Kot pri eksonu 2 lahko tudi tu opazimo, da je v primerjavi z referenčnim zaporedjem prišlo do veliko aminokislinskih zamenjav, vendar pa je tu do večine zamenjav prišlo pri vseh vzorcih krškopoljskih prašičev, torej verjetno tu ni prišlo do napake pri določanju nukleotidnega zaporedja, ampak je to dejansko nukleotidno zaporedje krškpoljskih prašičev.
24 Slika 11: Poravnava nukleotidnih zaporedij za ekson 10.
Slika 12: Poravnava aminokislinskih zaporedij za ekson 10.
Pri eksonu 10 pa je v primerjavi z referenčnim zaporedjem ohranjenih večina aminokislin pri vseh vzorcih, torej v tem eksonu ne opazimo velike genetske variabilnosti med pasmami prašičev.
25
5 RAZPRAVA
DNA smo izolirali iz klasičnih biopsij ušesnega tkiva in mikro biopsij, pridobljenih z ušesnimi kleščami. V obeh primerih je bilo tkiva dovolj za uspešno izolacijo DNA, ki je omogočala pomnoževanje genomskih odsekov z verižno rekcijo s polimerazo. Količine izolirane DNA so bile v vseh primerih znotraj območja, ki zagotavlja uspešno pomnoževanje (1 do 1000 ng) [20].
Za določanje nukleotidnega zaporedja smo uporabili DNA krškopoljskih prašičev (04, 23, 25, 30) in vzorec nemškega prašiča (4295/21). Izvedli smo po štiri 20 μl PCR reakcije, za eksone 2, 3, 9 in 10. Za eksona 2 in 9 sta bili reakciji uspešni (slika 5 in 6), saj na gelu vidimo le eno specifično progo. Za ekson 10 je bila PCR manj uspešna, manj specifična, saj je na gelu vidnih več lis (slika 6). Za ekson 3 reakcija ni uspela. Po določitvi nukleotidnega zaporedja eksonov 2, 9 in 10 smo ugotovili, da dve nukleotidni zaporedji nista dovolj kvalitetni za nadaljnjo analizo (04 in 4295/21) za ekson 9.
Na podlagi strukture proteina ACE2 pri človeku in proteina S so aminokislinski ostanki, ki so pri ACE2 ključni za vodikove vezi in hidrofobne interakcije z receptor vezavno domeno proteina S, Ser19, Gln24, Asp30, Lys31, His34, Glu35, Asp38, Tyr41, Gln42, Tyr83, Asn330, Lys353, Asp355 in His377 [14, 21].
Pri referenčnem zaporedju pasme duroc so od teh aminokislin ohranjeni ostanki Ser19, Lys31, Glu35, Asp38, Tyr41, Gln42, Asn330, Lys353, Asp355 in His377. Do neujemanj pride pri Gln24 in His34, ki sta zamenjana z Leu, in Asp30, ki je zamenjan z Glu. Gln24 tvori vodikovo vez z N487 v proteinu S, in ker je zamenjan z levcinom, ne more več tvoriti vodikove vezi.
His34 v središču veznega mesta je prav tako zamenjan z levcinskim ostankom, ki je večji in ne more tvoriti vodikove vezi. Asp30, ki tvori osrednji solni most, je zamenjan z glutamatom. Ker je tudi glutamat negativno nabit, solni most do Lys417 najverjetneje ostane nedotaknjen [14].
Pri naših analiziranih vzorcih krškopoljske pasme pride do več substitucij aminokislin; v primerjavi z ACE2 pri človeku so ohranjeni le Glu35, Asn330, Asp355 in His377. V primerjavi z referenčno sekvenco pasme duroc sta ohranjena Glu30 in Lys34, pri vseh naših analiziranih vzorcih pa so zamenjani Ser19 s Pro, Gln24 z Arg, Lys31 in Asp38 z Asn. Pri vseh vzorcih krškopoljskih prašičev (04, 23, 25 in 30) je namesto Tyr41 Asn in namesto Gln42 Lys; vzorec 4295/21 ima ta dva aminokislinska ostanka ohranjena. Pri vzorcu 30 je Lys353 zamenjan z Glu.
Že iz prejšnjih študij [5, 14, 21] lahko razberemo, da je afiniteta prašičjega ACE2 za vezavo virusnega proteina S manjša od afinitete človeškega. Izračunali so tudi Gibbsovo prosto energijo vezave ACE2 s proteinom S, in pri prašiču je ta v primerjavi s človekom znatno večja (- 128,67 kcal/mol pri človeku in − 46.31 kcal/mol pri prašiču), kar kaže, da pri prašiču ne pride do nekaterih ključnih interakcij med ACE2 in proteinom S [21].
26
V analiziranih vzorcih krškopoljskih praščev so popolnoma ohranjeni le štirje ključni aminokislinski ostanki, pasma duroc pa jih ima ohranjenih 10. To ovrže našo hipotezo, da imata pasmi duroc in krškopoljski prašič enako nukleotidno zaporedje za zapis za ACE2. To nakazuje, da je afiniteta vezave receptorja ACE2 s proteinom S pri krškopoljskih prašičih še manjša kot pri referenčni pasmi duroc. Krškopoljski prašiči so zato najverjetneje v majhni nevarnosti za okužbo s SARS-CoV-2. Vendar ta napoved temelji le na podlagi poravnave aminokislinskih ostankov, in bi za natančnejše rezultate morali izvesti tudi analize na podlagi 3D strukture receptorja ACE2.
27
6 ZAKLJUČEK
SARS-CoV-2, ki se je pojavil leta 2019, je po vsem svetu okužil milijone ljudi in močno vplival na vse vidike življenja. Ker virus ne okužuje le ljudi, ampak tudi živali, je potrebno ugotoviti, katere živali, ki so v najtesnejšem stiku s človekom, so najbolj dovzetne za okužbo z virusom.
S tem znanjem lahko preprečimo nenadzorovano širitev virusa med človeškimi in živalskimi populacijami in zaščitimo predvsem manjše živalske populacije pred okužbo. SARS-CoV-2 v celice vstopa po vezavi svojega proteina S na receptor ACE2 na membrani tarčne celice. V svoji diplomi sem določila zaporedje treh eksonov receptorja ACE2 pri prašiču, za katere smo ugotovili, da so najpomembnejši pri vezavi proteina S na ACE2. S poravnavo zaporedij sem ugotovila, da je prišlo do več zamenjav nekaterih ključnih aminokislin, ki so v stiku s proteinom S, in se zato najverjetneje zniža afiniteta vezave. Zaradi nizke afinitete vezave so krškopoljski prašiči, katerim je pripadala večina analiziranih vzorcev, najverjetneje v razmeroma majhni nevarnosti za okužbo s SARS-CoV-2. Tako je tudi malo verjetno, da bi se virus preko prašičev vračal v človeško populacijo. Da bi to lahko z gotovostjo trdili, pa bi bile potrebne še natančnejše študije, ki bi temeljile tudi na 3D strukturi kompleksa ACE2 in proteina S.
29
7 LITERATURA
[1] P. K. Datta, F. Liu, T. Fischer, J. Rappaport, X. Qin: SARS-CoV-2 pandemic and research gaps: Understanding SARS-CoV-2 interaction with the ACE2 receptor and implications for therapy. Theranostics 2020, 10(16). doi: 10.7150/thno.48076
[2] M.Y. Wang, R. Zhao, L. J. Gao, X. F. Gao, D. P. Wang, J. M. Cao: SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2020, 10: 587269. doi: 10.3389/fcimb.2020.587269
[3] COVID-19 Dashboard by the Center for Systems Science and Engineering (CSSE) at Johns Hopkins University (JHU), posodobljeno 20. 8. 2021 ob 14:2, URL:
https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/dashboards/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6 [4] T. Prince, S.L. Smith, A. D. Radford, T. Solomon, G. L. Hughes, E. I. Patterson: SARS-CoV-2 Infections in animals: Reservoirs for reverse zoonosis and models for study. Viruses 2021, 13: 494. https://doi.org/10.3390/v13030494
[5] A. Michelitsch, K. Wernike, L. Ulrich, T. C. Mettenleiter, M. Beer: SARS-CoV-2 in animals: From potential hosts to animal models. Advances in Virus Research 2021, 110: 59-102. doi: 10.1016/bs.aivir.2021.03.004
[6] Zoonoze. Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano. Novice, 15.3. 2021. URL:
https://www.nlzoh.si/objave/zoonoze/
[7] C. Haake, S. Cook, N. Pusterla, B. Murphy: Coronavirus infections in companion animals:
virology, epidemiology, clinical and pathologic features. Viruses 2020, 12(9):
1023. doi:10.3390/v12091023
[8] W. K. Jo, E. F. de Oliveira‐Filho, A. Rasche, A. D. Greenwood, K. Osterrieder, J. F. Drexler:
Potential zoonotic sources of SARS‐CoV‐2 infections. Transboundary and Emerging Diseases 2020, doi:10.1111/tbed.13872
[9] A. G. Harrison,T. Lin & P. Wang: Mechanisms of SARS-CoV-2 transmission and pathogenesis. Trends in Immunology 2020, doi:10.1016/j.it.2020.10.004
[10] A. Costagliola, G. Liguori, D. d'Angelo, C. Costa, F. Ciani, A. Giordano: Do animals play a role in the transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2)?
A commentary. Animals 2021, doi: https://dx.doi.org/10.3390/ani1101 0016
[11] F. Scialo, A. Daniele, F. Amato, L. Pastore, M. G. Matera, M. Cazzola, G. Castaldo, A.
Bianco: ACE2: The major cell entry receptor for SARS-CoV-2. Lung 2020, 198(6): 867-877.
doi: 10.1007/s00408-020-00408-4
[12] Y. Li, W. Zhou, L. Yang, R. You: Physiological and pathological regulation of ACE2, the SARS-CoV-2 receptor. Pharmacological Research 2020. doi:10.1016/j.phrs.2020.104833 [13] W. Ni, X. Yang, D. Yang, J. Bao, R. Li, Y. Xiao, C. Hou, H. Wang, J. Liu, D. Yang, Y.
Xu, Z. Cao, Z. Gao: Role of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) in COVID-19. Critical Care 2020, 24(1). doi:10.1186/s13054-020-03120-0
30
[14] X. Zhai, J. Sun, Z. Yan, J. Zhang, J. Zhao, Z. Zhao, Q. Gao, W. T. He, M. Veit, S. Su:
Comparison of SARS-CoV-2 spike protein binding to ACE2 receptors from human, pets, farm animals, and putative intermediate hosts. Journal of Virology 2020. doi:10.1128/jvi.00831-20 [15] P. V’kovski, A. Kratzel, S. Steiner, H. Stalder, V. Thiel: Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology 2020.
doi:10.1038/s41579-020-00468-6
[16] J. Luan, X. Jin, Y. Lu, L. Zhang: SARS-CoV-2 spike protein favors ACE2 from Bovidae and Cricetidae. Journal of Medical Virology2020, 92(9): 1649-1656. doi: 10.1002/jmv.25817 [17] Medical Definition of Seroconversion, Melissa Conrad Stöppler, pregledano 29. 3. 2021.
URL: https://www.medicinenet.com/seroconversion/definition.htm
[18] E. I. Patterson, G. Elia, A. Grassi, A. Giordano, C. Desario, M. Medardo, S. L. Smith, E.
R. Anderson, T. Prince, G. T. Patterson, E. Lorusso, M. S. Lucente, G. Lanave, S. Lauzi, U.
Bonfanti, A. Stranieri, V. Martella, F. Solari Basano, V. R. Barrs, A.D. Radford, U. Agrimi, G. L. Hughes, S. Paltrinieri, N. Decaro: Evidence of exposure to SARS-CoV-2 in cats and dogs from households in Italy. Nature Communications 2020. 11(1): 6231. doi: 10.1038/s41467-020-20097-0
[19] M. Fritz, B. Rosolen, E. Krafft, P. Becquart, E. Elguero, O. Vratskikh, S. Denolly, B.
Boson, J. Vanhomwegen, M. A. Gouilh, A. Kodjo, C. Chirouze, S. G. Rosolen, V. Legros, E.
M. Leroy: High prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in pets from COVID-19+ households.
One Health 2021. doi: 10.1016/j.onehlt.2020.100192
[20] T. C. Lorenz: Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments 2012. doi:10.3791/3998
[21] T. Koley, S. Madaan, S. R. Chowdhury, M. Kumar, P. Kaur, T. P. Singh, A. S.
Ethayathulla: Structural analysis of COVID-19 spike protein in recognizing the ACE2 receptor of different mammalian species and its susceptibility to viral infection. 3 Biotech 2021. 11(2):
109. doi: 10.1007/s13205-020-02599-2.