4.6 OBČUTLJIVOST PCR V REALNEM ČASU
4.6.1 Teoretična občutljivost PCR v realnem času
4.6.1.1 Določanje kravje DNA z nespecifično metodo določanja pomnožkov79
Na sliki 21 in v preglednici 18 je prikazana občutljivost PCR v realnem času, pri katerem smo uporabili začetne oligonukleotide, specifične za kravo (BOS-F/BOS-R). Kot vir čiste DNA je bila uporabljena standardna DNA, vzorec 1. Do pomnoževanja je prišlo vse do
razredčitve 10-5 (0,000605 ng/µL). Pri večjih razredčitvah do pomnoževanja ni prišlo. Ta koncentracija ustreza 0,0015 ng DNA v reakcijski mešanici.
Slika 21: Pomnoževanje standardne DNA krave z začetnima oligonukleotidoma, specifičnima za kravo, s PCR v realnem času z nespecifično metodo določanja pomnožkov
Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal, 1, 2: 6,05 ng/µL; 3, 4: 0,605 ng/µL; 5, 6: 0,0605 ng/µL; 7, 8: 0,00605 ng/µL; 9, 10: 0,000605 ng/µL
Preglednica 18: Rezultati pomnoževanja standardne DNA s PCR v realnem času z nespecifično metodo določanja pomnožkov in začetnima oligonukleotidoma, specifičnima za kravo
Vzorec Razredčitev Koncentracija (ng/µL) Ct Povp. Ct
1 10-1 6,05 5,3
2 6,2 5,8
3 10-2 0,605 7,6
4 9,2 8,4
5 10-3 0,0605 13,2
12,9
6 12,6
7 10-4 0,00605 16,3
15,8
8 14,3
9 10-5 0,000605 20,8
20,7
10 20,7
11 10-6 0,0000605 Ni pomnoževanja
12 Ni pomnoževanja /
Teoretično standardno krivuljo (slika 22) smo naredili glede na rezultate pomnoževanja standardne DNA (preglednica 18). Njen R2 znaša 0,98, E pa je 85,3. Pričakovali smo, da bo učinkovitost PCR pri standardni DNA krave občutno boljša, kot pri DNA, izolirani iz mešanic mleka, in da se bo približala idealni vrednosti E = 100. Standardna DNA naj ne bi vsebovala inhibitorjev PCR in slaba vrednost E nas je presenetila. Razlog je lahko tudi v dizajnu začetnih oligonukleotidov (poglavji 2.3.1 in 4.7 (Applied Biosystems, 2005; Ann Van Hee, 2013)).
Slika 22: Standardna krivulja za določanje teoretične občutljivosti PCR v realnem času pri nespecifični metodi določanja pomnožkov za začetne oligonukleotide, specifične za kravo
4.6.1.2 Določanje sesalčje DNA z nespecifično metodo določanja pomnožkov
Na sliki 23 in v preglednici 19 je prikazana občutljivost PCR v realnem času z začetnima oligonukleotidoma, specifičnima za sesalce (MAN-F/MAN-R). Kot vir čiste DNA smo uporabili standardno DNA. Do pomnoževanja je prišlo do razredčitve 10-5 (0,000605 ng/µL) (slika 23). Maksimalno število razredčitev, pri katerih še lahko pride do pomnoževanja, se ujema z maksimalnim številom, določenim z začetnimi oligonukleotidi, specifičnimi za kravo. Tudi v tem primeru je bila potrebna količina DNA v reakcijski mešanici 0,0015 ng.
Slika 23: Pomnoževanja standardne DNA z začetnima oligonukleotidoma, specifičnima za sesalce, s PCR v realnem času z nespecifično metodo določanja pomnožkov
Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 6,05 ng/µL; 3, 4: 0,605 ng/µL; 5, 6: 0,0605 ng/µL;
7, 8: 0,00605 ng/µL; 9, 10: 0,000605 ng/µL; 11, 12: 0,0000605 ng/µL
Preglednica 19: Rezultati pomnoževanja standardne DNA s PCR v realnem času z nespecifično metodo določanja pomnožkov in začetnima oligonukleotidoma, specifičnima za sesalce
Vzorec Razredčitev Koncentracija (ng/µL) Ct Povp. Ct
1 10-1 6,05 4,3 4,7
2 5,2
3 10-2 0,605 10,4 9,6
4 8,8
5 10-3 0,0605 13,3 13,2
6 13,2
7 10-4 0,00605 17,9 17,8
8 17,7
9 10-5 0,000605 22,2 22,3
10 22,5
11 10-6
0,0000605 Ni pomnoževanja /
12 Ni pomnoževanja
Teoretično standardno krivuljo (slika 24) smo naredili s standardno DNA krave s podatki iz preglednice 19. R2 umeritvene krivulje znaša 0,99 in njen E je 69,9. Tudi v primeru začetnih oligonukleotidov, specifičnih za sesalce, je bila slaba učinkovitost nepričakovana.
11 12
Ker je bila standardna DNA pripravljena kot vir čiste DNA brez inhibitorjev, menimo, da je razlog za slabo učinkovitost v dizajnu začetnih oligonukleotidov MAN. Učinkovitost PCR z začetnimi oligonukleotidi MAN je lahko slabša od učinkovitosti z začetnimi oligonukleotidi BOS zaradi neprimerno velikega pomnožka, ki nastaja pri določanju sesalcev (2.3.1 in 4.7 (Applied Biosystems, 2005; Ann Van Hee, 2013)).
Slika 24: Standardna krivulja za določanje teoretične občutljivosti PCR v realnem času pri nespecifični metodi določanja pomnožkov za začetne oligonukleotide, specifične za sesalce
4.6.1.3 Določanje kravje DNA s specifično metodo določanja pomnožkov
Pri določanju teoretične občutljivosti PCR v realnem času, pri specifični metodi določanja pomnožkov za določanje krave, smo uporabili začetne oligonukleotide, specifične za kravo (BOS-F/BOS-R), in sondo, specifično za kravo (BOS-P). Kot vir čiste DNA smo za matrično DNA uporabili standardno DNA krave. Rezultati so prikazani v preglednici 20 in na sliki 25. Do smiselnega pomnoževanja je prišlo do razredčitve 10-5 (0,000605 ng/µL).
Večje razredčitve so imele občutno višjo Ct vrednost, poleg tega so bile krivulje neznačilne. Maksimalno število redčitev, ko še pride do pomnoževanja, je bilo pri specifični metodi detekcije pomnožkov nižje od nespecifične metode. V tem primeru pomnoževanja je signal prešel mejo detekcije tudi pri milijonkrat redčenih vzorcih (0,00015 ng DNA v reakcijski mešanici). Zaradi pozne vrednosti Ct v primerjavi z ostalimi vzorci in netipičnosti krivulje, te redčitve nismo šteli kot pozitiven rezultat.
Slika 25: Pomnoževanje standardne DNA krave z začetnima oligonukleotidoma, specifičnima za kravo, s PCR v realnem času s specifično metodo določanja pomnožkov
Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 6,05 ng/µL; 3, 4: 0,605 ng/µL; 5, 6: 0,0605 ng/µL;
7, 8: 0,00605 ng/µL; 9, 10: 0,000605 ng/µL; 11, 12: 0,0000605 ng/µL
Preglednica 20: Rezultati pomnoževanja standardne DNA krave s PCR v realnem času s specifično metodo določanja pomnožkov in začetnima oligonukleotidoma, specifičnima za kravo
Vzorec Razredčitev Koncentracija (ng/µL) Ct Povprečen Ct
1 10-1 6,05 10,9
10,8
2 10,6
3 10-2 0,605 14,9
14,7
4 14,6
5 10-3 0,0605 20,0
19,7
6 19,4
7 10-4 0,00605 22,8
22,6
8 22,4
9 10-5 0,000605 25,8
25,9
10 26,1
11 10-6 0,0000605 37,3
37,6
12 38,0
Teoretična umeritvena krivulja je narejena na podlagi podatkov iz preglednice 20, le da smo izpustili vzorca 11 in 12, ker sta Ct in krivulji neznačilni. Umeritvena krivulja je prikazana na sliki 26. Njen R2 je 0,99, E pa znaša 82,9. Učinkovitost PCR je podobna učinkovitosti, ki smo jo dosegli pri nespecifični metodi določanja pomnožkov. Tudi pri
specifični metodi učinkovitost ni bila idealna, razlog je lahko v dizajnu začetnih oligonukleotidov (BOS) in sonde (BOS-P) (2.3.1 in 4.7 (Applied Biosystems, 2005; Ann Van Hee, 2013)).
Slika 26: Standardna krivulja za določanje teoretične občutljivosti PCR v realnem času pri specifični metodi določanja pomnožkov za začetne oligonukleotide, specifične za kravo