BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Kristina OCVIRK
SESTAVA TALNE MIKROBNE ZDRUŽBE V ODVISNOSTI OD VELIKOSTI STRUKTURNIH
AGREGATOV IN OBDELAVE TAL
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Kristina OCVIRK
SESTAVA TALNE MIKROBNE ZDRUŽBE V ODVISNOSTI OD VELIKOSTI STRUKTURNIH AGREGATOV IN OBDELAVE TAL
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
THE COMPOSITION OF SOIL MICROBIAL COMMUNITY IN RELATION TO SOIL AGGREGATE SIZE AND SOIL
MANAGEMENT
M. SC. THESIS Master Study Programs
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa druge stopnje Agronomija.
Delo je bilo opravljeno na Katedri za Pedologijo in varstvo okolja.
Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorja magistrskega dela imenovala izr.
prof. dr. Marjetko Suhadolc.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: doc. dr. Zalika ČREPINŠEK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: izr. prof. dr. Marjetka SUHADOLC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Klemen ELER
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum zagovora:
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 631.51:631.434:631.46(043.2)
KG mikrobne združbe, obdelava tal, struktura tal AV OCVIRK, Kristina
SA SUHADOLC; Marjetka (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Magistrski študijski program druge stopnje Agronomija
LI 2021
IN SESTAVA TALNE MIKROBNE ZDRUŽBE V ODVISNOSTI OD VELIKOSTI STRUKTURNIH AGREGATOV IN OBDELAVE TAL
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja) OP IX, 11, [41] str., 6 pregl., 13 sl., 3 pril., 54 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V predstavljeni nalogi smo preučevali vpliv zmanjšane intenzitete obdelave tal na velikost strukturnih agregatov, njihovo obstojnost ter na sestavo talne mikrobne združbe znotraj agregatov. Več kot dvajsetletni poskus v Moškanjcih nam je omogočal vpogled na spremembe v tleh, ki se pokažejo šele z daljšim časovnim zamikom po spremembi intenzitete obdelave. Poskus sestavljata obravnavanji konvencionalne (CT; oranje do 25 cm) in minimalne obdelave tal (MT, plitva obdelava do 10 cm, brez obračanja tal). Porušene in neporušene vzorce tal smo odvzeli februarja 2020 na dveh globinah (0-10 in 10-20 cm) v več ponovitvah.
Strukturne agregate neporušenih vzorcev tal smo ločili na 3 velikostne frakcije (<2 mm, 2-4 mm in 4-8 mm); z mokrim sejanjem smo določili njihovo obstojnost. Z ekstrahiranjem skupne talne DNK smo ocenili mikrobno biomaso po treh velikostnih skupinah strukturnih agregatov ter s kvantifikacijo (qPCR) splošnih bakterijskih in krenarhejskih 16S rRNK ter glivnih ITS genov določili velikost in sestavo mikrobne združbe. Poleg tega smo določili še številčnost denitrifikacijskega gena nosZII.
Rezultati kažejo, da se deleži posameznih velikostnih frakcij strukturnih agregatov med obravnavanji niso razlikovali. Se je pa večja vsebnost organske snovi na MT v globini 0-10 cm odražala v značilno večji obstojnosti strukturnih agregatov ter v večji mikrobni biomasi in večji številčnosti skupne združbe bakterij, arhej in gliv v primerjavi s CT pri tej globini. Med velikostnimi skupinami agregatov posameznega obravnavanja nismo odkrili razlik v sestavi združbe in prav tako ne med načinoma obdelave tal. Največja je bila številčnost bakterij; sledile so glive in krenarheje. Za bolj celosten vpogled bi bilo smiselno spremljati dinamiko v sestavi združb ali vzorčenje ponoviti vsaj še enkrat v času vegetacije.
KEYWORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 631.51:631.434:631.46(043.2)
CX microbial communities, tillage intensity, soil structure AU OCVIRK, Kristina
AA SUHADOLC; Marjetka (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Master Study Program in Agronomy
PY 2021
TI THE COMPOSITION OF SOIL MICROBIAL COMMUNITY IN RELATION TO SOIL AGGREGATE SIZE AND SOIL MANAGEMENT
DT M. SC. Thesis (Master Study Programmes) NO XI, 11, [41] p., 6 tab., 13 fig., 3 ann., 54 ref.
LA sl AL sl/en
AB Our study examined the effects of reduced tillage intensity on the size of soil aggregates, their stability, and the composition of microbial communities within them. More than twenty years of reduced tillage in Moškanjci allowed us to evaluate the long-term effects induced by reduced tillage. Two treatments were observed, conventional tillage (CT; moldboard ploughing to 25 cm) and minimum tillage (MT;
shallow non-inversion tillage to 10 cm). Composite and undisturbed soil samples from the two treatments (CT and MT) and two depths (0-10 cm and 10-20 cm) were collected in February 2020. Soil aggregates of undisturbed samples were fractionated into 3 size groups (<2 mm, 2-4 mm, and 4-8 mm). Aggregate stability was determined by the wet sieving method. Microbial biomass was estimated by the total extracted soil DNA. The abundance of the archaeal and bacterial 16S rRNA and fungal ITS genes and the denitrifier nosZII gene were determined by qPCR. The shares of selected aggregate size groups were not significantly different between treatments.
However, the difference in organic matter content was reflected in aggregate stability, microbial biomass, and abundance of all studied communities which were significantly higher in MT treatment than in CT. No significant difference was observed in the fractions of the same treatment. Moreover, the ratio of microbial communities remained the same, i.e. the most abundant was the bacterial community followed by fungi and Creanarchea. For a more cohesive insight, it would be useful to conduct at least one additional sampling during the vegetation period.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEYWORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VII KAZALO SLIK VIII
KAZALO PRILOG IX
1 UVOD ... 1
1.1 NAMEN IN POVOD DELA ... 2
1.2 DELOVNE HIPOTEZE ... 2
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 KAKOVOST TAL ... 3
2.1.1 Struktura tal ... 3
2.1.1.1 Struktura tal in talna mikrobna združba ... 4
2.2 OBDELAVA TAL ... 4
2.2.1 Vpliv na fizikalno-kemijske lastnosti tal ... 6
2.2.2 Vpliv na biološke lastnosti tal ... 7
3 MATERIALI IN METODE ... 10
3.1 ZASNOVA POSKUSA, VZORČENJE IN PRIPRAVA VZORCEV ... 10
3.2 KEMIJSKE LASTNOSTI TAL ... 12
3.2.1 Skupni topni ogljik in dušik ... 12
3.2.2 Skupni ogljik in dušik ... 12
3.2.3 Organski ogljik in organska snov ... 12
3.2.4 pH tal ... 12
3.2.5 Rastlinam dostopni fosfor in kalij ... 13
3.2.6 Mineralni ogljik ... 13
3.3 FIZIKALNE LASTNOSTI TAL... 13
3.3.1 Suha snov... 13
3.3.2 Tekstura ... 13
3.3.3 Obstojnost strukturnih agregatov z mokrim sejanjem ... 13
3.3.4 Obstojnost strukturnih agregatov po Sekeri ... 14
3.4 MOLEKULARNE METODE ... 14
3.4.1 Izolacija DNK ... 15
3.4.2 Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo (qPCR) ... 15
3.5 ANALIZA PODATKOV ... 17
4 REZULTATI ... 18
4.1 TALNE LASTNOSTI V ODVISNOSTI OD INTENZITETE OBDELAVE ... 18
4.2 TALNE LASTNOSTI V ODVISNOSTI OD OBDELAVE IN VELIKOSTI STRUKTURNIH AGREGATOV ... 19
4.2.1 Fizikalne lastnosti ... 21
4.2.2 Kemijske lastnosti... 23
4.2.3 Lastnosti talne mikrobne združbe ... 25
5 RAZPRAVA... 31
5.1 VPLIV OBDELAVE NA STRUKTURO TAL ... 31
5.1.1 Velikost strukturnih agregatov ... 31
5.1.2 Obstojnost strukturnih agregatov ... 31
5.1.3 Sestava izbranih velikostnih skupin strukturnih agregatov ... 32
5.1.3.1 Organska snov ... 32
5.1.3.2 Mikrobna združba... 33
6 SKLEPI ... 34
7 POVZETEK ... 35
8 VIRI ... 37 ZAHVALA
PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Ocena stopnje obstojnosti strukturnih agregatov za metodo po Sekeri (Grčman in Zupan, 2010) ... 14 Preglednica 2: Pogoji kvantitativne verižne reakcije s polimerazo glede na tarčni gen... 16 Preglednica 3: Sestava reakcijske raztopine za kvantitativno reakcijo s polimerazo ... 17 Preglednica 4: Kemijske lastnosti skupnih (nefrakcioniranih) vzorcev tal. Male črke
označujejo statistično značilne razlike med obravnavanji (Tukeyev HSD test, p < 0,05) ... 18 Preglednica 5: Teksturni razred in deleži peska, melja in gline v odvisnosti od velikostne
frakcije strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT). Med obravnavanji ni statistično značilnih razlik (Tukeyev HSD test, p < 0,05) ... 21 Preglednica 6: Obstojnost strukturnih agregatov (4-8 mm) glede na obravnavanje (CT in
MT) in globino (0-10 in 10-20 cm) vzorčenja določena z metodo po Sekeri ... 22
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Sestavni deli ohranitvenega kmetijstva, potrebne prilagoditve za širšo uporabo ter potencialni pozitivni učinki uvedbe na kakovost tal (prirejeno po Page in sod., 2020) ... 6 Slika 2: Potek odziva mikrobne združbe tal na motnje (prirejeno po Sharma in sod., 2010)
... 8 Slika 3: Shema poskusa z načrtom vzorčenja in razdelitvijo vzorcev glede na predvidene
analize ... 11 Slika 4: Deleži velikostnih frakcij strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm) po obravnavanjih
(CT in MT) ter po globinah vzorčenja (0-10 cm in 10-20 cm) ... 20 Slika 5: Delež obstojnih strukturnih agregatov (%) določenih po metodi mokrega sejanja v
odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT) ... 22 Slika 6: Vsebnost skupnega ogljika (TC) v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih
agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT) ... 23 Slika 7: Vsebnost topnega organskega ogljika (DOC) v odvisnosti od velikostne frakcije
strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT) ... 24 Slika 8: Vsebnost skupnega dušika (TN) v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih
agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT) ... 25 Slika 9: Vsebnost DNK (µg g -1) v vzorcih tal v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih
agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT) ... 26 Slika 10: Število kopij tarčnega gena 16S rRNK bakterij v odvisnosti od velikostne frakcije
strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT) ... 27 Slika 11: Število kopij tarčnega regije ITS gliv v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih
agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT) ... 28 Slika 12: Število kopij tarčnega gena 16S rRNK krenarhej v odvisnosti od velikostne frakcije
strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT) ... 29 Slika 13: Število kopij tarčnega gena nosZII v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih
agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT) ... 30
KAZALO PRILOG
Priloga A: Povprečna vsebnost DNK in število kopij tarčnih genov bakterij, gliv in krenarhej po obravnavanjih, globinah vzorčenja in frakcijah strukturnih agregatov
Priloga B: Povprečna vsebnost skupnega ogljika, topnega organskega ogljika, skupnega dušika, ter C/N razmerje po obravnavanjih, globinah vzorčenja in frakcijah strukturnih agregatov
Priloga C: Vpliv intenzitete obdelave na deleže izbranih velikostnih skupin strukturnih agregatov in na obstojnost strukturnih agregatov
1 UVOD
Poleg pridelave hrane je kmetijstvo odgovorno tudi za trajnostno upravljanje z naravnimi viri. Nadalje je poleg energetike, transporta in industrije eden od poglavitnih virov emisij toplogrednih plinov in kot tako dolžno zmanjšati svoj vpliv na okolje.
Kmetijstvo ima velik potencial tako za zmanjšanje lastnih emisij kot tudi za vezavo ogljika iz atmosfere. V obdobju med 1990 in 2016 je kmetijski sektor že zmanjšal svoje emisije za okoli 20 %. Vendar pa emisije iz kmetijstva še vedno predstavljajo okoli 10 % evropskih emisij. Največji vir emisij je živinoreja; sledijo emisije iz obdelovalnih površin (Climate change adaptation …, 2019).
Za obvladovanje emisij iz kmetijstva se kot najpomembnejši pristopi navajajo: zmanjšanje emisij CH4 in N2O, izboljšanje gospodarjenja z mineralnimi gnojili ter izboljšanje gospodarjenja s tlemi v smeri večje vezave ogljika vanje (Climate change adaptation…, 2019). Za doseganje zmanjšanja neto emisij preko povečanega shranjevanja ogljika v tleh so kmetijstvu lahko v pomoč različni ukrepi; eden od teh je tudi ohranitveno kmetijstvo, ki stremi k trajnostnem gospodarjenju s tlemi, in sicer preko (i) čim večje raznolikosti gojenih kultur, (ii) čim večje pokritosti tal z živimi rastlinami ali rastlinskim ostanki ter (iii) zmanjšane intenzitete obdelave tal (Slika 1). Poleg izboljšanja kakovosti tal kot posledice večje vsebnosti organske snovi lahko z vpeljavo ohranitvenega kmetijstva omilimo tudi nekatere druge posledice podnebnih sprememb, ki prizadenejo kmetijstvo (Hydbom in sod., 2017; Page in sod., 2020). Ohranitveno kmetijstvo tako lahko omili posledice vetrne in vodne erozije ter suše. Hkrati raziskave kažejo, da uvedba tehnologij ohranitvenega kmetijstva ne vpliva na pridelek in celo izboljša neto dobičke kmetij (Page in sod., 2020).
Zanimanje za uvedbo ohranitvenega kmetijstva se tako po svetu kot v Evropi v zadnjih letih povečuje (Helgason in sod., 2010). Toda zaradi velike prepletenosti mehanizmov delovanja in velikega vpliva okoljskih razmer je za širšo implementacijo pristopov ohranitvenega kmetijstva na tem področju potrebno več raziskav (D'Hose in sod., 2018; Belmonte in sod., 2018). V magistrski nalogi smo se osredotočili na preučevanje enega izmed omenjenih treh stebrov ohranitvenega kmetijstva, in sicer na učinke zmanjšane intenzitete obdelave tal.
Posebej pa smo se osredotočili na strukturo tal, saj je le-ta pomembna za normalno delovanje tal in hkrati so učinki ohranitve obdelave na oblikovanje strukturnih agregatov, njihovo obstojnost in življenje znotraj njih slabo raziskani.
1.1 NAMEN IN POVOD DELA
V magistrski nalogi smo želeli ugotoviti učinke zmanjšane intenzitete obdelave tal na vsebnost talnega organskega ogljika ter velikost in obstojnost strukturnih agregatov. Nadalje nas je zanimala sestava talne mikrobne združbe v odvisnosti tako od obdelave in globine vzorčenja kot tudi od velikostne frakcije strukturnih agregatov tal.
Učinki različne obdelave tal se na zgoraj omenjenih lastnostih tal odražajo s časovnim zamikom. Prav zato smo le-te preučevali v dolgoletnem poskusu v Moškanjcih, kjer že od leta 1999 poteka primerjava minimalne (plitve obdelave brez mešanja tal in z vsaj 30 % prekritostjo tal) in klasičnega oranja. Leta 2014 se je poskus preusmeril iz konvencionalnega v ekološki sistem pridelave (Mihelič in Suhadolc, 2019).
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Namen naloge je preveriti naslednje hipoteze:
I. Vsebnost organske snovi, mikrobna biomasa in obstojnost strukturnih agregatov bo večja v tleh zmanjšane intenzitete obdelave tal.
II. Intenziteta obdelave tal vpliva na velikost strukturnih agregatov in sestavo talne mikrobne združbe v posameznih velikostnih frakcijah strukturnih agregatov.
2 PREGLED OBJAV 2.1 KAKOVOST TAL
Kakovost tal ima več definicij, ki izhajajo iz različnih pristopov k vrednotenju tal. V večini se je kakovost tal v preteklosti ocenjevala kot rodovitnost tal, z vidika pridelave rastlin, medtem ko je v novejšem času ocena kakovosti postala bolj celostna. Tako so kakovostna tla definirana kot stabilen sistem z visoko stopnjo biotske pestrosti in aktivnosti, lastnim kroženjem hranil ter z odpornostjo na motnje (Sharma in sod., 2010; Suhadolc, 2013).
Kakovost tal je spremenljiva lastnost, ki je pod velikim vplivom gospodarjenja s tlemi, razpoložljivosti virov v agroekosistemu ter podnebnih razmer. Kakovost tal lahko ocenjujemo kvalitativno ali kvantitativno. Kvalitativna ocena vključuje vizualne, morfološke lastnosti tal. Kvantitativni parametri vključujejo analitske pristope za oceno fizikalnih, kemijskih in bioloških lastnosti tal. Izbor metod za oceno fizikalnih parametrov kakovosti tako vključujejo določanje teksture, volumske gostote, vodno-zadrževalnih lastnosti, poroznosti, obstojnosti strukturnih agregatov in globine tal. Glavni kemijski parametri so vsebnost organskega ogljika, pH, elektro prevodnost, kationska izmenjalna kapaciteta ter vsebnosti P, K, S in N. Na delovanje tal močno vplivajo tudi organizmi, ki jih naseljujejo, zato je uporaba biotskih kazalnikov prav tako pomembna. Uporaba le-teh je slabše raziskana in težja za interpretacijo. Za oceno kakovosti tal lahko uporabimo metode ocene biomase mikrobov, talnih živali ali vegetacije. Kakovost opiše tudi vrstna in funkcionalna pestrost mikroorganizmov, živali in rastlin. Poleg tega jo lahko ocenjujemo tudi preko aktivnosti živih organizmov v tleh, npr. z oceno dihanja tal, encimske aktivnosti, hitrosti razgradnje organske snovi itd. (Sharma in sod., 2010; Suhadolc, 2013).
2.1.1 Strukturatal
Struktura tal se razvije s povezovanjem osnovnih talnih delcev in organske snovi v med seboj jasno ločljive skupke (Grčman in Zupan, 2010). Povezovanje v večje skupke t. i. strukturne agregate izboljša kakovost tal, saj dobra strukturiranost tal izboljša poroznost in omogoča boljši razrast korenin, izboljša vodno zračni režim. Znotraj strukturnih agregatov pa je organska snov bolje zaščitena (Plaster, 2009). Strukturni agregati najprej nastajajo zaradi lokalnih tlakov, ki povežejo talne delce. Tlak navadno ustvarjajo korenine rastlin in glivne hife v A horizontih. V B horizontih agregati pogosteje nastajajo pod vplivom vlaženja oziroma izsuševanja tal ali taljenja in zamrzovanja. Tako nastali agregati so rahli, vendar pa so tekom oblikovanja zlepljeni s cementnimi snovmi, ki povečajo obstojnost (Plaster, 2009;
Grčman in Zupan, 2010). Kot lepila lahko delujejo glineni delci, železovi oksidi in različne organske snovi (Tisdal in Oades, 1982; Grčman in Zupan, 2010). Od slednjih imajo pomembno vlogo pri povečanju obstojnosti strukturnih agregatov mikrobni eksudati in ostanki (Murugan in sod., 2019; Plaster, 2009; Tisdal in Oades, 1982).
Oblikovanje agregatov pomembno vpliva na delovanje tal, saj fizično ščiti organsko snov in mikroorganizme pred zunanjimi vplivi. Obstojni strukturni agregati izboljšajo še infiltracijo in zadrževanje vode v tleh; pore, ki nastanejo med agregati pa izboljšajo porazdelitev zraka v tleh. Razvoj kompleksne strukture tal, sestavljene iz različnih velikosti por in agregatov, ustvari množico različnih habitatov, primernih za veliko vrst in funkcij mikroorganizmov (Vazzani in sod., 2018).
Struktura tal ni trajna lastnost in je pod velikim vplivom gospodarjenja s tlemi. Nanjo vpliva vrsta med seboj povezanih in pogosto povratnih mehanizmov (Bronick in Lal, 2005).
Obdelava tal strukturne agregate izpostavi mehanskim motnjam, ki pospešijo razpadanje agregatov in s tem tla izpostavijo povečani vetrni in vodni eroziji, kar poveča razgradnjo in posledično izgubo organske snovi (Helgason in sod., 2010).
Za izboljšanje obstojnosti strukture je pomembna vpeljava ukrepov, ki zmanjšajo količino motenj v agroekosistemu, povečajo vnos organske snovi, povečajo pokritost tal z rastlinami ali rastlinskimi ostanki ter zmanjšajo hitrost razgradnje organske snovi. Prav tako sta pomembni raznolikost gojenih kultur in mikro ter makro favne v tleh (Bronick in Lal, 2005).
2.1.1.1 Struktura tal in talna mikrobna združba
Mikrobne funkcije, kot so vezava in razgradnja talne organske snovi, so močno povezane z oblikovanjem strukturnih agregatov in njihovo stabilizacijo. Pomembno vlogo pri stabilizaciji strukturnih agregatov pa imajo tudi mikrobni ostanki (Murugan in sod., 2019).
Mehanizmi vezave, ki vključujejo mikroorganizme tal so prehodni, kjer kot vezavne snovi delujejo polimerni celični eksudati (nap. muramična kislina, ergosterol in aminosladkorji) ali začasni pod lokalnimi tlaki glivnih hif. Ti mehanizmi so posebej pomembni v tleh z manjšo vsebnostjo gline, kjer je povezava v organo-mineralne komplekse manj pogosta (Tisdal in Oades, 1982).
Hkrati pa strukturni agregati ustvarjajo v tleh specifične mikroniše za mikrobne združbe (Helgason in sod., 2010). Spremembe v fizikalnih in kemijskih lastnostih okolja, kot so spremenjen vodno-zračni režim ter poroznost tal in so posledica tvorbe strukturnih agregatov vplivajo na abundanco in strukturo mikrobnih združb v tleh. Strukturni agregati, ki se razlikujejo v kemijski sestavi in lastnostih, oblikujejo množico specifičnih mikrookolji v tleh (Zhang in sod., 2018).
2.2 OBDELAVA TAL
Obdelava tal stremi k ustvarjanju optimalnih pogojev za kalitev ter rast rastlin. Ne glede na način obdelave želimo obvladovati razrast plevelov, ustvariti za rast primerne razmere v tleh ter poskrbeti za rastlinske ostanke na in v tleh (Plaster, 2009). Konvencionalna obdelava, t.
j. klasično oranje z obračanjem tal, vključuje dva dela. V prvem delu s plugom obrnemo tla
ter plevele in rastlinske ostanke zadelamo v tla. V drugem delu (brananju) pa razbijemo večje grude, ki so nastale zaradi oranja in tako ustvarimo primerno setveno posteljico. Ornica, ki nastane, je homogen, fino strukturiran horizont, globok med do 20–30 cm (Plaster, 2009;
Page in sod., 2020).
Zmanjšana intenziteta obdelave, bodisi direktna setev (t. j. brez obdelave tal, angl. no-till) bodisi plitva obdelava brez mešanja tal, je ena od načel ohranitvenega kmetijstva. Ta pristop temelji na trajnostnem načinu kmetovanja, ki ob zagotavljanju pridelkov za ljudi in živali, zmanjšuje negativne vplive kmetovanja na zrak, vode in tla. Za doseganje teh ciljev ohranitveno kmetijstvo (Slika 1) predlaga tri ključne pristope. Eden od teh je ohranitvena obdelava, ki vključuje več načinov obdelave; vsem je skupno, da se intenziteta obdelave zmanjša ter da po obdelavi vsaj 30 % površine tal ostane pokrite z rastlinskimi ostanki (Stajnko, 2017).
Slika 1: Sestavni deli ohranitvenega kmetijstva, potrebne prilagoditve za širšo uporabo ter potencialni pozitivni učinki uvedbe na kakovost tal (prirejeno po Page in sod., 2020)
2.2.1 Vpliv na fizikalno-kemijske lastnosti tal
Konvencionalna obdelava tal (oranje s plugom) povzroči mehansko motnjo v obdelovani plasti tal in ustvari relativno homogen vrhnji horizont, tako imenovano ornico z relativno uniformnimi fizikalnimi lastnostmi in porazdelitvijo hranil (Kraut-Cohen in sod., 2020).
Mehanska motnja, ki jo predstavlja oranje, je direktno povezana z manjšo velikostjo ter obstojnostjo strukturnih agregatov, ki pod vplivom obdelave tudi hitreje razpadajo (Dhaliwal in sod., 2019; Vazzani in sod., 2018; Helgason in sod., 2010).
Vpliv obdelave se kaže tudi v kemijskih lastnostih. Motnje med obdelavo tal sprostijo organsko snov iz makroagregatov (Gmach in sod., 2020; Helgason in sod., 2010). Zaradi povečane izpostavljenosti organskega ogljika oksidaciji se zmanjša vsebnost organske snovi
v tleh (Vazzani in sod., 2018; Dhaliwal in sod., 2019). Hkrati so razdrobljeni in v tla vdelani rastlinski ostanki bolj izpostavljeni mikrobni razgradnji (Page in sod., 2020).
Kationska izmenjalna kapaciteta je močno vezana na lastnosti tal, kot sta mineralna sestava, še posebej vsebnost gline; nanjo lahko vplivata tudi vsebnost organske snovi in pH. V ohranitveni obdelavi se kationska izmenjalna kapaciteta tako lahko poveča. Povečanje je navadno v povezavi s povečanjem negativnega naboja pri povečani vsebnosti organske snovi (Page in sod., 2020).
Vpliv zmanjšane intenzitete obdelave na volumsko gostoto tal je lahko tako pozitiven kot negativen. Povečana volumska gostota je posledica posedanja tal v odsotnosti obdelave.
Toda povečana volumska gostota ni nujno povezana z manjšo količino por v tleh, saj se formirajo bolj stabilne makropore. Zmanjšanje volumske gostote ob zmanjšani intenziteti obdelave je lahko posledica povečane vsebnosti talnega organskega ogljika (Page in sod., 2020).
Spremembe v vodnem režimu tal pri zmanjšani intenziteti obdelave so posledica izboljšane obstojnosti strukturnih agregatov, večje količine rastlinskih ostankov ter večje količine in boljše povezljivosti makropor. Zaradi zmanjšane intenzitete obdelave se tako zmanjša izhlapevanje in poveča infiltracija vode (Page in sod., 2020; Vazzani in sod., 2018).
Ob povečanju vsebnosti organske snovi se spremeni tudi dostopnost rastlinskih hranil, in sicer tako zaradi spremembe količine hranil kot tudi zaradi prerazporeditve v talnem profilu.
Izkazalo se je, da se v tleh z zmanjšano intenziteto obdelave, kjer se poveča količina rastlinskih ostankov, poveča vsebnost dušika, fosforja, kalija ter tudi magnezija, mangana in cinka. Čeprav se v večini primerov v zgornji plasti tal poveča vsebnost rastlinskih hranil, to ne velja za njihovo dostopnost. Predvsem ko govorimo o dušiku, se pogosto zgodi, da se hitrost mineralizacije zmanjša ter poveča imobilizacija. Prav tako se manj mobilni elementi akumulirajo v zgornjih plasteh tal, kjer so lahko rastlinam slabše dostopni (Page in sod., 2020). Hranila, ki se kopičijo v površinskih horizontih, so lahko bolj izpostavljena površinskemu odtoku in izhlapevanju (Blanco-Caqui in Wortmann., 2020).
2.2.2 Vpliv na biološke lastnosti tal
V tleh živi raznolika združba bakterij, gliv, arhej, členonožcev, kolobarnikov, drugih nevretenčarjev ter rastlinskih korenin (Aislabie in Deslippe, 2011). Glede na raznolikost habitatov v tleh se mikrobne združbe v različnih tleh močno razlikujejo, saj nanje vplivajo podnebje, matična podlaga, relief. V zmernih klimatih po velikosti populacije prevladujejo bakterije; največjo biomaso pa ima združba gliv (Sharma in sod., 2010).
Mikroorganizmi v tleh so ključni za kroženje hranil v tleh; predvsem je pomembna njihova vloga pri kroženju dušika in fosforja. Prav tako so mikroorganizmi pomembni pri mineralizaciji organske snovi ter pri razgradnji in imobilizaciji onesnažil v tleh. Mnoge funkcije mikroorganizmov v tleh podpirajo rast in razvoj rastlin (Aislabie in Deslippe, 2011).
Slika 2: Potek odziva mikrobne združbe tal na motnje (prirejeno po Sharma in sod., 2010)
Različne vrste organizmov različno reagirajo na vrsto obdelave. Večji talni organizmi so na motnje v tleh, vdelane rastlinske ostanke ter spremenjen vodni in temperaturni režim, ki jih povzroči obdelava, bolj občutljivi (Kladivko, 2001; Mueller, 2015; Mangalassery in sod., 2015). Mehanskim motnjam pripišemo tudi spremenjeno sestavo mikrobne združbe tal, zmanjšano funkcionalno in vrstno pestrost (Slika 3) (Kraut-Cohen in sod., 2020; Page in sod., 2020; Scheu in sod., 1996). Z zmanjšano biomaso se zmanjša tudi volumen mikrobnih eksudatov, kot so glivni polisaharidi, ki stabilizirajo strukturo tal (Vazzani in sod., 2018;
Helgason in sod., 2010).
Pristopi ohranitvene obdelave, z zmanjšanim obsegom mehanskih motenj, ustvarijo bolj stabilno okolje v tleh za mikroorganizme in drugo talno favno. V primerjavi s konvencionalno obdelavo se v poskusih pogosto dokazuje, da imajo tla pod ohranitveno
obdelavo večjo mikrobno biomaso, večji obseg dihanja tal in encimske aktivnosti (Kraut- Cohen in sod., 2020; Scheu in sod., 1996; D'Hose in sod., 2018). Ker pa je dostopnost organskega substrata zmanjšana, povečana vlaga v tleh, spremenjeni temperaturni profil, zračnost ter sestava talne flore in favne, se mineralizacija organske snovi lahko zmanjša (Mueller, 2015; Mangalassery in sod., 2015).
Pojavnost rastlinskih bolezni je lahko pri zmanjšani intenziteti obdelave tako povečana kot zmanjšana. Ohranitvena obdelava pripravi bolj ugodno okolje za nekatere patogene, ki lahko na rastlinskih ostankih prezimijo; prav tako je zmanjšano število motenj; povečana vlažnost tal in nižja temperatura tal lahko omogočata boljši razvoj patogenov. Toda v splošnem povečana biotska pestrost in abundanca mikroorganizmov zavira razvoj patogenih mikroorganizmov oziroma zmanjša obseg okužb (Page in sod., 2020; D'Hose in sod., 2018).
3 MATERIALI IN METODE
Vzorčenje tal za kasnejše analize tal in strukturnih agregatov je potekalo 18. 2. 2020 in 27.
2. 2020 na dolgoletnem poljskem poskusu »Rašica« v Moškanjcih. V prvem terminu vzorčenja smo odvzeli vzorce tal za kemijske, fizikalne in biološke analize; vzorce drugega vzorčenja smo uporabili za določanje obstojnosti strukturnih agregatov. Dolgoletni poskus je na robu Panonske kotline, kjer je tipično subpanonsko, kontinentalno podnebje.
Dolgoletno (1999-2020) povprečje padavin znaša 927 mm letno; povprečna temperatura v tem obdobju je 10,9 °C. Tla na območju so se razvila na aluvialnih nanosih reke Drave in jih glede na WRB klasifikacijo uvrstimo v Sceletic, Eutric Cambisol (Loamic) (Kaurin in sod, 2015; Kaurin in sod., 2018; Mihelič in Suhadolc, 2019). Po slovenski klasifikaciji spadajo med evtrična rjava tla na produ in pesku z velikim deležem skeleta.
3.1 ZASNOVA POSKUSA, VZORČENJE IN PRIPRAVA VZORCEV
Poskus vpliva intenzivnosti obdelave tal je bil zasnovan leta 1999 in vključuje dve obravnavanji: konvencionalno obdelavo tal z oranjem do globine 25 cm (CT) in minimalno obdelavo do globine 10 cm brez obračanja tal in z vsaj 30 % pokritostjo z rastlinskimi ostanki (MT). Leta 2014 je bil poskus preusmerjen iz konvencionalne v ekološki sistem pridelave.
Obe obravnavanji sta razdeljeni v deset podparcelic (12 m x 8 m). Vzorčili smo štiri naključno izbrane podparcelice vsakega obravnavanja (Slika 3). Prav tako smo v vsaki podparcelici vzorčili na dveh globinah, in sicer 0-10 cm in 10-20 cm. Na istih podparcelicah smo odvzeli dva seta vzorcev in sicer porušene vzorce, sestavljene iz 5 izvrtkov, in neporušene vzorce, odvzete s Kopeckyjevimi cilindri. Porušene vzorce smo uporabili za analize kemijskih in fizikalnih lastnosti tal.
Slika 3: Shema poskusa z načrtom vzorčenja in razdelitvijo vzorcev glede na predvidene analize
Sveže, neporušene vzorce pa smo vzeli iz Kopeckyjevih cilindrov in jih previdno razlomili po ploskvah strukturnih agregatov, presejali skozi sosledje sit ter s tem odstranili tudi skelet in rastlinske ostanke, večje od 8 mm. Tako smo neporušen talni vzorec razdelili na posamezne frakcije strukturnih agregatov velikosti 4-8 mm, 2-4 mm in <2 mm. Skupaj smo za analize kemijskih, fizikalnih in bioloških lastnosti dobili 48 frakcioniranih podvzorcev (2 obravnavanji x 2 globini x 4 podparcelice x 3 frakcije).
Po frakcioniranju smo vzorce tal shranili v odvisnosti od vrste predvidenih analiz. Za kemijske analize smo tako vzorce posameznih frakcij kot tudi skupne (nefrakcionirane) vzorce sušili 24 h na 35-40 °C, zmleli in shranili na sobni temperaturi (ISO 11464, 2006).
Za molekularne analize smo podvzorce izbranih velikostnih skupin strukturnih agregatov homogenizirali, presejali na 2 mm, shranili v kriovialah ter zamrznili na suhem ledu.
3.2 KEMIJSKE LASTNOSTI TAL 3.2.1 Skupni topni ogljik in dušik
Za določanje topnih oblik organskega ogljika in dušika smo v centrifugirke natehtali 3 g posušenega vzorca tal. Prelili smo ga s 30 ml 0,01 M CaCl2 ter stresali dve uri pri 200 obratih na minuto. Vzorce smo nato 5 minut centrifugirali pri 4500 obratih na minuto ter supernatant prefiltrirali. Tako pripravljene vzorce smo uporabili za analizo z VarioTOC cube analizatorjem (Elementar, Nemčija). V stekleno vialo smo odpipetirali 10 ml vzorca ter dodali 100 μl 10 % HCl, da smo odstranili anorganski ogljik.
Iz standardne raztopine 500 ppm ogljika in dušika v razmerju 10:1 smo pripravili pet redčitev in iz njih umeritveno krivuljo. Njen koeficient smo uporabili za preračun vrednosti vzorcev.
CO2 in NOx, ki so nastajali med uplinjanjem in oksidacijo pri 850 °C, so bili pomerjeni s plinskim infrardečim (NDIR) in elektrokemičnim detektorjem (EC).
V istem ekstraktu smo določili tudi nitratni in amonijski dušik. Za določanje vsebnosti smo uporabili fotometrijski analizator Gallery Automated Photometric Analyzer (Thermo Scientific, ZDA).
3.2.2 Skupni ogljik in dušik
Posušene vzorce tal smo zatehtali v teflonske posodice in jih postavili v avtomatski podajalnik analizatorja VarioMAX (Elementar, Nemčija). Ta določa delež skupnega ogljika in dušika s suho oksidacijo. Najprej se v sežigni koloni ogljik in dušik uplinita; hkrati čistilne kolone vežejo vodo, halogene pline ter žveplo. Dušični plini potujejo direktno do analizatorja; ogljik se veže na absorpcijsko kolono, ki se nato segreje in sprosti CO2 do analizatorja (ISO 10694, 1996; ISO 13878, 1995).
3.2.3 Organski ogljik in organska snov
Delež organskega ogljika smo izračunali iz razlike deleža skupnega ogljika in mineralnega ogljika v tleh. Delež organske snovi smo izračunali kot količnik deleža organskega ogljika in povprečnega deleža ogljika v organski snovi (Rowell, 1994).
𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑠𝑘𝑎 𝑠𝑛𝑜𝑣 [%] =Organski C [%]
0,58 … (1)
3.2.4 pH tal
Tlom smo določili pH po metodi ISO 10390. Tako smo vzorec tal prelili s petkratnim volumnom 0,01 M CaCl2. Vzorce smo po nekaj urah dobro premešali, pH meter umerili s puferskima raztopinama s pH vrednostjo 4 in 7 ter vzorcem izmerili pH.
3.2.5 Rastlinam dostopni fosfor in kalij
Za določanje rastlinam dostopnega fosforja in kalija smo uporabili amon-laktatno ekstrakcijo po Egner-Rirhm-Domingo (Grčman in Zupan, 2010). Za ekstrakcijo smo uporabili 2,5 g vzorca, ki smo ga prelili s 50 ml 0,01 M amon-laktata. Po dveh urah stresanja pri 200 obratih na minuto smo vzorce prefiltrirali. Vsebnost fosforja smo pomerili z Gallery Automated Photometric Analyzer (Thermo Scientific, ZDA). Kalij smo pomerili z atomsko absorpcijsko spektrofotometrijo s plamenskim emisijskim spektrofotometrom AAS Varian (Varian, ZK).
3.2.6 Mineralni ogljik
Količino karbonatov smo določili z volumetričnim postopkom s Scheiblerjevim aparatom.
Vzorce smo prelili z 10 % HCl ter določili volumen CO2, ki je nastal pri reakciji med karbonati in kislino (ISO 10693, 1996).
3.3 FIZIKALNE LASTNOSTI TAL 3.3.1 Suha snov
Delež suhe snovi smo izračunali iz razmerja mase vlažnih vzorcev in vzorcev, ki smo jih 48 ur sušili pri 110 °C.
3.3.2 Tekstura
Teksturo frakcij smo določili s standardno sedimentacijsko metodo, ki temelji na Stokesovem zakonu. Ta pravi, da imajo mineralni delci različnih velikosti različen sedimentacijski čas. Suhim vzorcem smo dodali natrijev pirofosfat in jih štiri ure stresali, da smo zagotovili popolno disperzijo talnih delcev. Delež posamezne frakcije smo določili skladno z metodo ISO 11277 (2009) ter teksturni razred vzorca določili glede na ameriški teksturni trikotnik.
3.3.3 Obstojnost strukturnih agregatov z mokrim sejanjem
Obstojnost strukturnih agregatov smo določali z metodo mokrega sejanja (Eijkelkamp, Nizozemska). Po navodilih proizvajalca smo 4 g zračno suhih in po frakcijah ločenih vzorcev natehtali v zgornje posodice sejalnika s sitastim dnom. V spodnje posodice sejalnika smo nalili destilirano vodo, in sicer okoli 75 ml, da se je vzorec pri sejanju popolnoma potopil. Posodice z vzorci tal smo nato postavili v aparat in jih navlažili tako, da smo jih pomočili v destilirano vodo, dvignili in počakali 7 minut. Po pretečenem času smo 3 minute izvajali mokro sejanje v destilirani vodi. Nato smo sejanje prekinili in počakali, da je voda iz posodic s sitom odtekla. Spodnje posodice z vodo smo zamenjali za posodice z 0,05 M
NaOH. Ponovno smo izvajali mokro sejanje, in sicer 20 minut, ter vzorce med tem časom dvakrat rahlo pomešali. Po koncu sejanja smo posodice z vodo in z NaOH postavili v sušilnik na 110 °C za približno en dan, da je vsa tekočina izhlapela. Prav tako smo v sušilnik dali posodice s sitom, na katerem so ostali rastlinski ostanki ter manjši skelet.
Delež obstojnih strukturnih agregatov smo dobili s preračunom:
𝐷𝑒𝑙𝑒ž 𝑜𝑏𝑠𝑡𝑜𝑗𝑛𝑒 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑐𝑖𝑗𝑒 [%] = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑣 𝑁𝑎𝑂𝐻
𝑠𝑘𝑢𝑝𝑛𝑎 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑣𝑧𝑜𝑟𝑐𝑎 ∗ 100 … (2)
Pri preračunu pa smo upoštevali še maso NaOH v raztopini ter maso rastlinskih ostankov in skeleta v zatehti.
3.3.4 Obstojnost strukturnih agregatov po Sekeri
Velikostni skupini 4-8 mm smo obstojnost določili tako, da smo 10 strukturnih agregatov položili v petrijevke in jih previdno prelili z deionizirano vodo. Tako prelite agregate smo pustili 10 minut in jih med tem nekajkrat rahlo premešali. Obstojnost smo nato določili vizualno glede na Preglednico 1.
Preglednica 1: Ocena stopnje obstojnosti strukturnih agregatov za metodo po Sekeri (Grčman in Zupan, 2010) Stopnja obstojnosti Delež razpadlih strukturnih agregatov
1 Strukturni agregati so v glavnem nerazpadli.
2 Razpadlo je manj kot 50 % strukturnih agregatov.
3 Razpadlo je 50 % strukturnih agregatov.
4 Razpadlo je več kot 50 % strukturnih agregatov.
5 Večina agregatov je razpadla.
6 Vsi agregati so razpadli; nastala je suspenzija.
3.4 MOLEKULARNE METODE
Za ugotavljanje sestave mikrobne združbe po frakcijah tal smo uporabili metodo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR). Iz odmrznjenih vzorcev tal smo najprej izolirali DNK ter določili koncentracijo in čistost. Količino skupne ekstrahirane talne DNK smo uporabili kot oceno za mikrobno biomaso (Blagodatskaya in Kuzyakov, 2013).
3.4.1 Izolacija DNK
Za izolacijo mikrobne DNK iz vzorcev tal smo uporabili PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories Inc., Združene države Amerike). V PowerBeadTube, ki vsebuje delce za disperzijo tal, ter pufer, ki hkrati razgradi huminske snovi in ščiti DNK pred razgradnjo, smo zatehtali 0,25 g svežih tal. V centrifugirko smo dodali še 60 μl raztopine C1, to je natrijev dodecil sulfat, ki pomaga pri lizi celic.
Tako pripravljene vzorce smo stresali 2 minuti na pri 30 tresljajih na sekundo (Retsch, Nemčija); sledilo je enominutno centrifugiranje pri hitrosti 10.000 xg. Dobljeni supernatant smo prenesli v Collection Tube ter mu dodali 250 μl raztopine C2. Sledilo je kratko vrtinčenje in inkubacija 5 minut na 4 °C. Patentirana raztopina C2, ki smo jo dodali supernatantu, vsebuje tiamin hidroklorid, tiamin pirofosfat, 1,3-ditiazol-2-propanon, dibromid in piridoksamin in je namenjena precipitaciji humusnih in fulvičnih kislin, ki inhibirajo podvojevanje DNK s polimerazo. Nato smo vzorce ponovno centrifugirali, in sicer 1 minuto pri 10.000 xg. Supernatant smo prenesli v novo centrifugirko, dodali 200 μl raztopine C3, vzorce vrtinčili, inkubirali 5 minut pri 4 °C in centrifugirali 1 minuto pri 10.000 xg. Supernatant smo ponovno prenesli v novo Collection tube in mu dodali 1200 μl raztopine C4, ki vsebuje visoko koncentracijo soli in omogoča boljšo vezavo DNK na silicijev oksid na Spin filtru.
Po hitrem vorteksiranju smo 675 μl vzorca prenesli na Spin filter ter 1 minuto centrifugirali pri 10.000 xg. Nato smo na Spin filter nanesli 500 μl raztopine C5, ki vsebuje etanol in je namenjena odstranjevanju nečistoč. Ponovno smo centrifugirali 30 sekund, odlili tekočino in centrifugirali še 1 minuto pri 10.000 xg. Spin filter smo prenesli v novo centrifugirko ter na sredino filtra nanesli raztopino 50 μl C6; po centrifugiranju je le-ta sprala izolirano DNK s filtra v centrifugirko.
Koncentracijo DNK v vzorcu ter prisotnost nečistoč smo preverili spektrofotometrično z instrumentom NanoDrop 2000 UV-Vis (Thermo scientific, ZDA). Uspešnost postopka smo preverili glede na razmerja absorbanc pri valovnih dolžinah 280, 260 in 230 nm. Nato smo ekstrakte shranili pri -20 °C.
3.4.2 Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo (qPCR)
Ekstrakte DNK smo razredčili tako, da smo za qPCR uporabili redčitve vzorcev s koncentracijo 1 ng μl-1 DNK.
Vzorce (2 μl) smo nanesli na mikrotitrske plošče s 96 vdolbinami v dveh ponovitvah in dodali še 6 redčitev standarda s koncentracijami od 10 2 do 107 kopij želenega tarčnega gena na µl. Za kvantifikacijo bakterij smo za tarčni gen uporabili bakterijski gen za 16S rRNK, za denitrifikatorske bakterije nosZII, za arheje arhejski 16S rRNK ter za glive ITS regijo
(Preglednica 2). Za pomnoževanje bakterijskih, glivnih in krenarhejskih fragmentov smo pripravili založno reakcijsko raztopino, sestavljeno, kot je predstavljeno v Preglednici 3.
Preglednica 2: Pogoji kvantitativne verižne reakcije s polimerazo glede na tarčni gen Tarčni gen Bakterijski 16S
rRNK Bakterijski nosZII Glivna ITS regija Krenarhejski 16S rRNK
Začetna oligonukleotida
341F 534R
1153 nosZ 8F 1888 nosZ 29R
ITS 3F ITS 4R
Crenar771F Crenar975R Velikost
fragmenta (bp) 194 698 336 229
Referenca Muyzer in sod.,
1993 Jones in sod., 2013 White in sod., 1990 Ochsenreiter in sod., 2003
Zaporedje začetnih
oligonukleotidov
CCTACGGGAG GCAGCAG ATTACCGCGGC TGCTGGCA
CTIGGICCIYTKCA YAC
GCIGAICARAAITC BGTRC
GCATCGATGAAG AACGCAGC TCCTCCGCTTATT GATATGC
ACGGTGAGGGAT GAAAGCT CGGCGTTGACTC CAATTG
Temperaturni profil
95°C-15s 60°C-30s 72°C-30s 80°C-15s
95°C-15s 54°C-30s 72°C-30s 80°C-15s
95°C-15s 55°C-30s 72°C-30s 80°C-15s
95°C-15s 55°C-30s 72°C-30s 80°C-15s
Število ciklov 35 40 35 35
Mikrotitrske plošče s 2 µl vzorca in 13 µl založne raztopine smo prelepili s prozorno folijo ter 10 s centrifugirali na 1000 rpm. Nato smo plošče vstavili v napravo ABI 7500 fast (Applied Biosystems, ZDA). V pripadajoči program smo vdolbinicam dodelili tarčno DNK, določili parametre poteka reakcije, ki so navedeni v Preglednici 2, ter označili vdolbinice z redčitveno vrsto standarda. Po končani reakciji smo preverili dobljeno standardno krivuljo in iz nje izločili redčitve standardov, ki so najbolj izstopale, da smo dobili učinkovitost reakcije nad 90 % ter R2 nad 0,99.
Preglednica 3: Sestava reakcijske raztopine za kvantitativno reakcijo s polimerazo
Reagent Volumen [µl]
Vzorec 2
Taq polimeraza 0,5
Začetni oligonukleotidi
2 x 1,5
SYBR GREEN 7,5
DEPC voda 2
Za preračun števila kopij na gram suhih tal smo uporabili formulo:
Š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝑘𝑜𝑝𝑖𝑗 𝑛𝑎 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑠𝑢ℎ𝑖ℎ 𝑡𝑎𝑙 = š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝑘𝑜𝑝𝑖𝑗∗𝑟𝑒𝑑č𝑖𝑡𝑒𝑣
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑣𝑧𝑜𝑟𝑐𝑎 ∗ 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑠𝑝𝑖𝑟𝑎𝑛𝑗𝑎 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑒
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑠𝑢ℎ𝑖ℎ 𝑡𝑎𝑙 … (3) 3.5 ANALIZA PODATKOV
Dobljene rezultate smo zbrali, uredili in grafično prikazali s programom MS Excel. Za statistično obdelavo smo uporabili program R. Pri analizi skupnih vzorcev smo obravnavanja določili glede na vrsto obdelave in globino vzorčenja, pri vzorcih izbranih velikostih skupin strukturnih agregatov pa smo poleg obdelave in globine upoštevali še velikostno frakcijo.
Na podlagi štirih ponovitev vzorčenja smo na podlagi povprečji štirih ponovitev vzorčenja izvedli enosmerno analizo variance (ANOVA) ter to uporabili za Tukyev HSD test mnogoterih primerjav. Kot mejo za statistično značilne razlike smo upoštevali vrednost pri p<0,05.
4 REZULTATI
Z namenom ugotavljanja vpliva obdelave tal, t. j. konvencionalnega oranja (CT) v primerjavi z minimalno, plitvo obdelavo brez mešanja tal (MT), na sestavo talne mikrobne združbe v odvisnosti od velikosti strukturnih agregatov smo analize izvedli v dveh serijah vzorcev: (i) porušenih povprečnih vzorcih tal, odvzetih s sondiranjem (skupni, nefrakcionirani vzorci), in (ii) neporušenih vzorcih tal, odvzetih s Kopeckyevimi cilindri, ki smo jih ločili v velikostne frakcije strukturnih agregatov na 4-8 mm, 2-4 mm in <2 mm (frakcionirani vzorci).
4.1 TALNE LASTNOSTI V ODVISNOSTI OD INTENZITETE OBDELAVE
Zmanjšana intenziteta obdelave je značilno povečala vsebnost organskega ogljika v zgornjih 10 cm tal (Preglednica 4). Zgornjih 10 cm tal minimalne obdelave je vsebovalo 1,93 % skupnega ogljika, od tega 1,91 % organskega ogljika. Ostala obravnavanja so vsebovala le 1,3 % skupnega talnega ogljika in od tega med 1 in 1,3 % organskega. Delež mineralnega ogljika (Cmin) je v obeh obravnavanjih nizek in predstavlja le med 0,05 in 0,2 % skupnega ogljika. Prav tako je zgornjih 10 cm tal v MT vsebovalo značilno več skupnega dušika, nitrata, fosforja in kalija (Preglednica 4). Hkrati se razlike v intenziteti obdelave niso odražale v pH vrednosti in vsebnosti karbonatov.
Preglednica 4: Kemijske lastnosti skupnih (nefrakcioniranih) vzorcev tal. Male črke označujejo statistično značilne razlike med obravnavanji (Tukeyev HSD test, p < 0,05)
Obravnavanje CT MT
Globina (cm) 0-10 10-20 0-10 10-20
pH 6,45±0,06 a 6,53±0,05 a 6,73±0,26 a 6,70±0,28 a
Kalij (mg K2O 100 g-1 tal) 34,0±4,28 b 39,13±4,1 b 64,6±15,8 a 42,3±8,75 b Fosfor (mg P2O5100 g-1 tal) 31,73±1,43 c 32,40±0,86 bc 41,50±0,42 a 34,98±2,15 b
TN (%) 0,15±0,01 b 0,15±0,00 b 0,19±0,02 a 0,14±0,01 b
NH4 (mg 100 g-1 tal) 5,40±1,59 a 6,69±1,89 a 0,54±0,08 b 1,62±2,46 b NO3 (mg 100 g-1 tal) 0,16±0,03 b 0,16±0,03 b 0,37±0,1 a 0,27±0,1 ab
C/N 9±0,66 a 9±0,75 a 10±0,0 a 11±0,37 a
TC (%) 1,33±0,08 b 1,33±0,01 b 1,93±0,19 a 1,33±0,09 b
CaCO3 (%) 0,93±0,35 a 0,93±0,29 a 0,7±0,12 a 0,83±0,26 a
Corg (%) 1,32±0,09 b 0,99±0,66 b 1,91±0,17 a 1,32±0,09 b
Razmerje med organskim C in skupnim N (TN) (C/N) je bilo med 9 in 11; med obravnavanji ni bilo značilnih razlik. Delež skupnega dušika v obravnavanjih se je gibal med 0,13 in 0,21 %. Podobno kot skupni organski ogljik je bil tudi TN največji v obravnavanju MT 0- 10 cm; to obravnavanje se je značilno razlikovalo od CT 0-10 cm, CT 10-20 cm in MT 10- 20 cm, kjer je bila vsebnost najmanjša. Mineralne oblike dušika v tleh so bile pod značilnim vplivom obdelave; minimalna obdelava je vsebovala značilno več nitrata in značilno manj amonija kot konvencionalna obdelava tal.
Povprečen pH je bil 6,6. Obravnavanja med seboj niso statistično značilno razlikovala v vsebnosti karbonatov s povprečno vsebnostjo 0,8 %. Preskrbljenost tal s kalijem (K2O) je bila čezmerna in statistično značilno večja v obravnavanju MT 0-10 cm, kjer je povprečna vsebnost 64,6 mg K2O 100 g-1 tal; med ostalimi obravnavanji se ni razlikovala in je v povprečju znašala 38,5 mg 100 g-1 tal. Tudi preskrbljenost s fosforjem (P2O5) je bila čezmerna in največja v obravnavanju MT 0-10 cm (41,5 mg P2O5 100 g-1 tal). Spodnji globini (10-20 cm) CT in MT se med seboj nista razlikovali, ampak je prišlo do razlik med zgornjima globinama obravnavanj, kjer je bila vsebnost značilno večja v MT. Najmanjša je bila vsebnost v obravnavanju CT 0-10 cm (31,73 mg 100 g-1 tal).
4.2 TALNE LASTNOSTI V ODVISNOSTI OD OBDELAVE IN VELIKOSTI STRUKTURNIH AGREGATOV
Deleži izbranih velikostnih skupin strukturnih agregatov se med obravnavanji in globinami niso značilno razlikovali (Slika 5). Najmanjši delež pri vseh obravnavanjih so predstavljali najmanjši strukturni agregati. Agregati, manjši od 2 mm, so povprečno predstavljali okoli 10 % skupne mase. Največji delež so predstavljali največji strukturni agregati (4-8 mm). Ti so predstavljali med 60 in 80 % vzorcev pri vseh štirih obravnavanjih. Okoli 20 % oziroma med 12 in 28 % v vseh obravnavanjih so prestavljali strukturni agregati veliki 2-4 mm.
Slika 4: Deleži velikostnih frakcij strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm) po obravnavanjih (CT in MT) ter po globinah vzorčenja (0-10 cm in 10-20 cm)
V teksturi med izbranimi velikostnimi skupinami strukturnih agregatov nismo določili značilnih razlik. Tekstura vzorcev tal vseh preučevanih velikostnih skupin strukturnih agregatov obeh obravnavanj in globin je bila ilovica (Preglednica 6). Največji delež je predstavljal melj, okoli 40 %. Od tega je večji delež zavzel fini melj. Sledil je pesek, ki je v vseh obravnavanjih predstavljal med 30 in 40 %. Najmanjši je bil delež gline, okoli 20 %.
0% 20% 40% 60% 80% 100%
0-10 10-20 0-10 10-20
CTMT
Delež izbrane velikostne frakcije
Obravnavanje in globina vzorčenja
4-8 mm 2-4 mm <2 mm
Preglednica 5:Teksturni razred in deleži peska, melja in gline v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT).
Med obravnavanji ni statistično značilnih razlik (Tukeyev HSD test, p < 0,05) Obravna
vanje CT CT MT MT
Globina
(cm) 0-10 10-20 0-10 10-20
Frakcija
(mm) <2 2-4 4-8 <2 2-4 4-8 <2 2-4 4-8 <2 2-4 4-8
Pesek (%)
34,4
±1,31
32,2
±1,86
33,8
±2,36
35,9
±12,94
29,8
±4,94 33,6
±1,30 39,9
±1,33 35,9
±1,64 38,2
±1,18
38,5
±2,86
37,6
±1,98
36,2
±1,71 Glina
(%) 23,4
±0,6 23,4
±1,23 22,7
±0,68 24,9
±7,69 26,6
±5,31 24,0
±2,19 19,7
±1,98 20,6
±1,93 20,0
±1,06 23,4
±1,23 23,8
±1,51 23,4
±1,08 Skupni
melj (%) 42,2
±0,96
44,4
±2,73
43,5
±1,86
39,2
±6,11
43,6
±1,73 42,4
±2,29 40,4
±2,86 43,5
±2,38 41,8
±0,64
38,1
±1,79
38,7
±2,10
40,5
±1,74 Fini melj
(%) 25,9
±1,6 25,9
±2,56 27,2
±2,41 22,6
±4,13 24,7
±4,01 25,8
±1,06 24,0
±1,04 25,2
±0,99 25,7
±1,31 22,6
±1,00 24,4
±1,05 24,3
±1,27 Grobi
melj (%)
16,4
±0,68
18,5
±3,14
16,4
±1,19
16,6
±4,99
18,9
±4,11 16,7
±1,27 16,4
±2,31 18,3
±1,59 16,1
±1,76
15,5
±0,86
14,3
±2,52
16,2
±1,60 Teksturni
razred I I I I I I I I I I I I
4.2.1 Fizikalne lastnosti
Med obravnavanji smo ugotovili velike razlike v obstojnosti strukturnih agregatov.
Najmanjši delež obstojnih agregatov, določenih z mokrim sejanjem (Slika 5), je imela frakcija 1-2 mm zgornje globine obravnavanja CT (40 %). Sledili sta obe frakciji spodnje globine obravnavanja CT (49 %); najbolj obstojna v tem obravnavanju je bila frakcija 2-4 mm zgornje globine (57 %). V obravnavanju MT je bila obstojnost vseh frakcij večja v primerjavi s CT (Slika 6). V obravnavanju MT je imela največji delež obstojnih strukturnih agregatov frakcija 2-4 mm v globini 10-20 cm (80 %), najmanjši pa frakcija 1-2 mm globine 0-10 cm (75 %). Pri CT je bila v povprečju najbolj obstojna frakcija 2-4 mm globine 0-10 cm (57 %); najmanj obstojnih agregatov je imela frakcija 1-2 mm te globine (40 %).
Ugotovili smo velike razlike v obstojnosti agregatov znotraj obravnavanj, t. j. med ponovitvami istega obravnavanja. Največji standardni odkloni so bili pri naslednjih obravnavanjih: CT 10-20 cm 1-2 mm (49,2 ± 19,4, MT 0-10 cm 2-4 mm (79,9 ± 16,3) in MT 10-20 cm 1-2 mm (79,6 ± 15,3). Podobne rezultate obstojnosti agregatov kot z mokrim sejanjem smo dobili tudi z metodo po Sekeri (Preglednica 6). Pri CT je po 10 minutah razpadla večina strukturnih agregatov. Pri MT so agregati večinoma le delno razpadli.
Slika 5: Delež obstojnih strukturnih agregatov (%) določenih po metodi mokrega sejanja v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT)
Preglednica 6: Obstojnost strukturnih agregatov (4-8 mm) glede na obravnavanje (CT in MT) in globino (0-10 in 10-20 cm) vzorčenja določena z metodo po Sekeri
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0-10 10-20 0-10 10-20
CT MT
delež obstojnih agregatov (%)
Obravnavanje in frakcija strukturnih agregatov
1-2 2-4 Frakcija
CT
Ocena 5 5 4 5
MT
Ocena 3 2 2 3
4.2.2 Kemijske lastnosti
Primerjava rezultatov skupnih (nefrakcioniranih) vzorcev tal (Preglednica 4) in talnih vzorcev izbranih velikostnih skupin strukturnih agregatov (Priloga B) je pokazala podoben vpliv intenzitete obdelave tal na kemijske parametre. V vseh velikostnih frakcijah smo ugotovili največjo vsebnost skupnega ogljika in dušika v zgornji globini (0-10 cm) minimalne obdelave (MT). Sledili sta obravnavanji CT 0-10 cm in 10-20 cm; najmanjša je bila vsebnost pri spodnji globini MT.
Slika 6: Vsebnost skupnega ogljika (TC) v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4- 8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT)
Vsebnost skupnega ogljika se je gibala med 1,3 in 2,2 % (Slika 8). Statistično značilno večja je bila vsebnost TC v vseh frakcijah obravnavanja MT 0-10, kjer je bila vsebnost med 2,03 in 2,15 %. V ostalih obravnavanjih je bila vsebnost značilno manjša; najmanjša je bila pri obravnavi MT 10-20 cm (1,26 %).
Vpliv intenzitete obdelave na vsebnost topnega organskega ogljika (DOC) ni bil tako izrazit (Slika 7). Največjo povprečna vsebnost DOC je bila v frakciji 2-4 mm MT 0-10 cm 2-4 mm, in sicer 16,14 mg 100 g-1 tal. Najmanjša povprečna vsebnost DOC je bila določena pri obravnavanju CT 0-10 cm v isti frakciji (10,36 mg 100 g-1 tal).
0 0,5 1 1,5 2 2,5
<2 2-4 4-8
<2 2-4 4-8
<2 2-4 4-8
<2 2-4 4-8
0-1010-200-1010-20
CTMT
Vsebnost (%)
Obravnavanje, globina in frakcija
VsotaTC
Slika 7: Vsebnost topnega organskega ogljika (DOC) v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT)
Vsebnost skupnega dušika (TN) je znašala med 0,12 in 0,21 % in se je med obravnavanji statistično značilno razlikovala (Slika 7). Statistično značilno največja je bila v vseh frakcijah MT 0-10 cm; sledila so ostala obravnavanja, ki se med seboj niso značilno razlikovala. Prav tako nismo odkrili razlik med velikostnimi skupinami strukturnih agregatov znotraj obravnav.
0 5 10 15 20 25
<2 2-4 4-8
<2 2-4 4-8
<2 2-4 4-8
<2 2-4 4-8
0-1010-200-1010-20
CTMTObravnavanje, globina in frakcija
VsotaDOC (mg 100 g-1 tal)
Slika 8: Vsebnost skupnega dušika (TN) v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4- 8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT)
Topni organski dušik (DON) v vzorcih se je značilno razlikoval med globinama vzorčenja;
večje vsebnosti so bile v globini 0-10 cm v primerjavi z 10-20 cm (Priloga B). Največja vsebnost DON je bila v talnih vzorcih vseh velikostnih frakcij strukturnih agregatov obravnavanja MT 0-10 cm; sledilo je obravnavanje CT 0-10 cm. Obravnavi CT 10-20 cm in MT 10-20 cm sta imeli značilno manjšo vsebnost DON; na tej globini so prevladovale mineralne oblike dušika (Priloga B). Vsebnost nitrata je bila največja pri obravnavi MT 10- 20 cm v frakcijah 2-4 mm in 4-8 mm in je znašala 0,18 mg 100 g-1 tal. Pri CT je bila vsebnost večja v zgornji vzorčeni globini. Vsebnost amonija je bila največja v spodnji globini vzorčenja pri obeh obravnavah obdelave. Spodnji globini sta vsebovali povprečno 3,4 mg 100 g-1 tal, medtem ko sta zgornji globini vsebovali le med 0,5 in 2 mg 100 g-1 tal nitrata.
4.2.3 Lastnosti talne mikrobne združbe
Mikrobna biomasa, ki smo jo ocenili s skupno talno DNK, je bila statistično značilno največja v MT 0-10 cm; sledili sta obe globini obravnavanja CT; najmanjša je bila v MT 10- 20 cm (Slika 10, Priloga A). Ugotovimo lahko, da mikrobna biomasa sledi vsebnostim skupnega talnega ogljika (Slika 6). Statistično značilnih razlik v vsebnosti skupne talne DNK med velikostnimi frakcijami strukturnih agregatov sicer nismo določili v nobenem od obravnavanj, a so se največje razlike med frakcijami pokazale prav pri obravnavanju MT 0- 10 cm. Največja povprečna vsebnost skupne talne DNK je bila v frakciji <2 mm obravnavanja MT 0-10 cm, kar 16,7 µg g-1 tal , najmanjša pa v obravnavanju MT 10-20 cm prav tako v frakciji <2 mm (5,7 µg g-1 ).
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25
<2 2-4 4-8
<2 2-4 4-8
<2 2-4 4-8
<2 2-4 4-8
0-1010-200-1010-20
CTMT
Vsebnost (%)
Obravnavanje, globina in frakcija
VsotaTN
Slika 9: Vsebnost DNK (µg g -1) v vzorcih tal v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih agregatov (<2, 2- 4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT)
Vpliv obdelave na mikroorganizme se je ponovil tudi pri velikosti splošne mikrobne združbe, ki smo jo spremljali preko kvantifikacije splošnih bakterijskih in krenarhejskih 16S rRNK genov ter glivne ITS regije (Priloga B). Številčnost bakterij v tleh je bila pod vplivom tako obdelave kot globine vzorčenja (Slika 11, Priloga A). Velikost bakterijske združbe je bila v vseh obravnavanjih v primerjavi z glivami in krenarhejami največja. Največje število kopij (1,37 x 1010 kopij) smo dobili v frakciji <2 mm pri MT 0-10 cm. Od frakcij obravnavanja MT 0-10 cm so se statistično značilno razlikovale vse frakcije obravnavanja MT 10-20 cm. Najmanjše število kopij na gram tal so vsebovali vzorci MT 10-20 cm v frakciji <2 mm (2,81 x 109 kopij).
0 5 10 15 20
0-10 10-20 0-10 10-20
CT MT
Vsebnost DNA v suhi snovi frakcije [µg/g tal]
Obravnavanje in globina 4-8 2-4 <2 Frakcija
Slika 10: Število kopij tarčnega gena 16S rRNK bakterij v odvisnosti od velikostne frakcije strukturnih agregatov (<2, 2-4, 4-8 mm), globine vzorčenja (0-10 in 10-20 cm) in intenzitete obdelave tal (CT in MT)
Številčnost glivne združbe (Slika 12, Priloga A) je bila največja v obravnavanju MT 0-10 cm <2 mm (9,70 x 107 kopij), podobno kot pri bakterijah. Po vsebnosti so sledile ostale frakcije obravnavanja MT 0-10 cm ter frakcije obeh globin obravnavanja CT. Najmanjša je bila združba gliv v frakciji <2 mm pri obeh globinah obravnavanja CT ter pri vseh frakcijah MT 10-20 cm. Enako se številčnost tudi pri glivni združbi med velikostnimi frakcijami strukturnih agregatov znotraj obravnavanj ni razlikovala. Statistično značilne razlike so se pokazale med globinama obravnavanja MT.
