3.5.1 Izolacija DNK iz %istih kultur
3.5.1.1 Izolacija mikobakterijske DNK
Za izolacijo DNK iz #istih mikobakterijskih kultur (kadar izkoristek DNK ni bil pomemben) smo uporabljali kit SmartHelix. EZextract (Sekvenator d.o.o., Slovenija) po naslednjem modificiranem protokolu:
1. 100 do 500 µl kulture smo centrifugirali 5 min pri 10.000-g;
2. Odpipetirali smo supernatant in pelet resuspendirali v 100 µl SmartHelix.
EZextract me%anice z me%anjem na vorteksu;
3. Inkubirali smo v vreli vodi 15 min, nato pa ohladili na ledu (5 min);
4. Centrifugirali smo 10 min pri 10.000-g in 50 µl supernatanta prenesli v novo epico;
5. Tako pripravljeno DNK smo shranili na -20 °C do uporabe.
3.5.1.2 Izolacija amebne DNK
V primeru izolacije DNK iz ameb smo iz NNA plo%#e s klonalno populacijo ameb najprej izrezali ko%#ek agarja z ve#jo gostoto celic, ga potopili v 100 (l SmartHelix. EZextract me%anice in temeljito preme%ali na vorteksu. Ko%#ek agarja smo nato sterilno odstranili in izolacijo DNK nadaljevali s korakom 3, kot opisano v prej%njem poglavju.
3.5.2 Optimizacija protokolov za izolacijo mikobakterijske DNK iz okoljskih vzorcev V prvem koraku smo $eleli izbrati in prilagoditi ustrezno metodo, ki bi omogo#ala #im ve#je izkoristke izolacije mikobakterijske DNK. Za osnovo smo uporabili metodi SmartHelix. DNAid in SmartHelix. Classic (oboje od Sekventaor d.o.o., Slovenija). Obe metodi sta namenjeni za izolacijo DNK iz kompleksnih okoljskih vzorcev. Za primerjavo smo testirali tudi metodo Smarthelix. EZextract (Sekvenator d.o.o., Slovenija). Za testiranje izolacije DNK smo uporabili 0,5 ml teden dni stare kulture (OD~0,8) Mycobacterium avium podvrste avium (MAA), sev ATCC 25291 in za primerjavo 0,5 ml prekono#ne kulture (OD~1,1) Staphylococcus aureus.
Osnovni protokoli:
i) SmartHelix" DNAid kit
A. (Predpriprava vzorca) V 1,5 ml epice z navojem smo odpipetirali 0,5 ml bakterijske kulture, centrifugirali 5 min pri 10.000,g in odlili supernatant;
1. Dodali smo 400 µl D-stroyer pufra s proteinazo K in eno enoto SmartHelix.
steklenih kroglic, resuspendirali na vorteksu;
2. Stresali smo 2 min v stresalniku (ang. bead-beater) Mill Mix 20 (Tehtnica, SLO) na 30 Hz;
3. Inkubirali 15 min pri 56 °C;
4. Stresali 2 min v stresalniku Mill Mix 20 na 30 Hz;
5. Ponovili smo inkubacijo 15 min pri 56 °C in nato stresanje 2 min v stresalniku Mill Mix 20 na 30 Hz ;
6. Vzorce smo nato inkubirali v vreli vodi 10 min;
7. Ohladili na sobno temperaturo (ST) (v zamrzovalniku, 3 min) in centrifugirali 5
11. Filtrat smo zavrgli in na isto DNAid kolono dodali %e preostali vzorec, inkubirali 1 min na ST, centrifugirali 1 min na 16.000-g;
12. Filtrat smo zavrgli in dodali 600 µl W-pufra;
13. Centrifugirali 1 min na 16.000-g;
14. Filtrat smo zavrgli, dodali %e 500 µl W-pufra in centrifugirali 5 min pri 16.000-g;
15. Filtrat smo ponovno zavrgli in %e enkrat centrifugirali 1 min pri 16.000-g;
16. Kolone smo prestavili v nove 1,5 ml safe-lock epice, dodali 100 µl E-pufra in inkubirali 1 min na ST;
17. Centrifugirali 1 min na 16.000-g;
18. Eluirano DNK smo shranili pri -20 °C.
ii) SmartHelix" Classic kit
A. (Predpriprava vzorca) V 1,5 ml epice z navojem smo odpipetirali 0,5 ml bakterijske kulture, centrifugirali 5 min pri 10.000,g in odlili supernatant;
1. V epico z vzorcem smo dodali eno enoto steklenih kroglic, 300 µl raztopine Sol II in 375 µl raztopine Sol III ter dobro preme%ali na vorteksu;
2. Stresali smo 2 min v stresalniku Mill Mix 20 (Tehtnica, SLO) pri hitrosti 30 Hz;
3. Centrifugirali 5 min pri 10.000,g in zgornjo vodno fazo prenesli v novo 1,5 ml epico;
4. Stresanje smo ponovili %e 2-krat:
a. K vzorcu smo dodali 300 µl Sol II in 375 µl Sol III, vorteksirali in stresali 2 min v stresalniku Mill Mix 20 pri hitrosti 30 Hz;
b. Vsaki# smo prenesli zgornjo vodno fazo v zbiralno 1,5 ml epico;
5. Vodno fazo smo razdelili v ve# epic, tako da je bilo v vsaki maksimalno 500 µl;
6. Proteine smo dodatno odstranili z dodatkom 300 µl raztopine Sol III, vorteksirali in centrifugirali 5 min pri 10.000,g;
7. Supernatant smo prenesli v novo epico in dodali - volumna Sol IV in 2 volumna hladne Sol V, preme%ali z obra#anjem in inkubirali 1 h pri -20 °C;
8. Nato smo centrifugirali 30 min pri 16.000,g in 4 °C, previdno odlili supernatant in peletu dodali 750 µl raztopine Sol VI;
9. Centrifugirali smo 15 min pri 16.000,g in 4 °C, previdno odpipetirali supernatant, pelet pa posu%ili ob gorilniku (5-10 min);
10. Pelet smo resuspendirali v 30 µl raztopine Sol I.
Testirani protokoli v fazi optimizacije:
i) SmartHelix. Classic kit (Sekvenator d.o.o., Slovenija), po protokolu proizvajalca – oznaka SH;
ii) Smarthelix. Ezextract kit (Sekvenator d.o.o., Slovenija), po protokolu proizvajalca – oznaka EZ;
iii) SmartHelix. DNAid kit (Sekvenator d.o.o., Slovenija), po protokolu proizvajalca, vendar le z enkratnim (prvim po vrsti) stresanjem na stresalniku – oznaka SD1x;
iv) SmartHelix. DNAid kit (Sekvenator d.o.o., Slovenija), po protokolu proizvajalca – SD3x;
v) SmartHelix. DNAid kit (Sekvenator d.o.o., Slovenija), po protokolu proizvajalca, le da smo stresanje v stresalniku izvedli le enkrat, kot pod iii), namesto #i%#enja #ez kolone pa smo DNK o#istili s fenol-kloroform-izoamilalkoholom (FKI, 25:24:1, Sigma-Aldrich, ZDA) in DNK precipitirali z etanolom (EtOH), kot sledi;
1. Po koraku 8 osnovnega protokola smo dodali 300 (l FKI, vorteksirali in centrifugirali 5 min pri 10000-g. Supernatant smo prenesli v novo epico;
2. Nadaljevali smo s koraki 7-10 po protokolu Smarthelix Complex Samples DNA Extraction Kit;
Oznaka tega 'hibridnega' protokola je SD-SH;
vi) SmartHelix. DNAid kit (Sekvenator d.o.o., Slovenija), po protokolu proizvajalca, le da smo stresanje v stresalniku izvedli le enkrat, kot pod iii), supernatant iz koraka 8 pa smo pred #i%#enjem #ez kolone, o#istili %e s FKI, kot opisano pod v), to#ka 1 – oznaka SD1xFKI.
DNK iz kulture Staphylococcus aureus smo izolirali samo z metodami i), ii) in iii), DNK iz kulture MAA pa z vsemi metodami.
Izolirano DNK smo kvantificirali Qubit 1.0 fluorometrom z uporabo Quant-it DNA Assay kit, Broad Range (oboje od Life Technologies, Invitrogen, ZDA). Kvaliteto DNK smo preverili z gelsko elektroforezo na 1 % agaroznem gelu.
3.5.3 Izolacija DNK iz okoljskih vzorcev in govejega fecesa
3.5.3.1 Trdni vzorci in teko#inski vzorci, ki so vsebovali veliko suspendiranih delcev
!
Izolacijo iz trdnih vzorcev (npr. sediment, feces, biofilmi, itn.) in teko#inskih vzorcev, ki so vsebovali veliko suspendiranih delcev (npr. gnojnica, odpadne vode z biofilmi, itn.), smo izvedli po protokolu SmartHelix. DNAid kit (Sekvenator d.o.o., Slovenija).
Predpripravo vzorcev (A) smo izvedli na slede# na#in:
A. V 1,5 ml epice z navojem smo zatehtali okoli 0,5 g trdnih vzorcev (natan#no maso smo si zabele$ili). Teko#inske vzorce (1 ml), ki so vsebovali veliko suspendiranih delcev, pa smo najprej centrifugirali 5 min pri 10.000,g in odlili supernatant.
Nadaljevali smo s 1. korakom po protokolu proizvajalca.
3.5.3.2 Teko#inski vzorci, ki so vsebovali malo suspendiranih delcev
!
Izolacijo iz teko#inskih vzorcev, ki so vsebovali malo suspendiranih delcev (npr. voda iz napajalnikov, vodotokov, itn.), smo izvedli po protokolu SmartHelix. Classic kit (Sekvenator d.o.o., Slovenija).
Predpripravo vzorcev (A) smo izvedli na slede# na#in:
A. Vodne vzorce smo najprej filtrirali #ez sterilne filterske enote s PES filtri za enkratno uporabo (premer por 0,22 µm, Nalgene, Thermo Scientific, ZDA).
Volumen filtriranega vzorca smo si zabele$ili. Filter smo sterilno razrezali s
%karjicami in ga prestavili v dve 2 ml epico z navojem.
Nadaljevali smo s 1. korakom po protokolu proizvajalca.
3.5.4 Izolacija plazmidne DNK
Izolacijo plazmidov iz transformiranih E. coli smo izvedli z modificirano metodo alkalne lize (Sambrook in Russell, 2001):
1. Pozitivne transformante (po 2 transformanti na sklonirani gen) smo gojili preko no#i v 2 ml epicah v 1 ml LB goji%#a z ampicilinom (100 mg/l);
2. Centrifugirali 5 min pri 10.000-g in odlili supernatant;
3. Pelet smo resuspendirali v 100 µl ledeno hladne raztopine I (50 mM glukoza, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0);
4. Dodali smo 200 µl raztopine II (0,2 M NaOH, 1% NaDS (w/v)) in preme%ali z rahlim obra#anjem;
5. Dodali smo 150 µl ledeno hladne raztopine III (60 ml 5 M kalijev acetat, 11,5 ml glacialne ocetne kisline, 28,5 ml H2O), kjer je pri%lo do precipitacije, rahlo preme%ali z obra#anjem in pustili stati na ledu 5 min;
6. Nato smo centrifugirali 5 min pri 16.000-g pri 4 °C in supernatant prenesli v sve$o epico;
7. Dodali smo 2 volumna 96 % etanola in pustili precipitirati na 2 min na ST;
8. Centrifugirali smo pri 5 min pri 16.000-g pri 4 °C in odlili supernatant;
9. Dodali smo %e 1 ml 70 % etanola, preme%ali z obra#anjem in ponovno centrifugirali 5 min pri 16.000-g pri 4 °C;
10. Supernatant smo previdno odlili in ostanke popivnali s papirnato brisa#o, pelet pa posu%ili ob gorilniku (3-5 min);
11. Pelet smo resuspendirali v 50 µl deionizirane vode.