Rhodopi, ki velja za nahajališče vrste P. orphicus (Kolev, 2005). Rumeno je označeno hipotetično območje razširjenosti te vrste glede na filogenetske rezultate in mesta ulova vzorcev.
Drug primer simpatrije ozko sorodnih vrst sta P. eleniae in P. admetus pri vasi Granitis jogozahodno od gore Falakron. Glede na filogenetske raziskave sta to sestrski vrsti. Vrsti P. admetus in P. ripartii imata večje območje razširjenosti in se pojavljata tudi izven Balkanskega polotoka (Tolman in Lewington, 2008). Tudi ti dve sorodni vrsti se pojavljata simpatrični v juţnem delu Albanije v Lavdarju, soteski Devollu (vzorca LA66 in LA67) in okolici Drenove (vzorca LA57 in LA68). Na podlagi teh rezultatov lahko sklepamo, da alopatrična distribucija pri teh vrstah ni nujno prisotna in lahko zavrnemo hipotezo o alopatriji ozko sorodnih vrst.
6 SKLEPI
Od 25 metuljev iz rodu Polyommatus smo v diplomskem delu pregledali fenotip kril vsakega osebka. Na podlagi analize fenotipskih znakov v večini primerov nismo mogli potrditi preliminarne določitve vrst, saj so bili znaki znotraj vrst preveč variabilni. Morfološko smo lahko določili le osebke vrste P. admetus (LA51, LA56, LA58, LA62, LA67 in LA68). Kljub temu lahko fenotipske znake uporabljamo kot pomoč pri identifikaciji ali vsaj za preliminarno klasifikacijo na terenu, vendar takšna določitev ni verodostojna brez molekularnih podatkov.
Rezultati filogenetskih raziskav kaţejo na to, da so molekularno-filogenetske tehnike bolj primerne za določevanje vrst tega kompleksa. Vseeno je treba upoštevati moţnost nenatančnega pomnoţevanja fragmentov, ki je pogosta teţava pri tej metodi (Palumbi, 1996).
Teţava pri uporabi molekularnih podatkov so slabo raziskani sorodstveni odnosi znotraj rodu Polyommatus in neenotnost avtorjev glede le-teh (Wiemers, 2003; Kandul in sod., 2004;
Talavera in sod., 2012).
Iz naših rezultatov je razvidno, da so vrste P. admetus, P. elleniae in P. ripartii ozko sorodne.
P. ripartii je razdeljena v dve parafiletski skupini. Ločeni klad iz vzhodne Turčije bi lahko 2005), temveč ţivi tudi v Makedoniji in Grčiji.
Ozko sorodne vrste se pogosto pojavljajo simpatrično. Simpatrijo smo ugotovili med pari vrst P. ripartii in P. admetus, P. admetus in P. eleniae, P. aroaniensis in P. orphicus ter P.
orphicus in P. ripartii. Zaradi pojavljanja genetsko bolj podobnih vrst na istih lokacijah lahko sklepamo, da v primeru rodu Polyommatus ne gre za alopatrično distribucijo. Simpatrija je dokaz, da so tudi filogenetsko bolj sorodne vrste med seboj ločene z reproduktivno bariero.
7 POVZETEK
V diplomskem delu smo se ukvarjali z določevanjem vzorcev metuljev iz podrodu Agrodiaetus, ulovljenih na Balkanskem polotoku. Poleg filogenetskih raziskav smo kvalitativno opisali tudi fenotip kril oz. 8 najpogosteje uporabnih znakov za prepoznavo vrst.
Vsi vzorci spadajo v rod metuljev Polyommatus. Vrste, določene s filogenetsko analizo, smo primerjali z njihovo geografsko razširjenostjo in ugotavljali, ali se vrste pojavljajo simpatrično.
V raziskavi smo imeli 25 osebkov z območja Balkanskega polotoka, in sicer iz Grčije, Makedonije, Albanije, Bosne in Hercegovine ter Srbije. Vsak vzorec smo pregledali pod stereomikroskopom in opazovali naslednje fenotipske znake: barvo resic, prisotnost bele črte, prisotnost submarginalne pike na zadnjih krilih, osnovno barvo, prisotnost črne pike, ukrivljenost subkostalnih pik (a/b), prisotnost modrikastega sijaja bazalno in prisotnost pike v S1. Mnoge vrste kaţejo veliko znotrajvrstno variabilnost v morfologiji. Po morfologiji smo lahko določili osebke vrste P. admetus, ki imajo edini prisotne močno vidne submarginalne pike na krilih. Razlikovanje med drugimi vrstami na podlagi fenotipskih znakov je nezanesljivo.
V drugem delu raziskave smo iz nog vzorcev izolirali DNK in sekvencirali dele mitohondrijskega gena COI. Iz sekvenc smo nato z Bayesovo analizo ugotavljali sorodnost med vzorci, ki je prikazana v obliki filogenetskega drevesa. Po tej metodi so se vzorci razvrstili v 5 vrst znotraj rodu Polyommatus: Polyommatus ripartii, P. admetus, P. eleniae, P.
aroaniensis in P. orphicus. Poleg delitve na vrste so bili dobro podprti štirje kladi glede na vzorec zdruţevanja v večje skupine, ki so jih tvorili skupaj z referenčnimi vzorci zaporedij DNK iz baze GenBank. Te skupine so: skupina ripartii, skupina admetus, skupina eleniae in skupina aroaniensis. Te skupine so deloma podprte tudi v drugih molekulskih analizah tega podrodu (Kandul in sod., 2004; Schmitt in sod., 2005).
Bliţnja sorodnost vrst P. ripartii in P. admetus se ujema z dosedanjimi raziskavami (Vila in sod., 2010). Znotraj skupine aroaniensis je vrsta P. orphicus ločena od P. dantchenkoi, katere podvrsta naj bi bila (Kolev, 2005). Samostojen status te vrste je dobro podprt, vendar so odnosi med vrstami v tej skupini nedoločeni zaradi velikih genetskih razlik med vzorci in
manjšega števila vzorcev morfološko določenih kot P. aroaniensis, zato so potrebne dodatne raziskave in obseţnejše vzorčenje.
Hipotezo o alopatriji ozko sorodnih vrst smo ovrgli, saj se več vzorcev različnih ozko sorodnih vrst pojavlja na istih lokacijah. Simpatrične so vrste P. ripartii in P. admetus, P. eleniae in P. admetus ter P. orphicus in P. admetus. Glede na filogenetske raziskave lahko sklepamo, da vrsta P. orphicu ni razširjena le v Rodopih v Bolgariji (Kolev, 2005), ampak njen areal sega tudi v Makedonijo in severno Grčijo.
8 VIRI
Ajmal Ali M., Gyulai G., Hidvégi N., Kerti B., Al Hemaid M. A. F., Pandey K. A., Lee J.
2014. The changing epitome of species identification- DNA barcoding. Saudi Journal of Biological Sciences 21: 204-231.
Artemyeva E. A. 2005. Clinal variation in populations of the Common Blue butterfly Polyommatus icarus Rott. (Lepidoptera, Lycaenidae). Russian Journal of Genetics 41 (8):
859-870.
Bálint Z. 1993. The threatened lycaenids of the Carpathian Basin, east-central Europe.
Conservation Biology of Lycaenidae (Butterflies). Ed. New T. R. The IUCN Species Survival Commision. Str. 105-110.
Bickford D., Lohman J. D., Sodhi S. N., Ng K. L. P., Meier R., Winker K., Ingram K. K., Das I. 2007. Cryptic species as a window on diversity and conservation. TRENDS in Ecology and Evolution 22-3: 148-158.
Burghardt F., Knüttel H., Becker M., Fiedler K. 2000. Flavonoid wing pigments increase attractiveness of female common blue(Polyommatus icarus) butterflies to mate-searching males. Naturwissenschaften 87: 304-307.
Chapman D. A. 2009. Numbers of Living Species in Australia and the World, 2nd edition, Report for the Australian Biological Resoueces Study, Canberra.
Coutsis G. J., De Prins J. 2005. A new brown Polyommatus (Agrodiaetus) from northern Greece (Lepidoptera: Lycaenidae). Phegea 33(4): 129-137.
Dantchenko, A. V., & Lukhtanov, V. A., 1994. New taxa of the subgenus Agrodiaetus HÜBNER, 1822 from Caucasus (Lepidoptera, Lycaenidae). Atalanta,25, 207-213.
Dincă V., Runquist M., Nilsson M., Vila R. 2013. Dispersal, fragmentation, and isolation shape the phylogeography of the European lineages of Polyommatus (Agrodiaetus) ripartii (Lepidoptera: Lycaenidae). Biological Journal of the Linnean Society 109: 817- 829.
Elliot, J. N. 1973. The higher classification of the Lycaenidae (Lepidoptera): A tentative arrangement. Bulletin of the British Museum (Natural Hististory) Entomology, 28:371-505.
Floyd, R., Eyualem, A., Papert, A., Blaxter, M.L., 2002. Molecular barcodes for soil nematode identification. Molecular Ecology, 11: 839–850.
Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R. 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome coxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates.
Molecular Marine biology and Biotechnology.
Frézal, L., Leblois, R., 2008. Four years of DNA barcoding: Current advances and prospects.
Infection, genetics and evolution, doi: 10.1016/j.meegid.2008.05.005.
Hajibabaei M., Singer A. C. G., Hebert D. N. P., Hickey A. D. 2007. DNA barcoding: how it complements taxonomy, molecular phylogenetics and population genetics. Trends in Genetics 23-4.
Kandul P. N., Lukhtanov A. V., Dantchenko V. A., Coleman W. S. J., Sekercioglu H. C., Haig D., Pierce E. N. 2004. Phylogeny of Agrodiaetus Hübner 1822 (Lepidoptera:
Lycaenidae) Inferred from mtDNA Sequences of COI and COII and Nuclear Sequences of EF1-α: Karyotype Diversification and Species Radiation. Systematic Biology 53(2): 278-298.
Kandul P. N., Lukhtanov A. V., Pierce E. N. 2007. Karyotypic Diversity and Speciation in Agrodiaetus Butterflyes. Evolution 61 (3): 546- 559.
Klots A. B, Klots E. B. 1970. Metulji- red Lepidoptera. V: Ţuţelke, Ilustrirana enciklpedija ţivali. Šmit J. (ed.). Ljubljana, Mladinska knjiga: 184-258
Kolev Z. 2005. Polyommatus dantchenkoi (Lukhtanov & Wiemers, 2003) tentatively identified as new to Europe, with a description of a new taxon from the Balkan Peninsula (Lycaenidae). Nota lepidoptera 28 (1): 25- 34.
Kristensen N., Scoble J. M., Karsholt O. 2007. Lepidoptera phyogeny and systematics: the state of inventorying moth and butterfly diversity. Zootaxa 1668: 699-747.
Leimar O. 1996. Life History Plasticity: Influence of Photoperiod on Growth and Development in the Common Blue Butterfly. Oikos 76 (2): 228-234.
Lewis H. L. 1985. Butterflies of the World, Bracken Books, London.
Lukhtanov A. V., Wiemers M., Meusemann K. 2003. Description of a new species of the
»brown« Agrodiaetus complex from South-East Turkey (Lycaenidae). Nota lepidoptera 26(1/2): 65-71.
Melovski D., Bozhinovsk E. 2014. New Records for Four Butterfly Species (Lepidoptera:
Papilionidea & Hesperioidea) in the Republic of Macedonia. Journal of Natural Sciences Research 4 (7): 40-44.
Mohini J., Deshpande J. D. 2010. Polymerase chain reaction: methods, principles and application. International Journal of Biomedical Research 1 (5): 81-97.
National center for biotechnology information. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (citirano dne 12. 6. 2014).
Nielsen, E. S., and L. A. Mound. 2000. Global diversity of insects:the problems of estimating numbers. Str. 212–222 v P. H. Raven and T. Williams, (ed.). Nature and human society: the quest for a sustainable world. National Academy, Washington, DC.
Novotny, V., Basset, Y., Miller, S.E., Weiblen, G.D., Bremer, B., Cizek, L. and Drozd, P.
(2002). Low host specificity of herbivorous insects in a tropical forest. Nature 416: 841-844.
Palumbi, R. 1996. Nucleic acids II: The polymerase chain reaction. Molecular systematics, Sinauer Associates, Inc., 2nd edition, uredniki: Hills, D. M., Moritz C., Mable, K. M. str. 655.
Pamperis N. L., 2009. The Butterflies of Greece. Editions Pamperis, Atene.
Preston-Mafham R., Preston-Mafham K. 1988. Butterflies of the World, Blandford Press, London.
Przybylowicz L., Lukhtanov V., Lachowska- Cierlik D. 2013. Towards the understanding of the origin of the Polish remote population of Polyommatus (Agrodiaetus) ripartii (Lepidoptera: Lycaenidae) based on kariology and molecular phylogeny. Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research 52 (1): 44-51.
Ronquist F., Huelsenbeck J., Teslenko M. 2011. Draft MrBayes version 3.2 Manual: Tutorials and Model Summaries, str. 1-36.
Schmitt T., Varga Z., Seitz A. 2005. Are Polyommatus hispana and Polyommatus slovaticus bivoltine Polyommatus coridon (Lepidoptera: Lycaenidae)? The discriminatory value of genetics in taxonomy. Organisms, Diversity & Evolution 5: 297- 307.
Štrus J., Drobne D., Zidar P., 2002. Navodila za vaje iz splošne zoologije, 2. del. Študentska zaloţba, Ljubljana.
Talavera G., Lukhtanov A. V., Pierce E. N., Vila R. 2012. Establishing criteria for higher-level classification using molecular data: the systematics of Polyommatus blue butterflies (Lepidoptera, Lycaenidae). Cladistics 1-27.
Tolman T., Lewington R. 2008. Collins butterfly guide, The most complete guide to the Butterflies of Britain and Europe. Fluke Art Velika Britanija (ed.). London, HarperCollins Publishers: 15-120 str.
Triberti P., Daccordi M., Zanetti A. 1988. Butterflies and Moths, Mcdonald & Co (Publishers) Ltd, Londonstr 10-30.
Trontelj P., Fišer C. 2008. Cryptic species diversity should not be trivialised. Systematics and Biodiversity 7(1): 1-3.
van Swaay, C., Wynhoff, I., Verovnik, R., Wiemers, M., López Munguira, M., Maes, D., Sasic, M., Verstrael, T., Warren, M. & Settele, J. 2010a.Polyommatus admetus. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2014.1. <www.iucnredlist.org>. [04. 07. 2014].
van Swaay, C., Wynhoff, I., Verovnik, R., Wiemers, M., López Munguira, M., Maes, D., Sasic, M., Verstrael, T., Warren, M. & Settele, J. 2010b.Polyommatus ripartii. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2014.1. <www.iucnredlist.org>.[04. 07. 2014].
van Swaay, C., Wynhoff, I., Verovnik, R., Wiemers, M., López Munguira, M., Maes, D., Sasic, M., Verstrael, T., Warren, M. & Settele, J. 2010c.Polyommatus orphicus. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2014.1. <www.iucnredlist.org>. [04. 07. 2014].
van Swaay, C., Wynhoff, I., Verovnik, R., Wiemers, M., López Munguira, M., Maes, D., Sasic, M., Verstrael, T., Warren, M. & Settele, J. 2010d.Polyommatus eleniae. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2014.1. <www.iucnredlist.org>. [04. 07. 2014].
van Swaay, C., Wynhoff, I., Verovnik, R., Wiemers, M., López Munguira, M., Maes, D., Sasic, M., Verstrael, T., Warren, M. & Settele, J. 2010e.Polyommatus aroaniensis. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2014.1. <www.iucnredlist.org>. [04 July 2014].
Vershinina A. O., Lukhanov V. A. 2010. Geographical distribution of the cryptic species Agrodiaetus alcestis alcestis, A. Alcestis karacetinae and A. demavendi (Lepidoptera:
Lycaenidae) revealed by cytogenetic analysis. Comparative Cytogenetics. 4 (1), 1-11.
Vila R., Bell D. C., Macniven R., Goldman-Huertas B., Ree H. R., Marshall R., Bálint Z., Johnson K., Benyamini D., Pierce E. N. 2011. Phylogeny and palaeoecology of Polyommatus blue butterflies show Beringa was a climate-regulated gateway to the New World.
Proceedings of the Royal Society str. 4-10.
Vila R., Lukhtanov A. V., Talavera G., Gil-T. F., Pierce E. N. 2010. How common are dot-like distributions? Taxonomical oversplitting in western European Agrodiaetus (Lepidoptera:
Lycaenidae) revealed by chromosomal and molecular markers. Biological Journal of the Linnean Society 101: 130-154.
Wiemers M. 2003. Chromosome differentiation and the radiation of the butterfly subgenus Agrodiaetus (Lepidoptera: Lycaenidae: Polyommatus)- a molecular phylogenetic approach.
(Doktorska disertacija). Rheinischen Friedrich- Wilhelms- Universität Bonn, str. 5- 120.
Wiemers M., Stradomsky V. B., Vodolazhsky I. D. 2010. A molecular phylogeny of Polyommatus s. str. and Plebicula based on mitochondrial COI and nuclear ITS2 sequences (Lepidoptera: Lycaenidae). European Journal of Entomology 107: 325- 336.
Wilson, O.E., 2004. The encyclopedia of life. Trends in Ecology and. Evolution 18 (2): 77–
80.
Zahvala
Zahvaljujem se mentorju doc. dr. Verovniku za pomoč, vodstvo in potrpljenje med pisanjem diplomskega dela.
Zahvaljujem se tudi doc. dr. Fišerju za pregled diplome in vodstvo v končnih fazah pisanja ter doc. dr. Zidarju za končni pregled in odobritev diplomskega dela.
Velika zahvala gre tudi Teu Deliću za pomoč in vodstvo pri laboratorijskem delu diplomskega dela.
Zahvaljujem se tudi Anji, s katero sva skupaj raziskovala, pisala in si stala ob strani.
Za vse zabavne trenutke tekom študija se zahvaljujem še Joni in Nevi ter vsem ostalim, s katerimi smo preţivljali ves ta čas.