Preverjanje kakovosti izolirane DNA s PCR v realnem času

Kakovost vzorcev izolirane DNA smo preverjali s PCR v realnem času. Rezultati so zbrani v preglednici 10 in prikazani na slikah od 8 do 19.

Slika 8: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka s komercialnim kompletom NucleoSpin Food

Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 8,0 ng/µL; 3, 4: 1,6 ng/µL 5, 6: 0,8 ng/µL; 7, 8: 0,3 ng/µL; 9, 10: 0,2 ng/µL

Legenda: 1, 2: 14,5 ng/µL; 3, 4: 1,45 ng/µL 5, 6: 0,145 ng/µL.

5,6,7,8, 9,10 1,2 3,4

Slika 9: Pomnoževanje DNA izolirane s komercialnim kompletom QIAprep Spin Miniprep

1,2 3,4 5,6

Slika 10: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka s komercialnim kompletom DNeasy Blood & Tissue Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 3,5 ng/µL; 3, 4: 0,35 ng/µL; 5, 6: 0,035 ng/µL

Slika 11: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka s komercialnim kompletom DNeasy Food

Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 2,0 ng/µL; 3, 4: 0,20 ng/µL; 5, 6: 0,020 ng/µL.

1,2, 5,6 3,4

3,4 5 6

1 2

Slika 12: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka s komercialnim kompletom SmartHelix First DNAid Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 13 ng/µL; 3, 4: 1,3 ng/µL; 5, 6: 0,13 ng/µL; 7, 8:

0,013 ng/µL; 9, 10: 0,0013 ng/µL; 11, 12: 0,00013 ng/µL

Slika 13: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka s komercialnim kompletom Smart Helix Complex Samples Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: vzorec 1, 66 ng/µL; 3, 4: vzorec 1, 6,6 ng/µL; 5, 6:

vzorec 1, 0,66 ng/µL; 7, 8: vzorec 2, 54 ng/µL; 9, 10: vzorec 2, 54 ng/µL; 11, 12: vzorec 2, 54 ng/µL.

1,2 3,4 5,6 7,8 9,10 11,12

1,2,3,4 7,8,9,10

5,6 11,12

1, 2,3,4,5,6 7,8 9,10,11,12

Slika 14: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka s fenol-kloroformom

Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 161,5 ng/µL; 3, 4: 16,15 ng/µL; 5, 6: 1,615 ng/µL.

Slika 15: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka z dvakratno izolacijo s fenol-kloroformom

Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 64,5 ng/µL; 3, 4: 6,45 ng/µL; 5, 6: 0,645 ng/µL; 7, 8: 0,0645 ng/µL; 9, 10: 0,00645 ng/µL.

1,2 3,4 5,6 7,8 9,10 1, 2 3,4 5,6

Slika 16: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka s fenol-kloroformom in komercialnim kompletom NucleoSpin Food

Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 10,0 ng/µL; 3, 4: 1,0 ng/µL; 5, 6: 0,1 ng/µL.

Slika 17: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka s fenol-kloroformom in komercialnim kompletom DNeasy Blood & Tissue

Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 10,0 ng/µL; 3, 4: 1,0 ng/µL; 5, 6: 0,1 ng/µL.

1,2 3,4 5,6

1 2 3 5

4 6

Slika 18: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka po protokolu Bonaiti in sod. (2006)

Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 7,5 ng/µL; 3, 4: 0,75 ng/µL; 5, 6: 0,075 ng/µL.

Slika 19: Pomnoževanje DNA izolirane iz mleka po protokolu Murphy in sod. (2002)

Legenda: ΔRn: normaliziran fluorescentni signal; 1, 2: 192,5 ng/µL; 3, 4: 19,25 ng/µL; 5, 6: 1,925 ng/µL.

1 2 3 4

5,6

1 2

3 4 6

5

Preglednica 10: Rezultati PCR v realnem času za preverjanje kakovosti DNA izolirane iz vzorcev mleka z

... nadaljevanje: Preglednica 10: Rezultati PCR v realnem času za preverjanje kakovosti DNA izolirane iz

Legenda: C: koncentracija DNA; C_t: cikel meje določanja; R²: korelacijski faktor; E: učinkovitost PCR

Izolirano DNA smo pomnožili s PCR v realnem času z začetnimi oligonukleotidi, specifičnimi za kravo, z namenom, da bi potrdili ali ovrgli domnevo, da slaba čistost in visok SD pri vzorcih DNA negativno vplivata na pomnoževanje. Zbrali in primerjali smo rezultate pomnoževanja: vrednost Ct, odstopanje vrednosti Ct med paralelkami, tipičnost krivulj, pojav inhibicije, R² standardne krivulje in E standardne krivulje.

Da bi potrdili ali ovrgli domnevo, da slaba čistost in visok SD pri vzorcih izoliranih s klasičnimi postopki izolacije DNA negativno vplivata na pomnoževanje DNA, smo tudi z nekaterimi vzorci DNA iz te skupine izvedli PCR. Rezultati zaradi pogostosti inhibicije, netipičnih krivulj in visokih vrednosti Ct,večinoma niso bili zadovoljivi.

Kljub temu, da je po koncentraciji in čistosti izolirane DNA najbolj pozitivno izstopala izolacija s komercialnim kompletom SmartHelix Complex Samples, se pri pomnoževanju s PCR, zaradi pojava inhibicije, ni izkazalo tako. Tudi večina rezultatov ostalih izolacij DNA kaže na inhibicijo PCR pri neredčenih vzorcih DNA. Neredčeni vzorci imajo pogosto višjo vrednost Ct (DNeasy Food, SmartHelix First DNAid, SmartHelix Complex

Samples), v skrajnih primerih pa do pomnoževanja sploh ni prišlo (DNeasy Blood &

Tissue, FC in DNeasy Blood & Tissue, Bonaiti in sod. (2006), Murphy in sod. (2006)).

Izjema so izolacije s fenol-kloroformom, izolacija s komercialnim kompletom NucleoSpin Food in kombinacija s fenol-kloroformom ter izolacija s komercialnim kompletom QIAprep Spin Miniprep, pri katerih inhibicija PCR ni opazna.

Najnižje vrednosti Ct, ki omogočajo nižjo mejo detekcije, ter R² in E, ki se najbolj približata optimalnim vrednostim, so bile pri rezultatih pomnoževanja DNA izolirane z dvakratno izolacijo s fenol-kloroformom. Zadovoljive rezultate smo dobili tudi pri izolaciji s komercialnim kompletom NucleoSpin Food. Komercialni komplet NucleoSpin Food je bil ugoden tudi z vidika enostavnosti, hitrosti izolacije DNA in finančne dostopnosti.

Izolacija DNA iz mleka s komercialnim kompletom NucleoSpin Food poteka do 2 uri, medtem ko dvokratna izolacija s fenol-kloroformom lahko traja tudi do 3 dni. Vse nadaljnje izolacije DNA smo, če ni zapisano drugače, opravili s komercialnim kompletom NucleoSpin Food.

Primerjava rezultatov spektrofotometričnih meritev in rezultatov pomnoževanja PCR nam ne da jasne korelacije med določeno čistostjo in uspešnostjo PCR. Po koncentraciji in čistosti se je kot optimalna izkazala izolacija s komercialnim kompletom SmartHelix Complex Samples, a se je pri pomnoževanju s PCR zaradi inhibicije reakcije uvrstila med slabše metode. Nasprotno pa smo dvakratno izolacijo s fenol-kloroformom zaradi rezultatov spektrofotometričnih meritev (slaba čistost, visok SD koncentracije) šteli za slabšo metodo. Pri pomnoževanju s PCR pa se je ravno ta metoda odrezala kot najboljša, vendar je zaradi časovne zamudnosti nismo izbrali za nadaljnje delo. Iz rezultatov spektrofotometričnih meritev in rezultatov preverjanja kakovosti DNA s PCR v realnem času lahko zaključimo, da v primeru inhibicije PCR DNA mleka inhibitorno ne vplivajo snovi, ki jih določamo spektrofotometrično. Z razmerjem A260/A280 določamo, če DNA vsebuje nečistoče v obliki proteinov, in z razmerjem A260/A230, če DNA vsebuje nečistoče v obliki organskih snovi (npr. ogljikove hidrate, fenol, EDTA …) (Understanding and measuring … , 2011). V našem primeru inhibicija PCR ni bila vedno povezana s spektrofotometrično določeno slabo čistostjo izolirane DNA. Sklepamo lahko, da je inhibitorno vplivala snov, ki je pri spektrofotometričnem določanju čistosti DNA ne zaznamo. Bickley in sod. (1996) so kot močne inhibitorje PCR izpostavili ione kalcija, ki se vežejo z ioni magnezija v PCR mešanici, in preprečijo njihovo kofaktorsko funkcijo ter s tem onemogočijo delovanje polimeraze (Wilson, 1997).