Mikobaktini pri bakterijah podvrste MAP

Ena izmed glavnih karakteristik, na podlagi katere se je v predgenomski eri izvajala identifikacija in lo#itev bakterij podvrste MAP od sorodnih mikobakterij, je bila odvisnost

od eksogeno dodanega mikobaktina na in vitro goji%#ih. Twort in Ingram sta leta 1912 prva uspela izolirati bakterijo podvrste MAP, vendar %ele potem, ko sta v goji%#e vklju#ila steriliziran preparat iz kulture Mycobacterium phlei. Kasneje so ugotovili, da je bil dejavnik, ki je omogo#al rast bakterij podvrste MAP, mikobaktin. Sprva so za gojenje bakterij podvrste MAP uporabljali mikobaktin iz bakterije M. phlei, kasneje pa so zaradi bolj u#inkovitega spodbujanja rasti za#eli pridobivati mikobaktin (tipa J) iz bakterije podvrste MAP, sev NADC 18 (ali ATCC 12227). Ta sev je domnevno izgubil odvisnost od mikobaktina v laboratorijskih pogojih in za#el proizvajati lasten mikobaktin (Merkal in McCullough, 1982). Kasneje se je izkazalo, da je bil sev napa#no klasificiran, genetske analize so pokazale odsotnost za MAP specifi#ne IS900, sev pa je bil na novo klasificiran kot bakterija podvrste MAH, serovar 2 (Chiodini, 1993). Nekatere %tudije navajajo izgubo odvisnosti od mikobaktina pri ve# sevih MAP po parih precepljanjih v laboratorijskih pogojih in zagovarjajo, da gre za fenotipsko in ne za genotipsko karakteristiko (Barclay in Ratledge, 1983). Vendar pa je navidezna neodvisnost od mikobaktina lahko posledica prenosa membransko zasidranega mikobaktina, kar omogo#a nadaljnjo rast MAP, kljub odsotnosti MB v sve$em goji%#u (Adúriz in sod., 1995; Lambrecht in Collins, 1992).

Zaenkrat ni znano, kaj je vzrok, da MAP ne proizvaja lastnega mikobaktina, kot tudi ne kako MAP pridobiva $elezo v okolju izven ali znotraj gostitelja in ali zato sploh potrebuje mikobaktin. Odsotnost mikobaktina pri MAP je lahko posledica okvar na razli#nih ravneh:

i) na genetski ravni gre lahko za mutacije v mbt operonih, ki vodijo do nefunkcionalnih biosinteznih encimov; ii) na transkripcijski ravni kot posledica spremenjene regulacije operonov za sintezo mikobaktina, bodisi zaradi mutacij v regulatornih in intergenskih regijah ali zaradi sprememb v izra$anju ter delovanju regulatorjev, ki vplivajo na transkripcijo mbt operonov, in iii) na post-transkripcijski ravni zaradi sprememb v dodatnih regulatornih dogodkih, ki vplivajo na stabilnost mRNK in translacijo genov za sintezne encime.

2.3.5.5.1 Primerjalna genomika in ohranjenost mbt operonov pri M. avium podvrste paratuberculosis

Primerjalna genomika ka$e na ohranjenost mbt operonov pri ve#ini mikobakterij z izjemo M. leprae, pri kateri so mbt operoni odsotni (Cole in sod., 2001). Kljub ohranjenosti se organizacija operona mbt-1 med vrstami razlikuje. Pri hitro rasto#ih mikobakterijah je ve#inoma ohranjeno zaporedje ABCDEFGH medtem ko lokacija, zaporedje in orientacija mbtI in mbtJ variira, kar je posledica genskih translokacij in inverzij (Chavadi in sod., 2011). Na kompleksno preurejanje operona in horizontalni prenos genov med vrstami ka$e tudi razporeditev mbt genov pri bakterijah M. marinum, M. ulcerans ter M. abscessus. Pri slednji je mbtE podvojen, manjka pa mbtJ, katerega vloga pri sintezi mikobaktina %e ni razjasnjena. Pri po#asi rasto#ih mikobakterijah iz filogenetske veje M. tuberculosis in M.

avium je ohranjen vrstni red IJABCDEFGH (Chavadi in sod., 2011) (Slika 10). M. avium podvrste imajo v primerjavi z M. tuberculosis mbtB gen razcepljen na dva ORF (manj%i ORF Chavadi s sod. ozna#uje kot mbtT, ker je ohranjen tudi pri ve#ini drugih mikobakterijah, vendar njegova vloga pri sintezi mikobaktina ni znana). Med mbtA in mbtJ pri M. avium podvrstah le$i insercija, ki je pri MAH velika okoli 196 kb, pri MAP pa 19 kb. Insercija pri M. avium podvrstah je tudi med mbtJ in mbtI (5,7 kb pri MAH in 6,6 kb pri MAP) (Li in sod., 2005).

Slika 10: Ohranjenost mbt-1 operona pri mikobakterijah v primerjavi s 16S rRNK filogenijo (Chavadi in sod., 2011: 5911)

Filogenetsko drevo (levo) je skonstruirano glede na zaporedje 16S rRNK.

Kljub ohranjenosti in enake organizacije mbt-1 operonov pri MAH in MAP, pa le slednja ne proizvaja mikobaktina, zato se pojavlja vpra%anje, #e in v kak%ni meri genetika prispeva k tej karakteristiki. Primerjave posameznih genov mbt-1 operona so pokazale, da je mbtA zaradi delecije genomskega odseka LSP4 in insercije 19 kb pri MAP skraj%an in kodira za protein iz 400 aminokislin (aa), medtem ko je mbtA pri MAH kodira za 551 aminokislin dolg protein (565 aa pri M. tuberculosis). Manjkajo#i del vsebuje ATP vezavni motiv, ki ima predvidoma vlogo pri aktivaciji salicilata v prvem koraku sinteze mikobaktinskega jedra. To bi lahko povzro#ilo nefunkcionalnost MbtA in posledi#no nesposobnost produkcije mikobaktina (Li in sod., 2005). Hibridizacijske analize genomov razli#nih sevov MAP so pokazale, da je genomski odsek LSP4 odsoten le pri govejih sevih MAP, medtem ko ov#ji sevi delecije nimajo, zaradi #esar je mbtA popolnoma ohranjen in enak kot pri MAH (Alexander in sod., 2009). To pomeni, da mbtA per se ne more biti odgovoren za okvaro v sintezi mikobaktina pri MAP, glede na to, da ov#ji sevi kljub intaktnemu mbtA ne proizvajajo mikobaktina. Poleg mbtA so v primerjavi z MAH razlike tudi v genih mbtE in mbtF. Prvi je pri govejih sevih MAP kraj%i in razdeljen na dva ORF, vendar naj bi vse katalitske domene padle v prvi ORF. Tudi mbtF je skraj%an pri MAP, vendar naj bi kljub temu %e vedno vseboval vsa katalitska mesta, ki jih vsebuje mbtF pri MAH (Chavadi in sod., 2011). Zaradi ohranjenosti vseh katalitskih mest, skraj%ana mbtE in mbtF pri MAP verjetno nista razlog za okvaro v sintezi mikobaktina. Za iskanje vzrokov okvare na genetski ravni so vsekakor potrebne dodatne genomske analize, ki bodo vklju#ile dodatne seve MAP, tako goveje kot ov#je (tipa I in III), ter primerjale tudi mbt-2 operone in druge gene, vpletene v pridobivanje $eleza z mikobaktini.

2.3.5.5.2 Transkripcijska aktivnost in regulacija mbt operonov pri M. avium podvrste paratuberculosis

Do sedaj je bilo objavljenih zelo malo %tudij o transkripcijski aktivnosti mbt operonov pri MAP. Zhu in sod. niso zaznali povi%anega izra$anja genov mbt operonov v 120 urah po infekciji govejih makrofagov z govejimi in ov#jimi sevi MAP. Pri dveh izmed treh testiranih sevov MAP so sicer zaznali povi%ano izra$anje homologov mbtB (MAP3742) in mbtH (MAP1872c), vendar pa noben izmed teh dveh homologov do sedaj ni bil impliciran v sintezi mikobaktina, prav tako nista regulirana z IdeR (Zhu in sod., 2008). Wu in sodelavci so zaznali povi%ano izra$anje mbtC gena v odziv na razli#ne stresorje in vitro (nizek pH, oksidativni in toplotni stres), vendar odziv na pomanjkanje $eleza ni bil analiziran (Wu in sod., 2007). Pred kratkim so Janagama in sod. pokazali, da je IdeR iz MAP (MAP2827) funkcionalen, t.j. se ve$e na prepoznavno mesto v promotorju mbtB, in ob pomanjkanju $eleza aktivira prepis iz mbt-1 in mbt-2 operona, v prisotnosti $eleza pa inhibira (Janagama in sod., 2010b; Janagama in sod., 2009). Aktivacija transkripcije mbtB z IdeR iz MAP je primerljiva aktivaciji z IdeR iz M. tuberculosis. IdeR iz ov#jih sevov vsebuje v primerjavi z IdeR iz govejih sevov substitucijo R91G, ki sicer ne vpliva na transkripcijo mbt operona (mbtB), povzro#a pa spremenjeno regulacijo bfrA. IdeR iz M.

tuberculosis in govejega seva MAP aktivira transkripcijo bfrA (z M. tuberculosis promotorjem) v prisotnosti $eleza, medtem ko IdeR iz ov#jega ne povzro#i sprememb v izra$anju. Interakcija ov#jega IdeR z ov#jim bfrA promotorjem celo inhibira transkripcijo bfrA v prisotnosti $eleza, ravno nasprotno kot pri M. tuberculosis in govejih sevih MAP.

Isti avtorji so pokazali tudi povi%ano izra$anje gena mbtE v #love%kih makrofagih, ki velja za okolje, kjer primanjkuje $eleza (Janagama in sod., 2009). Te raziskave nakazujejo, da je transkripcija z mikobaktinskih operonov (vsaj delno) aktivna in odzivna na $elezo, ne razkrivajo pa, kak%na je raven transkripcije in razmerje posameznih genov v primerjavi s sorodnimi mikobakterijami, ki proizvajajo mikobaktin, kot npr. bakterije podvrste MAH.

2.3.5.5.3 Proteomske analize izra!anja encimov za sintezo mikobaktina pri M. avium podvrste paratuberculosis

Janagama in sod. so poleg transkriptomske analize bakterij podvrste MAP v goji%#u z in brez $eleza izvedli tudi proteomsko analizo z iTRAQ metodo. Kljub temu, da so transkripcijske analize kazale povi%ano izra$anje genov mbt operonov v goji%#u 'brez'

$eleza, proteomska analiza ni potrdila povi%anega izra$anja nobenega izmed encimov za sintezo mikobaktina (Janagama in sod., 2010b). Tudi raziskave proteomov z metodo 2D elektroforeze niso zaznale sprememb v izra$anju Mbt proteinov med in vivo (nizka dostopnost $eleza) ter in vitro (visoka dostopnost $eleza) pogoji (Weigoldt in sod., 2011).

Le ena %tudija navaja MbtN (MAP1553c) kot enega izmed desetih proteinov s povi%anim izra$anjem in vivo pri ovcah s paratuberkulozo v primerjavi z in vitro proteomom (Hughes in sod., 2007).

3 MATERIAL IN METODE