UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
JAN VEGELJ MAGISTRSKO DELO
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
JAN VEGELJ
UGOTAVLJANJE VPLIVA IZBRANIH IZOFLAVONOIDOV NA AKTIVNOST KRESNIČKINE LUCIFERAZE
INFLUENCE OF SELECTED ISOFLAVONOIDS ON FIREFLY LUCIFERASE ACTIVITY
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM INDUSTRIJSKA FARMACIJA
Ljubljana, 2021
I
Magistrsko delo sem opravljal na Univerzi v Ljubljani, Fakulteti za farmacijo, Katedri za farmacevtsko kemijo pod mentorstvom prof. dr. Marije Sollner Dolenc, mag. farm., in somentorstvom asist. Maše Kenda, mag. farm. Molekulsko sidranje je bilo izvedeno na Teoretičnem odseku Kemijskega inštituta, Laboratorij za računsko biokemijo in načrtovanje učinkovin.
ZAHVALA
Iskeno se zahvaljujem somentorici asist. Maši Kenda, mag. farm., za neprestano spodbudo, pomoč, predvsem pa za veliko mero potrpežljivosti. Hvala Barbari Herlah, mag. ind. farm., in doc. dr. Andreju Perdihu, mag. farm., za vse nasvete in usmeritve pri izvajanju molekulskega sidranja. Hvala tudi mentorici, prof. dr. Mariji Sollner Dolenc, mag. farm., za vse spodbudne besede in omogočeno možnost raziskovanja pod njenim mentorstvom.
Na koncu pa bi se rad zahvalil tudi vsem najbljižjim.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelal samostojno pod mentorstvom prof. dr. Marije Sollner Dolenc, mag. farm., in somentorstvom asist. Maše Kenda, mag. farm.
Jan Vegelj
Predsednica komisije: izr. prof. dr. Mojca Kerec Kos, mag. farm.
Članica komisije: doc. dr. Špela Zupančič, mag. farm.
II
KAZALO VSEBINE
1 UVOD ... 1
1.1 LUCIFERAZE KOT REPORTERSKI GENI ... 1
1.2 KRESNIČKINA LUCIFERAZA ... 2
1.2.1 ZAVIRALCI KRESNIČKINE LUCIFERAZE... 4
1.2.2 STABILIZACIJA KRESNIČKINE LUCIFERAZE IN TEŽAVE PRI INTERPRETACIJI REZULTATOV ... 6
1.3 LUCIFERAZA MORSKE MAČEHE ... 7
1.3.1 ZAVIRALCI LUCIFERAZE MORSKE MAČEHE ... 8
1.4 PRIMERI OECD SMERNIC, KI VKLJUČUJEJO UPORABO LUCIFERAZ ... 9
1.5 IZOFLAVONOIDI... 10
2 NAMEN DELA ... 13
3 MATERIALI IN METODE ... 15
3.1 MATERIALI ... 15
3.1.1 TESTIRANE SPOJINE ... 15
3.1.2 LIZATI CELIČNE LINIJE AR-ECOSCREEN... 18
3.1.3 REAGENTI IN MATERIALI ... 18
3.2 METODE ... 19
3.2.1 PROGRAM INTERPRED ... 19
3.2.2 PRIPRAVA CELIČNEGA LIZATA... 21
3.2.3 LUCIFERAZNI TEST ... 22
3.2.4 MOLEKULSKO SIDRANJE ... 23
3.2.5 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV ... 26
4 REZULTATI ... 27
4.1 REZULTATI PROGRAMA INTERPRED ... 27
4.2 REZULTATI LUCIFERAZNEGA TESTA ZA ZAVIRANJE IN TEMPERATURNO STABILIZACIJO IZBRANIH PROTEINOV ... 27
4.2.1 KONTROLNI SPOJINI ... 27
4.2.2 REZULTATI TESTIRANJA OSNOVNIH KONCENTRACIJ IZOFLAVONOIDOV ... 29
III
4.2.3 DOLOČITEV IC50 IZOFLAVONOIDOV, KI SO ZAVIRALI KRESNIČKINO
LUCIFERAZO ... 30
4.2.4 POSKUS PREVERJANJA TEMPERATURNE STABILIZACIJE KRESNIČKINE LUCIFERAZE ... 31
4.3 REZULTATI MOLEKULSKEGA SIDRANJA ... 33
4.3.1 SIDRANJE IZOFLAVONOIDOV V AKTIVNO MESTO KRESNIČKINE LUCIFERAZE ... 33
4.3.2 SIDRANJE IZOFLAVONOIDOV V AKTIVNO MESTO LUCIFERAZE MORSKE MAČEHE ... 36
5 RAZPRAVA ... 38
5.1 PRIMERJAVA REZULTATOV QSAR PROGRAMA INTERPRED TER METODE IN VITRO ZA PREUČEVANJE INTERFERENCE OZIROMA ZAVIRANJA KRESNIČKINE LUCIFERAZE ... 38
5.2 VREDNOTENJE UPORABE LUCIFERAZNEGA TESTA ... 39
5.2.1 DOLOČANJE ZAVIRALNE AKTIVNOSTI ... 39
5.2.2 DOLOČANJE TEMPERATURNE STABILIZACIJE ... 41
5.3 MEHANIZEM ZAVIRANJA KRESNIČKINE LUCIFERAZE IN SAR IZOFLAVONOIDOV ... 44
5.4 SMISELNOST UPORABE LUCIFERAZE MORSKE MAČEHE KOT ALTERNATIVE KRESNIČKINI LUCIFERAZI ... 47
6 SKLEP ... 49
7 LITERATURA ... 51
IV
KAZALO SLIK
Slika 1: Struktura kresničkine luciferaze (PDB 3ies) prikazana s pomočjo LigandScout (3). ... 2 Slika 2: Bioluminiscenčna reakcija, ki jo katalizira kresničkina luciferaza (povzeto po (4)). D-LH2
(D-luciferin), LH2-AMP (luciferil adenilat). ... 3 Slika 3: Strukture substratov bioluminiscenčne reakcije kresničkine luciferaze ter primeri zaviralcev glede na tip zaviranja: 1- D-LH2, 2- ATP, 3- 2-(2-fluorofenil)-6-metoksi-1,3- benzotiazol, 4- 2-[(4-klorobenzoil)amino]-N-(1-piridin-5-iletildenamino)benzamid, 5- 2-kloro-3- {[2-(1-metil-1H-1,3-benzodiazol-2-il)hidrazin-iliden]metil}kinolin, 6- resveratrol, 7- PTC124- AMP. ... 5 Slika 4: Bioluminiscenčna reakcija, ki jo katalizira luciferaza morske mačehe (povzeto po (13) ... 7 Slika 5: Struktura substrata luciferaze morske mačehe 8- koelenterazina in primer strukture zaviralca 9- H-89. ... 8 Slika 6: Shema dela. ... 14 Slika 7: Napoved interference kresničkine luciferaze s programom InterPred za spojino biokanin A. ... 21 Slika 8: Poenostavljeni bioluminiscenčni reakciji, ki ju katalizirata kresničkina luciferaza in luciferaza morske mačehe (35). ... 22 Slika 9: Reproducirana vezavna konformacija ko-kristaliziranega referenčnega liganda PDB struktur 1) 3ies (PTC124-AMP), 2) 3rix (Aspulvinon J-CR), 3) 4e5d (2-(2-fluorofenil)-6-metoksi- 1,3-benzotiazol). S temno modro barvo je označen ponovno sidran ligand. ... 25 Slika 10: Reproducirana vezavna konformacija ko-kristaliziranega referenčnega liganda PDB 2psj (koelenteramid). S temno modro barvo je označen ponovno sidran ligand. ... 25 Slika 11: Rezultati zaviranja kresničkine luciferaze za resveratrol. Na navpični osi je prikazan % aktivnosti kresničkine luciferaze glede na 1 % DMSO. Na vodoravni osi so prikazane logaritemske vrednosti uporabljenih molarnih koncentracij. ... 28 Slika 12: Rezultati zaviranja luciferaze morske mačehe za kontrolno spojino H-89. Na navpični osi je prikazan % aktivnosti luciferaze morske mačehe glede na 1 % DMSO. Na vodoravni osi so prikazane logaritemske vrednosti uporabljenih molarnih koncentracij. ... 28 Slika 13: Rezultati osnovnega testiranja zaviranja kresničkine luciferaze za izbrane izoflavonoide pri treh osnovnih koncentracijah. Rezultati so normalizirani na 1 % DMSO. Z rdečo neprekinjeno črto je označena postavljena meja za zaviranje kresničkine luciferaze (70 %). Statistična značilnost:
p ≤ 0,05 (*); p ≤ 0,01 (**); p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). ... 29 Slika 14: Rezultati osnovnega testiranja zaviranja luciferaze morske mačehe za izbrane izoflavonoide pri treh osnovnih koncentracijah. Rezultati so normalizirani na 1 % DMSO. Z rdečo neprekinjeno črto je označena postavljena meja za zaviranje luciferaze morske mačehe (70 %).
Statistična značilnost: p ≤ 0,05 (*); p ≤ 0,01 (**); p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****)... 30
V
Slika 15: Koncentracijska krivulja za aktivne izoflavonoide s pripadajočimi IC50 vrednostmi. Na navpični osi je prikazan % aktivnosti kresničkine luciferaze glede na 1 % DMSO. Na vodoravni osi so prikazane logaritemske vrednosti uporabljenih molarnih koncentracij. ... 31 Slika 16: Temperaturna stabilizacija kresničkine luciferaze s kontrolo (1 % DMSO). Na navpični osi so prikazane relativne vrednosti svetlobe (RLU, angl. relative light units). Na vodoravni osi so prikazane temperaturne vrednosti, katerim so bili predhodno izpostavljeni vzorci. ... 32 Slika 17: Temperaturna stabilizacija kresničkine luciferaze brez kontrole. Na navpični osi so prikazane RLU. Na vodoravni osi so prikazane temperaturne vrednosti, katerim so bili predhodno izpostavljeni vzorci. ... 33 Slika 18: Primerjava izračunane in sidrane poze biokanina A v kristalnih strukturah kresničkine luciferaze (PDB: 3ies (1), 3rix (2) in 4e5d (3)). ... 34 Slika 19: Predpostavljen vezavni modeli biokanina A (1), daidzeina (2), formononetina (3), genisteina (4), gliciteina (5), kalikozina (6) in prunetina (7) v vezavnem mestu za D-LH2 določen z metodo molekulskega sidranja (uporabljena kristalna struktura PDB 3ies). Črtkana črta predstavlja vodikovo vez. ... 36 Slika 20: Primerjava vezavnih konformacij biokanina A v kristalni strukturi PDB 2psj (1) in kristalni strukturi PDB 3ies (2). ... 37 Slika 21: Osnovni skelet izoflavonoidov. ... 45
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: OECD testi, ki vključujejo uporabo luciferaz. ... 9 Preglednica II: Podatki o izoflavonoidih uporabljenih v testiranju. ... 15 Preglednica III: Podatki o kontrolah uporabljenih v testiranju. ... 17 Preglednica IV: Rezultati programa InterPred (P predstavlja verjetnost interference kresničkine luciferaze, SD standardni odklon pri izračunani vrednosti). ... 27 Preglednica V: Primerjava uporabljene metode z literaturno ThermoFluor metodo (3). ... 42 Preglednica VI: Strukturne značilnosti izbranih izoflavonoidov. ... 46
KAZALO PRILOG
Priloga 1: Izračunani modeli aktivnih izoflavonoidov v kristalni strukturah kresničkine luciferaze (PDB 3rix in 4e5d) ... 55
VI
SEZNAM OKRAJŠAV
AR androgeni receptor ATP adenozin trifosfat
CASRN registrska številka CAS, ki jo za vsako obstoječo snov določi Ameriško kemijsko društvo (angl. CAS registry number)
DLR reagent za merjenje aktivnosti dveh luciferaz (angl. Dual-Luciferase®
Reporter Assay system) DMSO dimetilsulfoksid
D-LH2 D-luciferin
E2 17β-estradiol
ER estrogenski receptor (α in β)
IC50 koncentracija pri katerih je zavrto 50 % delovanje encima (angl. inhibitory concentration 50)
L-AMP dehidro-luciferil AMP LH2-AMP luciferil-adenilat Ki konstanta inhibicije
Km Michaelis-Mentenova konstanta
OECD Organizacija za gospodarsko sodelovanje in razvoj (angl. Organisation for Economic Co-operation and development)
P verjetnost
PDB baza proteinskih struktur (angl. Protein Data Bank)
PPAR s peroksisomskim proliferatorjem skopljen receptor (α in γ) RLB lizirni pufer (angl. Reporter Lysis Buffer)
RLU relativna vrednost svetlobe (angl. relative light unit) RSD relativna standardna deviacija
SAR odnos med strukturo in delovanjem spojine (angl. structure-activity relationship)
SD standardna deviacija
SMILES opis strukture molekul s kratkimi nizi znakov (angl. simplified molecular input line entry system)
Tm sredinska temperatura razvijanja proteina (angl. midpoint temperature of the protein-unfolding transition)
VII
ΔTm razlika v sredinski temperaturi razvijanja proteina v primerjavi s kontrolo, ki simbolizira temperaturno stabilizacijo
Tpovp. temperatura, pri kateri pride do 50 % padca bioluminiscence
ΔTpovp. razlika v temperaturi pri kateri pride do 50 % padca bioluminiscence v primerjavi s kontrolo
QSAR kvantitativni odnos med strukturo spojine in njeno aktivnostjo (angl.
quantitative structure-activity relationship)
VIII
POVZETEK
Kresničkina luciferaza je reporterski gen, ki se pogosto uporablja na področju raziskovanja vpliva spojin na transkripcijsko aktivnost genov in se njegovo izražanje ugotavlja preko bioluminiscenčne reakcije nastalega proteina. Izraženi protein je dovzeten za potencialni vpliv spojin, med drugim zaviranje in stabilizacijo, kar lahko vodi v lažno pozitivne rezultate. Luciferaza morske mačehe, ki se pogosto uporablja v kombinaciji s kresničkino luciferazo, predstavlja pomembno alternativo le-tej. Ker so izoflavonoidi kot ena izmed skupin naravnih spojin pogosto preiskovanih tudi v testnih sistemih s kresničkino luciferazo, je smiselno, da ovrednotimo njihov vpliv na le-to.
V nalogi smo se osredotočili na 11 strukturno različnih izoflavonoidov in ovrednotili njihov vpliv na aktivnost kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe. Pri tem smo potencialno interferenco kresničkine luciferaze v obliki zaviranja najprej ovrednotili s pomočjo QSAR programa InterPred, ki je napovedal veliko verjetnost zaviranja za 7 od 11 izoflavonoidov. Z novo metodo in vitro, ki temelji na osnovi luciferaznega testa na lizatu celične linije AR-EcoScreen, smo preverili zaviranje obeh reporterskih proteinov. Pri tem smo najprej testirali spojine pri 1, 10 in 100 µM koncentraciji, čemur je v primeru zaviralne aktivnosti sledilo še testiranje pri dodatnih koncentracijah in določitev IC50. Sedem od 11 izoflavonoidov je zaviralo kresničkino luciferazo, pri čemer smo pri primerjavi z rezultati programa InterPred prišli do zaključka, da program pravilno napove zaviralno aktivnost. Nobeden izmed izbranih izoflavonoidov ni zaviral luciferaze morske mačehe in vitro. Za najbolj močne zaviralce smo v obliki prirejenega testa in vitro vrednotili tudi temperaturno stabilizacijo kresničkine luciferaze. Vendar pa z gotovostjo težko potrdimo, da so pridobljene vrednosti posledica stabilizacije proteina, saj ima ta metoda nekaj pomanjkljivosti. Zaviranje kresničkine luciferaze smo raziskali še bolj podrobno s pomočjo molekulskega sidranja in potrdili, da se aktivni izoflavonoidi vežejo v luciferinski žep proteina ter preučili odnos med strukturo in aktivnostjo aktivnih izoflavonoidov. Z molekulskim sidranjem smo tudi potrdili, da izbrani izoflavonoidi ne zavirajo luciferaze morske mačehe.
Potrdili smo zaviralno aktivnost nekaterih izbranih izoflavonoidov, kar lahko zaradi stabilizacije pojasni višje odzive celičnih linij s kresničkino luciferazo v preteklih študijah.
Pri testiranju vpliva izoflavonoidov na transkripcijsko aktivnost izbranih genov bi bila tako bolj ustrezna uporaba luciferaze morske mačehe.
Ključne besede: izoflavonoidi, kresničkina luciferaza, luciferaza morske mačehe
IX
ABSTRACT
Firefly luciferase is a reporter gene, commonly used when determining the influence of selected compounds on transcriptional activity of genes and its expression is determined by the bioluminescent reaction of the protein product. Expressed protein can be influenced by studied compounds, mostly by inhibition or stabilisation, which can lead to false-positive results. Sea pansy luciferase, which is commonly used in combination with firefly luciferase, is its important alternative. Isoflavonoids are one of the groups of natural compounds, often studied in reporter gene assays with firefly luciferase, so it is important to evaluate their influence on firefly luciferase.
In our thesis we focused on 11 structurally diverse isoflavonoids and evaluated their influence on the activity of firefly and sea pansy luciferase. At first we evaluated potential interference of firefly luciferase in the form of inhibition with QSAR programme InterPred, which predicted high likelihood of inhibition for 7 out of 11 isoflavonoids. By using a new, method in vitro, based on luciferase assay of lysate of cell line AR- EcoScreen, we evaluated inhibition of both reporter proteins. Firstly, we tested compounds in 1, 10 and 100 µM concentration, which was followed by testing at additional concentrations, in the case of inhibition, for the determination of IC50. Seven out of 11 isoflavonoids inhibited firefly luciferase, which in comparison with the results of InterPred confirmed its correct prediction of interference. None of the isoflavonoids inhibited sea pansy luciferase in vitro. The most potent inhibitors were also tested in a modified in-vitro assay for their potential thermal stabilisation of firefly luciferase. We cannot confirm that obtained values are the consequence of stabilisation, due to shortcomings of the method.
Firefly luciferase inhibition was further explored with molecular docking, which confirmed that active isoflavonoids bind to luciferin pocket, followed by determination of structure- activity relationship for the active isoflavonoids. With molecular docking we also confirmed, that the selected isoflavonoids do not inhibit sea pansy luciferase.
We confirmed inhibitory activity of some isoflavonoids, which can due to stabilisation explain previously reported higher responses in cell lines with firefly luciferase. When studying the influence of isoflavonoids on transcriptional activity of selected genes it would be more appropriate to use sea pansy luciferase as reporter gene.
Key words: isoflavonoids, firefly luciferase, sea pansy luciferase
1
1 UVOD
1.1 LUCIFERAZE KOT REPORTERSKI GENI
Reporterski geni predstavljajo neprecenljivo orodje za preučevanje izražanja tarčnih genov in se pogosto uporabljajo na področju biomedicinskega razvoja. Tak gen je po navadi vnešen v regulatorno regijo preiskovanega gena s pomočjo metod rekombinantne DNA tehnologije in se lahko izraža tako odvisno kot neodvisno od tarčnega gena (pod vplivom izbranega promotorja), konstitutivno ali inducibilno z zunanjim posredovanjem. Izražanje reporterskega gena vodi v nastanek reporterskih proteinov, katerih prisotnost najbolj pogosto določamo preko merjenja njihove encimske aktivnosti (s kromo-, fluoro- ali luminogenimi substrati), z imunološkimi testi (npr. encimsko imunoadsorpcijski test) ali s histokemijskim barvanjem celic in tkiv (1).
Med najbolj pogosto uporabljene reporterske gene skupaj z detektiranimi reporterskimi proteini spadajo β-glukuronidaza, kloramfenikol acetiltransferaza, zeleni fluorescenteni protein in različne luciferaze (1).
Luciferaze predstavljajo pomembno skupino uporabljenih reporterskih proteinov oziroma encimov, pri čemer se med seboj razlikujejo glede na luciferinski substrat, ki je potreben za detekcijo (D-luciferin (D-LH2) ali koelenterazin), mesto izražanja (zunaj ali znotrajcelično) in razpolovni čas (nekaj ur do nekaj dni). Razlikujejo se tudi glede na izvor, saj so izolirane iz različnih organizmov sposobnih tvorbe bioluminiscence, ki med drugim vključujejo kresnice (Lampyridae), hrošče pokalice (Elateridae), ličinke svetlobnih črvov (Phengodidae) ter različne morske organizme, kot je morska mačeha (Renillidae) (2).
Eden izmed glavnih razlogov za njihovo vsesplošno uporabo je v tem, da pri detekciji luciferaz kot reporterskih proteinov ni potrebna ekscitacijska energija, kar posledično vodi v zmanjšanje signala v ozadju. Odstranitev vira ekscitacijske energije prepreči interferenco zaradi fluorescence spojine, kar kljub signifikantno nižji intenziteti signala vodi v bolj občutljive testne sisteme (2). Najbolj pogosto uporabljena luciferaza je kresničkina luciferaza, ki je podrobneje opisana v nadaljevanju.
2
1.2 KRESNIČKINA LUCIFERAZA
Kresničkina luciferaza je encim izoliran iz navadne orientalske kresnice (Photinus pyralis), ki se od 80. let prejšnjega stoletja pogosto uporablja kot reporterski gen pri rešetanju visoke zmogljivosti. Spada v naddružino encimov sposobnih tvorbe adenilata, ki med drugim vključuje acil- in aril-koencim A sintetaze in neribosomske peptidne sintetaze.
Prenos adenilatne skupine na substrat za tvorbo z encimom povezanega intermediata je najbolj pogost način aktivacije substrata v tej encimski družini (2).
Encim je sestavljen iz N- in C-terminalne domene, obe vključujeta α- in β-strukturo, ki sta povezani s fleksibilno pregibno regijo. Aktivno mesto encima se nahaja na N-terminalni domeni blizu pregibne regije. Predpostavljajo, da pride po vezavi substrata do konformacijske spremembe, pri čemer se reža med N- in C-terminalno domeno zapre, kar naj bi povečalo katalitično aktivnost (2). Struktura kresničkine luciferaze je prikazana na sliki 1.
Slika 1: Struktura kresničkine luciferaze (PDB 3ies) prikazana s pomočjo LigandScout (3).
Za potek bioluminiscenčne reakcije so potrebni D-LH2 (hidroksi-benzotiazolil-tiazolin- karboksilna kislina), adenozin trifosfat (ATP), kisik in kovinski kation (Mg2+). Do nastanka svetlobe pride zaradi reakcije med D-LH2 in kresničkino luciferazo preko SN2 nukleofilne reakcije, v kateri karboksilat na tiazolinskem obroču D-LH2 reagira z α- fosfatno skupino ATP-ja (slika 2). V prvem delu reakcije pride do sproščanja pirofosfata in
3
nastanka v encim vezanega luciferil-adenilata (LH2-AMP), ki ga v nadaljevanju oksidira prisotni kisik. To vodi v nastanek nestabilnega luciferinskega dioksetanona, ki generira CO2 in elektronsko ekscitiran oksiluciferin, ta pa pri razgradnji v osnovno stanje oddaja fotone rdeče in zelene svetlobe (2).
Slika 2: Bioluminiscenčna reakcija, ki jo katalizira kresničkina luciferaza (povzeto po (4)).
D-LH2 (D-luciferin), LH2-AMP (luciferil adenilat).
Poleg bioluminiscenčne reakcije kresničkina luciferaza istočasno katalizira še druge stranske, t. i. temne, ne-bioluminiscenčne reakcije. Najbolj pomembna izmed njih vključuje oksidacijo LH2-AMP, kar vodi v nastanek dehidro-luciferil AMP (znan tudi kot L-AMP), močnega zaviralca kresničkine luciferaze. Okoli 20 % D-LH2 se porabi za nastanek L-AMP, ki se nato tesno veže v aktivno mesto kresničkine luciferaze. L-AMP je primer zaviralca, pri katerem nastane multi-substratni adukt (angl. multisubstrate adduct inhibitor) kot posledica samoregulacije encima. Kot zanimivost lahko izpostavimo, da z nastankom tega zaviralca pojasnimo ugašanje svetlobe kresnic ter njihovo ponovno
4
svetenje zaradi regeneracije luciferaze preko reakcije L-AMP s pirofosfatom ali koencimom A (2). Kresničkina luciferaza lahko s pomočjo nekaterih maščobnih kislin tvorbi tudi maščobne acil-koencim A metabolite(2, 5).
1.2.1 ZAVIRALCI KRESNIČKINE LUCIFERAZE
Za zaviralce kresničkine luciferaze je značilno, da so strukturno raznolike spojine, ki pa imajo določene skupne značilnosti. V splošnem so nizkomolekularne spojine (povprečna molekulska masa je 325,8 ± 63,3 Da, največ 898,8 Da in najmanj 122,17 Da) s planarno strukturo. Za večje spojine z nelinearno strukturo velja, da izkazujejo manjšo verjetnost zaviranja tega encima (4). Obstaja več študij, ki so se ukvarjale z zaviranjem kresničkine luciferaze samostojno ali v kombinaciji z drugimi luciferazami, pri čemer je skupni zaključek vsem, da strukturno gledano zaviralci kresničkine luciferaze vsebujejo različne 5-členske obroče, med katerimi so najbolj pogosti tiazolni, imidazolni, oksadiazolni, in piridinski obroči. Kombinacija teh struktur je pogosta med benzotiazoli, benzoksazoli in benzimidazoli. Kresničkino luciferazo pogosto zavirajo tudi spojine, ki imajo v svoji strukturi prisotno benzojsko kislino in hidrazin(6, 7, 8).
V raziskavah zaviranja kresničkine luciferaze s spojinami, pridobljenimi iz različnih kemijskih knjižnic, je v največji študiji pri skupno 360.854 spojinah približno 12 % spojin zaviralo luciferazo (6), medtem ko so kresničkino luciferazo v drugi študiji zavirali 3 % izmed skupno 70.000 spojin (8). Pri preučevanju več kot 42.000 spojin iz PubChem knjižnice so 4 % spojin zavirali kresničkino luciferazo pri 10 µM koncentraciji (7).
Zaviralci najbolj pogosto tekmujejo s substratoma, D-LH2 in ATP-jem, zato sta strukturi obeh predstavljeni na sliki 3 (spojini 1 in 2).
Ena izmed primarnih skupin zaviralcev oponaša D-LH2, pri čemer imajo strukture zaviralcev benzotiazolno, benzoksazolno ali benzimidazolno jedro ter se vežejo v žep za luciferinski substrat. Tak primer je 2-(2-fluorofenil)-6-metoksi-1,3-benzotiazol, ki je prikazan na sliki 3 (spojina 3). Zaviralci lahko prav tako tekmujejo z ATP-jem, kot je značilno za spojino 2-[(4-klorobenzoil)amino]-N-(1-piridin-5-iletildenamino)benzamid, struktura prikazana na sliki 3 (spojina 4) (6). Kompeticija tako z D-LH2 kot ATP-jem je bila dokazana za spojino 2-kloro-3-{[2-(1-metil-1H-1,3-benzodiazol-2-il)hidrazin- iliden]metil}kinolin, struktura prikazana na sliki 3 (spojina 5) (6). V nasprotju s
5
kompetitivno naravo zaviranja resveratrol kresničkino luciferazo zavira nekompetitivno, struktura je prikazana na sliki 3 (spojina 6) (9).
Že prehodno omenjen mehanizem zaviranja z nastankom multisubstratnega adukta so dokazali tudi v primeru spojine PTC124. Kresničkina luciferaza adenilira PTC124 preko m-karboksilatne skupine, da nastane PTC124-AMP, ki se veže v luciferinski žep in v vezavno mesto za ATP ter učinkovito zavira encim. Za nastanek takega tipa zaviralca je potrebna vsaj delna substratna (D-LH2) specifičnost. Ta tip zaviralcev se je izkazal za najmočnejšega (slika 3, spojina 7)(3).
Strukture zgoraj opisanih spojin se nahajajo na sliki 3, pri čemer v primeru zgornjih treh spojin (3, 4, 5) puščice nakazujejo na njihovo naravo zaviranja preko tekmovanja z enim izmed ali obema substratoma (1, 2).
Slika 3: Strukture substratov bioluminiscenčne reakcije kresničkine luciferaze ter primeri zaviralcev glede na tip zaviranja: 1- D-LH2, 2- ATP, 3- 2-(2-fluorofenil)-6-metoksi-1,3- benzotiazol, 4- 2-[(4-klorobenzoil)amino]-N-(1-piridin-5-iletildenamino)benzamid, 5- 2- kloro-3-{[2-(1-metil-1H-1,3-benzodiazol-2-il)hidrazin-iliden]metil}kinolin, 6- resveratrol, 7- PTC124-AMP.
6
1.2.2 STABILIZACIJA KRESNIČKINE LUCIFERAZE IN TEŽAVE PRI INTERPRETACIJI REZULTATOV
Pravilna interpretacija rezultatov testiranj, pri katerih je kresničkina luciferaza uporabljena kot reporterski gen, je glede na opisane interakcije lahko težavna. Poleg zaviranja lahko prisotnost zaviralcev povzroči tudi stabilizacijo reporterskega proteina.
Stabilizacija kresničkine luciferaze z zaviralci je splošen in pogost pojav v celičnih testih.
Takšna vrsta stabilizacije vodi v nepričakovano višji odziv celične linije, kot bi pričakovali zaradi zaviralcev, saj ti preprečijo ali upočasnijo encimsko razgradnjo, kar omogoči povečanje količine encima v celičnih kulturah po daljšem časovnem obdobju v primerjavi s kontrolo brez zaviralca. Tekmovanje z luciferinskim substratom in stabilizacija ter uporaba komercialnih reagentov s presežkom substrata, ki zaviralce izpodrinejo iz vezavnega mesta, vodi v na videz povišan odziv celične linije. Ta pojav se imenuje tudi aktivacija luciferaze (2). Da se v komercialnih reagentih nahajajo presežki substratov, je bilo dokazano v študiji, kjer je preučevanje zaviralne aktivnosti na prečiščenih proteinih s komercialnimi reagenti vodilo v višje IC50 vrednosti (vrednost pri kateri je 50 % zavrto delovanje encima) (8). V drugi študiji pa so prišli do zaključka, da je pri 30 – 40 % zaviralcev pri preučevanju zaviralne aktivnosti prišlo do določitve petkrat višje vrednosti IC50 pri uporabi komercialnih reagentov (6).
Ker konformacije proteina obstajajo v termodinamičnemu ravnovesju in se ligandi (v tem primeru zaviralci) lahko vežejo v določeno konformacijo, to vodi v stabilizacijo proteina.
Potencialno stabilizacijo zato določamo s pomočjo metod, ki merijo spremembe v denaturaciji, pri čemer vodi povišanje temperature v drugačno razvijanje proteina, ki ni stabiliziran z zaviralcem. V določenih primerih, kot je značilno za kresničkino luciferazo, vezava zaviralcev vodi v povišano stabilnost encima (4).
V študiji PCT124 in njegovih analogov (3) so temperaturno stabilizacijo preučevali preko t. i. temperaturnih premikov (angl. thermal shifts) s pomočjo metode, ki temelji na uporabi fluorescenčnega barvila SYPRO Orange, sposobnega nespecifične vezave na hidrofobne površine proteina. Pri poviševanju temperature in posledičnem razvijanju proteina pride do razlike v detektirani fluorescenci, pri čemer se preko Boltzmann-ovega modela izračuna t.i.
sredinsko temperaturo razvijanja proteina (označena Tm, angl. midpoint temperature of the protein-unfolding transition) (10). S primerjavo sredinske temperature razvijanja proteina so v primeru PTC124 in analogov prišli do zaključkov, da temperaturna stabilizacija
7
oziroma ΔTm vrednost, v primerjavi s kontrolo, korelira z zaviralno aktivnostjo, pri čemer je bila v primeru 200 µM koncentracije PCT124 ΔTm = 8 °C, medtem ko je pri sintezno pridobljenem PTC124-AMP prišlo do mnogo večje stabilizacije (ΔTm = 28 °C). Tako visoka vrednost temperaturne stabilizacije je v primeru spojine PTC124-AMP povezana z vezavo spojine tako v D-LH2 kot ATP vezavno mesto (3).
Glede na pomanjkljivosti kresničkine luciferaze kot reporterskega proteina je smiselno razmisliti o potencialnih alternativah. Ena izmed njih je luciferaza morske mačehe, ki je opisana v nadaljevanju.
1.3 LUCIFERAZA MORSKE MAČEHE
Luciferaza morske mačehe, tudi renilla luciferaza, izvira iz morske mačehe (Renilla reniformis) ter se pogosto uporablja kot reporterski gen v dvojnem luciferaznem sistemu, najpogosteje v kombinaciji s kresničkino luciferazo (2). Tak sistem je zastavljen tako, da signal ene luciferaze odraža izražanje tarčnega gena, medtem ko se druga izraža konstitutivno in se uporabi za normalizacijo rezultatov, npr. na osnovi citotoksičnosti, kot je značilno za celično linijo AR-EcoScreen (11). Do nastanka svetlobe pri luciferazi morske mačehe pride zaradi oksidativne dekarboksilacije substrata (koelenterazina) v prisotnosti kisika, tako da nastanejo ogljikov dioksid, oksiluciferin (koelenteramid) in foton modre svetlobe (12). Reakcija je predstavljena na spodnji sliki (slika 4).
Slika 4: Bioluminiscenčna reakcija, ki jo katalizira luciferaza morske mačehe (povzeto po (13)).
Luciferaza morske mačehe se od kresničkine luciferaze razlikuje glede na velikost (36 kDa, kresničkina luciferaza 62 kDa), vrsto substrata potrebnega za bioluminiscenčno reakcijo (koelenterazin), potrebe po ATP (reakcija pri luciferazi morske mačehe poteče brez ATP-ja), emisijski maksimum signala (480 nm, pri kresničkini luciferazi 550 – 570
8
nm) in razpolovnem času (ki se od kresničkine razlikuje za uro in pol). Za razliko od preostalih luciferaz se lahko luciferaza morske mačehe kot kresničkina luciferaza uporabljata tako v biokemijskih kot celičnih testih (2).
1.3.1 ZAVIRALCI LUCIFERAZE MORSKE MAČEHE
Ker je luciferaza morske mačehe od ATP neodvisen encim, predpostavljajo, da je najbolj pogost tip zaviranja tekmovanje s substratom, vendar pa sami mehanizmi zaviranja niso dobro raziskani. Struktura, ki je prisotna v najbolj močnih zaviralcih, ima arilsulfonamidno jedro (4). Kot zaviralec luciferaze morske mačehe je bila prepoznana spojina H-89, vendar pa točen mehanizem zaviranja ni popolnoma znan, saj je spojina izkazovala nekompetitiven način zaviranja, je pa tekom testiranja prišlo do določenih vizualnih sprememb, ki so jih razlagali z možnimi interakcijami H-89 s substratom, vendar jih kasneje niso mogli potrditi z masno spektroskopijo (14). Pri preiskovanju zaviralcev kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe so prišli do zaključka, da se zaviralci obeh encimov v veliki meri strukturno zelo razlikujejo (7). Strukturi substrata luciferaze morske mačehe, koelenterazina (spojina 8) in znanega zaviralca H-89 (spojina 9) sta podani na sliki 5.
Slika 5: Struktura substrata luciferaze morske mačehe 8- koelenterazina in primer strukture zaviralca 9- H-89.
V nasprotju s kresničkino luciferazo, ki ni občutljiva na potencialno gašenje ali razpršitev svetlobe, lahko na signal luciferaze morske mačehe z emisijskim maksimumom pri 480 nm vplivajo rumeno-rjavo obarvane spojine, kar se pri nizko molekularnih spojinah izrazi šele pri koncentracijah > 10 µM (4).
9
1.4 PRIMERI OECD SMERNIC, KI VKLJUČUJEJO UPORABO LUCIFERAZ
Uporabo luciferaz kot reporterskih genov predpisujejo tudi smernice Organizacije za gospodarsko sodelovanje in razvoj (OECD) na področju testiranja varnosti kemikalij glede njihove potencialne endokrine toksičnosti (detekcija agonistov in antagonistov estrogenskega receptorja α in β (ERα in β) ter androgenega receptorja (AR)) in imunotoksičnosti (sensitizacija kože – aktivacija keratinocitov in dendritičnih celic). Kot je razvidno iz preglednice I, je med reporterskimi geni najbolj pogosta kresničkina luciferaza v primeru različnih celičnih linij. Uporaba luciferaze morske mačehe je del notranje kontrole za citotoksičnost testiranih spojin pri celični liniji AR-EcoScreen v protokolu testne smernice 458 (15).
Preglednica I: OECD testi, ki vključujejo uporabo luciferaz.
Testna smernica Celična linija Luciferaza Vir
442D – In vitro sensitizacija
kože (aktivacija
keratinocitov)
KeratinoSens™ Kresničkina luciferaza (16)
LuSens Kresničkina luciferaza
442E – In vitro sensitizacija kože (aktivacija dendritičnih celic – izločanje interleukina-8)
THP-G8 Stabilna luciferaza rdeče, stabilna luciferaza oranžno
(17)
455 – Detekcija agonistov in antagonistov ER α, Erβ
ERα-HeLa-9903 Kresničkina luciferaza (18) VM7Luc4E2 Kresničkina luciferaza
ERα CALLUX® Kresničkina luciferaza 458 – Detekcija agonistov
in antagonistov AR
AR-EcoScreen Kresničkina luciferaza, luciferaza morske mačehe
(15)
AR-CALLUX® Kresničkina luciferaza 22Rv1/MMTV_GR-KO Kresničkina luciferaza
OECD smernice opozarjajo na potencialno lažno pozitivne rezultate in možnost vpliva testiranih spojin tako na reporterski gen kot reporterski protein. Testna smernica 455 pri uporabi celične linije ERα-HeLa-9903 opozarja, da testiranje fitoestrogenov v koncentracijah višjih od 1 μM vodi v pretirano visoke odzive celične linije, pri čemer so
10
lažno pozitivni rezultati (v tem primeru agonizem) lahko posledica z ER nepovezane aktivacije luciferaznega gena, direktne aktivacije reporterskega gena ali nepovezane fluorescence. V nadaljevanju je pri celičnih linijah VM7Luc4E2 in ERα CALLUX®
poudarek predvsem na očitnem zaviranju ali povečani bioluminiscenci zaradi stabilizacije reporterskega proteina (18). Podobna opozorila, kot jih opazimo pri testni smernici 455, najdemo tudi v testnih smernicah 442D in 442E (16, 17), medtem ko je v testni smernici 458 navedeno, da v primeru uporabe celične linije AR-EcoScreen lahko pride do pretiranega odziva ali zaviranja reporterskega proteina, vendar pa takšni učinki na reporterski protein pri celični liniji AR-CALUX® niso bili opaženi, medtem ko za celično linijo 22Rv1/MMTV_GR-KO ni dovolj podatkov (15).
Predlogi za reševanje lažno pozitivnih rezultatov se v smernicah razlikujejo. Medtem ko testni smernici 442D in 442E ne omenjata konkretnih rešitev, pač pa samo opozarjata na previdnost pri interpretaciji rezultatov (16, 17), smernica 455 v primeru skrbi o potencialnem vplivu na aktivacijo luciferaznega gena ali drugih interakcij svetuje uporabo ER antagonista, hidroksitamoksifena (18) ter ugotavljanje vpliva na odziv. Smernica 458 podobno svetuje uporabo znanega AR antagonista, hidroksiflutamida (15).
1.5 IZOFLAVONOIDI
Izoflavonoidi so velika in zelo značilna podskupina flavonoidov, ki jo najbolj pogosto najdemo v soji in drugih stročnicah ter v mikroorganizmih. Igrajo pomembno vlogo kot prekurzorji v razvoju fitoaleksinov pri interakcijah med rastlino in mikrobi ter skrbijo za zaščito rastlin pred insekti (19).
So sekundarni presnovki rastlin in vsebujejo 3-fenilkromanski skelet, ki je biogenetsko izpeljan iz 2-fenilkromanskega skeleta flavonoidov. Najbolj znani izoflavonoidi so daidzein, genistein in glicitein, ki se nahajajo v soji (Glycine max), v glikozidni obliki kot genistin, daidzin in glicitin. Biološko aktivne so aglikolnske oblike, ki poleg že omenjenih vključujejo še biokanin A, kalikozin in formononetin, ki so prisotni v črni detelji (Trifolium pratense), ter druge. V splošnem so izoflavonoidi lahko v obliki glikozidov ali aglikonski obliki (20).
Glede na IUPAC smernice za poimenovanje flavonoidov, izoflavonoidi spadajo v skupino flavonoidov s C-6 – C-3 – C-6 ogljikovim skeletom, v katero med drugim uvrščajo tudi flavonoide (flavani, flavoni in flavonoli ter antocianini), neoflavonoide (neoflavani in
11
neoflavoni), kalkone in dihidroalkone, aurone, pterokarpane ter njihove derivate (kumestani). Podobno kot neoflavonoide in flavonoide, izoflavonoide lahko nadaljnjo delimo še na izoflavane in izoflavone (21). Med izoflavonoide pa spada tudi S-ekvol, izoflavandiol, ki velja za ključni metabolit izoflavonoida iz soje, daidzina (22, 23).
Izoflavonoidom, predvsem tistim iz soje, pripisujejo mnoge pozitivne učinke na človeško zdravje, med drugim na kronične bolezni (koronarna srčna bolezen, sladkorna bolezen), osteoporozo in raka (24, 25). Prav tako lahko preko stimulacije ali zaviranja imunskega sistema vplivajo na imunsko funkcijo in bi lahko imeli pomembno vlogo pri preprečevanju raka (20). Izmed vseh vplivov je najbolje raziskan njihov vpliv na endokrini sistem.
Zaradi strukturne podobnosti z endogenim estrogenom 17β-estradiolom (E2) se izoflavonoidi vežejo in aktivirajo jedrne estrogenske receptorje (ERα, ERβ). Zaradi oponašanja funkcije naravnega estrogena jih imenujemo tudi fitoestrogeni (20). Genistein in daidzein izkazujeta visoko afiniteto do vezave na ERα in ERβ, pri čemer je afiniteta višja do ERβ, vendar sta slednji še vedno manjši od endogenega estrogena (E2), ki se enakovredno veže na obe izoobliki receptorja. Potencialni stimulatorni učinek genisteina na razvoj tumorjev so preiskovali tudi z vidika proliferacije MCF-7 celic in raka dojke pri glodavcih. Pri tem so prišli do zaključka, da v večih testiranjih, tudi na glodavcih, izoflavonoidi stimulirajo rast tumorjev (hormonsko pogojen rak mlečnih žlez pri podganah ter reproduktivnega tkiva pri odraslih miših), vendar pa so tudi v modelih na glodavcih izoflavonoidi relativno šibki agonisti ER v primerjavi z E2 (26).
Ker je prekomerna izpostavitev estrogenom eden izmed glavnih dejavnikov, ki pripomore k razvoju raka dojke, je povezava med hrano iz soje in rakom dojk postala kontroverzna.
Estrogenu podobni učinki so problematični predvsem v primeru žensk v menopavzi, pri katerih je tveganje za razvoj raka dojk večje, vendar pa ni veliko dokazov, ki bi potrdili, da bi šibko estrogensko delovanje izoflavonoidov iz prehrane imelo klinično relevanten vpliv na tkivo dojk pri zdravih ženskah in tistih, ki so v preteklosti že imele raka dojk.
Epidemiološke študije so pokazale, da je visok vnos hrane iz soje pri Azijkah povezan s skoraj tretjinskim zmanjšanjem tveganja za rak dojk in da imajo Japonke v primerjavi z ženskami z Zahoda boljšo možnost za preživetje. Podatki glede vpliva na razvoj raka dojk so nasprotujoči (20).
12
Poleg delovanja na ER izoflavonoidi delujejo tudi na s peroksisomskim proliferatorjem aktivirane receptorje (PPAR), ki igrajo pomembno vlogo pri energetski homeostazi in metabolizmu. Pri tem je vpliv izoflavonoidov biokanina A in formononetina na PPARα višji kot pri znanih agonistih PPARα/γ, kot sta ragaglitazar in tesaglitazar, medtem ko je njun vpliv na PPARγ šibkejši (27, 28).
Na težave pri vrednotenju fitoestrogenov v testnih sistemih s kresničkino luciferazo kot reporterskim genom opozarjajo OECD smernice (15, 18), pri čemer je bil povišan signal dokazan v primeru večih celičnih linij, ki so kot reporterski gen uporabljale kresničkino luciferazo. Biokanin A, daidzein in genistein so v koncentraciji višji od 1 µM povzročili povišan odziv v celičnih linijah HELN-ERα in HELN-ERβ (29), prav tako so povišan odziv povzročili tudi v celični linijah MCF-7 (biokanin A, daidzein, genistein) (30), MVLN (daidzein, genistein) (31) in CHO (biokanin A, daidzein, formononetin, genistein, glicitein) (32). To je bilo najbolj opazno pri testiranju izoflavonoidov kot agonistov ERα in ERβ, kjer je bil odziv višji od kontrolne spojine, E2.
Za nekatere izoflavonoide, katerih zaviralno aktivnost smo preiskovali tekom naloge, je bilo predhodno dokazano, da je v primeru > 1,0 µM koncentracije pri testiranju njihovega učinka na ERα prišlo do povišanega signala, ki pa ni bil posledica z ERα povezanimi učinki, in je lahko posledica zaviranja ter z njim povezane stabilizacije reporterskega proteina (33). Podatkov o potencialnem zaviranju kresničkine luciferaze z izbranimi izoflavonoidi nismo našli, sta pa eden izmed flavonoidov in spojina strukturno sorodna flavonoidom zavirala kresničkino luciferazo tako nekompetitivno kot kompetitivno. Izmed teh dveh je spojina PD98059, ki je najbolj podobna preučevanim izoflavonoidom, zavirala kresničkino luciferazo kompetitivno, saj zaviranje ni bilo več prisotno pri primerljivi določitvi zaviralne aktivnosti z uporabo detekcijskega reagenta proizvajalca Promega (8).
13
2 NAMEN DELA
Namen magistrske naloge je z uporabo tako metod in silico kot in vitro ovrednotiti, ali izbrani izolflavonoidi vplivajo na aktivnost kresničkine luciferaze ter ugotoviti, ali je luciferaza morske mačehe ustrezna alternativa kresničkini luciferazi.
Tekom raziskovalnega dela bomo potencialno interferenco v obliki zaviranja kresničkine luciferaze najprej ovrednotili s pomočjo metode in silico, t.j. z računalniškim programom InterPred, ki temelji na kvantitativnem odnosu med strukturo spojine in njeno aktivnostjo (QSAR, angl. quantitative structure-activity relationship) in omogoča napoved verjetnosti (P) interference kresničkine luciferaze na osnovi molekulskih in fizikalno-kemijskih deskriptorjev. In vitro bomo zaviralno aktivnost izbranih izoflavonoidov preverili pri 1, 10 in 100 µM koncentraciji s pomočjo nove metode, v obliki luciferaznega testa na lizatu celične linije AR-EcoScreen, ki izraža tako kresničkino luciferazo kot luciferazo morske mačehe. Pri spojinah, ki bodo izkazovale zaviralno aktivnost, bomo izvedli meritve pri dodatnih koncentracijah in določili zaviralno koncentracijo IC50.Pri in vitro preverjanju zaviranja kresničkine luciferaze, bomo ugotavljali tudi vpliv na luciferazo morske mačehe.
Za najbolj aktivne izoflavonoide bomo s pomočjo prilagojene metode in vitro poskusili preveriti tudi potencialno temperaturno stabilizacijo kresničkine luciferaze.
V zadnjem delu bomo s pomočjo molekulskega sidranja aktivnih izoflavonoidov, potrjenih z metodo in vitro, v aktivno mesto dostopnih struktur kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe poskušali ovrednotili ključne elemente in razlike medmolekulske prepoznave ter potrditi rezultate pridobljene in vitro.
Struktura dela je predstavljena na sliki 6.
14
Slika 6: Shema dela.
Pri analizi rezultatov se bomo v prvem delu posvetili razlikam med rezultati pridobljenimi s QSAR programom in metodo in vitro ter smiselnosti uporabe takšnega programa pri načrtovanju študij. Komentirali bomo prednosti in slabosti razvitih metod in vitro v kontekstu njihove uporabnosti, ustreznosti rezultatov in primerjave z literaturnimi metodami. Del razprave bomo namenili tudi razumevanju odnosa med strukturo in aktivnostjo (SAR, angl. structure-activity relationship) za izbrane spojine in mehanizemu zaviranja. V zadnjem delu bomo predstavili predhodne študije in utemeljili smiselnost uporabe luciferaze morske mačehe kot alternative.
•Interferenca kresničkine luciferaze vseh izbranih izoflavonoidov
QSAR program
•Zaviranje kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe vseh izbranih izoflavonoidov
•Temperaturna stabilizacija kresničkine luciferaze za najmočnejše zaviralce
Nova in vitro metoda
•Sidranje izoflavonoidov, ki so se prehodno izkazali za aktivne v aktivni mesti kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe
Molekulsko
sidranje
15
3 MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI
3.1.1 TESTIRANE SPOJINE
Za preučevanje zaviranja kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe smo izbrali 11 strukturno različnih izoflavonoidov. V preglednici II so v abecednem vrstnem redu podane vse osnovne informacije o izbranih izoflavonoidih, ki vključujejo kemijsko ime in strukturo, molsko maso, proizvajalca in čistoto ter opis strukture molekule s kratkimi nizi znakov (SMILES, angl. simplified molecular input line entry system). Pri QSAR programu smo kot pozitivno kontrolo za interferenco kresničkine luciferaze uporabili resveratrol. Pri in vitro luciferaznem testu smo za pozitivno kontrolo za zaviranje kresničkine luciferaze uporabili resveratrol, za luciferazo morske mačehe pa H-89. V preglednici III so podane osnovne informacije o kontrolah.
Preglednica II: Podatki o izoflavonoidih uporabljenih v testiranju.
Biokanin A Daidzein
Kemijsko ime
5,7-dihidroksi-3-(4-metoksifenil)kromen-4-
on 7-hidroksi-3-(4-hidroksifenil)kromen-4-on
Kemijska struktura
Molska masa (g/mol)
284,6 254,23
Proizvajalec, čistota
Extrasynthese, ≥ 99,0 % Sigma-Aldrich, ≥ 98,0 %
SMILES COC1=CC=C(C=C1)C2=COC3=CC(=CC (=C3C2=O)O)O
C1=CC(=CC=C1C2=COC3=C (C2=O) C=CC(=C3)O)O
Daidzin S-ekvol
Kemijsko ime
3-(4-hidroksifenil)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)- 3,4,5-trihidroksi-6-(hidroksimetil)oksan-2- il] oksikromen-4-on
(3S)-3-(4-hidroksifenil)-7-kromanol
Kemijska struktura
Molska masa (g/mol)
416,38 242,27
Proizvajalec, čistota
Sigma-Aldrich, ≥ 98,0 % Sigma-Aldrich, ≥ 97,0 %
SMILES C1=CC(=CC=C1C2=COC3=C(C2=O)C=
CC(=C3) OC4C(C(C(C(O4)CO)O)O)O)O C1[C@H](COC2=C1C=CC(=C2)O)C3=
CC=C(C=C3)O
16
Formononetin Genistein
Kemijsko ime
7-hidroksi-3-(4-metoksifenil)kromen-4-on 5,7-dihidroksi-3-(4-hidroksifenil) kromen- 4-on
Kemijska struktura
Molska masa (g/mol)
268,26 270,24
Proizvajalec, čistota
Extrasynthese, ≥ 99,0 % Sigma-Aldrich, ≥ 98,0 %
SMILES COC1CCC(CC1)C1COC2C(C1=O)CCC
(C2)O C1=CC(=CC=C1C2=COC3=CC
(=CC(=C3C2=O)O)O)O
Genistin Glicitein
Kemijsko ime
5-hidroksi-3-(4-hidroksifenil)-7- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroksi-6- (hidroksimetil)oksan-2-il]-oksikromen-4-on
7-hidroksi-3-(4-hidroksifenil)-6-metoksi- 4-kromenon
Kemijska struktura
Molska masa (g/mol)
432,37 284,267
Proizvajalec, čistota
Sigma-Aldrich, ≥ 98,0 % Extrasynthese, ≥ 95,0 %
SMILES C1=CC(=CC=C1C2=COC3=CC(=CC(=C3
C 2=O)O)OC4C(C(C(C(O4)CO)O)O)O)O COC1=C(C=C2C(=C1)C(=O)C(=CO2) C3=CC=C(C=C3)O)O
Glicitin Kalikozin
Kemijsko ime
3-(4-hidroksifenil)-6-metoksi-7- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroksi-6- (hidroksimetil)oksan-2-il]oksikromen-4-on
7-hidroksi-3-(3-hidroksi-4-metoksifenil) kromen-4-on
Kemijska struktura
Molska masa (g/mol)
446,408 284,267
Proizvajalec, čistota
Extrasynthese, ≥ 95,0 % Phytolab, 99 %
SMILES COC1=C(C=C2C(=C1)C(=O)C(=CO2)C3
=CC=C(C=C3)O)OC4C(C(C(C(O4)CO) O)O)O
COC1C(CC(CC1)C1COC2C(C1=O)CCC (C2)O)O
17 Nadaljevanje preglednice II.
Preglednica III: Podatki o kontrolah uporabljenih v testiranju.
Priprava osnovnih raztopin izoflavonoidov in kontrolnih spojin
Priprava spojin je zajemala tehtanje na analitski tehtnici (AG245, Mettler Toledo, Švica), raztapljanje natehtanih spojin v 99,9 % dimetisulfoksid (DMSO) in redčenje spojin z 99,9
% DMSO do ustreznih izhodiščnih koncentracij. Te so bile 100-krat večje od tistih, ki so bile uporabljene pri testiranju.
Uporabljene koncentracije spojin
V prvem delu smo testirali izbrane spojine v 1, 10 in 100 µM koncentraciji in tako izločili spojine, ki niso izkazovale zaviralne aktivnosti na katerkoli izmed dveh prisotnih luciferaz.
Nadalje smo aktivne izoflavonoide zaradi boljšega vpogleda v koncentracijsko območje Prunetin
Kemijsko ime
5-hidroksi-3-(4-hidroksifenil)-7- metoksikromen-4-on
Kemijska struktura
Molska masa (g/mol)
284,26
Proizvajalec, čistota
Extrasynthese, ≥ 95,0 %
SMILES COC1=CC(=C2C(=C1)OC=C(C2=O) C3=CC=C(C=C3)O)O
Resveratrol H-89
Kemijsko ime
5-[(E)-2-(4-hidroksifenil)etenil]benzen-
1,3-diol N-[2-[[3-(4-bromofenil)-2-
propenil]amino]etil]-5- izokinolinsulfonamid Kemijska
struktura
Molska masa (g/mol)
228,24 446,36
Proizvajalec, čistota
Sigma Aldrich, > 99 % (HPLC) MedChemExpress, 99,34 %
SMILES C1=CC(=CC=C1C=CC2=CC(=CC(=C2) O)O)O
O=S(C1=CC=CC2=C1C=CN=C2) (NCCNC/C=C/C3=CC=C(Br)C=C3)=O
18
aktivnosti in bolj pravilne določitve vrednosti IC50 testirali še pri dodatnih (vmesnih in nižjih) koncentracijah.
3.1.2 LIZATI CELIČNE LINIJE AR-ECOSCREEN
Zaviranje kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe smo preučevali na lizatu celične linije AR-EcoScreen. Ta se uporablja za preučevanje vpliva spojin na AR, ki ga izraža v kombinaciji z reporterskim genom za kresničkino luciferazo in luciferazo morske mačehe. Celice izhajajo iz jajčnikov kitajskega hrčka in so po morfologiji epitelijskega tipa (11, 34).
Celični lizati so bili predhodno pripravljeni s strani somentorice, postopek priprave je opisan v podpoglavju 3.2.2 Priprava celičnega lizata.
3.1.3 REAGENTI IN MATERIALI
Pri preučevanju vpliva izoflavonoidov na kresničkino luciferazo in luciferazo morske mačehe smo uporabili Dual-Luciferase® Reporter Assay System (ref. št. E1960; Promega, ZDA) (DLR), ki omogoča hitro in zaporedno kvantifikacijo signalov obeh reporterskih proteinov, pri čemer je zaznavnost bioluminiscence v osmih za kresničkino in šestih velikostnih razredih za luciferazo morske mačehe. Ker merjenje bioluminiscence luciferaze morske mačehe sledi merjenju kresničkine luciferaze, je dodan reagent, ki omogoča popolno utišanje signala kresničkine luciferaze za faktor 105 oziroma do 0,001 % ostanka svetlobe v eni sekundi po dodatku reagenta. V formulacijo je dodan koencim A, ki omogoča boljšo reakcijsko kinetiko (bolj stabilni bioluminiscenčni signali s signifikantno večjo intenziteto) (35).
Set zajema:
- Luciferase Assay Buffer II: pufer za luciferazni test s kresničkino luciferazo, - Luciferase Assay Substrate: substrat za kresničkine luciferazo,
- Stop & Glo® Buffer: pufer za utišanje signala kresničkine luciferaze in luciferazni test z luciferazo morske mačehe, in
- Stop & Glo® Substrate: substrat za luciferazo morske mačehe.
19
Pri testiranju vpliva na stabilizacijo kresničkine luciferaze smo tri najbolj aktivne izoflavonoide testirali pri 100 µM koncentraciji.
Pri preučevanju potencialne temperaturne stabilizacije kresničkine luciferaze smo uporabili Luciferase Assay System (ref. št. E1501; Promega, ZDA), ki nam omogoča merjenje bioluminiscence kresničkine luciferaze (36).
Set zajema:
- Luciferase Assay Substrate: substrat za kresničkino luciferazo in
- Luciferase Assay Buffer: pufer za luciferazni test s kresničkino luciferazo.
Za pripravo lizata smo uporabili lizirni pufer (RLB, angl. Reporter Lysis Buffer) (ref. št.
E4030; Promega, ZDA). Reagente za luciferazni test je potrebno pred začetkom segreti na sobno temperaturo.
Pri redčenju smo uporabili 99,9 % DMSO (ref. št. 276855, Sigma-Aldrich, ZDA).
Pri delu smo uporabljali izdelke proizvajalcev laboratorijske opreme Sartorius, Nemčija (nastavki za pipete), TPP, Švica (pipete, gojitvene posode, centrifugirke) in Thermo Fischer, ZDA (mikrotitske ploščice).
3.2 METODE
3.2.1 PROGRAM INTERPRED
Spletno orodje InterPred spada med računalniške metode vrednotenja potencialne interference testnih sistemov. Program so razvili raziskovalci ameriškega Nacionalnega inštituta za vede o okoljskem zdravju (angl. National Intitute of Environmental Health Sciences), ki z drugimi vladnimi agencijami sodelujejo pri projektu Toksikologija v 21.
stoletju (angl. Toxicology in the 21st Century). InterPred združuje 17 QSAR modelov, ki poleg napovedovanja interference sistemov s kresničkino luciferazo omogočajo tudi napovedovanje interference specifičnih avtofluorescentnih modelov glede na tip celic, barvo in pogoje. Program je bil razvit zaradi želje po čim lažji potrditvi pravilnosti rezultatov, saj se predpostavlja, da je 5–10 % rezultatov lažno pozitivnih (37, 38).
QSAR modeli so bili razviti na osnovi rezultatov testov avtofluorescence in zaviranja kresničkine luciferaze, pri čemer so raziskovalci testirali več kot 10.000 spojin, ki so vključevale 8.305 edinstvenih struktur iz Tox21 kemijske knjižnice. S kemoinformatičnimi
20
pristopi so nato povezali strukturne lastnosti s profili aktivnosti za posamezen model ter razvili algoritme za napovedovanje interference na osnovi molekulskih deskriptorjev in fizikalno-kemijskih lastnosti. Za uporabo so bili v InterPred vključeni le QSAR modeli, ki so imeli najboljšo možno napovednost (37, 38).
Program je dostopen na naslednjem spletnem naslovu:
https://sandbox.ntp.niehs.nih.gov/interferences/.
Postopek dela s programom InterPred
Na dnu spletne strani se nahaja ikona »Submit chemicals«, s klikom na katero smo preusmerjeni na vmesnik »Upload chemicals«, ki nam omogoča vnos ene spojine ali pa vnos dokumenta z več spojinami. Spojine lahko vnesemo v obliki SMILES kode, registrske številke CAS (CASRN) ali pa identifikatorja iz podatkovne baze Distributed Structure-Searchable Toxicity. Te se po ponovnem kliku na ikono »Submit chemicals«
pretvorijo v SMILES kodo, ki je pripravljena za QSAR model. Pri tem potečejo naslednji postopki: odstranitev vodikov, kovinskih ionov, desolvatacija, procesiranje stereokemije in filtriranje fragmentov soli.
S klikom na ikono »Compute descriptors« model izračuna set deskriptorjev za posamezno spojino, ki ga lahko prenesemo na svoj računalnik v obliki preglednice. Za vsako spojino je izračunanih 677 1D in 2D deskriptorjev skupaj z dodatnimi 30 fizikalno-kemijskimi deskriptorji.
Spodaj na strani med navedenimi modeli izberemo »Luciferase interference model« in kliknemo na ikono »Compute predictions«, kar vodi v izračun napovednosti interference sistema s kresničkino luciferazo. Verjetnost interference oziroma zaviranja je podana v obliki numerične vrednosti (0–1) skupaj z barvno lestvico (zelena, rumena, oranžna, rdeča) in standardno deviacijo (SD), pri čemer vrednost blizu števila 1 in rdeč barvni razred, simbolizirata največjo verjetnost interference sistema.
Na sliki 7 je podan primer napovedi interference kresničkine luciferaze za biokanin A.
21
Slika 7: Napoved interference kresničkine luciferaze s programom InterPred za spojino biokanin A.
3.2.2 PRIPRAVA CELIČNEGA LIZATA
Celično linijo AR-EcoScreen (kupljena pri Japonski zbirki raziskovalnih biovirov (Japanese Collection of Research Bioresources), JCRB1328) smo gojili v DMEM/F-12 mediju brez fenol rdečega (Gibco, ZDA) z dodanim 5 % z dekstranom in z aktivnim ogljem prečiščenim fetalnim govejim serumom (Gibco, Brazilija), 200 µg/mL Zeocina (Invivogen, Francija), 100 µg/mL higromicina (Sigma-Aldrich, ZDA), 100 U/mL penicilina (Sigma-Aldrich, ZDA) in 100 µg/mL streptomicina (Sigma-Aldrich, ZDA).
Celice smo gojili v humidificiranem inkubatorju s 5 % CO2 pri 37 ºC. Za poskus smo 4,7 x 106 celic nasadili v gojitveno posodo s površino 150 cm2 in inkubirali 24 ur. Nato smo v gojitveno posodo dodali v DMSO raztopljen dihidrotestosteron (Sigma-Aldrich, ZDA) do končne 10 nM koncentracije v gojitveni posodi. Po ponovni 24-urni inkubaciji smo medij odstranili ter v gojitveno posodo dodali 9,4 mL lizirnega pufra RLB. Gojitveno posodo smo nato zamrznili na - 80 ºC do uporabe za luciferazni test.
22
3.2.3 LUCIFERAZNI TEST
Z luciferaznim testom na lizatu celične linije AR-EcoScreen, v katerem sta bili prisotni tako kresničkina luciferaza kot luciferaza morske mačehe, smo neposredno določali učinek izbranih izoflavonoidov na njuno aktivnost.
Luciferaza je generičen izraz za encim, ki katalizira oksidacijo substrata preko bioluminiscenčne reakcije, pri kateri se kemična energija pretvori v svetlobo. Evolucijsko se kresničkina luciferaza in luciferaza morske mačehe razlikujeta, zato sta za potek reakcije potrebna različna substrata. Kresničkina luciferaza je encim, ki katalizira oksidacijo luciferina v oksiluciferin, medtem ko luciferaza morske mačehe katalizira oksidacijo koelenterazina v koelenteramid. V obeh primeri pride do tvorbe svetlobe, ki zelo hitro izgine (35). Reakciji sta predstavljeni na sliki 8.
Slika 8: Poenostavljeni bioluminiscenčni reakciji, ki ju katalizirata kresničkina luciferaza in luciferaza morske mačehe (35).
Zaporedno merjenje zaviranja kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe
Pri preučevanju vpliva izbranih izoflavonoidov na encima smo 5 µL 100-kratne koncentracije raztopine izoflavonoida v DMSO (glede na končno na mikrotitrski ploščici) razredčili v 45 µL sveže odtaljenega lizata ter tako pripravili mešanico v 10-krat manjši koncentraciji. Nadalje smo 10 µL te mešanice še enkrat redčili, tokrat v 90 µL lizata ter tako prišli do želenih končnih koncentracij za preučevanje zaviralne aktivnosti. Pri delu smo bili pozorni, da smo kombinacijo lizata in raztopine izoflavonoida dobro premešali.
23
Po 30-minutni inkubaciji smo v tri vdolbinice na mikrotitrske ploščice prenesli 20 µL posameznih kombinacij izoflavonoida in lizata. Nato smo dodali 30 µL reagenta za merjenje aktivnosti kresničkine luciferaze, čemur je sledilo takojšnje merjenje bioluminiscence s čitalcem mikrotitrskih ploščic Biotek Synergy HT (Bio Tek, ZDA).
Po končanem merjenju bioluminiscence kresničkine luciferaze smo dodali še 30 µL reagenta za merjenje aktivnosti luciferaze morske mačehe in ponovno takoj pomerili bioluminiscenco.
Poskus preverjanja temperaturne stabilizacije kresničkine luciferaze
Raztopino izoflavonoida smo pri proučevanju temperaturne stabilizacije kresničkine luciferaze redčili v lizatu na isti način, kot smo to storili pri predhodnem testiranju zaviranja obeh encimov.
Pripravljene mešanice smo v epicah inkubirali tri minute pri izbrani temperaturi v napravi Thermoblock (FALC Instruments, Italija), čemur je sledilo 3-minutno hlajenje na sobno temperaturo. V tri vdolbinice na mikrotitrski ploščici smo prenesli po 20 µL lizata z izbrano spojino ter dodali 30 µL reagenta za merjenje aktivnosti kresničkine luciferaze.
Temu je sledilo takojšnje merjenje bioluminiscence s čitalcem mikrotitrskih ploščic Biotek Synergy HT.
Pri preučevanju temperaturne stabilizacije kresničkine luciferaze smo prvo meritev izvedli pri sobni temperaturi (25 °C), s čimer smo pridobili podatke o osnovnem zaviranju encima.
Ker je bila pričakovana razlika v denaturaciji encima nad 30 °C, smo naslednjo meritev izvedli pri tej temperaturi, naprej pa v intervalih po 3 °C do 45 °C. Zadnja temperatura, pri kateri smo merili bioluminiscenco, je bila 50 °C, kjer je bila pričakovana denaturacija proteina. Ker smo tekom dela istočasno izvajali tudi statistično obdelavo rezultatov, smo izvedli še dodatno meritev pri 43,5 °C zaradi boljše določitve temperature, pri kateri pride do 50 % upada bioluminiscence.
3.2.4 MOLEKULSKO SIDRANJE
Molekulsko sidranje aktivnih izoflavonoidov v vezavno mesto kresničkine luciferaze in luciferaze morske mačehe smo izvedli na Teoretičnem odseku (D-01) Kemijskega inštituta v Ljubljani. Izoflavonoide smo narisali s programom ChemDraw Professional 16.0, 3D strukture pa generirali s programom Chem3D, oba last podjetja PerkinElmer, ZDA. 3D strukturo smo pred sidranjem ustrezno optimizirali z uporabo polja sil MMF94, pri čemer
