjih krilih

Osnovna

barva Črna pika v celici

Ukrivljenost subkostalnih pik

(a/b)**

Modrikast

sijaj bazalno Bazalna pika v S1 Pravilna določitev vzorca LA35 rjava/ siva šibka niso prisotne svetlo

rjava prisotna šibka rahel ni prisotna ne

LA36 rjava/ sivo

rjava močna slabo vidne svetlo

rjava ni prisotna šibka rahel ni prisotna ne

LA37 rjava/ sivo

rjava ni prisotna niso prisotne temno

LA38 svetlo

rjava/siva ni prisotna niso prisotne rjava ni prisotna močna rahel ni prisotna ne

LA39 rjava/ belo rjava

šibka−

polovična niso prisotne temno

rjava ni prisotna močna rahel ni prisotna ne

LA50 rjava/ sivo

rjava šibka slabo vidne rjava ni prisotna močna rahel ni prisotna ne

LA51 temno rjava/

sivo rjava ni prisotna prisotne − močne temno

rjava prisotna močna rahel prisotna da − P. admetus

LA52 temno rjava/

sivo bela močna niso prisotne rjava prisotna močna rahel ni prisotna ne

LA53 rjava/ svetlo

rjava šibka niso prisotne rjava ni prisotna močna rahel ni prisotna ne

LA54 temno rjava/

sivo rjava šibka slabo vidne temno

rjava ni prisotna šibka prisoten ni prisotna ne

LA55 rjava/ sivo

rjava šibka niso prisotne svetlo

rjava ni prisotna močna prisoten ni prisotna ne

LA56 siva/ siva šibka prisotne − močne svetlo

rjava prisotna močna prisoten prisotna da − P. admetus

LA57 temno rjava/

sivo rjava močna prisotne temno

(38)

LA58 temno rjava/

rjavo siva ni prisotna prisotne − močne temno

rjava prisotna šibka rahel ni prisotna da − P. admetus

LA59 rjavo bela/belo

siva močna prisotne temno

rjava prisotna šibka rahel ni prisotna ne

LA60 svetlo rjava/

sivo bela močna niso prisotne temno

LA61 temno rjava/

sivo rjava šibka niso prisotne temno

rjava ni prisotna močna rahel ni prisotna da − P. aroaniensis

LA62 svetlo rjava/

svetlo rjava ni prisotna prisotne − močne temno

rjava prisotna močna rahel prisotna da − P. admetus

LA63 svetlo rjava/

svetlo rjava

šibka,

široka niso prisotne svetlo

rjava ni prisotna šibka rahel ni prisotna da − P. eleniae

LA64 temno rjava/

svetlo rjava šibka slabo vidne temno

LA65 svetlo rjava/

siva močna slabo vidne temno

LA66 temno rjava/

svetlo rjava močna niso prisotne temno

rjava ni prisotna močna rahel ni prisotna ne

LA67 temno rjava/

svetlo rjava ni prisotna prisotne − močne temno

rjava prisotna šibka rahel ni prisotna da − P. admetus

LA68 svetlo rjava/

siva ni prisotna prisotne − močne svetlo

rjava prisotna močna rahel ni prisotna da − P. admetus

LA69 svetlo rjava/

siva ni prisotna niso prisotne svetlo

rjava prisotna močna rahel ni prisotna ne

(39)

4.2 Genetska podobnost med osebki

V filogenetskem drevesu se glede na referenčne vzorce in zunanjike naši vzorci uvrščajo v 5 skupin, ki ustrezajo 5 ločenim vrstam: P. ripartii, P. admetus, P. eleniae, P. orphicus in P.

aroaniensis (Slika 5). Vzorce smo glede na filogenetsko drevo razporedili v naslednje vrste:

 P. ripartii, vzorci: LA36, LA50, LA52, LA53, LA54, LA55, LA57, LA59, LA64, LA66 in LA69;

 P. admetus, vzorci: LA51, LA56, LA58, LA62, LA67 in LA68;

 P. aroaniensis, vzorci: LA35 in LA61;

 P. eleniae, vzorci: LA63 in LA65;

 P. orphicus, vzorci: LA37, LA38, LA39 in LA60.

V filogenetskem drevesu je jasno ločen kompleks P. aroaniensis z vsemi sorodnimi vrstami:

P. humedaseae, P. dantchenkoi in P. orphicus. Vrste znotraj te skupine so si med seboj sorodne, sorodstveni odnosi med njimi pa niso povsem razjasnjeni. Globoke cepitve vej znotraj skupine aroaniensis kaţejo, da so znotraj skupine verjetno prisotne še druge kriptične vrste. Nekateri avtorji v to skupino uvrščajo tudi vrsto P. eleniae (Coutsis in De Prins, 2005), ki pa je v naši analizi bliţje vrsti P. admetus. Pod skupino eleniae lahko opazimo tudi skupino štirih vzorcev iz baze NCBI, določenih kot vrsta P. ripartii. Takšna razvrstitev lahko pomeni moţno napačno uvrstitev teh osebkov ali moţnost prisotnosti kriptične vrste, saj so ti vzorci iz vzhodnega dela Turčije, torej so geografsko ločeni od ostalih vzorcev P. ripartii. Podporo kladov smo določili s posteriorno verjetnostjo, ki je bila relativno nizka (pod 95 %).

Znotrajvrstni kladi, predvsem pri vrsti P. ripartii, ima podpore večinoma celo pod 50 %.

Areali vrst se glede na lokacije ulova vzorcev delno prekrivajo. Simpatrijo opazimo pri vrstah P. orphicus in P. ripartii, saj se obe pojavljata na Ceru v Makedoniji (vzorca LA37 in LA36).

Tudi vrsti P. aroaniensis in P. orphicus se pojavljata na isti lokaciji, in sicer v Siatisti v Grčiji (vzorca LA60 in LA61). Vrsti P. admetus (vzorci LA56, LA67 in LA68) in P. ripartii (vzorci LA55, LA57 in LA66) se prav tako pojavljata na istih lokacijah. Prekrivanje lahko opazimo v

(40)

Lavdarju v Albaniji (LA55 in LA56), v Drenovi v Makedoniji (LA57 in LA68) in v Devollu v Albaniji (LA66 in LA67).

(41)

Slika 5: Filogenetsko drevo podobnosti, izračunano po metodi Bayes. Imena vrst, ki so obarvana, so naši vzorci, črno obarvane vrste pa so referenčni vzorci ali zunanji vzorci. Oznake na razvejitvah so vrednosti posteriorne verjetnosti, izražene v %. Z barvami so označeni naši vzorci, črno pa so obarvani zunanji in referenčni vzorci iz baze GenBank.

Znotraj skupine aroaniensis se nahajajo tudi vzorci, določeni kot P. orphicus.

- skupina ripartii - skupina admetus - skupina eleniae - skupina aroaniensis