POLIPLOIDNOST PRI KONOPLJI

V znanstveni literaturi so objavljeni štirje članki, ki opisujejo uspešno pridobivanje poliploidov pri navadni konoplji (Bagheri in Mansouri, 2015, Mansouri in Bagheri 2017; Parsons in sod., 2019; Kurtz in sod., 2020). Poliploidnost so večinoma sprožali z nanašanjem antimitotičnih sredstev, kot sta kolhicin in orizalin, na apikalne meristeme mladih poganjkov. Metode so se med raziskavami nekoliko razlikovale, kar je razloženo v nadaljevanju.

Prva sta se leta 2015 indukcije lotila Bagheri in Manosuri in sicer tako, da sta semena diploidne konoplje kalila v petrijevkah, na vlažnem filter papirju pri 25 °C ter jih nato presadila v substrat in gojila pri 18-urni fotoperiodi (18/6 ur svetloba/tema), na 24 °C ter jih zalivala 3 krat dnevno do cvetenja. Eksperiment so opravili v več delih in sicer so imeli kontrolni poskus, poskuse z različnimi koncentracijami kolhicina (0,1 % in 0,2 %) in tudi različne časovne dobe izpostavljenosti (24 ur, 48 ur). Za vsako koncentracijo in čas izpostavljenosti so uporabili 30 enako starih, mladih rastlin, na katere so na apikalni meristem nanesli 100 µl kolhicina določene koncentracije. S podaljševanjem časa in višanjem koncentracije kolhicina je vedno več rastlin propadlo. Stopnja preživetja si je sledila tako: 100 % za kontrolne rastline, 89,96 %, za rastline tretirane z 0,1 % raztopine kolhicina in 73,33 %, za tiste z 0,2 % raztopine kolhicina. Vsi primerki, ki so bili tretirani, so razvili poliploidno tkivo, miksoploidno (celice tkiva imajo različne ploidnosti) ali tetraploidno. Za indukcijo tetraploidov je bila najbolj optimalna koncentracija 0,2 % v trajanju 24 ur. Največ miksoplpidov pa je bilo pridobljenih pri 0,1%

koncentraciji in trajanju 24 ur. Za natančno določitev ploidnosti so se poslužili pretočne citometrije, s katero so naredili analizo količine dednega materiala. Vzorčili so 0,5cm² velike koščke pravih listov ter jih prelili s pufrom ter jih z britvijo nasekljali v petrijevki. Dobljeno suspenzijo so prefiltrirali in obarvali z barvilom DAPI ter analizirali s programsko opremo

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, 2021

5

Mode Fit, s katero so določali fluorescenčno intenziteto diploidov in potencialnih poliploidov.

Opazovali so pozicije vrhov na histogramu in iz tega preračunavali ploidnost. Dobili so dva očitna vrhova, ki sta bila na dveh različnih kanalih, tetraploidi pri 51,47 in diploidi pri 25,35. S temi podatki so razlikovali rastline glede na njihovo ploidnost, saj imajo tetraploidi 2 krat več dednega materiala od kontrolnih rastlin. V primeru miksoploidov pa sta se na histogramu pojavila dva vrhova. Po določeni ploidnosti s pretočno citometrijo so sledile biokemične meritve. Po dveh mesecih gojenja rastlin, so z njih odtrgali tretji list ter ga uporabljali za analizo.

Določevali so količino klorofila in karotenoidov s pomočjo Lichtenthaler-jevega testa. Opazili so, da ni razlik med dvema pigmentoma in so iz tega lahko sklepali, da ta lastnost ni pogojena s ploidnostjo. Razlike pri kopičenju pigmentov so bile samo v smislu antocianov, ki so se bolj izrazito kopičili pri diploidih. Poliploidi so izstopali pri količini flavonoidov, ki je bila pri miksoploidih skoraj 2 krat večja od diploidov, ti so vsebovali tudi večjo količino škroba.

Miksoploidi pa so diploide prekašali tudi v količini reducirajočih sladkorjev ter proteinov v listih. Preverili so tudi razlike v koncentraciji THC-ja, te pa so zopet bile opažene kot najvišje samo pri miksoploidih. Tudi CBD-ja je bilo največ v miksoploidih ter tetraploidih, za razliko od kontrolnih rastlin. Med vstopom rastline v reproduktivno fazo so zaznali padec v količini THC-ja v listih, ob istem času pa zaznali povišanje CBD-ja pri ženskih rastlinah. Zmanjšanje količine aktivnih snovi v poliploidih je lahko posledica zmanjšanega izražanja genov v primerjavi z diploidi. Največ THC-ja in CBD-ja so vsebovali miksoploidi, sledili so jim diploidi in na koncu tetraploidi, katerim se je vsebnost teh snovi zmanjšala. Zmanjšanje aktivnih snovi je lahko posledica zmanjšanega števila trihomov pri tetraploidih. Morfološki pregled je zajemal prečni prerez lista in ugotovili so, da je v listnem tkivu tetraploidov manj medceličnega prostora v listnem tkivu in da lahko to posledično privede do tolerance večje difuzije CO2-ja in zmanjšane fiksacije le tega, česar posledica je lahko manjša sinteza ogljikovih hidratov.

Indukcija poliploidnosti je tudi vodila do 53 % zmanjšanja količine celuloze, kar je posledica večje površine celic in manjše količine le teh pri poliploidih. V celičnih stenah so imeli tetraploidi manj celuloze in zato je prišlo tudi do fizikalnega odstopanja od kontrolnih rastlin (Bagheri in Mansouri, 2015).

V drugi študiji istih avtorjev (Mansouri in Bagheri, 2017) so se pridobivanja poliploidov lotili na način tretiranja apikalnega meristema s kolhicinom. Tretitrali so 60 rastlin, starih en teden, vzgojenih iz tkivnih kultur. Antimitotsko snov so nanesli na vsako rastlino (100 µl), v treh različnih koncentracijah: 0 %, ki je bila slepa kontrola, 0,1 % in 0,2 %. Te koncentracije so na rastline nanašali v 6-urnih intervalih ter jih tretirali za 24 ali 48 ur. Vse tretirane rastline so nato gojili pod enakimi pogoji. Zelo pomembno je tu opomniti, kako pomembno vlogo imajo koncentracija kolhicina, trajanje izpostavljenosti, vrsta rastline in prodornost rastlinskega tkiva ali je velika ali majhna. Ti faktorji imajo vpliv na učinkovitost sprejema kemikalij in na odstotek meristematskih celic, ki posledično povečajo število kromosomov. Najmanjši propad rastlin so opazili pri kontroli, ki se s časom tretiranja pričakovano ni spremenila. Sledila je stopnja preživetja s tretiranjem z 0,1 % raztopino kolhicina, ki se s podaljšanjem časa ni spremenila, bila je 89 do 96 %. Čas izpostavljenosti je močno vplival na rastline tretirane z 0,2 % raztopino

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, 2021

6

kolhicina. Pri 24-urnem tretiranju je bila stopnja preživetja 73,33 %, še bolj pa je padla, ko so čas tretiranja podvojili na 48 ur, takrat je bila samo 63,33 %. Ploidnost so potrdili s pretočno citometrijo, katero so izvedli 50 dni po tretiranju. Enako kot pri zgodnejši študiji (iz leta 2015), so tudi tukaj vzorčili 0,5 cm² velike koščke listov, katere so skupaj s pufrom za lizo jedra, nasekljali v petrijevki, suspenzijo prefiltrirali in obarvali z DAPI barvilom. Z opremo Mode Fit so izdelali histogram, na katerem so zasledili 2 vrhova, indikatorja poliploidnosti. Vrh diploidov je bil uporabljen kot standard za primerjavo diploidov in potencialnih tetraploidov. Zanimivo je bilo, da pri tretiranju z 0,2 % kolhicinom ni prišlo do nobenih himer. Največ tetraploidov (43,33 %) pa je nastalo s koncentracijo 0,2 % pri izpostavitvi za 24 ur, z višanjem koncentracije kolhicina in podaljševanjem časa izpostavljenosti je odstotek padal. Tretieane rastline so opazovali tudi med prehodom v fazo cvetenja, ki je pri ženskih tetraploidih nastopila kar 2 tedna pred diploidi. Isti čas, to je med cvetenjem, so opazovali tudi biokemične parametre in njihovo odvisnost od ploidnosti. Ugotovljeno je bilo, da se je količina THC-ja povečala samo pri miksoploidih ali himerah, v reproduktivni fazi tetraploidov pa je ta močno upadla. Vsebnost CBD-ja se je pri miksoploidih in tetraploidih povečala. Upadla je tudi količina drugih kanabinoidov, saj so imeli tetraploidi ponovno zmanjšano število trihomov (enako kot pri študiji iz leta 2015). Izmerjena je bila še vsebnost proteinov, ki je bila največja pri miksoploidih,. Miksoploidi so bili tudi prevladujoči v količini topnih sladkorjev, ki je bila skoraj 2 krat večja od diploidov, tetraploidi so jih imeli najmanj (41 % manj kot kontrole).

Pričetek odbire rastlin po morfoloških znakih se je začela približno 2 meseca kasneje, po razvoju 5 do 6 pravih listov. Ugotovitve so bile sledeče in sicer, da so tetraploidi imeli krajše liste s povečano širino za razliko od diploidov, zaradi tega je prišlo do razlik pri listnem indeksu, ki je bil pri tetraploidih skoraj pol manjši kot pri diploidih (2,68 in 4,47). Opažene so bile tudi očitne razlike v višini stebel med rastlinami, pri čemer so bili tetraploidi nižji in so imeli skoraj 2 krat večje moške cvetove, kot kontrolne rastline (1,1 cm in 0,4 cm). Opravili so tudi prečni prerez listov iz rastlin obeh ploidnosti in ugotovili, da so celice stebričastega in žilnega tkiva tetraploidov večje ter je med njimi manj medceličnega prostora, prerezali so tudi steblo in potrdili, da imajo tetraploidi debelejše ksilemsko tkivo. Po opazovanju rastlin glede na morfološke znake so se osredotočili še na velikost celic zapiralk in spremljevalk, kar je tudi dober pokazatelj ploidnosti. Lotili so se preverjanja, ko je imela konoplja že razvite prave liste, vzorčili so nižje liste. Na površino listov velikosti 5 mm krat 10 mm površino listov so nanesli prozoren lak za nohte in počakali, da se le-ta posuši. Posušeni lak, na katerega se je prilepila spodnja povrhnjica, so nato odstranili in si jo ogledali pod svetlobnim mikroskopom pri 100x in 400x povečavi. Ugotovitve so temeljile na tem, da imajo tetraploidi večje celice listnih rež kot diploidi in je že to precej zanesljiv znak, na podlagi katerega so lahko ločili diploide od tetraploidov (Mansouri in Bagheri, 2017).

Parsons in sod. (2019) pa so se procesa indukcije lotili malo drugače in sicer tako, da so nabirali nodije stebla z mladimi aksilarnimi brsti brez razvitih lističev. Te vzorce so pridobili iz znanih matičnih rastlin, gojenimi pod enakimi pogoji, da nebi prišlo do sprememb. Steblo so odrezali pod kotom 45 stopinj in pustili 5 mm dolžine nad brstom. Izsečke so nato sterilizirali v 2 %

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, 2021

7

raztopini natrijevega hipoklorita in 0,1 % raztopini Tween-20. Pred nanosom na sterilno gojišče so izsečke še 3 krat spirali s sterilno destilirano vodo. Sterilne brste so gojili v steklenih posodah na rastnem gojišču MS (Murashige in Skoog), kateremu so dodali še saharozo in rastne regulatorje. Aksilarne brste so tretirali z orizalinom tako, da so jih inokulirali v gojišča z različnimi koncentracijami orizalina . Koncentracije so si sledile: 0, ki je bil kontrolni poskus, 50, 100 in 150 µM (0,0017318 %, 0,0034636 % in 0,0051954%). Opravili pa so še drugi poskus z drugačnimi koncentracijami: 20, 40 in 60 µM (0,00069272 %, 0,00138544 %, 0,00207816

%). Gojišče za rastline so pripravili tako, da so razredčili MS mešanico makro- in mikroelementov in tretirane kulture prekrili s folijo, da nebi prišlo do svetlobne degradacije orizalina. Gojišča s kulturami so dali za 24 ur na stresalnik in po koncu 3 krat spirali z destilirano vodo in biocidom. Po 1 do 5 mesecih so opazili poganjke in jih subkultivirali na svežem gojišču.

Večje rastline so premestili v večje posode in čakali 3 do 5 tednov do ukoreninjanja vseh. Vse vzorce so bile inkubirane pri 24 °C na fluorescentni svetlobi. Rastline, ki so dobro razvile koreninski sistem, so presadili iz gojišča v rastni substrat z mikoriznimi glivami ter jih postavili na temperaturno in svetlobno stabilno območje s stalno zračno vlago. Konoplja je rastla pod belimi fluorescentnimi lučmi, z 18-urno fotoperiodo. Po razvoju vsaj treh listov, so z vsake rastline vzorčili enega z namenom testiranja ploidnosti in naprej gojili domnevne poliploide.

Na enak način, kot pri prejšnjih dveh opisanih raziskavah, so tudi tukaj opredelili ploidnost s pretočno citometrijo. Tega so se lotili tako, da so nabrane liste iz matičnih rastlin shranili med vlažnimi papirnatimi brisačami na ledu za 24 ur pred analizo. Iz listov so vzorčili 0,5 cm² velike koščke, katere so skupaj s pufrom nasekljali v petrijevki, nato prefiltrirali in barvali s propidijevim jodidom za 30minut. Ploidnost oziroma količino DNA v jedru so izmerili s pretočnim citometrom Gallios in kot standard uporabljali diploidne vzorce redkve. Vsebnost DNA so določili s prisotnostjo fluorescentnih vrhov na dobljenem histogramu. Dokazali so lahko, da so bile vse tretirane rastline poliploidizirane, še vedno pa je bil največji izplen miksoploidov. Od vseh tretiranj so se najbolj izkazali primerki inducirani s 40 µM in 20 µM orizalina, glede na preživetveno stopnjo in uspešnostjo poliploidizacije. Vsebnost različnih kanabinoidov so izmerili tudi pri tej študiji poliploidizacije z orazilinom in sicer tako, da so posušili material rastlin (liste in brste) in ga homogenizirali ter 0,5 g le tega zmešali z ekstrakcijsko raztopino. Dobljene vzorce so nato ultrazvočno obdelali in prefiltrirali. THC in CBD sta glavna kanabinoida, ki ju v konoplji najdemo v kislinski obliki (COOH). S HPCL analizo so določili, da je bila količina obeh pri različnih ploidih drugačna. Majhna razlika je bila v količini CBD-ja, saj so ga diploidi vsebovali 8,9 % več kot tetraploidi tetraploidi, ni pa bilo opaznih razlik pri THC-ju. Izmerjena je bila tudi vsebnost terpenoidov in sicer so jih tetraploidi imeli v listih več, za kar 71,5 %, kar bi pomenilo 8,8 mg/g vseh terpenoidov in je ekvivalentno vsebnosti terpenoidov v brstih diploidov. Tudi pri tej raziskavi so enako kot pri prejšnji raziskavi avtorjev Bagheri in Mansouri (2015) opravili štetje trihomov. Dva tedna pred vzorčenjem so na listih konoplje izvedli opazovanje. Na rastlinah diploidnega in tetraploidnega značaja so izbrali tri poganjke in odtrgali četrti list od vrha navzdol. Dele listov so si ogledali pod mikroskopom, na 10-kratni povečavi ter izračunali gostoto trihomov. Tetraploidni listi so imeli 40,4 % več trihomov, kot kontrolne rastline, vendar ni pa bilo nobene razlike v njihovi

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, 2021

8

zrelosti, saj so vsi bili 2 tedna pred vzorčenjem še v mlečnem stadiju. Poleg trihomov pa so opazovali še ostale morfološke znake. Študija je temeljila na opazovanju rastnih parametrov di in tetraploidnih potaknjencev iz matičnih rastlin. Pripravili so 15 potaknjencev iz vsake rastline in jih gojili pod stabilnimi pogoji do uspešnega ukoreninjanja. Po treh tednih je bilo ukoreninjenih 60 % tetraploidnih in 100 % diploidnih potakjencev, pri tetraploidnih so opazili zakasnjen pojav korenin. Kasneje so jih presadili ter osvetljevali z belimi fluorescentnimi lučmi na 18-urni fotoperiodo. Po 5 tednih so pridobili 9 do10 zdravih potakjencev, ki so bili primerni za opazovanje. Med procesom gojenja so potakjence optimalno gnojili, vršičkali in pincirali ter presajali. Rastne parametre so merili 1-krat tedensko, in sicer velikost listov, ki so bili pri tetraploidih za 0,75 cm širši, dolžino in širino stebel, ki sta bili pri tetra in diploidih skozi rast podobni, med rastno dobo pa so imeli tetraploidi malo krajše lateralne poganjke. Tako diploidni kot tudi tetraploidni potakjenci so zacveteli ob istem času, to je en teden po izpostavitvi kratkemu dnevu, tudi rast je bila skozi celo obdobje podobna. Pri indukciji z orizalinom jih je tudi zanimala velikost listnih rež. Tudi tukaj so uporabljali metodo laka za nohte in si pod 40-kratno povečavo ogledali 8 vidnih polj, na katerih so prešteli število listnih rež. Na vsaki sliki so si izbrali še 3 specifične listne reže ter izmerili dolžino celic spremljevalk. Kot pričakovano je bila velikost listnih rež tetraploidov večja kot pri diploidih, vendar je pa bila gostota manjša.

Diploidi so imeli več listnih rež na enako površino lista (Parsons in sod., 2019).

Pri zadnjem eksperimentu, objavljenem leta 2020, pa so Kurtz in sod. izvedli dva poskusa pri katerih so želeli pridobiti triploide. Pri prvem so tretirali pred-kaljena semena (določenih sort), katera so namakali v vodi in jih kalili v petrijevki na papirju ovlaženem s kolhicinom koncentracij 0,02 % ali 0,05 %, pri 3 dolžinah: 6 ur, 12 ur in 24 ur, da bi s tem določili najboljšo časovno periodo pri kateri nastanejo tetraploidi. Za kontrolo so tretirali semena samo z vodo.

Pri drugem poskusu pa so uporabili pred-kaljena semena (drugih, bolj priljubljenih sort), ki so jih tretirali s kolhicinom koncentracije 0,05 % za 12 ur. To so počeli, ker so imeli omejene zaloge semen priljubljenih sort in so se želeli izogniti velikemu številu miksoploidov. Po nanašanju kolhicina so semena sprali s sterilno vodo ter jih posejali v substrat na globino 6 do 8 mm. Pri obeh eksperimentih so rastline gojili pod enakimi pogoji v rastlinjaku pri 21 °C dnevne in 17 °C nočne temperatutre ter 18-urni fotoperiodi, po potrebi so jih tudi fertigirali. Po 10-ih dneh po sajenju so bili vidni prvi sejanci iz substrata. Triploide so pridobivali s križanjem tetraploidnih in diploidnih potakjencev ženskega spola, iz obeh poskusov. Tri potakjence, pridobljene iz dveh tetraploidnih rastlin, so izpostavili kratkemu dnevu (12 ur svetlobe, 12 ur teme) pri temperaturi 21 °C podnevi in 17 °C ponoči ter na ta način inducirali cvetenje. To so ponovili tudi s štirimi diploidnimi potakjenci, pod enakimi pogoji. Diploidne rastline so tretirali s srebrovim-tiosulfatom, da bi tako inducirali razvoj moških cvetov. Ko so dobili prve moške cvetove diploidov, so z njimi oprašili tetraploidne materne rastline. Morebitna triploidna semena so se začela razvijati po prvih dveh tednih po oprašitvi. Iz tetraploidnih maternih rastlin so pridobili 20 zrelih semen in jih površinsko sterilizirali z natrijevim-hipokloridom. Iz 20-ih semen so uspeli pridobiti samo 7 embrijev, ki so uspešno vzklila in vitro ter jih subkultivirali na rastnem gojišču. Kasneje so malo večje rastline presadili ex vitro v kocke kamene volne.

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, 2021

9

Dobili so le 4 ukoreninjene rastline, ki so jih presadili v rastni substrat in aklimatizirali v rastlinjaku, pri dolgodnevni fotoperiodi. V prvem eksperimentu so dobili samo 5 tetraploidov, 3 od teh so se tvorili po tretiranju z 0,02 % kolhicinom za 12 h. Iz tega obravnavanja so dobili tudi 2 miksoploida. Ostala dva tetraploida pa so dobili iz tretiranja z 0,05 % kolhicinom za 6 h in 12 h. S tretiranjem z 0,05 % pri 6 h, so dobili še 3 miksoploide, pri 12 urnem tretiranju pa ni bilo regeneriranega nobenega miksoploida. Indukcija tetraploidnosti se je gibala med 26 in 64

%, odvisno od sorte. Pri 2. eksperimentu, se je tvorilo kar 39 tetraploidov. Prvi eksperiment je bil manj uspešen, verjetno zaradi slabše kakovosti semen. Pri drugem pa so uporabili semena boljše kakovosti in je zato prišlo do boljšega genotipskega odziva na kolhicin ter posledično več tetraploidov. Pri tej študiji, od vseh zgoraj navedenih, je bila produkcija tetraploidov najbolj uspešna. Vsebnost DNA v jedru celic so potrdili s pretočno citometrijo. Vzorčili so 50 mg mladih listov, katere so nasekljali v pufru. Zmes so prefiltrirali in centrifugirali, da je nastala usedlina ter jo resuspendirali v barvilu za barvanje jedra (propidijev jodid). S pretočnim citometrom so izmerili relativno fluorescenco količine DNA ter podatke prikazali s histogramom. Za določitev ploidnosti so vrhove histogramov morebitnih tetra in triploidov primerjali z vrhovi diploidov. Določili so, da je bila količina DNA-ja pri tetraploidih za 96 % večja kot pri diploidih. Triploidi so imeli v povprečju 40 % več DNA-ja od diploidov in 40 % manj od tetraploidov. Rastline so že na zunanji izgled kazale znake različnih ploidnosti.

Rastline tretirane s kolhicinom so bile očitno manjše od kontrolnih. Kalčki, ki so bili tretirani z 0,02 % za 24 h in tisti, ki so bili tretirani z 0,05 % raztopino kolhicina, so bili 10 dni po vzklitju krajši od 1 cm in so imeli zadebeljene hipokotile in kotiledone. Nekateri embrii po vzklitju sploh niso mogli razviti epikotila in so zato propadli. Pri koncentraciji 0,02 % so s podaljševanjem časa imeli vedno nižje rastline. Enako kot pri vseh eksperimentih opisanih do zdaj, so tudi v tem z metodo laka za nohte potrdili da se velikost listnih rež s ploidnostjo veča, njihova gostota pa manjša. Avtorji so razložili, da so lahko povečane listne reže pri tetra in triploidih posledica povečanega števila genomov, ki so prisotni pri poliploidih. Metoda z indukcijo triploidov je relativno nova in na konoplji ni bila velikokrat preizkušena ter so zato potrebne nadaljnje študije, ki bi bolj natančno opisale dobljene triploidne rastline. Bila pa je že temeljito preizkušena na hmelju, kjer so dobili triploide, ki dajejo večji pridelek z večjo vsebnostjo alfa-kislin. Iz teh ugotovitev na hmelju se sedaj tudi sklepa, da bi lahko tudi pri konoplji lahko dobili podobne rezultate v smislu pridobivanja sekundarnih metabolitov (Kurtz

Rastline tretirane s kolhicinom so bile očitno manjše od kontrolnih. Kalčki, ki so bili tretirani z 0,02 % za 24 h in tisti, ki so bili tretirani z 0,05 % raztopino kolhicina, so bili 10 dni po vzklitju krajši od 1 cm in so imeli zadebeljene hipokotile in kotiledone. Nekateri embrii po vzklitju sploh niso mogli razviti epikotila in so zato propadli. Pri koncentraciji 0,02 % so s podaljševanjem časa imeli vedno nižje rastline. Enako kot pri vseh eksperimentih opisanih do zdaj, so tudi v tem z metodo laka za nohte potrdili da se velikost listnih rež s ploidnostjo veča, njihova gostota pa manjša. Avtorji so razložili, da so lahko povečane listne reže pri tetra in triploidih posledica povečanega števila genomov, ki so prisotni pri poliploidih. Metoda z indukcijo triploidov je relativno nova in na konoplji ni bila velikokrat preizkušena ter so zato potrebne nadaljnje študije, ki bi bolj natančno opisale dobljene triploidne rastline. Bila pa je že temeljito preizkušena na hmelju, kjer so dobili triploide, ki dajejo večji pridelek z večjo vsebnostjo alfa-kislin. Iz teh ugotovitev na hmelju se sedaj tudi sklepa, da bi lahko tudi pri konoplji lahko dobili podobne rezultate v smislu pridobivanja sekundarnih metabolitov (Kurtz