Količina maščob v živilih je zelo različna od manj kot 0.1 % (v zelenjavi) pa vse do skoraj 100 % (v masteh in oljih). Večje količine maščob vsebujejo živila živalskega izvora (svinjska mast, loj), maslo (84 %), polnomastni sir (65 %), mleko (3.5 %). V zelenjavi in v večini sadja je količina maščob neznatna od 0.1 do 1 %. Večje količine maščob so v semenih in v nekaterih plodovih, kot so olive (19 %), suhi lešniki (62 %), suhi orehi (58 %) …
V analitičnem pogledu je definicija za maščobe sledeča:
Maščobe so snovi, ki jih iz živila ekstrahiramo z brezvodnim etrom in, ki po enournem sušenju na 100 0C ne izparijo.
Za ekstrakcijo maščob uporabljamo naslednja topila: eter, petroleter, kloroform, trikloretilen.
Ker so v teh topilih razen maščob topne še druge snovi (voski, steroli, vitamini, pigmenti, eterična olja, proste maščobne kisline) imenujemo dobljen ekstrakt – eterski ekstrakt ali surove maščobe. Pri večini živil je količina nemaščobnega dela surovih maščob neznatna in jo lahko pri analitiki zanemarimo. Kjer pa je ta vsebnost večja, jih lahko ločimo s pomočjo umiljenja maščob. Neumiljive snovi so nemaščobna sestava maščob.
Določanje količine maščob v živilu je pomembno za ocenjevanje energijske vrednosti živil in za živila, ki jih razvrščamo v razrede glede na količino maščob (primer maslo, sir).
Analitika maščob zavzema:
• Določanje količine maščobe.
• Identifikacija vrste maščob – sestava maščob.
• Karakteristična števila.
• Določitev dodatkov, antioksidantov, tuje snovi.
• Določanje kvara maščob.
4.4.1 Določanje količine maščob
Princip vseh metod je ekstrakcija maščob iz živila z organskim topilom. Katero topilo in metodo določanja bomo izbrali je odvisno od vrste živila. Obstaja veliko metod, ki jih delimo glede na osnovni princip ekstrakcije:
1. Metode ekstrakcije z neodmerjeno količino topila (metoda po Soxhletu, po Rosenfeldu, po Winterju)
2. Metoda ekstrakcije z določeno količino topila (metoda po Grossfeldu)
3. Metoda ekstrakcije z odmerjeno ali neodmerjeno količino topila po predhodni obdelavi vzorca s kislino, bazo ali površinsko aktivno snovjo (metoda po Weibull-Stoldtu, po Grossfeldu, acidobutirometrična metoda in po Rose-Gottliebu).
Slika 78: Butirometer za določanje maščob po Gerber-ju v mleku in mlečnih izdelkih Vir: Hmelak Gorenjak, 2007
DOLOČANJE MAŠČOB PO SOXHLETU
Vzorec pred ekstrakcijo posušimo (na 105 °C, dve uri). Suh, homogeniziran vzorec prenesemo v poseben patron, ki ga namestimo v ekstraktor Soxhletove aparature. Bučko (predhodno jo sušimo na 105 °C, eno uro) napolnimo do ¾ volumna s topilom in sestavimo aparaturo s hladilnikom. Ekstrakcija poteka 3 do 6 ur, odvisno od vrste vzorca, v klasični aparaturi po Soxhletu. V novejših modificiranih izvedbah se je čas ekstrakcije zmanjšal tudi za polovico.
Količino maščobe, ki jo dobimo v bučki, po končani ekstrakciji in po enournem sušenju na 105 °C, lahko preračunamo na zatehto vzorca ali na suho snov.
Slika 79: Sestavni deli klasične in sodobne aparature za določanje maščob po Soxhletu (a – hladilnik, b – ekstraktor, c - tulec z vzorcem, d – bučka)
Vir: Hmelak Gorenjak, 2007
METODA PO M. WEIBULLU in W. STOLDTU
Pri metodi po M. Weibullu in W. Stoldtu vzorec predhodno razklopimo s klorovodikovo kislino, pri čemer prihaja do hidrolize beljakovin in škroba. Izločeno mast prefiltriramo in ekstrahiramo po Soxhletovi metodi. Metoda je primerna za živila, pri katerih sama ekstrakcija z etrom ne daje dobrih rezultatov, bodisi zaradi prepočasnega pronicanja etra v celice, ali ker se mast nahaja vezana na beljakovine in ogljikove hidrate.
POSTOPEK DOLOČANJA:
REAGENTI:
klorovodikova kislina, konc.
eter, brezvodni ali petroleter
Vzorec (5 do 10 g) segrevamo 15 min. v čaši s 100 mL vode in 60 mL konc. HCl na vreli vodni kopeli z občasnim mešanjem. Nato segrevamo z mešanjem še nad plinskim gorilnikom do vrenja. Čašo pokrijemo z urnim steklom in pustimo, da počasi vre (cca. pol ure,) dokler ne dobimo raztopine. Še vročo raztopino razredčimo z dvojno količino vroče vode, s katerim tudi speremo urno steklo in takoj filtriramo skozi navlažen, naguban filter papir. Po dobrem spiranju čaše s toplo vodo, in ko se je vsa voda odcedila s filter papirja, prenesemo filter papir skupaj z maščobo na urno steklo, sušimo 2-3 ure na 105 °C in zatem prenesemo direktno v ekstraktor po Soxhletu.
Ekstrakcijo po Soxhletovi metodi lahko izvedemo v avtomatski aparaturi po Soxhletu:
Suho bučko stehtamo, v patron vstavimo filter papir z maščobo in izvajamo ekstrakcijo po ustreznem programu. Po končani ekstrakciji bučko sušimo 1 uro na 100 °C, jo ohladimo in izračunamo % maščobe.
4.4.2 Določanje kvara maščobe
DOLOČANJE HIDROLITIČNEGA KVARA
Masti in olja niso nikoli nevtralna, ker vedno vsebujejo še določeno količino prostih maščobnih kislin. S staranjem se količina prostih maščobnih kislin v maščobah poveča (hidrolitičen kvar maščob). Pravilnik o kakovosti živil predpisuje maksimalno količino dovoljenih prostih maščobnih kislin, izraženo v % oleinske kisline.
Kislost maščob izražamo s kislinskim številom, kislinsko stopnjo in % oleinske kisline:
- Kislinsko število: se izraža kot število mg KOH potrebnih za nevtralizacijo prostih maščobnih kislin v 1 g vzorca.
- Kislinska stopnja: se izraža v številu mL 1 M KOH ali NaOH potrebnih za nevtralizacijo 100 g vzorca.
- % oleinske kisline dobimo, če kislinsko stopnjo pomnožimo s faktorjem 0.2823.
DOLOČANJE OKSIDATIVNEGA KVARA
Na nenasičenih maščobnih kislinah prihaja v procesu staranja do oksidativnih sprememb kot posledica delovanja kisika, svetlobe, temperature in prisotnosti težkih metalov (Fe, Cu, Mn, Co ...). Tvorijo se peroksidi. Autokatalizna reakcija je v prvi fazi počasna, produkte ne moremo zaznati organoleptično, potem se hitrost reakcije eksponentno poveča. Vrste oksidativnih sprememb so odvisne od višine temperature. Pri temperaturah nad 130 °C peroksidi začenjajo razpadati – nastajajo sekundarni produkti oksidacije. Ti produkti nastajajo tudi pri nižjih temperaturah, hitrost nastajanja je tem večja, čim hitreje nastajajo sami peroksidi. Sekundarne proizvode oksidacije razvrstimo v tri skupine:
- aldehidi, ketoni, mravljična kislina (značilen vonj po žarkem), - oksidacijske kisline,
- produkti polimerizacije.
Peroksidno število
Z njim določamo stopnjo oksidativnega kvara. Določanje peroksidnega števila je zelo delikatno, ponovljivost analize je slaba. Z napredovanjem kvara (nastajanjem sekundarnih produktov oksidacije) peroksidno število pada. Zato se moramo nujno posluževati tudi ostalih metod določanja kvara maščobe.
Peroksidno število se izraža na dva načina:
- kot število mg aktivnega kisika v 1 g maščobe ali
- kot število milimolov peroksida izraženega v 1 kg maščobe.
Slika 80: Določanje peroksidnega števila tudi s sodobnim titratorjem Vir:www.radiometer-analytical.com(10. 12. 2009)
Kreissova reakcija
Z njo dokazujemo drugo fazo oksidativnega kvara – nastanek epihidrinaldehida, ki ga dokažemo z barvno reakcijo z rezorcinom v benzolu ali floroglucinom v etru. Epihidrin je nosilec pozitivne reakcije v Kreissovi reakciji, značilen vonj žarkih maščob pa izhaja od heptilaldehida.
Število tiobarbiturne kisline (TBK)
S TBK testom ugotavljamo stopnjo oksidativnega kvara. Izraža se v miligramih malonaldehida v 1 kg maščobe. Določamo ga spektrofotometrično. Tiobarbiturna kislina daje rdeče obarvanje s sekundarnimi produkti oksidativnega kvara.
4.4.3 Določanje kemijskih in fizikalnih konstant
Število umiljenja
Je število mg KOH potrebnega za popolno umiljenje prostih in estersko vezanih maščobnih kislin v 1 g masti. Je značilna konstanta za posamezna olja in masti. Vrednost je odvisna od molekulske mase maščobnih kislin.
Estersko število
Je število mg KOH potrebnega za umiljenje estersko vezanih maščobnih kislin. Pri nevtralnih maščobah sta estersko število in število umiljenja enaka.
Določanje neumiljivih snovi
So nemaščobna sestava maščob. V vseh naravnih maščobah je količina neumiljivih snovi majhna od 0.2 do 2 %.
Jodno število
Izraža se s številom g joda, ki se veže na nenasičene maščobne kisline v 100 g masti ali olja.
Proste ali vezane nenasičene maščobne kisline imajo lastnost, da adirajo molekulo halogena na dvojno vez. Ker prosti klor in brom razen adicije vstopata še v reakcijo substitucije, uporabljamo za določanje jodnega števila jodov monoklorid (ali monobromid) v ustreznem topilu.
Slika 81: Avtomatski titrator za določanje jodnega števila Vir: www.metrohm.co.uk (10. 12. 2009)
Slika 82: Prikaz vezave joda na proste vezi v maščobnih kislinah in vrednosti jodnega števila za posamezne vrste maščob
Vir: http://www.hcc.mnscu.edu/chem/V.26/page_id_21002.html(10. 12. 2009)
Določanje indeksa refrakcije
Določamo ga refraktometrično. Z njim lahko dokažemo identiteto masti in olja.
4.4.4 Določanje sestave maščobe
Rastlinska olja in maščobe živalskega porekla imajo značilno sestavo maščobnih kislin in steroidov. Pri analizi maščob zato pogosto določamo maščobne kisline. Najprimernejši metodi za določanje sestave maščob sta plinska kromatografija in tekočinska kromatografija visoke zmogljivosti. Z njima lahko določimo sestavo vseh pomembnih živalskih in rastlinskih maščob od dveh do pet utežnih odstotkov natančno. Obe metodi sta uporabni tudi za ugotavljanje potvorb maščob.
4.4.5 Določanje pristnosti maščob
Za dokazovanje pristnosti maščob oz. ugotavljanje njihovih potvorb poznamo več metod:
• Ugotavljanje značilnih primesi v maščobah. Primer: holesterin se nahaja le v živalskih maščobah, α-/γ-tokoferol v sončničnem olju, α-/δ-tokoferol v sojinem olju.
• Dodatek rafiniranih olj naravnemu rastlinskemu olju dokažemo s snovmi, ki nastajajo pri rafinaciji. Primer: pri beljenju olj nastaja disterileter, med postopkom dezodoriranja pa dimeri in oligomeri triacilglicerolov in izomerna struktura linolne kisline.
• Določanje E-faktorja:
Določimo maščobno kislino na drugi poziciji in izračunamo razmerje le-te proti celotni molekuli. Določanje E-faktorja je primerno za ugotavljanje pristnosti oljčnega olja. Je neodvisen od geografskega izvora olja.
4.4.6 Holesterol
Spada med lipide. Kemično je sterol. V našem organizmu ima pomembne funkcije: iz njega nastajajo steroidni hormoni, vitamin D3 in žolčne kisline. Holesterol je tudi pomembna gradbena sestavina vsake celične membrane, ki se nahaja v lipofilnem delu dvojnega fosfolipidnega sloja. Sodeluje tudi pri vzdrževanju viskoznosti membran. Za razliko od trigliceridov in sfingolipidov se sterolni obroč v organizmu ne more razgraditi. Zato je za njegovo odstranitev iz organizma potrebna presnova v žolč in žolčne kisline, ki se izločajo v črevesju.
Holesterol se veže z beljakovinami – nastanejo lipoproteini, ki prenašajo holesterol in druge trigliceride v krvi po telesu:
Večina se ga veže v LDL (low density lipoproteins) – lipoproteini nizke gostote (vsebujejo veliko holesterola), ostanek pa v HDL (high density lipoproteins) – lipoproteini visoke gostote (vsebujejo večinoma beljakovine) in VLDL (very low density lipoproteins).
Holesterol je za organizem nujno potreben, vendar so prevelike količine holesterola v krvi škodljive, saj pospešujejo natanek ateroskleroze. Pri tem imata LDL in HDL holesterol različni vlogi. HDL holesterol imenujemo tudi “dobri” holesterol in ima zaščitno vlogo pri aterosklerotičnih procesih v nasprotju z LDL holesterolom, ki te procese pospešuje.
Vsebnost holesterola v živilu je zato pomemben podatek, posebno če gre za dietetično prehrano.
Poznane so številne metode določanja, ki se razlikujejo po načinu priprave vzorca in po kvantitativni meritvi pri določanju (kolorimetrične, kromatografske in encimske).
Kolorimetrične metode se razlikujejo po reagentu za razvijanje barve.
Za hitro določanje holesterola v mleku glej spletno stran:
http://jds.fass.org/cgi/content/abstract/81/11/2833
Slika 83: Strukturna formula holesterola
Vir: http://jds.fass.org/cgi/content/abstract/81/11/2833 (10. 12. 2009)
Več poiščite tudi na spletu:
http://www.hcc.mnscu.edu/chem/V.26/page_id_21002.html (10. 12. 2009)
4.4.7 Povzetek s preverjanjem znanja
Analitika maščob je zelo kompleksna in zavzema določanje količine, kvara, karakterističnih števil, vrste maščobnih kislin in pristnosti maščob. Klasična metoda za določanje količine maščob v živilu je ekstrakcija maščob z organskim topilom, med njimi je najpomembnejša metoda določanje količine maščob po Soxhletu. Pri maščobah določamo hidrolitičen kvar maščob (izražamo ga s kislinskim številom, kislinsko stopnjo in % oleinske kisline) in oksidativen kvar maščob (določamo ga kot peroksidno število ali s TBK testom). Med pomembnejša značilna števila pri analitiki maščob sodi še jodno število (z njim izražamo nasičenost oz. nenasičenost maščobnih kislin) in število umiljenja (je pokazatelj dolžine verig maščobnih kislin oz. molske mase maščobe). Za ugotavljanje vrste maščobnih kislin in pristnosti maščob se najpogosteje uporabljajo sodobne kromatografske tehnike (HPLC in GC kromatografija).
- Razložite pomen določanja maščob.
- Kaj so surove maščobe?
- Navedite topila za določanje maščob. Razmislite, na kaj vse moramo biti pozorni pri izbiri topila za ekstrakcijo maščobe?
- S katero metodo in kako bi določil količino maščob v čipsu?
- Kakšen kvar maščob poznate in kako ga določamo?
- Kaj nam pove jodno število in kaj število umiljenja?
- Zakaj je pomembno znanje o sestavi maščob in kako jo določamo?
- S katerimi metodami bi lahko določil pristnost rastlinskih maščob?
- Ali je smiselno določati količino holesterola v živalskih maščobah?