Table 6: Characteristics of structural and non-structural APMV-1 proteins.
Protein Masa [kDa]3 Dolžina [ak]4 Funkcija Viri
F1 66 553 - Omogoča zlitje gostiteljske in virusne membrane in s tem vstop APMV-1 v gostiteljsko celico.
- Pomembna vloga pri virulenci APMV-1.
HN1 74 571–616 - Hemaglutinacijsko in nevraminidazno aktivnost omogoča globularna glava HN.
- Interakcija s proteini F, ki omogočajo fuzijo APMV-1 s specifično membrano gostitelja.
L1 250 2204 - Predstavlja največji protein APMV-1, ki je prisoten v najmanj kopijah.
- Sinteza virusne mRNA in podvojevanje genomske RNA.
- Sinteza kape na 5´ koncu in poli-A polimerazna aktivnost na novo sintetizirani mRNA.
- Vzdrževal naj bi krožno obliko delca APMV-1.
Chambers in sod., 1986b
32
nadaljevanje preglednice 6. Lastnosti strukturnih in nestrukturnih proteinov APMV-1
Protein Masa [kDa]3 Dolžina [ak]4 Funkcija Viri
P1 50–555 395 - Je del prepisovalnega kompleksa APMV-1.
- Ključna vloga pri podvojevanju APMV-1 in prepisovanju virusne RNA. Stabilizira protein L v kompleksu P-L, ki deluje kot RNA-usmerjena RNA polimeraza.
- V tetramerni obliki in v kombinaciji s proteinom L in kompleksom RNA-NP deluje kot šaperon in preprečuje naključno enkapsulacijo ne-virusne RNA.
- Tvori kompleks s posameznimi proteini NP in regulira prehod med prepisovanjem virusne RNA
V2 36 239 - Pomemben virulentni dejavnik APMV-1.
- Z domeno na C-terminalnem delu inhibira odziv interferonov (IFN) α in β. Inhibira signalizacijo IFN z delovanjem na STAT1 in s tem povzroči njegovo razgradnjo. Lahko tudi inhibira odziv IFN-β z delovanjem na MDA5.
- Vloga pri podvojevanju virusne RNA, kjer reagira s proteinom NP v gostiteljski celici.
Ganar in sod., 2014
- Točna funkcija pri podvojevanju APMV-1 še ni znana.
Ganar in sod., 2014 Yusoff in Tan, 2001
NP1 53 489 - Več tisoč podenot NP tvori nukleokapsido APMV-1, ki obdaja virusno genomsko RNA in jo ščiti pred nukleazami.
- Je del prepisovalnega kompleksa APMV-1.
- Je najštevilčnejši protein APMV-1.
- N-terminalni del NP tvori povezavo z virusno RNA in proteinom P in določa strukturo
L: veliki protein (RNA-usmerjena RNA polimeraza; ang. large protein); HN: hemaglutinin-nevraminidaza; F:
fuzijski protein; M: matrični protein; P: fosforilacijski protein (V, W: mRNA, ki kodira protein P, se lahko po prepisu ustrezno preoblikuje in povzroči sintezo proteina V oziroma W); NP: nukleokapsidni protein.
1 Strukturni protein; 2 nestrukturni protein; 3 molekulska masa podana v kDa.
4 Število aminokislinskih ostankov, ki sestavljajo protein, glede na nukleotidno zaporedje.
5 Masa proteina P je med sevi različna zaradi različnih oblik fosforilacije (Dortmans in sod., 2010).
2.6.2 Podvajanje APMV-1
Postopek podvajanja APMV-1 se začne s pritrditvijo virusa na celične receptorje z vezano sialično kislino. Navadno se APMV-1 s proteinom HN pritrdi na celice sluznic dihal, ki vsebujejo receptorje kot so gangliozidi in N-glikoproteinski receptorji. Po pritrditvi pride protein F v neposredni stik s celično membrano, spremeni obliko in povzroči zlitje virusne in celične membrane. Skozi poro, ki nastane po zlitju membran, nukleokapsidni kompleks APMV-1 (genomska RNA obdana s proteini NP, P in L) vstopi v gostiteljsko celico.
Znotrajcelično podvajanje APMV-1, ki sledi vstopu nukleokapsidnega kompleksa, poteka izključno v citoplazmi. APMV-1 ima negativno polarno genomsko RNA, zato virusna RNA-usmerjena RNA polimeraza v prvi fazi sintetizira komplementarne pozitivno polarne
33
transkripte genoma, ki jih mehanizmi gostiteljeve celice uporabijo v procesih prevajanja virusnih proteinov in prepisovanja v virusne negativno polarne RNA genome. Prepisovanje virusnih genov se začne na zaporedju skrajnega 3´ konca genoma APMV-1, sintetizirajo pa se mRNA od začetka do konca posamezne genske sekvence. Ponovni začetki prepisovanja genov proti 5´ koncu niso enotni, kar vodi v nastanek gradienta populacij mRNA, katerih število se zmanjšuje z oddaljevanjem od 3´ konca genoma. Sinteza proteinov HN in F poteka v zrnatem endoplazemskem retikulumu; sta edina proteina APMV-1, ki se po prevajanju modificirata z glikozilacijo, vzpostavitvijo disulfidnih mostičkov in cepitvijo s celičnimi proteazami. Protein F se sintetizira kot nefunkcionalni protein F0, ki potrebuje za vzpostavitev funkcionalnosti cepitev z gostiteljskimi proteazami na F1 in F2 podenoti, ki sta povezani z disulfidnim mostičkom. Protein HN se pri določenih sevih APMV-1 po prevajanju prav tako cepi z gostiteljskimi proteazami. Po ustrezni modifikaciji se virusni proteini F in HN iz Golgijevega aparata transportirajo na celično membrano in se na določenem mestu vgradijo v lipidni dvosloj. Na mestu vgradnje se z njimi na notranji strani celične membrane povežejo proteini M. Po enkapsulaciji negativno polarne genomske RNA s proteini NP se nukleokapsidni kompleks, skupaj s proteini P in L, pritrdi na proteine M znotraj modificirane celične membrane. V zaključni fazi podvajanja APMV-1 se virusni delci z naraščajočim izbočenjem odcepijo iz celične membrane gostitelja (Alexander in Senne, 2008; Ganar in sod., 2014; Yusoff in Tan, 2001).
2.6.3 Patogeneza APMV-1
Pri kokoših je patogeneza APMV-1 pogojena predvsem z virusnim sevom, vpliv pa imajo tudi količina virusa, mesto vnosa okužbe, starost kokoši in okoljski pogoji. Na splošno velja, mlajša, kot je žival, hujša je oblika bolezni. Po okužbi z virulentnimi sevi APMV-1 piščanci navadno nenadno poginejo brez očitnih kliničnih znakov, pri starejših pa je lahko bolezen dolgotrajnejša z značilnimi kliničnimi znaki (Alexander in Senne, 2008). Pasma in genetsko poreklo živali nimata očitnega vpliva pri dovzetnosti kokoši na bolezen (Cole in Hutt, 1961). Naravne poti okužbe z APMV-1, kot so nazalna, oralna in okularna, naj bi v večji meri povzročale respiratorno obliko bolezni (Beard in Easterday, 1967), intramuskularne, intravenozne in intracerebralne poti pri načrtni okužbi pa živčno obliko AKK (Beard in Hanson, 1984). Virulenca sevov APMV-1 se navadno zelo razlikuje glede na gostitelja. Za kokoši visoko virulentni sevi lahko povzročajo pri racah blage klinične znake oziroma jih ne, četudi pride do okužbe s sevi, ki so smrtni za kokoši (Higgins, 1971).
Patogenezo in virulenco APMV-1 določata strukturna površinska proteina HN in F, ki omogočata pritrjevanje delcev APMV-1 na receptorje, in vstop nukleokapsidnega kompleksa v gostiteljsko celico in protein V, ki vpliva na imunski odziv gostitelja na okužbo (Ganar in sod., 2014).
34 2.6.3.1 Vloga proteina F pri patogenezi APMV-1
Cepitev proteina F med posttranslacijskim modificiranjem v gostiteljski celici predstavlja eno izmed glavnih determinant patogenosti, saj lahko le proteolitično cepljeni protein F povzroči zlitje membran gostitelja in APMV-1 (Ganar in sod., 2014). Med podvajanjem APMV-1 se funkcionalno pomembni fuzijski protein F sintetizira kot protein F0 (66 kDa), ki se proteolitično cepi na daljšo podenoto F1 (55 kDa) in krajšo F2 (12,5 kDa), ki ostaneta povezani z disulfidnim mostičkom (Nagai in sod., 1989). Podenota F1 vsebuje transmembransko domeno, ki se nahaja blizu C-terminalnega konca proteina, domena na N-terminalnem koncu F1 pa naj bi bila direktno vpletena pri procesu zlitja membran. V kolikor do cepitve proteina F0 ne pride, novo nastali virusni delci ne postanejo infektivni.
Proteolitično cepitev F0 povzročijo gostiteljske proteaze na peptidni vezi med aminokislinama na mestu 116 in 117 od N-terminalnega konca F0 (Nagai in sod., 1976a;
Rott in Klenk, 1988; Yusoff in Tan., 2001). Specifiko cepitve določa aminokislinsko zaporedje, ki se nahaja na cepnem mestu F0 in se med sevi APMV-1 razlikuje (Glickman in sod., 1988; Toyoda in sod., 1987). Proteaza, ki je zmožna katalizirati cepitev proteina F0 pri vseh sevih APMV-1, je tripsin. Za kokoši visoko virulentni sevi APMV-1 se lahko podvajajo v širokem naboru celičnih tipov v pogojih in vitro z ali brez dodanega tripsina, nizko virulentni sevi pa le ob prisotnosti dodanega tripsina in le v določenih celičnih tipih (Alexander in Senne, 2008). Tretiranje ne-infektivnih sevov s tripsinom v pogojih in vitro povzroči obnovitev virusne infektivnosti in nastanek plakov na celičnih kulturah (Nagai in sod., 1976b). Vsi sevi APMV-1 se lahko podvajajo v alantoisni votlini oplojenih kokošjih jajc (Alexander in Senne, 2008). Določitev aminokislinskih zaporedij cepnih mest proteinov F0, ki so jih pridobili na podlagi nukleotidnih zaporedij z nukleotidnim sekvenciranjem, je omogočila primerjavo in ločevanje med velogenimi, mezogenimi, lentogenimi in asimptomatskimi sevi APMV-1 (Alexander in Senne, 2008; Collins in sod., 1994; Miller in Koch, 2013). Prisotnost dodatne bazične aminokisline pri virulentnih sevih določa cepitev F0 s proteazo oziroma proteazami, ki so prisotne v številnih gostiteljskih celičnih tipih, tkivih in organih. Proteolitični encim oziroma encimi še niso popolnoma identificirani, zelo verjetno pa spadajo med znotrajcelične proprotein-procesirajoče, subtilizinu-sorodne endoproteaze. Domneva se, da cepitev F0 pri virulentnih sevih APMV-1 povzroča furin (Fijii in sod., APMV-1999; Stieneke-Gröber in sod., APMV-1992). Po okužbi z virulentnimi sevi APMV-1 poteka cepitev F0 v gostiteljski celici kot modifikacija po prevajanju. Posledično se proizvedejo virusni delci s proteinom F v obliki F1-F2, ki lahko povzročijo zlitje membrane virusa z membrano vsake celice, na katero se novo nastali virus pritrdi s proteinom HN. Zaradi tega okužba z virulentnimi sevi APMV-1 vodi v sistemsko okužbo, ki se navadno konča s poginom okužene živali. Pri lentogenih sevih APMV-1 lahko cepitev F0 opravijo le tripsinu podobne proteaze. Za razliko od cepitve pri virulentnih sevih APMV-1 cepitve F0 pri lentogenih sevih ne opravijo znotrajcelične proteaze v procesu modifikacije po prevajanju, ampak specifične zunajcelične proteaze (Ganar in sod., 2014). Posledično se lahko lentogeni sevi APMV-1 podvajajo le v celičnih
35
tipih, kot so respiratorni in črevesni epiteliji, vendar ne pride do sistemske okužbe (Alexander in Senne, 2008). Dokumentirana aminokislinska zaporedja cepnega mesta prekurzorskega proteina F0 pri različnih sevih APMV-1 so prikazana v preglednici 7.
Preglednica 7: Aminokislinska zaporedja cepnega mesta proteina F0 pri različnih sevih APMV-1 (Alexander