KRESNIČKINA LUCIFERAZA

Kresničkina luciferaza je encim izoliran iz navadne orientalske kresnice (Photinus pyralis), ki se od 80. let prejšnjega stoletja pogosto uporablja kot reporterski gen pri rešetanju visoke zmogljivosti. Spada v naddružino encimov sposobnih tvorbe adenilata, ki med drugim vključuje acil- in aril-koencim A sintetaze in neribosomske peptidne sintetaze.

Prenos adenilatne skupine na substrat za tvorbo z encimom povezanega intermediata je najbolj pogost način aktivacije substrata v tej encimski družini (2).

Encim je sestavljen iz N- in C-terminalne domene, obe vključujeta α- in β-strukturo, ki sta povezani s fleksibilno pregibno regijo. Aktivno mesto encima se nahaja na N-terminalni domeni blizu pregibne regije. Predpostavljajo, da pride po vezavi substrata do konformacijske spremembe, pri čemer se reža med N- in C-terminalno domeno zapre, kar naj bi povečalo katalitično aktivnost (2). Struktura kresničkine luciferaze je prikazana na sliki 1.

Slika 1: Struktura kresničkine luciferaze (PDB 3ies) prikazana s pomočjo LigandScout (3).

Za potek bioluminiscenčne reakcije so potrebni D-LH2 (hidroksi-benzotiazolil-tiazolin-karboksilna kislina), adenozin trifosfat (ATP), kisik in kovinski kation (Mg²⁺). Do nastanka svetlobe pride zaradi reakcije med D-LH2 in kresničkino luciferazo preko SN2 nukleofilne reakcije, v kateri karboksilat na tiazolinskem obroču D-LH2 reagira z α-fosfatno skupino ATP-ja (slika 2). V prvem delu reakcije pride do sproščanja pirofosfata in

3

nastanka v encim vezanega luciferil-adenilata (LH2-AMP), ki ga v nadaljevanju oksidira prisotni kisik. To vodi v nastanek nestabilnega luciferinskega dioksetanona, ki generira CO2 in elektronsko ekscitiran oksiluciferin, ta pa pri razgradnji v osnovno stanje oddaja fotone rdeče in zelene svetlobe (2).

Slika 2: Bioluminiscenčna reakcija, ki jo katalizira kresničkina luciferaza (povzeto po (4)).

D-LH2 (D-luciferin), LH2-AMP (luciferil adenilat).

Poleg bioluminiscenčne reakcije kresničkina luciferaza istočasno katalizira še druge stranske, t. i. temne, ne-bioluminiscenčne reakcije. Najbolj pomembna izmed njih vključuje oksidacijo LH2-AMP, kar vodi v nastanek dehidro-luciferil AMP (znan tudi kot L-AMP), močnega zaviralca kresničkine luciferaze. Okoli 20 % D-LH2 se porabi za nastanek L-AMP, ki se nato tesno veže v aktivno mesto kresničkine luciferaze. L-AMP je primer zaviralca, pri katerem nastane multi-substratni adukt (angl. multisubstrate adduct inhibitor) kot posledica samoregulacije encima. Kot zanimivost lahko izpostavimo, da z nastankom tega zaviralca pojasnimo ugašanje svetlobe kresnic ter njihovo ponovno

4

svetenje zaradi regeneracije luciferaze preko reakcije L-AMP s pirofosfatom ali koencimom A (2). Kresničkina luciferaza lahko s pomočjo nekaterih maščobnih kislin tvorbi tudi maščobne acil-koencim A metabolite(2, 5).

1.2.1 ZAVIRALCI KRESNIČKINE LUCIFERAZE

Za zaviralce kresničkine luciferaze je značilno, da so strukturno raznolike spojine, ki pa imajo določene skupne značilnosti. V splošnem so nizkomolekularne spojine (povprečna molekulska masa je 325,8 ± 63,3 Da, največ 898,8 Da in najmanj 122,17 Da) s planarno strukturo. Za večje spojine z nelinearno strukturo velja, da izkazujejo manjšo verjetnost zaviranja tega encima (4). Obstaja več študij, ki so se ukvarjale z zaviranjem kresničkine luciferaze samostojno ali v kombinaciji z drugimi luciferazami, pri čemer je skupni zaključek vsem, da strukturno gledano zaviralci kresničkine luciferaze vsebujejo različne 5-členske obroče, med katerimi so najbolj pogosti tiazolni, imidazolni, oksadiazolni, in piridinski obroči. Kombinacija teh struktur je pogosta med benzotiazoli, benzoksazoli in benzimidazoli. Kresničkino luciferazo pogosto zavirajo tudi spojine, ki imajo v svoji strukturi prisotno benzojsko kislino in hidrazin(6, 7, 8).

V raziskavah zaviranja kresničkine luciferaze s spojinami, pridobljenimi iz različnih kemijskih knjižnic, je v največji študiji pri skupno 360.854 spojinah približno 12 % spojin zaviralo luciferazo (6), medtem ko so kresničkino luciferazo v drugi študiji zavirali 3 % izmed skupno 70.000 spojin (8). Pri preučevanju več kot 42.000 spojin iz PubChem knjižnice so 4 % spojin zavirali kresničkino luciferazo pri 10 µM koncentraciji (7).

Zaviralci najbolj pogosto tekmujejo s substratoma, D-LH2 in ATP-jem, zato sta strukturi obeh predstavljeni na sliki 3 (spojini 1 in 2).

Ena izmed primarnih skupin zaviralcev oponaša D-LH2, pri čemer imajo strukture zaviralcev benzotiazolno, benzoksazolno ali benzimidazolno jedro ter se vežejo v žep za luciferinski substrat. Tak primer je 2-(2-fluorofenil)-6-metoksi-1,3-benzotiazol, ki je prikazan na sliki 3 (spojina 3). Zaviralci lahko prav tako tekmujejo z ATP-jem, kot je značilno za spojino 2-[(4-klorobenzoil)amino]-N-(1-piridin-5-iletildenamino)benzamid, struktura prikazana na sliki 3 (spojina 4) (6). Kompeticija tako z D-LH2 kot ATP-jem je bila dokazana za spojino 2-kloro-3-{[2-(1-metil-1H-1,3-benzodiazol-2-il)hidrazin-iliden]metil}kinolin, struktura prikazana na sliki 3 (spojina 5) (6). V nasprotju s

5

kompetitivno naravo zaviranja resveratrol kresničkino luciferazo zavira nekompetitivno, struktura je prikazana na sliki 3 (spojina 6) (9).

Že prehodno omenjen mehanizem zaviranja z nastankom multisubstratnega adukta so dokazali tudi v primeru spojine PTC124. Kresničkina luciferaza adenilira PTC124 preko m-karboksilatne skupine, da nastane PTC124-AMP, ki se veže v luciferinski žep in v vezavno mesto za ATP ter učinkovito zavira encim. Za nastanek takega tipa zaviralca je potrebna vsaj delna substratna (D-LH2) specifičnost. Ta tip zaviralcev se je izkazal za najmočnejšega (slika 3, spojina 7)(3).

Strukture zgoraj opisanih spojin se nahajajo na sliki 3, pri čemer v primeru zgornjih treh spojin (3, 4, 5) puščice nakazujejo na njihovo naravo zaviranja preko tekmovanja z enim izmed ali obema substratoma (1, 2).

Slika 3: Strukture substratov bioluminiscenčne reakcije kresničkine luciferaze ter primeri zaviralcev glede na tip zaviranja: 1- D-LH2, 2- ATP, 3- 2-(2-fluorofenil)-6-metoksi-1,3-benzotiazol, 4- 2-[(4-klorobenzoil)amino]-N-(1-piridin-5-iletildenamino)benzamid, 5- 2-kloro-3-{[2-(1-metil-1H-1,3-benzodiazol-2-il)hidrazin-iliden]metil}kinolin, 6- resveratrol, 7- PTC124-AMP.

6

1.2.2 STABILIZACIJA KRESNIČKINE LUCIFERAZE IN TEŽAVE PRI INTERPRETACIJI REZULTATOV

Pravilna interpretacija rezultatov testiranj, pri katerih je kresničkina luciferaza uporabljena kot reporterski gen, je glede na opisane interakcije lahko težavna. Poleg zaviranja lahko prisotnost zaviralcev povzroči tudi stabilizacijo reporterskega proteina.

Stabilizacija kresničkine luciferaze z zaviralci je splošen in pogost pojav v celičnih testih.

Takšna vrsta stabilizacije vodi v nepričakovano višji odziv celične linije, kot bi pričakovali zaradi zaviralcev, saj ti preprečijo ali upočasnijo encimsko razgradnjo, kar omogoči povečanje količine encima v celičnih kulturah po daljšem časovnem obdobju v primerjavi s kontrolo brez zaviralca. Tekmovanje z luciferinskim substratom in stabilizacija ter uporaba komercialnih reagentov s presežkom substrata, ki zaviralce izpodrinejo iz vezavnega mesta, vodi v na videz povišan odziv celične linije. Ta pojav se imenuje tudi aktivacija luciferaze (2). Da se v komercialnih reagentih nahajajo presežki substratov, je bilo dokazano v študiji, kjer je preučevanje zaviralne aktivnosti na prečiščenih proteinih s komercialnimi reagenti vodilo v višje IC50 vrednosti (vrednost pri kateri je 50 % zavrto delovanje encima) (8). V drugi študiji pa so prišli do zaključka, da je pri 30 – 40 % zaviralcev pri preučevanju zaviralne aktivnosti prišlo do določitve petkrat višje vrednosti IC50 pri uporabi komercialnih reagentov (6).

Ker konformacije proteina obstajajo v termodinamičnemu ravnovesju in se ligandi (v tem primeru zaviralci) lahko vežejo v določeno konformacijo, to vodi v stabilizacijo proteina.

Potencialno stabilizacijo zato določamo s pomočjo metod, ki merijo spremembe v denaturaciji, pri čemer vodi povišanje temperature v drugačno razvijanje proteina, ki ni stabiliziran z zaviralcem. V določenih primerih, kot je značilno za kresničkino luciferazo, vezava zaviralcev vodi v povišano stabilnost encima (4).

V študiji PCT124 in njegovih analogov (3) so temperaturno stabilizacijo preučevali preko t. i. temperaturnih premikov (angl. thermal shifts) s pomočjo metode, ki temelji na uporabi fluorescenčnega barvila SYPRO Orange, sposobnega nespecifične vezave na hidrofobne površine proteina. Pri poviševanju temperature in posledičnem razvijanju proteina pride do razlike v detektirani fluorescenci, pri čemer se preko Boltzmann-ovega modela izračuna t.i.

sredinsko temperaturo razvijanja proteina (označena Tm, angl. midpoint temperature of the protein-unfolding transition) (10). S primerjavo sredinske temperature razvijanja proteina so v primeru PTC124 in analogov prišli do zaključkov, da temperaturna stabilizacija

7

oziroma ΔTm vrednost, v primerjavi s kontrolo, korelira z zaviralno aktivnostjo, pri čemer je bila v primeru 200 µM koncentracije PCT124 ΔTm = 8 °C, medtem ko je pri sintezno pridobljenem PTC124-AMP prišlo do mnogo večje stabilizacije (ΔTm = 28 °C). Tako visoka vrednost temperaturne stabilizacije je v primeru spojine PTC124-AMP povezana z vezavo spojine tako v D-LH2 kot ATP vezavno mesto (3).

Glede na pomanjkljivosti kresničkine luciferaze kot reporterskega proteina je smiselno razmisliti o potencialnih alternativah. Ena izmed njih je luciferaza morske mačehe, ki je opisana v nadaljevanju.