Namen naloge je preveriti naslednje hipoteze:
I. Vsebnost organske snovi, mikrobna biomasa in obstojnost strukturnih agregatov bo večja v tleh zmanjšane intenzitete obdelave tal.
II. Intenziteta obdelave tal vpliva na velikost strukturnih agregatov in sestavo talne mikrobne združbe v posameznih velikostnih frakcijah strukturnih agregatov.
2 PREGLED OBJAV 2.1 KAKOVOST TAL
Kakovost tal ima več definicij, ki izhajajo iz različnih pristopov k vrednotenju tal. V večini se je kakovost tal v preteklosti ocenjevala kot rodovitnost tal, z vidika pridelave rastlin, medtem ko je v novejšem času ocena kakovosti postala bolj celostna. Tako so kakovostna tla definirana kot stabilen sistem z visoko stopnjo biotske pestrosti in aktivnosti, lastnim kroženjem hranil ter z odpornostjo na motnje (Sharma in sod., 2010; Suhadolc, 2013).
Kakovost tal je spremenljiva lastnost, ki je pod velikim vplivom gospodarjenja s tlemi, razpoložljivosti virov v agroekosistemu ter podnebnih razmer. Kakovost tal lahko ocenjujemo kvalitativno ali kvantitativno. Kvalitativna ocena vključuje vizualne, morfološke lastnosti tal. Kvantitativni parametri vključujejo analitske pristope za oceno fizikalnih, kemijskih in bioloških lastnosti tal. Izbor metod za oceno fizikalnih parametrov kakovosti tako vključujejo določanje teksture, volumske gostote, vodno-zadrževalnih lastnosti, poroznosti, obstojnosti strukturnih agregatov in globine tal. Glavni kemijski parametri so vsebnost organskega ogljika, pH, elektro prevodnost, kationska izmenjalna kapaciteta ter vsebnosti P, K, S in N. Na delovanje tal močno vplivajo tudi organizmi, ki jih naseljujejo, zato je uporaba biotskih kazalnikov prav tako pomembna. Uporaba le-teh je slabše raziskana in težja za interpretacijo. Za oceno kakovosti tal lahko uporabimo metode ocene biomase mikrobov, talnih živali ali vegetacije. Kakovost opiše tudi vrstna in funkcionalna pestrost mikroorganizmov, živali in rastlin. Poleg tega jo lahko ocenjujemo tudi preko aktivnosti živih organizmov v tleh, npr. z oceno dihanja tal, encimske aktivnosti, hitrosti razgradnje organske snovi itd. (Sharma in sod., 2010; Suhadolc, 2013).
2.1.1 Strukturatal
Struktura tal se razvije s povezovanjem osnovnih talnih delcev in organske snovi v med seboj jasno ločljive skupke (Grčman in Zupan, 2010). Povezovanje v večje skupke t. i. strukturne agregate izboljša kakovost tal, saj dobra strukturiranost tal izboljša poroznost in omogoča boljši razrast korenin, izboljša vodno zračni režim. Znotraj strukturnih agregatov pa je organska snov bolje zaščitena (Plaster, 2009). Strukturni agregati najprej nastajajo zaradi lokalnih tlakov, ki povežejo talne delce. Tlak navadno ustvarjajo korenine rastlin in glivne hife v A horizontih. V B horizontih agregati pogosteje nastajajo pod vplivom vlaženja oziroma izsuševanja tal ali taljenja in zamrzovanja. Tako nastali agregati so rahli, vendar pa so tekom oblikovanja zlepljeni s cementnimi snovmi, ki povečajo obstojnost (Plaster, 2009;
Grčman in Zupan, 2010). Kot lepila lahko delujejo glineni delci, železovi oksidi in različne organske snovi (Tisdal in Oades, 1982; Grčman in Zupan, 2010). Od slednjih imajo pomembno vlogo pri povečanju obstojnosti strukturnih agregatov mikrobni eksudati in ostanki (Murugan in sod., 2019; Plaster, 2009; Tisdal in Oades, 1982).
Oblikovanje agregatov pomembno vpliva na delovanje tal, saj fizično ščiti organsko snov in mikroorganizme pred zunanjimi vplivi. Obstojni strukturni agregati izboljšajo še infiltracijo in zadrževanje vode v tleh; pore, ki nastanejo med agregati pa izboljšajo porazdelitev zraka v tleh. Razvoj kompleksne strukture tal, sestavljene iz različnih velikosti por in agregatov, ustvari množico različnih habitatov, primernih za veliko vrst in funkcij mikroorganizmov (Vazzani in sod., 2018).
Struktura tal ni trajna lastnost in je pod velikim vplivom gospodarjenja s tlemi. Nanjo vpliva vrsta med seboj povezanih in pogosto povratnih mehanizmov (Bronick in Lal, 2005).
Obdelava tal strukturne agregate izpostavi mehanskim motnjam, ki pospešijo razpadanje agregatov in s tem tla izpostavijo povečani vetrni in vodni eroziji, kar poveča razgradnjo in posledično izgubo organske snovi (Helgason in sod., 2010).
Za izboljšanje obstojnosti strukture je pomembna vpeljava ukrepov, ki zmanjšajo količino motenj v agroekosistemu, povečajo vnos organske snovi, povečajo pokritost tal z rastlinami ali rastlinskimi ostanki ter zmanjšajo hitrost razgradnje organske snovi. Prav tako sta pomembni raznolikost gojenih kultur in mikro ter makro favne v tleh (Bronick in Lal, 2005).
2.1.1.1 Struktura tal in talna mikrobna združba
Mikrobne funkcije, kot so vezava in razgradnja talne organske snovi, so močno povezane z oblikovanjem strukturnih agregatov in njihovo stabilizacijo. Pomembno vlogo pri stabilizaciji strukturnih agregatov pa imajo tudi mikrobni ostanki (Murugan in sod., 2019).
Mehanizmi vezave, ki vključujejo mikroorganizme tal so prehodni, kjer kot vezavne snovi delujejo polimerni celični eksudati (nap. muramična kislina, ergosterol in aminosladkorji) ali začasni pod lokalnimi tlaki glivnih hif. Ti mehanizmi so posebej pomembni v tleh z manjšo vsebnostjo gline, kjer je povezava v organo-mineralne komplekse manj pogosta (Tisdal in Oades, 1982).
Hkrati pa strukturni agregati ustvarjajo v tleh specifične mikroniše za mikrobne združbe (Helgason in sod., 2010). Spremembe v fizikalnih in kemijskih lastnostih okolja, kot so spremenjen vodno-zračni režim ter poroznost tal in so posledica tvorbe strukturnih agregatov vplivajo na abundanco in strukturo mikrobnih združb v tleh. Strukturni agregati, ki se razlikujejo v kemijski sestavi in lastnostih, oblikujejo množico specifičnih mikrookolji v tleh (Zhang in sod., 2018).
2.2 OBDELAVA TAL
Obdelava tal stremi k ustvarjanju optimalnih pogojev za kalitev ter rast rastlin. Ne glede na način obdelave želimo obvladovati razrast plevelov, ustvariti za rast primerne razmere v tleh ter poskrbeti za rastlinske ostanke na in v tleh (Plaster, 2009). Konvencionalna obdelava, t.
j. klasično oranje z obračanjem tal, vključuje dva dela. V prvem delu s plugom obrnemo tla
ter plevele in rastlinske ostanke zadelamo v tla. V drugem delu (brananju) pa razbijemo večje grude, ki so nastale zaradi oranja in tako ustvarimo primerno setveno posteljico. Ornica, ki nastane, je homogen, fino strukturiran horizont, globok med do 20–30 cm (Plaster, 2009;
Page in sod., 2020).
Zmanjšana intenziteta obdelave, bodisi direktna setev (t. j. brez obdelave tal, angl. no-till) bodisi plitva obdelava brez mešanja tal, je ena od načel ohranitvenega kmetijstva. Ta pristop temelji na trajnostnem načinu kmetovanja, ki ob zagotavljanju pridelkov za ljudi in živali, zmanjšuje negativne vplive kmetovanja na zrak, vode in tla. Za doseganje teh ciljev ohranitveno kmetijstvo (Slika 1) predlaga tri ključne pristope. Eden od teh je ohranitvena obdelava, ki vključuje več načinov obdelave; vsem je skupno, da se intenziteta obdelave zmanjša ter da po obdelavi vsaj 30 % površine tal ostane pokrite z rastlinskimi ostanki (Stajnko, 2017).
Slika 1: Sestavni deli ohranitvenega kmetijstva, potrebne prilagoditve za širšo uporabo ter potencialni pozitivni učinki uvedbe na kakovost tal (prirejeno po Page in sod., 2020)
2.2.1 Vpliv na fizikalno-kemijske lastnosti tal
Konvencionalna obdelava tal (oranje s plugom) povzroči mehansko motnjo v obdelovani plasti tal in ustvari relativno homogen vrhnji horizont, tako imenovano ornico z relativno uniformnimi fizikalnimi lastnostmi in porazdelitvijo hranil (Kraut-Cohen in sod., 2020).
Mehanska motnja, ki jo predstavlja oranje, je direktno povezana z manjšo velikostjo ter obstojnostjo strukturnih agregatov, ki pod vplivom obdelave tudi hitreje razpadajo (Dhaliwal in sod., 2019; Vazzani in sod., 2018; Helgason in sod., 2010).
Vpliv obdelave se kaže tudi v kemijskih lastnostih. Motnje med obdelavo tal sprostijo organsko snov iz makroagregatov (Gmach in sod., 2020; Helgason in sod., 2010). Zaradi povečane izpostavljenosti organskega ogljika oksidaciji se zmanjša vsebnost organske snovi
v tleh (Vazzani in sod., 2018; Dhaliwal in sod., 2019). Hkrati so razdrobljeni in v tla vdelani rastlinski ostanki bolj izpostavljeni mikrobni razgradnji (Page in sod., 2020).
Kationska izmenjalna kapaciteta je močno vezana na lastnosti tal, kot sta mineralna sestava, še posebej vsebnost gline; nanjo lahko vplivata tudi vsebnost organske snovi in pH. V ohranitveni obdelavi se kationska izmenjalna kapaciteta tako lahko poveča. Povečanje je navadno v povezavi s povečanjem negativnega naboja pri povečani vsebnosti organske snovi (Page in sod., 2020).
Vpliv zmanjšane intenzitete obdelave na volumsko gostoto tal je lahko tako pozitiven kot negativen. Povečana volumska gostota je posledica posedanja tal v odsotnosti obdelave.
Toda povečana volumska gostota ni nujno povezana z manjšo količino por v tleh, saj se formirajo bolj stabilne makropore. Zmanjšanje volumske gostote ob zmanjšani intenziteti obdelave je lahko posledica povečane vsebnosti talnega organskega ogljika (Page in sod., 2020).
Spremembe v vodnem režimu tal pri zmanjšani intenziteti obdelave so posledica izboljšane obstojnosti strukturnih agregatov, večje količine rastlinskih ostankov ter večje količine in boljše povezljivosti makropor. Zaradi zmanjšane intenzitete obdelave se tako zmanjša izhlapevanje in poveča infiltracija vode (Page in sod., 2020; Vazzani in sod., 2018).
Ob povečanju vsebnosti organske snovi se spremeni tudi dostopnost rastlinskih hranil, in sicer tako zaradi spremembe količine hranil kot tudi zaradi prerazporeditve v talnem profilu.
Izkazalo se je, da se v tleh z zmanjšano intenziteto obdelave, kjer se poveča količina rastlinskih ostankov, poveča vsebnost dušika, fosforja, kalija ter tudi magnezija, mangana in cinka. Čeprav se v večini primerov v zgornji plasti tal poveča vsebnost rastlinskih hranil, to ne velja za njihovo dostopnost. Predvsem ko govorimo o dušiku, se pogosto zgodi, da se hitrost mineralizacije zmanjša ter poveča imobilizacija. Prav tako se manj mobilni elementi akumulirajo v zgornjih plasteh tal, kjer so lahko rastlinam slabše dostopni (Page in sod., 2020). Hranila, ki se kopičijo v površinskih horizontih, so lahko bolj izpostavljena površinskemu odtoku in izhlapevanju (Blanco-Caqui in Wortmann., 2020).
2.2.2 Vpliv na biološke lastnosti tal
V tleh živi raznolika združba bakterij, gliv, arhej, členonožcev, kolobarnikov, drugih nevretenčarjev ter rastlinskih korenin (Aislabie in Deslippe, 2011). Glede na raznolikost habitatov v tleh se mikrobne združbe v različnih tleh močno razlikujejo, saj nanje vplivajo podnebje, matična podlaga, relief. V zmernih klimatih po velikosti populacije prevladujejo bakterije; največjo biomaso pa ima združba gliv (Sharma in sod., 2010).
Mikroorganizmi v tleh so ključni za kroženje hranil v tleh; predvsem je pomembna njihova vloga pri kroženju dušika in fosforja. Prav tako so mikroorganizmi pomembni pri mineralizaciji organske snovi ter pri razgradnji in imobilizaciji onesnažil v tleh. Mnoge funkcije mikroorganizmov v tleh podpirajo rast in razvoj rastlin (Aislabie in Deslippe, 2011).
Slika 2: Potek odziva mikrobne združbe tal na motnje (prirejeno po Sharma in sod., 2010)
Različne vrste organizmov različno reagirajo na vrsto obdelave. Večji talni organizmi so na motnje v tleh, vdelane rastlinske ostanke ter spremenjen vodni in temperaturni režim, ki jih povzroči obdelava, bolj občutljivi (Kladivko, 2001; Mueller, 2015; Mangalassery in sod., 2015). Mehanskim motnjam pripišemo tudi spremenjeno sestavo mikrobne združbe tal, zmanjšano funkcionalno in vrstno pestrost (Slika 3) (Kraut-Cohen in sod., 2020; Page in sod., 2020; Scheu in sod., 1996). Z zmanjšano biomaso se zmanjša tudi volumen mikrobnih eksudatov, kot so glivni polisaharidi, ki stabilizirajo strukturo tal (Vazzani in sod., 2018;
Helgason in sod., 2010).
Pristopi ohranitvene obdelave, z zmanjšanim obsegom mehanskih motenj, ustvarijo bolj stabilno okolje v tleh za mikroorganizme in drugo talno favno. V primerjavi s konvencionalno obdelavo se v poskusih pogosto dokazuje, da imajo tla pod ohranitveno
obdelavo večjo mikrobno biomaso, večji obseg dihanja tal in encimske aktivnosti (Kraut-Cohen in sod., 2020; Scheu in sod., 1996; D'Hose in sod., 2018). Ker pa je dostopnost organskega substrata zmanjšana, povečana vlaga v tleh, spremenjeni temperaturni profil, zračnost ter sestava talne flore in favne, se mineralizacija organske snovi lahko zmanjša (Mueller, 2015; Mangalassery in sod., 2015).
Pojavnost rastlinskih bolezni je lahko pri zmanjšani intenziteti obdelave tako povečana kot zmanjšana. Ohranitvena obdelava pripravi bolj ugodno okolje za nekatere patogene, ki lahko na rastlinskih ostankih prezimijo; prav tako je zmanjšano število motenj; povečana vlažnost tal in nižja temperatura tal lahko omogočata boljši razvoj patogenov. Toda v splošnem povečana biotska pestrost in abundanca mikroorganizmov zavira razvoj patogenih mikroorganizmov oziroma zmanjša obseg okužb (Page in sod., 2020; D'Hose in sod., 2018).
3 MATERIALI IN METODE
Vzorčenje tal za kasnejše analize tal in strukturnih agregatov je potekalo 18. 2. 2020 in 27.
2. 2020 na dolgoletnem poljskem poskusu »Rašica« v Moškanjcih. V prvem terminu vzorčenja smo odvzeli vzorce tal za kemijske, fizikalne in biološke analize; vzorce drugega vzorčenja smo uporabili za določanje obstojnosti strukturnih agregatov. Dolgoletni poskus je na robu Panonske kotline, kjer je tipično subpanonsko, kontinentalno podnebje.
Dolgoletno (1999-2020) povprečje padavin znaša 927 mm letno; povprečna temperatura v tem obdobju je 10,9 °C. Tla na območju so se razvila na aluvialnih nanosih reke Drave in jih glede na WRB klasifikacijo uvrstimo v Sceletic, Eutric Cambisol (Loamic) (Kaurin in sod, 2015; Kaurin in sod., 2018; Mihelič in Suhadolc, 2019). Po slovenski klasifikaciji spadajo med evtrična rjava tla na produ in pesku z velikim deležem skeleta.
3.1 ZASNOVA POSKUSA, VZORČENJE IN PRIPRAVA VZORCEV
Poskus vpliva intenzivnosti obdelave tal je bil zasnovan leta 1999 in vključuje dve obravnavanji: konvencionalno obdelavo tal z oranjem do globine 25 cm (CT) in minimalno obdelavo do globine 10 cm brez obračanja tal in z vsaj 30 % pokritostjo z rastlinskimi ostanki (MT). Leta 2014 je bil poskus preusmerjen iz konvencionalne v ekološki sistem pridelave.
Obe obravnavanji sta razdeljeni v deset podparcelic (12 m x 8 m). Vzorčili smo štiri naključno izbrane podparcelice vsakega obravnavanja (Slika 3). Prav tako smo v vsaki podparcelici vzorčili na dveh globinah, in sicer 0-10 cm in 10-20 cm. Na istih podparcelicah smo odvzeli dva seta vzorcev in sicer porušene vzorce, sestavljene iz 5 izvrtkov, in neporušene vzorce, odvzete s Kopeckyjevimi cilindri. Porušene vzorce smo uporabili za analize kemijskih in fizikalnih lastnosti tal.
Slika 3: Shema poskusa z načrtom vzorčenja in razdelitvijo vzorcev glede na predvidene analize
Sveže, neporušene vzorce pa smo vzeli iz Kopeckyjevih cilindrov in jih previdno razlomili po ploskvah strukturnih agregatov, presejali skozi sosledje sit ter s tem odstranili tudi skelet in rastlinske ostanke, večje od 8 mm. Tako smo neporušen talni vzorec razdelili na posamezne frakcije strukturnih agregatov velikosti 4-8 mm, 2-4 mm in <2 mm. Skupaj smo za analize kemijskih, fizikalnih in bioloških lastnosti dobili 48 frakcioniranih podvzorcev (2 obravnavanji x 2 globini x 4 podparcelice x 3 frakcije).
Po frakcioniranju smo vzorce tal shranili v odvisnosti od vrste predvidenih analiz. Za kemijske analize smo tako vzorce posameznih frakcij kot tudi skupne (nefrakcionirane) vzorce sušili 24 h na 35-40 °C, zmleli in shranili na sobni temperaturi (ISO 11464, 2006).
Za molekularne analize smo podvzorce izbranih velikostnih skupin strukturnih agregatov homogenizirali, presejali na 2 mm, shranili v kriovialah ter zamrznili na suhem ledu.
3.2 KEMIJSKE LASTNOSTI TAL 3.2.1 Skupni topni ogljik in dušik
Za določanje topnih oblik organskega ogljika in dušika smo v centrifugirke natehtali 3 g posušenega vzorca tal. Prelili smo ga s 30 ml 0,01 M CaCl2 ter stresali dve uri pri 200 obratih na minuto. Vzorce smo nato 5 minut centrifugirali pri 4500 obratih na minuto ter supernatant prefiltrirali. Tako pripravljene vzorce smo uporabili za analizo z VarioTOC cube analizatorjem (Elementar, Nemčija). V stekleno vialo smo odpipetirali 10 ml vzorca ter dodali 100 μl 10 % HCl, da smo odstranili anorganski ogljik.
Iz standardne raztopine 500 ppm ogljika in dušika v razmerju 10:1 smo pripravili pet redčitev in iz njih umeritveno krivuljo. Njen koeficient smo uporabili za preračun vrednosti vzorcev.
CO2 in NOx, ki so nastajali med uplinjanjem in oksidacijo pri 850 °C, so bili pomerjeni s plinskim infrardečim (NDIR) in elektrokemičnim detektorjem (EC).
V istem ekstraktu smo določili tudi nitratni in amonijski dušik. Za določanje vsebnosti smo uporabili fotometrijski analizator Gallery Automated Photometric Analyzer (Thermo Scientific, ZDA).
3.2.2 Skupni ogljik in dušik
Posušene vzorce tal smo zatehtali v teflonske posodice in jih postavili v avtomatski podajalnik analizatorja VarioMAX (Elementar, Nemčija). Ta določa delež skupnega ogljika in dušika s suho oksidacijo. Najprej se v sežigni koloni ogljik in dušik uplinita; hkrati čistilne kolone vežejo vodo, halogene pline ter žveplo. Dušični plini potujejo direktno do analizatorja; ogljik se veže na absorpcijsko kolono, ki se nato segreje in sprosti CO2 do analizatorja (ISO 10694, 1996; ISO 13878, 1995).
3.2.3 Organski ogljik in organska snov
Delež organskega ogljika smo izračunali iz razlike deleža skupnega ogljika in mineralnega ogljika v tleh. Delež organske snovi smo izračunali kot količnik deleža organskega ogljika in povprečnega deleža ogljika v organski snovi (Rowell, 1994).
𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑠𝑘𝑎 𝑠𝑛𝑜𝑣 [%] =Organski C [%]
0,58 … (1)
3.2.4 pH tal
Tlom smo določili pH po metodi ISO 10390. Tako smo vzorec tal prelili s petkratnim volumnom 0,01 M CaCl2. Vzorce smo po nekaj urah dobro premešali, pH meter umerili s puferskima raztopinama s pH vrednostjo 4 in 7 ter vzorcem izmerili pH.
3.2.5 Rastlinam dostopni fosfor in kalij
Za določanje rastlinam dostopnega fosforja in kalija smo uporabili amon-laktatno ekstrakcijo po Egner-Rirhm-Domingo (Grčman in Zupan, 2010). Za ekstrakcijo smo uporabili 2,5 g vzorca, ki smo ga prelili s 50 ml 0,01 M amon-laktata. Po dveh urah stresanja pri 200 obratih na minuto smo vzorce prefiltrirali. Vsebnost fosforja smo pomerili z Gallery Automated Photometric Analyzer (Thermo Scientific, ZDA). Kalij smo pomerili z atomsko absorpcijsko spektrofotometrijo s plamenskim emisijskim spektrofotometrom AAS Varian (Varian, ZK).
3.2.6 Mineralni ogljik
Količino karbonatov smo določili z volumetričnim postopkom s Scheiblerjevim aparatom.
Vzorce smo prelili z 10 % HCl ter določili volumen CO2, ki je nastal pri reakciji med karbonati in kislino (ISO 10693, 1996).
3.3 FIZIKALNE LASTNOSTI TAL 3.3.1 Suha snov
Delež suhe snovi smo izračunali iz razmerja mase vlažnih vzorcev in vzorcev, ki smo jih 48 ur sušili pri 110 °C.
3.3.2 Tekstura
Teksturo frakcij smo določili s standardno sedimentacijsko metodo, ki temelji na Stokesovem zakonu. Ta pravi, da imajo mineralni delci različnih velikosti različen sedimentacijski čas. Suhim vzorcem smo dodali natrijev pirofosfat in jih štiri ure stresali, da smo zagotovili popolno disperzijo talnih delcev. Delež posamezne frakcije smo določili skladno z metodo ISO 11277 (2009) ter teksturni razred vzorca določili glede na ameriški teksturni trikotnik.
3.3.3 Obstojnost strukturnih agregatov z mokrim sejanjem
Obstojnost strukturnih agregatov smo določali z metodo mokrega sejanja (Eijkelkamp, Nizozemska). Po navodilih proizvajalca smo 4 g zračno suhih in po frakcijah ločenih vzorcev natehtali v zgornje posodice sejalnika s sitastim dnom. V spodnje posodice sejalnika smo nalili destilirano vodo, in sicer okoli 75 ml, da se je vzorec pri sejanju popolnoma potopil. Posodice z vzorci tal smo nato postavili v aparat in jih navlažili tako, da smo jih pomočili v destilirano vodo, dvignili in počakali 7 minut. Po pretečenem času smo 3 minute izvajali mokro sejanje v destilirani vodi. Nato smo sejanje prekinili in počakali, da je voda iz posodic s sitom odtekla. Spodnje posodice z vodo smo zamenjali za posodice z 0,05 M
NaOH. Ponovno smo izvajali mokro sejanje, in sicer 20 minut, ter vzorce med tem časom dvakrat rahlo pomešali. Po koncu sejanja smo posodice z vodo in z NaOH postavili v sušilnik na 110 °C za približno en dan, da je vsa tekočina izhlapela. Prav tako smo v sušilnik dali posodice s sitom, na katerem so ostali rastlinski ostanki ter manjši skelet.
Delež obstojnih strukturnih agregatov smo dobili s preračunom:
𝐷𝑒𝑙𝑒ž 𝑜𝑏𝑠𝑡𝑜𝑗𝑛𝑒 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑐𝑖𝑗𝑒 [%] = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑣 𝑁𝑎𝑂𝐻
𝑠𝑘𝑢𝑝𝑛𝑎 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑣𝑧𝑜𝑟𝑐𝑎 ∗ 100 … (2)
Pri preračunu pa smo upoštevali še maso NaOH v raztopini ter maso rastlinskih ostankov in skeleta v zatehti.
3.3.4 Obstojnost strukturnih agregatov po Sekeri
Velikostni skupini 4-8 mm smo obstojnost določili tako, da smo 10 strukturnih agregatov položili v petrijevke in jih previdno prelili z deionizirano vodo. Tako prelite agregate smo pustili 10 minut in jih med tem nekajkrat rahlo premešali. Obstojnost smo nato določili vizualno glede na Preglednico 1.
Preglednica 1: Ocena stopnje obstojnosti strukturnih agregatov za metodo po Sekeri (Grčman in Zupan, 2010) Stopnja obstojnosti Delež razpadlih strukturnih agregatov
1 Strukturni agregati so v glavnem nerazpadli.
2 Razpadlo je manj kot 50 % strukturnih agregatov.
3 Razpadlo je 50 % strukturnih agregatov.
4 Razpadlo je več kot 50 % strukturnih agregatov.
5 Večina agregatov je razpadla.
6 Vsi agregati so razpadli; nastala je suspenzija.
3.4 MOLEKULARNE METODE
Za ugotavljanje sestave mikrobne združbe po frakcijah tal smo uporabili metodo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR). Iz odmrznjenih vzorcev tal smo najprej izolirali DNK ter določili koncentracijo in čistost. Količino skupne ekstrahirane talne DNK smo uporabili kot oceno za mikrobno biomaso (Blagodatskaya in Kuzyakov, 2013).
3.4.1 Izolacija DNK
Za izolacijo mikrobne DNK iz vzorcev tal smo uporabili PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc., Združene države Amerike). V PowerBeadTube, ki vsebuje delce za disperzijo tal, ter pufer, ki hkrati razgradi huminske snovi in ščiti DNK pred razgradnjo, smo zatehtali 0,25 g svežih tal. V centrifugirko smo dodali še 60 μl raztopine C1, to je natrijev dodecil sulfat, ki pomaga pri lizi celic.
Tako pripravljene vzorce smo stresali 2 minuti na pri 30 tresljajih na sekundo (Retsch, Nemčija); sledilo je enominutno centrifugiranje pri hitrosti 10.000 xg. Dobljeni supernatant smo prenesli v Collection Tube ter mu dodali 250 μl raztopine C2. Sledilo je kratko vrtinčenje in inkubacija 5 minut na 4 °C. Patentirana raztopina C2, ki smo jo dodali supernatantu, vsebuje tiamin hidroklorid, tiamin pirofosfat, 1,3-ditiazol-2-propanon, dibromid in piridoksamin in je namenjena precipitaciji humusnih in fulvičnih kislin, ki
Tako pripravljene vzorce smo stresali 2 minuti na pri 30 tresljajih na sekundo (Retsch, Nemčija); sledilo je enominutno centrifugiranje pri hitrosti 10.000 xg. Dobljeni supernatant smo prenesli v Collection Tube ter mu dodali 250 μl raztopine C2. Sledilo je kratko vrtinčenje in inkubacija 5 minut na 4 °C. Patentirana raztopina C2, ki smo jo dodali supernatantu, vsebuje tiamin hidroklorid, tiamin pirofosfat, 1,3-ditiazol-2-propanon, dibromid in piridoksamin in je namenjena precipitaciji humusnih in fulvičnih kislin, ki