INDUKCIJA POLIPLOIDNOSTI PRI NAVADNI KONOPLJI (Cannabis sativa L.) IN HMELJU (Humulus lupulus L.)

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO

Ana ABERŠEK

INDUKCIJA POLIPLOIDNOSTI PRI NAVADNI KONOPLJI (Cannabis sativa L.) IN HMELJU (Humulus

lupulus L.)

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO

Ana ABERŠEK

INDUKCIJA POLIPLOIDNOSTI PRI NAVADNI KONOPLJI (Cannabis sativa L.) IN HMELJU (Humulus lupulus L.)

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja

INDUCTION OF POLYPLOIDY IN HEMP (Cannabis sativa L.) AND HOP (Humulus lupulus L.)

B. SC. THESIS Academic Study Programmes

Ljubljana, 2021

(3)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, 2021

II

Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Kmetijstvo – agronomija. Delo je bilo opravljeno na Katedri za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin.

Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorja diplomskega dela imenovala izr. prof.

dr. Jana Murovec.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: red. prof. dr. Dominik VODNIK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: izr. prof. dr. Jana MUROVEC

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Marko FLAJŠMAN

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo

Datum zagovora:

(4)

III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1

DK UDK 631.528:631.528.2:633.522:633.791(043.2)

KG poliploidnost, tetraploid, triplodi, konoplja, hmelj, sekundarni metaboliti, kolhicin, orizalin, kromosomi

AV ABERŠEK, Ana

SA MUROVEC, Jana (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Univerzitetni študijski program prve stopnje Kmetijstvo - agronomija

LI 2021

IN INDUKCIJA POLIPLOIDNOSTI PRI KONOPLJI IN HMELJU in vitro TER in vivo TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja)

OP VI, 20 str., 2 sl., 31 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Za poliploidne rastline je značilno, da imajo zaradi pomnoženih kromosomov zmožnost utišanja ali izražanja novih genov, ki boljše vplivajo na rast, razvoj in druge lastnosti rastline. Na primeru konoplje (Cannabis sativa L.) in hmelja (Humulus lupulus L.), katera se gojita večinsko za uporabo sekundarnih metabolitov, ima indukcija poliploidnosti velik pomen. Konoplja se po svetu prideluje v medicinske namene za pridobivanje kanabinoidov CBD-ja in THC-ja. Slednji ima psihoaktivne učinke in zaradi tega večina držav na svetu konopljo uvršča med ilegalne droge. Z indukcijo poliploidnosti lahko mi povečamo ali zmanjšamo vsebnost določenih kanabinoidov ter tako omogočimo bolj ekonomično pridelavo. Pri hmelju je podobno in sicer so glavni pridelek ženska socvetja, s prisotnostjo alfa-kislin, katera se uporabljajo v pivovarski industriji. Z indukcijo poliploidnosti, specifično triploidnosti, lahko pridelujemo partenokarpa socvetja, katera ni potrebno predčasno tretirani z raznimi substancami, z namenom odstranitve semen, ki bi znižala ekonomsko vrednost in okus pridelka. Namen diplomskega dela je predstavitev do sedaj uporabljenih metod indukcije poliploidnosti pri teh dveh vrstah.

(5)

IV

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1

DC UDC 631.528:631.528.2:633.522:633.791(043.2)

CX polyploidy, tetraploid, triploid, hemp, hop, secundary metabolites, colchicine, oryzalin, chromosomes

AU ABERŠEK, Ana

AA MUROVEC, Jana (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Academic Study Programmed in Agriculture - Agronomy

PY 2021

TI INDUCTION OF POLYPLOIDY IN HEMP AND HOP in vitro AND in vivo DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)

NO VI, 20 p., 2 fig., 31 ref.

LA sl AL sl/en

AB Polyploid plants are characterized by the ability to use or express new genes, which have a beneficial influence on the growth, development and other characteristics of the plant, due to the multiplied chromosomes. In the case of cannabis (Cannabis sativa L.) and hops (Humulus lupulus L.), which are grown mostly for the use of secondary metabolites, the induction of polyploidy is of great importance. Cannabis is grown worldwide for medical purposes to obtain cannabinoids CBD and THC. The Latter has psychoactive effects and as a result most countries in the world classify cannabis as an illegal drug. By inducing polyploidy, we can increase or decrease the content of particular cannabinoids to enable more economical farming. In the case of hops, it is similar, the main yield are female inflorescences, which contain alpha-acids, that are used in the brewing industry. By inducing polyploidy, especially triploidy, we can grow parthenocarpic inflorescences, which do not need to be prematurely treated with various substances, to remove seeds, which would reduce the economic value and taste of the crop. The aim of the thesis is to present techniques that have been used to induce poliploidy in cannabis and hop.

(6)

V

KAZALO VSEBINE

Str.

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO SLIK ... VI

1 UVOD ... 1

1.1 NAMEN NALOGE ... 1

2 SPLOŠNO O POLIPLOIDIH ... 2

3 KONOPLJA ... 3

3.1 POMEN KONOPLJE ... 3

3.2 POLIPLOIDNOST PRI KONOPLJI ... 4

4 HMELJ ... 10

4.1 POMEN HMELJA ... 11

4.2 POLIPLOIDI PRI HMELJU ... 12

5 ZAKLJUČEK ... 17

6 VIRI ... 18

(7)

VI KAZALO SLIK

Str.

Slika 1: Primerjava diploidnega (A) in tetraploidnega (B) lista, z odtisi abaksialnih strani z listnimi režami (Parsons in sod., 2019) ... 10 Slika 2: Primerjava tetraploidnih in diploidnih cvetov (A), storžkov (B) in listov (C) (Trojak- Goluch in Skomra, 2013) ... 17

(8)

1 1 UVOD

Poliploidnost je stanje organizma, katerega celice v jedru vsebujejo več kot dve garnituri kromosomov. Ta pojav lahko izvira iz naravnih mutacij ali iz umetne indukcije z raznimi kemičnimi pripravki, kot so antimitotska sredstva in herbicidi. V rastlinskem svetu so poliploidi nekaj vsakdanjega, saj se je skozi evolucijski razvoj število kromosomov konstantno spreminjalo in posledično utišalo ali izrazilo nove gene, ki so omogočili preživetje v spreminjajočem se okolju.

V današnjem času so poliploidi zelo zanimivi iz žlahtniteljskega pogleda, saj so za njih značilne razne zaželene karakteristike, kot so močnejši vigor, večja biomasa, sterilnost plodov in podobno. Za produkcijo le teh so se skozi zgodovino razvijale in izpopolnjevale razne tehnike.

Konoplja je ena izmed najstarejših gojenih rastlin, ki se že 5000 let uporablja v medicinske in prehranske namene ter kot vir naravnih vlaken za pridobivanje tekstila. V primeru konoplje so zelo zaželjene spremembe pri vsebnosti kanabinoidov, kot sta THC (tetrahidrokanabinol) in CBD (kanabidiol). S podvajanjem genoma so posledično zmanjšali količino THC-ja, ki loči legalno industrijsko konopljo od marihuane. Zaželjena pa je bila večja vsebnost CBD-ja, ki se danes uporablja za različne namene. Poleg sekundarnih metabolitov pa indukcija poliploidnosti pri konoplji spreminja tudi njen zunanji izgled in hitrost razvoja, kar je lahko za pridelovalca ključnega pomena.

Hmelj je popularna kulturna rastlina, katere uporaba sega daleč v zgodovino. Od nekdaj se že uporablja v pivovarski industriji, zaradi grenkega okusa, pridobljenega iz mehkih smol. Enako kot pri konoplji so tudi pri hmelju zaželeni poliploidi, specifično triploidi. Proces indukcije v večini primerov temelji na antimitotskih sredstvih in nadaljnjem križanju. Enako so pri hmelju poliploidi zaželeni zaradi izboljšanih rastnih in biokemičnih lastnosti ter kakovosti pridelka. Za lažje pridelovanje se lahko ustvarjajo rastline, ki potrebujejo za rast manjše površine in ki dajejo večji pridelek, brez neželenih stranskih produktov, kot so semena v ženskih socvetjih.

1.1 NAMEN NALOGE

Namen diplomskega dela je predstaviti moderne tehnike pridobivanja poliploidnih različic hmelja in konoplje ter kako se pomnoženo število kromosomov v jedru odraža na morfologiji, fiziologiji in biokemični strukturi socvetij. Želim poudariti, katere so najboljše koncentracije in časovne periode, katerim izpostavljamo rastline za najbolj optimalen izplen poliploidov.

Poliploidnost pa omogoča bolj ekonomično in okolju prijazno kmetovanje s kulturnimi rastlinami, kot sta hmelj in konoplja.

(9)

2 2 SPLOŠNO O POLIPLOIDIH

Poliploidnost je stanje, kjer ima organizem več kot dve garnituri kromosomov v svojem jedru (Touchell in sod., 2020). Večinoma so organizmi diploidni, kar pomeni da imajo dva para kromosomov in vsakega so podedovali od enega od staršev. Poliploidnost se nanaša na nepravilno podvajanje posameznega genoma v procesu mitoze, čemur rečemo avtopoliplodija, ali na kombinacijo dveh ali več različnih genomov, čemur pravimo alopoliploidija, s katero se ustvari nova vrsta. Od poliploidnih kvasovk, haploidnih moških mravelj in čebel, tetraploidnih sort navadne zlate ribice do oktoploidne jagode, spremembe ravni ploidnosti in števila kromosomov so presenetljivo pogosta značilnost življenja na Zemlji. Še vedno pa se poliploidnost najbolj množično pojavlja pri rastlinah, za razliko od živali in gliv (Nadon in Jackson, 2019).

Podvajanje genoma oziroma poliploidizacija je igrala veliko vlogo pri evoluciji višjih rastlin, še posebej pri kritosemenkah, za katere je pričakovano, da jih večina izvira iz poliploidnih prednikov. Moderni rastlinski genom nosi dokaze o več stopenjski poliploidizaciji skozi čas ter posledičnem utišanju določenih genov, povečani heterozi, naklonjenosti mutacijam in fenotipski plastičnosti (Touchell in sod., 2020).

Zaradi vseh pozitivnih lastnosti, ki so se odražale skozi evolucijo, so znanstveniki pri rastlinah začeli razvijati metode umetne indukcije poliploidnosti. Manipulacija ploidnosti je zelo pomembno orodje pri žlahtniteljskih programih. Posledice podvajanja genoma lahko vključujejo večje in debelejše rastlinske organe, temnejše liste, daljše obdobje cvetenja z debelejšimi venčnimi listi, izboljšan vigor, povečano velikost listnih rež ter boljšo produkcijo sekundarnih metabolitov, kar lahko vodi do tolerance na biotski in abiotski stres. Poleg dobrih posledic lahko organizem izraža tudi slabe, kot je na primer aneuploidnost, kjer ima osebek v celicah nepravilno število kromosomov (Parsons in sod., 2019).

Vključitev poliploidov v žlahtniteljske programe pogosto zahteva indukcijo novih poliploidov.

Dominantna metoda podvajanja genoma je z uporabo antimitotskega sredstva, kolhicina in različnih herbicidov, kot sta orazilin in trifluralin. Delovanje antimitotskih sredstev temelji na temu, da se začasno ustavijo delitev celice, še pred citokinezo, v aktivno rastočem tkivu.

Uspešnost pridobivanja poliploidov je odvisna navsezadnje od koncentracije antimitotskega sredstva, dolžine izpostavljenosti le temu, vrste rastlinskega tkiva, metode nanašanja, razmer v rastnem mediju in razlik med rastlinskimi vrstami.

Prvo srečanje s poliploidnim organizmom se je zgodilo leta 1907, ko je Lutz navedel, da so imeli nekateri mutanti rastline Oenothera lamarckiana povečane celice, s približno podvojenim številom kromosomov (Nadon in Jackson, 2019). Prve umetne poliploide pa so ustvarili na začetku 20. stoletja (1937), ko sta Blakeslee in Avery s pomočjo kolhicina pomnožila genom številnih različnih vrst. Od teh zgodnjih začetkov pa do danes je minilo že veliko let in ta metoda

(10)

3

podvajanja genoma se je uvedla kot osnovna komponenta v številne žlahtniteljske programe, za vse ekonomsko pomembne rastlinske vrste (Touchell in sod., 2020).

In vitro indukcija poliploidnosti je v današnjem času zelo pomembna, saj lahko s povečanjem genoma v jedru, posledično povečamo tudi velikost biomase, kot na primer pri travah, ki se uporabljajo za krmo za živino, ter se posledično porabi manj pridelovalne površine. Indukcija poliploidnosti je tudi pogosta tehnika, da se izognemo sterilnosti hibridnih rastlin, kot je na primer tritikala, ki je sama po sebi sterilna, nosi pa dobre lastnosti staršev za nadaljnjo pridelavo. V procesu poliploidizacije so njen genom pomnožili in s tem preprečili njegovo sterilnost. Na drugi strani pa lahko z indukcijo poliploidnosti ustvarimo sterilno rastlino oziroma partenokarpo, ki ne tvori semen, kar je lahko iz ekonomskega in pridelovalnega vidika tudi za željeno (Touchell in sod., 2020).

3 KONOPLJA

Navadna konoplja ali znanstveno Cannabis sativa L. je zelnata rastlina, ki raste v različnih habitatih po svetu, z izvorom iz centralne Azije. Sodi v družino konopljevke ali Cannabaceae (Schilling in sod., 2020).

3.1 POMEN KONOPLJE

Konoplja je ena izmed najstarejših rastlin, ki se je že pred 5000 leti uporabljala za prehrano, tekstilna vlakna in v ljudski medicini (ElSohly in Gul, 2014). Za to rastlino je znano, da lahko oblaži ali celo pozdravi bolečine, slabost in depresijo. To zmožnost ji dajejo sekundarni metaboliti, prisotni pri vseh treh tipih konoplje, imenujejo se kanabinoidi oziroma fitokanabinoidi. Poznanih je več kot 100 fitokanabinoidov, katere proizvaja predvsem ženska rastlina v trihomih, ki jih je največ v socvetijh. Najbolj poznana kanabinoida sta kanabidiol ali CBD in tetrahidrokanabinol oziroma THC, za katerega je značilen psihoaktiven efekt in začrta jasno razliko med industrijsko konopljo, ki ima raven THC-ja pod 0,2 % in se lahko prosto goji kot poljščina, in medicinsko konopljo, ki vsebuje 20-30 % THC-ja (Flajšman, 2019). Zaradi psihoaktivnega značaja, ki se je nekoč uporabljal v ljudske medicinske namene, se medicinska konoplja uporablja kot aktivna droga in je zato v mnogih državah ilegalna (Schilling in sod., 2020). Njena uporaba je izključno namenjena za medicinske namene (Flajšman, 2019).

Za razliko od medicinske konoplje pa svet pozna tudi industrijsko konopljo, ki je nenehno hvaljena iz vidika njenih uporabnosti, zaradi skladnosti z okoljem in tudi kot proizvodna alternativa za male kmete. V današnjem času iz konoplje izdelujemo razne tekstilne izdelke, papir, gradbeni material, uporabljamo tudi konopljina semena v humani prehrani, za izdelavo olja, kozmetičnih izdelkov in bio-goriva (Schilling in sod., 2020).

(11)

4

Poleg njene vsestranske uporabe je konoplja primerna tudi za pridelavo v ekološkem kmetijstvu.. Je zelo dober člen v poljedelskem kolobarju, ker ima dober učinek na naslednje posevke. Še en zanimiv podatek je, da lahko konoplja raste na s težkimi kovinami onesnaženih tleh, uporabljamo jo lahko tudi za fitoremediacijo. Kljub vsem pozitivnim lastnostim pridelave konoplje, ta v zadnjem stoletju na svetovni ravni upada. Šele v zadnjih nekaj letih se vrača popularnost pridelave konoplje, zaradi dobrega vpliva na okolje in trajnostnih produktov, med drugimi tudi takih z vsebnostjo CBD-ja. Pred množičnim gojenjem te rastline se je treba soočiti s številnimi problematikami, kot so količina THC in legalizacija le tega, dosegljivost semen s spremenjenim genotipom, izpopolnjenost agrotehničnih ukrepov za pridelavo in izboljšavo letine, ipd. (Amaducci in Gusovius, 2010).

V Sloveniji je trenutno dovoljeno pridelovati konopljo le iz semen v namene nadaljnega razmnoževanja, proizvodnje hrane in pijače, kozmetičnih izdelkov, vlaken in krme za živino.

Konoplja, katera se lahko prideluje na njivah, mora strogo spadati v skupino sort z Evropske sortne liste (Skupni katalog sort poljščin) z vsebnostjo THC-ja pod 0,2 % (Glivar in sod., 2020).

3.2 POLIPLOIDNOST PRI KONOPLJI

V znanstveni literaturi so objavljeni štirje članki, ki opisujejo uspešno pridobivanje poliploidov pri navadni konoplji (Bagheri in Mansouri, 2015, Mansouri in Bagheri 2017; Parsons in sod., 2019; Kurtz in sod., 2020). Poliploidnost so večinoma sprožali z nanašanjem antimitotičnih sredstev, kot sta kolhicin in orizalin, na apikalne meristeme mladih poganjkov. Metode so se med raziskavami nekoliko razlikovale, kar je razloženo v nadaljevanju.

Prva sta se leta 2015 indukcije lotila Bagheri in Manosuri in sicer tako, da sta semena diploidne konoplje kalila v petrijevkah, na vlažnem filter papirju pri 25 °C ter jih nato presadila v substrat in gojila pri 18-urni fotoperiodi (18/6 ur svetloba/tema), na 24 °C ter jih zalivala 3 krat dnevno do cvetenja. Eksperiment so opravili v več delih in sicer so imeli kontrolni poskus, poskuse z različnimi koncentracijami kolhicina (0,1 % in 0,2 %) in tudi različne časovne dobe izpostavljenosti (24 ur, 48 ur). Za vsako koncentracijo in čas izpostavljenosti so uporabili 30 enako starih, mladih rastlin, na katere so na apikalni meristem nanesli 100 µl kolhicina določene koncentracije. S podaljševanjem časa in višanjem koncentracije kolhicina je vedno več rastlin propadlo. Stopnja preživetja si je sledila tako: 100 % za kontrolne rastline, 89,96 %, za rastline tretirane z 0,1 % raztopine kolhicina in 73,33 %, za tiste z 0,2 % raztopine kolhicina. Vsi primerki, ki so bili tretirani, so razvili poliploidno tkivo, miksoploidno (celice tkiva imajo različne ploidnosti) ali tetraploidno. Za indukcijo tetraploidov je bila najbolj optimalna koncentracija 0,2 % v trajanju 24 ur. Največ miksoplpidov pa je bilo pridobljenih pri 0,1%

koncentraciji in trajanju 24 ur. Za natančno določitev ploidnosti so se poslužili pretočne citometrije, s katero so naredili analizo količine dednega materiala. Vzorčili so 0,5cm² velike koščke pravih listov ter jih prelili s pufrom ter jih z britvijo nasekljali v petrijevki. Dobljeno suspenzijo so prefiltrirali in obarvali z barvilom DAPI ter analizirali s programsko opremo

(12)

5

Mode Fit, s katero so določali fluorescenčno intenziteto diploidov in potencialnih poliploidov.

Opazovali so pozicije vrhov na histogramu in iz tega preračunavali ploidnost. Dobili so dva očitna vrhova, ki sta bila na dveh različnih kanalih, tetraploidi pri 51,47 in diploidi pri 25,35. S temi podatki so razlikovali rastline glede na njihovo ploidnost, saj imajo tetraploidi 2 krat več dednega materiala od kontrolnih rastlin. V primeru miksoploidov pa sta se na histogramu pojavila dva vrhova. Po določeni ploidnosti s pretočno citometrijo so sledile biokemične meritve. Po dveh mesecih gojenja rastlin, so z njih odtrgali tretji list ter ga uporabljali za analizo.

Določevali so količino klorofila in karotenoidov s pomočjo Lichtenthaler-jevega testa. Opazili so, da ni razlik med dvema pigmentoma in so iz tega lahko sklepali, da ta lastnost ni pogojena s ploidnostjo. Razlike pri kopičenju pigmentov so bile samo v smislu antocianov, ki so se bolj izrazito kopičili pri diploidih. Poliploidi so izstopali pri količini flavonoidov, ki je bila pri miksoploidih skoraj 2 krat večja od diploidov, ti so vsebovali tudi večjo količino škroba.

Miksoploidi pa so diploide prekašali tudi v količini reducirajočih sladkorjev ter proteinov v listih. Preverili so tudi razlike v koncentraciji THC-ja, te pa so zopet bile opažene kot najvišje samo pri miksoploidih. Tudi CBD-ja je bilo največ v miksoploidih ter tetraploidih, za razliko od kontrolnih rastlin. Med vstopom rastline v reproduktivno fazo so zaznali padec v količini THC-ja v listih, ob istem času pa zaznali povišanje CBD-ja pri ženskih rastlinah. Zmanjšanje količine aktivnih snovi v poliploidih je lahko posledica zmanjšanega izražanja genov v primerjavi z diploidi. Največ THC-ja in CBD-ja so vsebovali miksoploidi, sledili so jim diploidi in na koncu tetraploidi, katerim se je vsebnost teh snovi zmanjšala. Zmanjšanje aktivnih snovi je lahko posledica zmanjšanega števila trihomov pri tetraploidih. Morfološki pregled je zajemal prečni prerez lista in ugotovili so, da je v listnem tkivu tetraploidov manj medceličnega prostora v listnem tkivu in da lahko to posledično privede do tolerance večje difuzije CO2-ja in zmanjšane fiksacije le tega, česar posledica je lahko manjša sinteza ogljikovih hidratov.

Indukcija poliploidnosti je tudi vodila do 53 % zmanjšanja količine celuloze, kar je posledica večje površine celic in manjše količine le teh pri poliploidih. V celičnih stenah so imeli tetraploidi manj celuloze in zato je prišlo tudi do fizikalnega odstopanja od kontrolnih rastlin (Bagheri in Mansouri, 2015).

V drugi študiji istih avtorjev (Mansouri in Bagheri, 2017) so se pridobivanja poliploidov lotili na način tretiranja apikalnega meristema s kolhicinom. Tretitrali so 60 rastlin, starih en teden, vzgojenih iz tkivnih kultur. Antimitotsko snov so nanesli na vsako rastlino (100 µl), v treh različnih koncentracijah: 0 %, ki je bila slepa kontrola, 0,1 % in 0,2 %. Te koncentracije so na rastline nanašali v 6-urnih intervalih ter jih tretirali za 24 ali 48 ur. Vse tretirane rastline so nato gojili pod enakimi pogoji. Zelo pomembno je tu opomniti, kako pomembno vlogo imajo koncentracija kolhicina, trajanje izpostavljenosti, vrsta rastline in prodornost rastlinskega tkiva ali je velika ali majhna. Ti faktorji imajo vpliv na učinkovitost sprejema kemikalij in na odstotek meristematskih celic, ki posledično povečajo število kromosomov. Najmanjši propad rastlin so opazili pri kontroli, ki se s časom tretiranja pričakovano ni spremenila. Sledila je stopnja preživetja s tretiranjem z 0,1 % raztopino kolhicina, ki se s podaljšanjem časa ni spremenila, bila je 89 do 96 %. Čas izpostavljenosti je močno vplival na rastline tretirane z 0,2 % raztopino

(13)

6

kolhicina. Pri 24-urnem tretiranju je bila stopnja preživetja 73,33 %, še bolj pa je padla, ko so čas tretiranja podvojili na 48 ur, takrat je bila samo 63,33 %. Ploidnost so potrdili s pretočno citometrijo, katero so izvedli 50 dni po tretiranju. Enako kot pri zgodnejši študiji (iz leta 2015), so tudi tukaj vzorčili 0,5 cm² velike koščke listov, katere so skupaj s pufrom za lizo jedra, nasekljali v petrijevki, suspenzijo prefiltrirali in obarvali z DAPI barvilom. Z opremo Mode Fit so izdelali histogram, na katerem so zasledili 2 vrhova, indikatorja poliploidnosti. Vrh diploidov je bil uporabljen kot standard za primerjavo diploidov in potencialnih tetraploidov. Zanimivo je bilo, da pri tretiranju z 0,2 % kolhicinom ni prišlo do nobenih himer. Največ tetraploidov (43,33 %) pa je nastalo s koncentracijo 0,2 % pri izpostavitvi za 24 ur, z višanjem koncentracije kolhicina in podaljševanjem časa izpostavljenosti je odstotek padal. Tretieane rastline so opazovali tudi med prehodom v fazo cvetenja, ki je pri ženskih tetraploidih nastopila kar 2 tedna pred diploidi. Isti čas, to je med cvetenjem, so opazovali tudi biokemične parametre in njihovo odvisnost od ploidnosti. Ugotovljeno je bilo, da se je količina THC-ja povečala samo pri miksoploidih ali himerah, v reproduktivni fazi tetraploidov pa je ta močno upadla. Vsebnost CBD-ja se je pri miksoploidih in tetraploidih povečala. Upadla je tudi količina drugih kanabinoidov, saj so imeli tetraploidi ponovno zmanjšano število trihomov (enako kot pri študiji iz leta 2015). Izmerjena je bila še vsebnost proteinov, ki je bila največja pri miksoploidih,. Miksoploidi so bili tudi prevladujoči v količini topnih sladkorjev, ki je bila skoraj 2 krat večja od diploidov, tetraploidi so jih imeli najmanj (41 % manj kot kontrole).

Pričetek odbire rastlin po morfoloških znakih se je začela približno 2 meseca kasneje, po razvoju 5 do 6 pravih listov. Ugotovitve so bile sledeče in sicer, da so tetraploidi imeli krajše liste s povečano širino za razliko od diploidov, zaradi tega je prišlo do razlik pri listnem indeksu, ki je bil pri tetraploidih skoraj pol manjši kot pri diploidih (2,68 in 4,47). Opažene so bile tudi očitne razlike v višini stebel med rastlinami, pri čemer so bili tetraploidi nižji in so imeli skoraj 2 krat večje moške cvetove, kot kontrolne rastline (1,1 cm in 0,4 cm). Opravili so tudi prečni prerez listov iz rastlin obeh ploidnosti in ugotovili, da so celice stebričastega in žilnega tkiva tetraploidov večje ter je med njimi manj medceličnega prostora, prerezali so tudi steblo in potrdili, da imajo tetraploidi debelejše ksilemsko tkivo. Po opazovanju rastlin glede na morfološke znake so se osredotočili še na velikost celic zapiralk in spremljevalk, kar je tudi dober pokazatelj ploidnosti. Lotili so se preverjanja, ko je imela konoplja že razvite prave liste, vzorčili so nižje liste. Na površino listov velikosti 5 mm krat 10 mm površino listov so nanesli prozoren lak za nohte in počakali, da se le-ta posuši. Posušeni lak, na katerega se je prilepila spodnja povrhnjica, so nato odstranili in si jo ogledali pod svetlobnim mikroskopom pri 100x in 400x povečavi. Ugotovitve so temeljile na tem, da imajo tetraploidi večje celice listnih rež kot diploidi in je že to precej zanesljiv znak, na podlagi katerega so lahko ločili diploide od tetraploidov (Mansouri in Bagheri, 2017).

Parsons in sod. (2019) pa so se procesa indukcije lotili malo drugače in sicer tako, da so nabirali nodije stebla z mladimi aksilarnimi brsti brez razvitih lističev. Te vzorce so pridobili iz znanih matičnih rastlin, gojenimi pod enakimi pogoji, da nebi prišlo do sprememb. Steblo so odrezali pod kotom 45 stopinj in pustili 5 mm dolžine nad brstom. Izsečke so nato sterilizirali v 2 %

(14)

7

raztopini natrijevega hipoklorita in 0,1 % raztopini Tween-20. Pred nanosom na sterilno gojišče so izsečke še 3 krat spirali s sterilno destilirano vodo. Sterilne brste so gojili v steklenih posodah na rastnem gojišču MS (Murashige in Skoog), kateremu so dodali še saharozo in rastne regulatorje. Aksilarne brste so tretirali z orizalinom tako, da so jih inokulirali v gojišča z različnimi koncentracijami orizalina . Koncentracije so si sledile: 0, ki je bil kontrolni poskus, 50, 100 in 150 µM (0,0017318 %, 0,0034636 % in 0,0051954%). Opravili pa so še drugi poskus z drugačnimi koncentracijami: 20, 40 in 60 µM (0,00069272 %, 0,00138544 %, 0,00207816

%). Gojišče za rastline so pripravili tako, da so razredčili MS mešanico makro- in mikroelementov in tretirane kulture prekrili s folijo, da nebi prišlo do svetlobne degradacije orizalina. Gojišča s kulturami so dali za 24 ur na stresalnik in po koncu 3 krat spirali z destilirano vodo in biocidom. Po 1 do 5 mesecih so opazili poganjke in jih subkultivirali na svežem gojišču.

Večje rastline so premestili v večje posode in čakali 3 do 5 tednov do ukoreninjanja vseh. Vse vzorce so bile inkubirane pri 24 °C na fluorescentni svetlobi. Rastline, ki so dobro razvile koreninski sistem, so presadili iz gojišča v rastni substrat z mikoriznimi glivami ter jih postavili na temperaturno in svetlobno stabilno območje s stalno zračno vlago. Konoplja je rastla pod belimi fluorescentnimi lučmi, z 18-urno fotoperiodo. Po razvoju vsaj treh listov, so z vsake rastline vzorčili enega z namenom testiranja ploidnosti in naprej gojili domnevne poliploide.

Na enak način, kot pri prejšnjih dveh opisanih raziskavah, so tudi tukaj opredelili ploidnost s pretočno citometrijo. Tega so se lotili tako, da so nabrane liste iz matičnih rastlin shranili med vlažnimi papirnatimi brisačami na ledu za 24 ur pred analizo. Iz listov so vzorčili 0,5 cm² velike koščke, katere so skupaj s pufrom nasekljali v petrijevki, nato prefiltrirali in barvali s propidijevim jodidom za 30minut. Ploidnost oziroma količino DNA v jedru so izmerili s pretočnim citometrom Gallios in kot standard uporabljali diploidne vzorce redkve. Vsebnost DNA so določili s prisotnostjo fluorescentnih vrhov na dobljenem histogramu. Dokazali so lahko, da so bile vse tretirane rastline poliploidizirane, še vedno pa je bil največji izplen miksoploidov. Od vseh tretiranj so se najbolj izkazali primerki inducirani s 40 µM in 20 µM orizalina, glede na preživetveno stopnjo in uspešnostjo poliploidizacije. Vsebnost različnih kanabinoidov so izmerili tudi pri tej študiji poliploidizacije z orazilinom in sicer tako, da so posušili material rastlin (liste in brste) in ga homogenizirali ter 0,5 g le tega zmešali z ekstrakcijsko raztopino. Dobljene vzorce so nato ultrazvočno obdelali in prefiltrirali. THC in CBD sta glavna kanabinoida, ki ju v konoplji najdemo v kislinski obliki (COOH). S HPCL analizo so določili, da je bila količina obeh pri različnih ploidih drugačna. Majhna razlika je bila v količini CBD-ja, saj so ga diploidi vsebovali 8,9 % več kot tetraploidi tetraploidi, ni pa bilo opaznih razlik pri THC-ju. Izmerjena je bila tudi vsebnost terpenoidov in sicer so jih tetraploidi imeli v listih več, za kar 71,5 %, kar bi pomenilo 8,8 mg/g vseh terpenoidov in je ekvivalentno vsebnosti terpenoidov v brstih diploidov. Tudi pri tej raziskavi so enako kot pri prejšnji raziskavi avtorjev Bagheri in Mansouri (2015) opravili štetje trihomov. Dva tedna pred vzorčenjem so na listih konoplje izvedli opazovanje. Na rastlinah diploidnega in tetraploidnega značaja so izbrali tri poganjke in odtrgali četrti list od vrha navzdol. Dele listov so si ogledali pod mikroskopom, na 10-kratni povečavi ter izračunali gostoto trihomov. Tetraploidni listi so imeli 40,4 % več trihomov, kot kontrolne rastline, vendar ni pa bilo nobene razlike v njihovi

(15)

8

zrelosti, saj so vsi bili 2 tedna pred vzorčenjem še v mlečnem stadiju. Poleg trihomov pa so opazovali še ostale morfološke znake. Študija je temeljila na opazovanju rastnih parametrov di in tetraploidnih potaknjencev iz matičnih rastlin. Pripravili so 15 potaknjencev iz vsake rastline in jih gojili pod stabilnimi pogoji do uspešnega ukoreninjanja. Po treh tednih je bilo ukoreninjenih 60 % tetraploidnih in 100 % diploidnih potakjencev, pri tetraploidnih so opazili zakasnjen pojav korenin. Kasneje so jih presadili ter osvetljevali z belimi fluorescentnimi lučmi na 18-urni fotoperiodo. Po 5 tednih so pridobili 9 do10 zdravih potakjencev, ki so bili primerni za opazovanje. Med procesom gojenja so potakjence optimalno gnojili, vršičkali in pincirali ter presajali. Rastne parametre so merili 1-krat tedensko, in sicer velikost listov, ki so bili pri tetraploidih za 0,75 cm širši, dolžino in širino stebel, ki sta bili pri tetra in diploidih skozi rast podobni, med rastno dobo pa so imeli tetraploidi malo krajše lateralne poganjke. Tako diploidni kot tudi tetraploidni potakjenci so zacveteli ob istem času, to je en teden po izpostavitvi kratkemu dnevu, tudi rast je bila skozi celo obdobje podobna. Pri indukciji z orizalinom jih je tudi zanimala velikost listnih rež. Tudi tukaj so uporabljali metodo laka za nohte in si pod 40- kratno povečavo ogledali 8 vidnih polj, na katerih so prešteli število listnih rež. Na vsaki sliki so si izbrali še 3 specifične listne reže ter izmerili dolžino celic spremljevalk. Kot pričakovano je bila velikost listnih rež tetraploidov večja kot pri diploidih, vendar je pa bila gostota manjša.

Diploidi so imeli več listnih rež na enako površino lista (Parsons in sod., 2019).

Pri zadnjem eksperimentu, objavljenem leta 2020, pa so Kurtz in sod. izvedli dva poskusa pri katerih so želeli pridobiti triploide. Pri prvem so tretirali pred-kaljena semena (določenih sort), katera so namakali v vodi in jih kalili v petrijevki na papirju ovlaženem s kolhicinom koncentracij 0,02 % ali 0,05 %, pri 3 dolžinah: 6 ur, 12 ur in 24 ur, da bi s tem določili najboljšo časovno periodo pri kateri nastanejo tetraploidi. Za kontrolo so tretirali semena samo z vodo.

Pri drugem poskusu pa so uporabili pred-kaljena semena (drugih, bolj priljubljenih sort), ki so jih tretirali s kolhicinom koncentracije 0,05 % za 12 ur. To so počeli, ker so imeli omejene zaloge semen priljubljenih sort in so se želeli izogniti velikemu številu miksoploidov. Po nanašanju kolhicina so semena sprali s sterilno vodo ter jih posejali v substrat na globino 6 do 8 mm. Pri obeh eksperimentih so rastline gojili pod enakimi pogoji v rastlinjaku pri 21 °C dnevne in 17 °C nočne temperatutre ter 18-urni fotoperiodi, po potrebi so jih tudi fertigirali. Po 10-ih dneh po sajenju so bili vidni prvi sejanci iz substrata. Triploide so pridobivali s križanjem tetraploidnih in diploidnih potakjencev ženskega spola, iz obeh poskusov. Tri potakjence, pridobljene iz dveh tetraploidnih rastlin, so izpostavili kratkemu dnevu (12 ur svetlobe, 12 ur teme) pri temperaturi 21 °C podnevi in 17 °C ponoči ter na ta način inducirali cvetenje. To so ponovili tudi s štirimi diploidnimi potakjenci, pod enakimi pogoji. Diploidne rastline so tretirali s srebrovim-tiosulfatom, da bi tako inducirali razvoj moških cvetov. Ko so dobili prve moške cvetove diploidov, so z njimi oprašili tetraploidne materne rastline. Morebitna triploidna semena so se začela razvijati po prvih dveh tednih po oprašitvi. Iz tetraploidnih maternih rastlin so pridobili 20 zrelih semen in jih površinsko sterilizirali z natrijevim-hipokloridom. Iz 20-ih semen so uspeli pridobiti samo 7 embrijev, ki so uspešno vzklila in vitro ter jih subkultivirali na rastnem gojišču. Kasneje so malo večje rastline presadili ex vitro v kocke kamene volne.

(16)

9

Dobili so le 4 ukoreninjene rastline, ki so jih presadili v rastni substrat in aklimatizirali v rastlinjaku, pri dolgodnevni fotoperiodi. V prvem eksperimentu so dobili samo 5 tetraploidov, 3 od teh so se tvorili po tretiranju z 0,02 % kolhicinom za 12 h. Iz tega obravnavanja so dobili tudi 2 miksoploida. Ostala dva tetraploida pa so dobili iz tretiranja z 0,05 % kolhicinom za 6 h in 12 h. S tretiranjem z 0,05 % pri 6 h, so dobili še 3 miksoploide, pri 12 urnem tretiranju pa ni bilo regeneriranega nobenega miksoploida. Indukcija tetraploidnosti se je gibala med 26 in 64

%, odvisno od sorte. Pri 2. eksperimentu, se je tvorilo kar 39 tetraploidov. Prvi eksperiment je bil manj uspešen, verjetno zaradi slabše kakovosti semen. Pri drugem pa so uporabili semena boljše kakovosti in je zato prišlo do boljšega genotipskega odziva na kolhicin ter posledično več tetraploidov. Pri tej študiji, od vseh zgoraj navedenih, je bila produkcija tetraploidov najbolj uspešna. Vsebnost DNA v jedru celic so potrdili s pretočno citometrijo. Vzorčili so 50 mg mladih listov, katere so nasekljali v pufru. Zmes so prefiltrirali in centrifugirali, da je nastala usedlina ter jo resuspendirali v barvilu za barvanje jedra (propidijev jodid). S pretočnim citometrom so izmerili relativno fluorescenco količine DNA ter podatke prikazali s histogramom. Za določitev ploidnosti so vrhove histogramov morebitnih tetra in triploidov primerjali z vrhovi diploidov. Določili so, da je bila količina DNA-ja pri tetraploidih za 96 % večja kot pri diploidih. Triploidi so imeli v povprečju 40 % več DNA-ja od diploidov in 40 % manj od tetraploidov. Rastline so že na zunanji izgled kazale znake različnih ploidnosti.

Rastline tretirane s kolhicinom so bile očitno manjše od kontrolnih. Kalčki, ki so bili tretirani z 0,02 % za 24 h in tisti, ki so bili tretirani z 0,05 % raztopino kolhicina, so bili 10 dni po vzklitju krajši od 1 cm in so imeli zadebeljene hipokotile in kotiledone. Nekateri embrii po vzklitju sploh niso mogli razviti epikotila in so zato propadli. Pri koncentraciji 0,02 % so s podaljševanjem časa imeli vedno nižje rastline. Enako kot pri vseh eksperimentih opisanih do zdaj, so tudi v tem z metodo laka za nohte potrdili da se velikost listnih rež s ploidnostjo veča, njihova gostota pa manjša. Avtorji so razložili, da so lahko povečane listne reže pri tetra in triploidih posledica povečanega števila genomov, ki so prisotni pri poliploidih. Metoda z indukcijo triploidov je relativno nova in na konoplji ni bila velikokrat preizkušena ter so zato potrebne nadaljnje študije, ki bi bolj natančno opisale dobljene triploidne rastline. Bila pa je že temeljito preizkušena na hmelju, kjer so dobili triploide, ki dajejo večji pridelek z večjo vsebnostjo alfa-kislin. Iz teh ugotovitev na hmelju se sedaj tudi sklepa, da bi lahko tudi pri konoplji lahko dobili podobne rezultate v smislu pridobivanja sekundarnih metabolitov (Kurtz in sod., 2020).

(17)

10

Slika 1: Primerjava diploidnega (A) in tetraploidnega (B) lista, z odtisi abaksialnih strani z listnimi režami (Parsons in sod., 2019)

4 HMELJ

Hmelj ali botanično Humulus lupulus L. je vrsta cvetoče rastline iz družine konopljevk ali Cannabaceae, z izvorom iz Evrope, severne Amerike in zahodne Azije. Je večletna, zelnata, plezalna rastlina, ki prezimi samo s koreninami, spomladi pa iz tal požene nove poganjke. Je dvodomnega značaja, kar pomeni, da obstajajo ločene moške in ženske rastline. Ženske proizvajajo socvetja, iz katerih se razvijejo t. i. storžki, le ta pa vsebujejo različne kemične komponente. Poznamo dva tipa hmelja: divji hmelj, ki se v večini primerov uporablja kot okrasna rastlina in komercialni hmelj, ki ima velik ekonomski pomen, saj se le tega goji za izplen sekundarnih metabolitov iz socvetij (Almaguer in sod., 2014).

(18)

11

4.1 POMEN HMELJA

Kultiviranje hmelja je v veliki večini usmerjeno v pridelavo storžkov, katere uporabljajo v pivovarski industriji za dodajanje grenkega priokusa. Približno 97 % vsega gojenega hmelja je pridelanega za namene varjenja piva. Socvetja ženskih rastlin so sestavljena iz venčnih listov podobnih struktur, imenovanih brakteoli. Na dnu teh so lupulinske žleze, iz katerih se izloči rumenkast smolnat prah. Rumenkast prah se imenuje lupulin in v njem se skriva grenka aromatična snov, ki daje pivu značilen okus. V hmeljiščih gojimo samo ženske rastline, da ne pride do neželenega nastanka semen v storžkih, ki znižujejo hjihovo kakovost in pridelek lupulina (Almaguer in sod., 2014).

Hmelj ima številne dobre lastnosti, ki se pripisujejo njegovim sekunadarnim metabolitom, katere rastlina proizvaja v obrambne namene, v storžkih. Delimo jih na tri glavne skupine:

smole, polifenoli in olja. Značilen okus piva dobimo iz hmeljevih socvetij, ki so sestavljeni iz 24% mehkih smol, med katere spadajo alfa-kisline ali humuloni, te dajejo grenak okus.

Podobno kot ostale rastline na svetu vsebuje hmelj tudi polifenole, ki imajo močno biološko aktivnost ter iz njih v modernem času razvijajo zdravila proti rakastim tvorbam. Esencialna olja hmelja pa so raznolika skupina snovi s fizikalno-kemičnimi, biološkimi in organoleptičnimi učinki. Poleg uporabe v pivovarski industriji ima hmelj že kar 2000 let staro tradicijo v ljudski medicini, kjer so ga včasih uporabljali proti gobavosti, smradu stopal, zaprtju in za čiščenje krvi (Karabín in sod., 2016).

Največji pridelovalki hmelja sta Nemčija in Združene države Amerike, ki pridelata kar 75 do 80% vsega hmelja na svetu (Fric in sod., 1991). Povsod drugod pa hmelj gojijo kjer je dovolj svetlobe (1800-2000ur na leto sončnega obsevanja), dosti letnih padavin (ker je hmelj hidrofilna rastlina), in primerna temperatura med rastno dobo (8-10 °C) (Fric in sod., 1991).

Večinoma so taki pogoji v regijah zmernega podnebnega pasu. Ostale proizvajalke hmelja so sledijo Češka republika, Poljska, Slovenija, Anglija, Ukrajina, Kitajska, južna Afrika, Avstralija in Nova Zelandija (Almaguer in sod., 2014).

Za izboljšavo pridelka in lažjo pridelavo vključujejo hmelj v razne žlahtniteljske programe. Pri teh strmijo k boljšemu izplenu alfa-kislin, večji toleranci na klimatske spremembe, ki se v današnjem času hitro odvijajo, tudi za odpornost na razne škodljivce in bolezni. Pri določenih programih so se lotili tudi izboljšave habitusa rastline, da bi razvili pritlikavo različico, ki bi omogočala lažje obiranje in posledično manj delovne sile ter manjšo porabo prostora. Večina tehnik, s katerimi bi dobili željene rezultate, temelji na produkciji rastlin s triploidnim genotipom. V Sloveniji je pomemben cenetr za žlahtnjenje triploidnih sort hmelja Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, v Žalcu. Po zaslugi gospe Dragice Kralj se je v devetdesetih letih uveljavila vzgoja triploidnih kultivarjev, iz katerih so nastale sorte Cekin, Celeia, Cerea in Cicero (Trojak-Goluch in Skomra, 2018).

(19)

12 4.2 POLIPLOIDI PRI HMELJU

V slednjem poglavju bom na kratko opisala 5 člankov iz znanstvene literature, ki govorijo o pridobivanju poliploidov pri hmelju (Roy in sod., 2001; Koutoulis in sod., 2005; Roborgh, 2012; Trojak-Goluch in Skomra, 2013; Švécarová in sod., 2019). Vsak se je indukcije poliploidnosti lotil malo drugače ter strmel h končnemu rezultatu nastanka triploidne sorte rastline, ki je za pivovarske namene veliko bolj ekonomična in aromatična, kot že znane diploidne sorte.

Roy in sod. (2001) so se in vitro produkcije tetraploidnega hmelja leta 2001 lotili s kolhicinom.

Eksperiment so pričeli z v sterilnem okolju z rastlinami, katere so gojili na Murashinge in Skoog gojišču, kateremu so mu dodali različne koncentracije kolhicina. Za indukcijo tetraploidnosti so uporabili koncentracije 0,01 %, 0,05 %, 0,1 % in 0,5 %. V tekoča gojišča so inokulirali samo apikalne brste ter jih tretirali z različnimi koncentracijami, imeli so tudi kontrolni poskus, ki ni vseboval kolhicina. V poskus so vključili 25 do 30 rastlin. Gojili so jih na stresalniku pri temperaturi 25 °C, za 5 različnih dolžin tretiranj: 24 ur, 48 ur, 72 ur, 96 ur in 120 ur. Po zaključenem tretiranju so rastlinske poganjke 3 krat spirali z destilirano vodo. Potencialne kulture so namnožili v rastnem gojišču in dobili 20 do 25 klonov, katere so inokulirali na gojišče z rastnimi regulatorji. Ukoreninjene poganjke so prestavili v sterilne rastne pogoje ter jih gojili za 3 do 4 tedne, nato so jih prenesli v osenčeno območje in gojili do odraslosti. Učinke tretiranja rastlin s kolhicinom so ovrednotili 5 tednov po tretiranju, ko so ne-rastoče brste so smatrali za propadle. Preživeli so vsi brsti kontrolnega poskusa in poskusa, ki je trajal 24 ur s koncentracijami 0,01 % in 0,05 %. Pri vsakem tretiranju s kolhicinom je nekaj rastlin propadlo, vsa tretiranja z 0,5 % in za 12 ur z 0,1 %, so imela 70 % letalnost rastlin. 100 %, propadanje pa so zaznali tudi pri 24 urni izpostavitvi rastlin, 1 % kolhicinu, ki je imel toksičen učinek. Takšna stopnja preživetja rastlin v odvisnosti od časa in koncentracije je bila pričakovana. Prvi vidni efekti kolhicina so bili zakasnitev v rasti, kontrolne rastline so začele brsteti po 3 do 4 dneh, medtem ko tretirane šele po 5 do 7 dneh. Po 5-ih tednih rasti so bili vsi tretirani poganjki nižji in tudi z manjšim številom nodijev v primerjavi s kontrolnimi diploidi. Inducirano ploidnost vseh ne-propadlih rastlin so dokazali z zanesljivo metodo, t.j. pretočno citometrijo. Z rastlin so vzorčili po 1g listnega izsečka, ki so ga z britvijo narezali v petrijevki z Galibraithovim pufrom.

Za vidnost DNA so jedra obarvali s propidijevim jodidom. Fluorescenco so izmerili z pretočnim citometrom ter jih klasificirali kot diploide, tetraploide ali miksoploide, glede na vrhove, ki so se izrisali na histogramu. Vsi tretirani vzorci so izkazali poliploidne lastnosti, opazili so nekaj izjem pri tretiranju z 0,01 % za 24 in 72 ur ter pri 0,05 % kolhicinu pri trajanju 96 in 120 ur. Pri teh so nekateri diploidi ostali nespremenjeni. Največ tetraploidov, kar 25,6 %, so pridobili pri tretiranju z 0,05 % kolhicinom in 24-urni časovni periodi. Tudi ostala tretiranja z 0,01 % (48 ur), 0,05 % (24 ur, 96 ur) in 0,1 % (24 ur), so doprinesla več kot 20 % rastlin, ki so bile tetraploidne. Za hitrejšo determinacijo poliploidnosti, brez citoloških analiz, so si ogledali tudi morfologijo listov. Listne karakteristike so si ogledali na in vitro vzgojenih rastlinah, po 4 do 6mesecih, ko so bile le-te že čisto ustaljene. Prvi listi tetraploidov ali miksoploidov so imeli

(20)

13

drugačen oziroma popačen izgled, poznejši pa ne in so izgledali normalno. Tudi dolžina in širina poliploidnih listov se od listov kontrolnih rastlin ni očitno razlikovala. Opaženo je bilo edino to, da so kontrolne rastline hitreje rastle od tretiranih. Pri opazovanju listov so si bolje ogledali tudi listne reže. Liste so narezali na vzorčke velikosti 1 cm² in jih postavili v 15 % H2O2 za 72 do 96 ur. Nato so odstranili epidermalno plast in jo obarvali s safraninom ter si jo ogledali pod svetlobnim mikroskopom. Velikost listne reže je bil uporaben parameter za ocenjevanje ploidnosti. Dolžina in širina se je opazno razlikovala med vzorci, pri čemer so bile listne reže tetraploidov daljše in širše (Roy in sod., 2001).

Naslednji članek (Koutoulis in sod., 2005) govori o superiornosti triploidnih rastlin hmelja, zaradi njihove partenokarpe značilnosti ter ohranjanju raznih arom pri varjenju piva ter tudi o pridobivanju le teh iz miksoploidov. Pri tej študiji so se osredotočili na opazovanje diploidnega hmelja in domnevnega tetraploida, ki izivira iz ZDA, pridobljenega z ex vitro kolhicinsko indukcijo. Testirali so različne tkivne tipe rastlin, kot so: listi, vrh poganjka, steblo in korenine.

Opravljena je tudi bila pretočna citometrija za natančno določanje količine dednega materiala v jedru celic. Nasekljali so 1 g listnega vzorca v Galbraithovem pufru in zadevo obarvali s propidijevim jodidom. Kot kontrolo so uporabljali jedra boba (Vicia faba). S pretočno citometrijo so pridobili hitogram DNA intenzitete, ki se navezuje na DNA ploidnost. Vzorce so razvrstili po ploidnosti glede na vrhove na histogramu. Poleg pričakovanih diploidov in tetraploidov je bilo mogoče zaslediti tudi nekaj miksoploidov. Diploidi so vsebovali majhen odstotek jeder s tetraploidno garnituro kromosomov, kar najdemo v jedru, ki je v pozni S ali zgodnji G2 fazi celičnega cikla. Podobno so tudi mikso in tetraploidi vsebovali oktaploidna jedra. Dokazali so različne ravni ploidnosti v različnih rastlinskih tkivih in prišli do ugotovitve, da imata listni in rastni vršiček poganjkov imata podobno ploidnost pri individualni rastlini, med tem ko stebelno in koreninsko tkivo izkazujeta večjo raven ploidnosti od listov in vršičkov, pri individualni rastlini. To je bilo bolj izrazito pri koreninskem tkivu in je lahko posledica večjega števila celic, ki so v procesu delitve. Koutoulis in sod. (2005) so pridobljene miksoploide razdelili v tri razrede, glede na količino diploidnih in tetraploidnih celic.

Miksoploide iz razreda 3, ki so vsebovali manj diploidnih kakor tetraploidnih celic, je bilo mogoče ločiti od tetraploidov z analizo listnega tkiva, ni pa jih bilo mogoče ločiti z analizo koreninskega tkiva. Iz tega so sklepali, da so domnevni tetraploidi pri pretočni citometriji z listnih izsečkov izkazovali znalčilnosti miksoploidov, pri analizi koreninskih vzorcev pa tetraploidov. O ploidnosti te rastline so se na koncu prepričali še z metodo štetja kromosomov in prišli do sklepa, da so res tetraploidi. Iz te rastline so lahko s križanjem z moškim diploidom, dobili triploidno potomstvo, kljub domnevam, da je ta sorta miksoploid. Prišli so do sklepa, da ima vse reproduktivne organe s tetraploidnim značajem. Ugotovljeno je bilo, da si lahko v žlathniteljskih programih, z željo po pridobivanju triploidih rastlin, pomagajo z miksoploidi.

Težko je edino preveriti DNA raven ploidnosti s pretočno citometrijo, saj samo zelo majhen delec cveta, to je jajčece v embrionalnem ovoju, odloča o stopnji ploidnosti potomstva (Koutoulis in sod., 2005).

(21)

14

Nekoliko novejša študija iz leta 2012 (Roborgh, 2012) temelji na tretiranju diploidnih ženskih poganjkov hmelja s kolhicinom, z namenom pridobiti partenokarpie plodovie, ki so primerni za gojenje. V hmeljišča se sadi stebelne potaknjence, zato pridelovalci za njih ne potrebujejo semen. Da so prišli do indukcije podvojevana kromosomov med procesom mitoze, so morali rastoč vrh mlade, 30 cm visoke ženske rastline, odrezati in pustiti pod njim tri najmanjše brste.

S tem, da so odrezali vrh rastline in pustili samo tri brste, so pospešili razvoj in rast celic v brstih. Vrh rastline so nato pomočili v 0,2 % in 0,3 % raztopino kolhicina, za 6 ur. Prej so preverili že več koncentracij in trajanja, vendar so se izkazale za neučinkovite. Po 2 do 4 tednih so se tretirani brsti pričeli razvijati v lateralne veje, ki so bile v celoti ali delno sestavljene iz tetra oziroma poliploidniega tkiva. Nove rastline, ki so nastale iz lateralnih poganjkov, so bili čisti tetraploidi ter celo himere/miksoploidi. Iz diploidnih mater, tretiranih s kolhicinom, so dobili dva mutanta. Prvi mutant, ko je bil oplojen s cvetnim prahom diploidnega očeta, se je razvil v hmelj normalne velikosti in nosil delno sterilne storžke. Drugi mutant je imel pod enakimi pogoji večjo rast in je bil fertilen. Prve so smatrali za himere in druge za čiste tetraploide. S citološkimi študijami so dokazali tudi podvojen genom v jedru celic koreninskega vršička. Z zasaditvijo in križanjem teh mutantov z diploidnimi moškimi rastlinami je nastalo veliko ženskih partenokarpih sadik, ki so trenutno v procesu testiranja za agronomske lastnosti in vrednost varjenja za pivo (Roborgh, 2012).

Torjak-Goluch in Skomra (2013) sta se za bolj ekonomično gojenje triploidnega hmelja lotili produkcije tetraploidov na način tretiranja nodalnih delov rastlinskih poganjkov ali s tretiranjem mladih sadik hmelja. Za rastlinski material sta uporabili eno leto stare diploidne rastline Humulus lupulus L.. Nodalne dele, gojene v rastlinjaku, sta površinsko sterilizirali ter jih inokulirali na Murashige in Skoog gojišče. Sterilne kulture sta kasneje prenesli na rastno gojišče in jih gojili pri temperaturi 24/26 °C, pri 16/8 h fotoperiodi, za 5 tednov. Rastne vršičke rastlin dolžine 5 do 7 mm velikosti, so bile pobrane iz in vitro gojenih rastlin in prenesene na tekoče MS gojišče, katero je vsebovalo tri različne koncentracije kolhicina 0,01 %, 0,05 % in 0,1 %.

Kulture s kolhicinom so inkubirali na stresalniku za 3 različne dolžine trajanja: 24 ur, 48 ur in 72 ur, na svetlem, pri temperaturi 24 °C. Vzpostavili so tudi kontrolni poskus, z enakim gojiščem, ki ni vsebovalo kolhicina. Za vsako posamično tretiranje je bilo uporabljenih 18 krastnih vršičkov, poskus so ponovili 2 krat. Po zaključenem tertiranju s kolhicinom so rastline 3 krat spirali s sterilno vodo ter jih prenesli na sveže MS gojišče, z dodanimi rastnimi regulatorji. Po treh tednih so rastline subkultivirali v gojišče brez rastnih regulatorjev z namenom vzpodbuditve koreninjenja in jih izpostavili 16-urni fotoperiodi, pri 24 °C. Dobro ukoreninjene rastline so nato prenesli v plastične lončke s perlitom in šoto ter jih aklimatizirali na pogoje v rastlinjaku. Natančnost postavljenega eksperimenta so preverili s pretočno citometrijo, kjer so kontrolne diploide uporabljali kot standard. Vzorčili so koščke listov velikosti, 1 cm² ter te nasekljali v petrijevki skupaj s pufrom za lizo celic. Suspenzijo so prefiltrirali in obarvali z barvilom DAPI. Vzorce so inkubirali za 2 minuti in jih pozneje testirali za relativno intenziteto fluorescence. S pretočno citometrijo so dokazali, da so se vse tretirane rastline odzvale s poliploidnostjo. Uspešnost ploiploidnosti je bila med 5,6 % in 52,8 % in je

(22)

15

bila v veliki odvisnosti od koncentracije in časa izpostavljenosti. Poleg pričakovanih poliploidov, pa so zaznali še mikosploide. Med poskusi so opazili, da so bile velike razlike pri indukciji tetraploidov. Najvišje število tetraploidov je bilo 25 %, katerega so dosegli pri tretiranju z 0,05 % kolhicinom za 48ur. Temu je sledilo tretiranje z 0,1 % kolhicinom za 48 ur, pri katerem je bil izplen tetraploidov 22,2 %. Na splošno so ugotovili, da se je delež tetraplodov povečeval z naraščanjem koncentracije kolhicina in podaljševanjem časa izpostavljenosti.

Vendar so imeli težave v primeru, ko so poskusi vključevali 0,1 % kolhicina za 72 ur in 0,05 % kolhicina za 48 ur, saj se je tam pojavljala največja smrtnost rastlin. Poleg pretočne citometrije so uporabili še eno citološko tehniko in sicer štetje kromosomov. Somatske kromosome so pripravili iz mladih listov, katere so prej tretirali z raznimi kemikalijami ter inkubirali pod določenimi pogoji. Število kromosomov so določili pri vsaj 30-ih celicah, pri 20 naključno izbranih rastlinah, vsake ploidnosti. Ta analiza je dokazala, da so somatske celice diploidov, vsebovale 2n=2x=20 kromosomov, med tem, ko so tetraploide rastline vsebovale 2n=4x=40 kromosomov. Miksoploidi pa so imeli različne celice z diploidnimi in tetraploidnimi garniturami kromosomov. Pridobljene rastline so nadaljnje gojili za 4 mesece v rastlinjaku, da so se dobro ukoreninile. 20 rastlin so odbrali ter jih presadili na njivo v razmaku in gojili na običajen način. Po treh letih rasti, je preživelo samo 6 rastlin od 20 tetraploidov, katere so primerjali z diploidnim kontrolam. Opravili so meritve morfoloških lastnostih. Poliploidi so izkazovali slabo zmogljivost aklimatiziranja na zunanje oziroma njivske pogoje. Rast tetraploidov je bila počasnejša in od diploidov so se razlikovali morfoloških lastnostih.

Tetraploidi so imeli mnogo tanjša bazalna stebla, debeline 4,7 do 7,4 mm, pri diploidih so bila stebla premera 8,2 mm. Razlike so bile tudi pri opazovanju dolžine lateralnih poganjkov, katere so tetraploidi imeli krajše. Pri povečani ploidnosti so imele rastline tudi manjše liste. Večina tetraploidov je imela navadno krajše in ožje liste od diploidov, te razlike so bile manj opazne pri višje rastočih listih. Opazovali so tudi cvetove, kateri so bili pri tetraploidih manjši od kontrolnih rastlin. Pri prehodu rastlin v tehnološko zrelost, so se lotili meritev storžkov. Teža le teh se je gibala med 48,2 g in 73,3 g in je bila najvišja pri tetraploidih. Rastline večje ploidnosti so imele tudi daljše lupulinske žleze, katerih pa je bilo manj. Kljub večjim lupulinskim žlezam pri tetraploidih, to ni imelo večjega vpliva na kakovost storžkov in vsebnost alfa-kislin. Tetraploidni storžki so izkazovali tudi nižjo vsebnost esencialnih olj, so pa imeli več humulena. Diploidi in tetraploidi so se tudi razlikovali tudi pri koncentarcijah kariofilena in farnesena, glavnih sestavin ki jih želimo v pivovarstvu (Trojak-Goluch in Skomra, 2013).

V najmlajši metodi, iz leta 2019 (Švécarová in sod., 2019), pa za razliko od zgoraj opisanih niso uporabili kolhicina, ampak orizalin. Poliploidizacijo so pri prvem poskusu preizkušali na nodalnih delih, na gojišču z različnimi koncentracijami orizalina, 1, 5 in 10 µM (0,00003464

%, 0,00017318 %, 0,00034636 %), za 2 tedna. Drugi poskus pa je temeljil na namakanjem z raztopino orizalina, koncentracij 10 µM in 20 µM (0,00034636%, 0,00069272 %), za 24 ali 48 ur. Za eksperimentalne rastline so uporabili in vitro pridobljene sadike hmelja, ki so jih gojili na Murashinge in Skoog gojišču. Hranili so jih na 22 °C ±2, na 16/8 h dan/noč fotoperiodi.

Subkultivirali so jih vsakih 5 tednov ter jih razrezali na delčke s tremi pari listov, da so dobili

(23)

16

zadostno število rastlin za poskuse z orizalinom. Izbrali so si nodalne delčke iz treh aktivno rastočih klonov, za in vitro indukcijo poliploidnosti z orizalinom. Pripravljena je bila tudi raztopina orizalina iz nje pa določene koncentracije, uporabljene pri sledečem eksperimentu.

Prva metoda je temeljila na gojenju nodalnih delčkov z orizalinom v rastnem gojišču za 2 tedna.

Nodalne delčke so premestili v erlenmajerice z MS gojiščem brez hormonov, vsebovale pa so 0, 1, 5 ali 10 µM orizalina. Vzorce so gojili pod konstantnimi pogoji, pri 25 °C za 2 tedna. Po dveh tednih so jih premestili na MS gojišče z rastnimi regulatorji ter jih subkultiviralu še za 4 tedne. Vsak regeneriran segment je bil smatran kot en klon. Eksperiment so ponovili 3 krat.

Druga metoda tretiranja z orizalinom je bila namakanje z le tem. Nodalne delčke so postavili v MS gojišče brez hormonov in jih namakali za 24 ur z 15 mL različnih koncentracij orizalina in sicer z 10 in 20 µM, tertirali so tudi z destilirano vodo kot kontrolni poskus. Kultivirali so tretirane rastline pri stalni temperaturi 25 °C. Po namakanju za 24 ur, so orazilinsko raztopino odstranili. Nodalne delčke so 3 krat spirali z destilirano vodo ter jih prenesli na MS gojišče s hormoni za 2 tedna in jih subkultivirali kasneje vsake 4 tedne v gojitvenih posodah.

Eksperiment so ponovili 2 krat. Prva metoda, ki se je tudi imenovala CMNS (1, 5 ali 10 µM orizalina za 2 tedna) je imela 43,75 % uspešnost za indukcijo tetraploidnosti. Najbolj optimalni pogoji so bili gojenje 2 tedna na gojišču, ki je vsebovalo 5 µM orazilina. Druga metoda, imenovana ONS (namakanje z 10 ali 20 µM orizalina, za 24 in 48 ur), pa je izkazala najboljše rezultate, ko so uporabili 20 µM orazilina za časovno periodo 48 ur. Pri tej metodi so imeli uspeh indukcije tetraploidnosti kar 58,33 %. Te številke so se seveda razlikovale med različnimi kloni. Po izpostavitvi rastlin orizalinu je bila rast bistveno uopočasnjena, v primerjavi s kontrolnimi rastlinami. Štiri mesece po tretiranju, so bile rastline, ki so bile izpostavljene orizalinu, mnogo manjše (dolge samo 1 do 2 cm), s krajšimi internodiji ter listi svetlo zelene ali temno zelene barve. Poleg tega so se počasneje ukoreninjale. Kontrolne rastline so bile daljše, dolžine že 8 cm, bolj zelene in dobro ukoreninjene. V primerjavi s kontrolami so imele tetraploidne rastline večjo površino listov. Potrdili so tudi, da ploidnost vpliva na obliko listov.

Po koncu rasti (1 do 2 meseca kasneje), so ugotovili tudi, da je bila velikost listnih rež večja pri tetraploidih, kot pri diploidh. To so si ogledali s pomočjo svetlobnega mikroskopa, pri 40 kratni povečavi. Po 4 do 6 mesecih rasti so odbrali rastline primerne za preverjanje ploidnosti s pretočno citrometrijo ter kromosomskim opazovanjem. Pri pretočni citometriji so bili mladi listi tretiranih rastlin, uporabjeni za analizo količine DNA. Za standard oziroma za kalibracijo citometra so uporabili liste soje (Glycine max L.). Iz vsakega lista so vzorčili 1cm dolg vzorec in ga z ostrim rezilom razrezali v petrijevki, ter dodali 1,5 mL ledeno hladnega LB01 pufra ter nastalo raztopino prefiltrirali skozi najlonsko sito. Suspenzija sproščenih jeder je bila obarvana z barvilom DAPI ter inkubirarana pri sobni temperaturi za 10 min. S pomočjo pretočnega citometra so izmerili fluorescenco vsaj 3000 delcev in jih prikazali v obliki histograma. Dobili so dva vrhova na različnih kanalih, ki sta zaznamovala ali je rastlina diploid ali tetraploid oziroma koliko ima dednega materiala, pri čemer so ga imeli tetraploidi skoraj 2 krat več.

Rastline, ki so bile dokazane za diploidne in tetraploidne so vzorčili še na koreninskih konicah, katere so tretirali z raznimi pripravki in narezali na 1mm dolge koščke, te so si kasneje ogledali pod svetlobnim mikroskopom ter prešteli kromosome. Dokazano je bilo, da so imeli diploidi

(24)

17

2n=2x=20 kromosomov, med tem ko so imeli tetraploidi 2n=4x=40 kromosomov (Švécarová in sod., 2019).

Slika 2: Primerjava tetraploidnih in diploidnih cvetov (A), storžkov (B) in listov (C) (Trojak-Goluch in Skomra, 2013)

5 ZAKLJUČEK

V obeh poglavjih Konoplja in Hmelj sem namenila velik poudarek indukciji poliploidnosti s pomočjo kolhicina, ki vpliva mitotske delitve celic. Protokoli za konopljo in hmelj so si podobni, saj rastlini sodita v isto družino in imata podobne lastnosti.

Poliploidnost pri konoplji je relativno mlada tematika v znanstveni literaturi in je na to temo napisanih bistveno manj študij kakor za hmelj. To je verjetno zaradi dolge tradicije hmeljarstva in spornih mnenj glede gojenja konoplje, ki se šele v zadnjih nekaj letih ponovno uveljavlja kot pomembnejša kmetijska rastlina.

Protokoli se med seboj bistveno ne razlikujejo, razen v koncentracijah antimitotskega sredsta, po večini kolhicina in po trajanju izpostavitve rastlin le-temu. V vseh primerih se je tako pri konoplji kakor pri hmelju, višanje koncentracije kolhicina in podaljševanje časa tretiranja odražalo v višji stopnji letalnosti. Pri obeh vrstah pa so, kljub prizadevanju za indukcijo tetraploidnosti, dobili večinsko miksoploidne rastline.

Najvišja stopnja preživetja in največje število induciranih tetraploidov sta bila pri obeh vrstah zabeležena po tretiranju z najnižjimi koncentracijami kolhicina (0,02 % do 0,2 %), vse pa je bilo v veliki meri odvisno od dolžine tretiranja, ki se je v večini primerov gibala med 6 pa do 48 ur. Poleg koncentracije in časa je imela na indukcijo in količino poliploidov velik vpliv tudi sorta rastlin, med katerimi so lahko bile zelo velike razlike, zaradi drugačne fiziologije rastlin.

Večina študij tako konoplje, kot tudi hmelja, je temeljila na indukciji poliploidnosti pri in vitro pogojih. S tem so si zagotovili najbolj stabilne rezultate, katere niso ovirali zunanji dejavniki, kot so okoljske spremembe, škodljivci in bolezni.

(25)

18

Poliploidnost je pri obeh vrstah rastlin vplivala na morfološki izgled in razvoj. Tiste, ki so vsebovale pomnoženo število kromosomov, so za razliko od kontrolnih rastlin rastle počasneje, nižje in se slabše ukoreninjale. Razlike so bile tudi na primeru velikosti listnih rež in trihomov, katere so imeli tetraploidi večje in manj goste na isti površini kot diploidi. Kljub povečanemu številu trihomom pri tetraploidnih osebkih le-ti niso imeli večjega vpliva na proizvodnjo sekundarnih metabolitov.

6 VIRI

Adams K. L., Wendel J. F. 2005. Polyploidy and genome evolution in plants. Current Opinion in Plant Biology, 8: 135-141

Almaguer C., Schönberger C., Gastl M., Arndt E. K., Becker T. 2014. Humulu lupulus – a story that beags to be told. Journal of the Institute of Brewing, 120: 289-314

Amaducci S., Gusovius H. J. 2010. Hemp – cultivation, extraction and processing. V: Industrial applications of natural fibers: Structure, properties and technical applications. 1st ed.

Chichester, West Sussex, John Wiley and Sons: 109-135

Andre C. M., Hausman J. F., Guerriero G. 2016. Cannabis sativa: the plant of the thousand and one molecules. Frontiers in Plant Science, 7, 19, doi: 10.3389/fpls.2016.00019: 17 str.

Bagheri M., Mansouri H. 2015. Effect of induced polyploidy on some biochemical parameters in Cannabis sativa L. Applied Biochemistry and Biotechnology, 175, 5: 2366–2375

ElSohly M. A., Slade D. 2005. Chemical constituents of marijuana: The Complex Mixture of Natural Cannabinoids. Life Sciences, 78: 539-548

ElSohly M., Gul W. 2014. Constituents of Cannabis sativa. V: Handbook of Cannabis. 1st ed.

New York, Oxford university press: 3-10

Flajšman M. 2019. Metode žlahtnjenja industrijske konoplje (Cannabis sativa L.). Hmeljraski bilten, 26,1: 129-146

Fric V., Havel J., Libich V., Křiž J., Markovec K., Perlík Z., Rybáček V., Sachl J., Srp A., Šnobl J., Vančura M. 1991. Technology of production. V: Hop production. New York, Elsevier:

121-255

Glivar T., Eržen J., Kreft S., Zagožen M., Čerenak A., Čeh B., Tavčar Benković E. 2020.

Cannabinoid content in industrial hemp (Cannabis sativa L.) varieties grown in Slovenia.

Industrial Crops and Products, 145, doi: 10.1016/j.indcrop.2019.112082: 9 str.

Karabín M., Hudcová T., Jelínek L., Dostálek P. 2016. Biologically active compounds from hops and prospects for their use. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 15, 3: 542-567

Knez Hrnčič M., Španinger E., Košir I. J., Knez Ž., Bren U. 2019. Hop compounds: extraction techniques, chemical analyses, antioxidative, antimicrobial and anticarcinogenic effects.

Nutrients, 11, 257, doi: 10.3390/nu11020257: 37 str.

Koutoulis A., Roy A. T., Price A., Sherriff L., Leggett G. 2005. DNA ploidy level of colchicine- treated hops (Humulus lupulus L.). Scienta Horticulturae, 105, 2: 263-268

(26)

19

Kurtz L. E., Brand M. H., Lubell-Brand, J. D. 2020. Production of tetraploid and triploid hemp. HortScience, 55, 10: 1703–1707

Leitch I. J., Bennett M. D. 1997. Polyploidy in angiosperms. Trends in Plant Science, 2, 12:

470-476

Mansouri H., Bagheri M. 2017. Induction of polyploidy and its effect on Cannabis sativa L. V:

Cannabis sativa L.-Botany and Biotechnology. Springer: 365–383

Nadon B., Jackson S. 2020. The polyploid origins of crop genomes and their implications: A case study in legumes. Advances in Agronomy, 159: 275-313

Neve R. A. 1986. Hop breeding worldwide – its aims and achievements. Journal of the Institute of Brewing, 92: 21-24

Parsons J. L., Martin S. L., James T., Golenia G., Boudko E. A., Hepworth S. R. 2019.

Polyploidization for the genetic improvement of Cannabis sativa. Frontires in Plant Science, 10:476, doi: 10.3389/fpls.2019.00476: 12 str.

Paterson A. H. 2005. Polyploidy, evolutionary opportunity, and crop adaptation. Genetica, 123:

191-196

Roborgh R. H. J. 1969. The production of seedless varieties of hop (Humulus lupulus) with colchicine. New Zealand Journal of Agricultural Research, 12: 1, 256-259

Roy A. T., Legget G., Koutoulis A. 2001. In vitro tetraploid induction and generation of tetraploids from mixoploids in hop (Humulus lupulus L.). Plant Cell Reports, 20: 489-495 Schiessl S. V., Katche E., Ihien E., Chawla H. S., Mason A. S. 2019. The role of genomic

structural variation in the genetic improvement of polyploid crops. The Crop Journal, 7, 2:

127-140

Schilling S., Melzer R., McCabe P. F. 2020. Quick guide Cannabis sativa. Current Biology, 30: R1-R9

Soltis D. E., Soltis P. S. 1995. The dynamic nature of polyploid genomes. Proceedings of the National Academy of Science USA, 92: 8089-8091

Šrédl K., Prášilová M., Svoboda R., Severová L. 2020. Hop production in Czech Republic and its international aspects. Heliyon 6, 7, doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e04371: 11 str.

Švécarová M., Navrátilová B., Hašler P., Ondřej V. 2019. Artificial induction of tetraploidy in Humulus lupulus L. using oryzalin. Acta agrobotanica, 72, 2, doi: 10.5586/aa.1764: 10 str.

Touchell D. H., Palmer I. E., Ranney T. G. 2020. In vitro ploidy manipulation for crop improvement. Frontiers in Plant Science, 11, 722, doi: 10.3389/fpls.2020.00722: 11 str Trojak-Goluch A., Skomra U. 2013. Artificially induced polyploidization in Humulus lupulus

L. and its effect on morphological and chemical traits. Breeding Science, 63: 393-399 Trojak-Goluch A., Skomra U. 2018. Breeding of triploid common hop cultivars (Humulus

lupulus L.). Polish Jurnal of Agronomy, 34: 3-10

Turner C. E., Elsohly M. A., Boeren E. G. 1980. Constituents of Cannabis sativa L. XVII. A review of the natural constituents. Journal of Natural Products, 43, 2: 169-234

(27)

20 ZAHVALA

Za strokovne nasvete, pomoč in razumevanje pri izdelavi diplomske naloge se zahvaljujem mentorici izr. prof. dr. Jani MUROVEC in recenzentu doc. dr. Marko FLAJŠMANU.

Za vsestransko pomoč tekom študija se zahvaljujem tudi svoji družini in najbližjim, ki so me podpirali in motivirali.

Najlepša hvala vsem!