DIPLOMSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Tina Arnšek

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA

Genetska pestrost nukleotidnega zaporedja kodogenih regij proteina ACE2 pri prašiču (Sus scrofa)

DIPLOMSKO DELO

Tina Arnšek

M

ENTOR

: prof. dr. Peter Dovč

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Tina Arnšek sem avtorica diplomskega dela z naslovom Genetska pestrost nukleotidnega zaporedja kodogenih regij proteina ACE2 pri prašiču (Sus scrofa).

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Petra Dovča;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

 je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, dne 3. 9. 2021 Podpis avtorice:

(6)

(7)

Genetska pestrost nukleotidnega zaporedja kodogenih regij proteina ACE2 pri prašiču (Sus scrofa)

Povzetek: Decembra 2019 se je v mestu Wuhan na Kitajskem pojavil novi betakoronavirus, SARS-CoV-2, povzročitelj koronavirusne bolezni 2019 (COVID-19).

SARS-CoV-2 je tretji zoonotski človeški koronavirus v tem stoletju, ki je povzročil epidemijo. SARS-CoV-2 za vstop v gostiteljske celice z receptor vezavno domeno na S proteinu prepoznajo receptor ACE2 (angiotenzin konvertaza 2) na celicah gostitelja.

SARS-CoV-2 se lahko prenaša tudi s človeka na žival. Primarna struktura ACE2 kaže na veliko podobnost aminokislinskega zaporedja pri človeku in različnih živalskih vrstah.

Zaradi podobnosti tarčnih proteinov za vezavo virusa SARS-CoV-2 s tarčnimi proteini človeka, nekatere vrste domačih živali predstavljajo potencialni rezervoar za razmnoževanje virusa in lahko povzročijo (ponovno) razširjanje okužb v človeški populaciji. Določila sem nukleotidno zaporedje, ki zapisuje ACE2 receptor nekaterih krškopoljskih prašičev, in poskušala napovedati, ali lahko predstavljajo potencialni rezervoar za SARS-CoV-2. Ugotovila sem, da se ACE2 receptorji krškopoljskih prašičev od človeškega ACE2 razlikujejo v nekaterih ključnih aminokislinah, na katere se veže SARS-CoV-2, in zato najverjetneje niso v veliki nevarnosti za okužbo s tem virusom.

Ključne besede: ACE2, SARS-CoV-2, zoonoza

Genetic variability of ACE2 coding regions in pig (Sus scrofa)

Abstract: In December 2019, a new betacoronavirus, SARS-CoV-2, the causative agent of coronavirus disease 2019 (COVID-19), appeared in Wuhan, China. SARS-CoV-2 is the third zoonotic human coronavirus in this century to cause an epidemic. For entry into host cells SARS-CoV-2 recognizes the ACE2 receptor (angiotensin-converting enzyme 2) on host cells via the receptor binding domain of the S protein. SARS-CoV-2 can also be transmitted from human to animal. The primary structure of ACE2 displays very high amino acid sequence similarity in humans and different animal species. Due to the similar target proteins for SARS-CoV-2 virus binding to human target proteins, some domestic animal species represent a potential reservoir for virus replication and may cause (re) spread of infection in the human population. I determined the DNA sequence of the ACE2 receptor of several krškopoljski pigs, and tried to predict whether they might represent a potential reservoir for SARS-CoV-2. I have found that ACE2 receptors in krškopoljski pigs differ from human ACE2 in some of the key amino acids to which SARS-CoV-2 binds, and therefore are most likely not at high risk for infection with this virus.

Keywords: ACE2, SARS-CoV-2, zoonosis

(8)

(9)

KAZALO

1 UVOD ... 1

1.1 Koronavirusi ... 1

1.1.1 Struktura SARS-CoV-2 ... 2

1.2 Angiotenzin konvertaza 2 ... 4

1.3 Vloga ACE2 pri okužbi s SARS-CoV-2 ... 5

1.4 Vstop SARS-CoV-2 v celico ... 6

1.5 SARS-CoV-2 in živali ... 8

1.5.1 Prašiči ... 9

1.5.2 Hermelini ... 10

1.5.3 Živali v živalskih vrtovih ... 10

1.5.4 Mačke ... 11

1.5.5 Psi ... 12

2 NAMEN DELA IN HIPOTEZA ... 13

3 MATERIALI IN METODE ... 15

3.1 Izolacija DNA ... 15

3.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR) ... 16

3.3 Določanje nukleotidnega zaporedja ... 17

4 REZULTATI ... 19

5 RAZPRAVA ... 25

6 ZAKLJUČEK ... 27

7 LITERATURA ... 29

(10)

(11)

KAZALO SLIK

Slika 1: Struktura SARS-CoV-2 ... 3

Slika 2: Funkcija ACE2 v renin-angiotenzinskem sistemu (RAS) in vpliv SARS-CoV-2 na RAS. ... 5

Slika 3: DNA, izolirana iz vzorcev prašičjih ušes. ... 20

Slika 4: DNA, izolirana iz ušes divjih prašičev. ... 20

Slika 5: PCR produkti za ekson 2. ... 21

Slika 6: PCR produkti za eksona 9 in 10. ... 21

Slika 7: Poravnava nukleotidnih zaporedij za ekson 2. ... 22

Slika 8: Poravnava aminokislinskih zaporedij za ekson 2. ... 22

KAZALO TABEL

Tabela 1: Količine reagentov za 20 μl PCR reakcijo. ... 16

Tabela 2: Reagenti in njihove količine za čiščenje PCR produkta. ... 17

Tabela 3: Reagenti in njihove količine za sekvenčno reakcijo. ... 17

Tabela 4: Koncentracije DNA, izolirane iz prašičjih ušes... 19

(12)

(13)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

ACE – angiotenzin konvertaza oz. angiotenzin pretvarjajoči encim (angl. angiotensin- converting enzyme)

ACE2 – angiotenzin konvertaza 2 oz. angiotenzin pretvarjajoči encim 2 (angl.

angiotensin-converting enzyme 2) AGE – agarozna gelska elektroforeza Ang-I – angiotenzin I

Ang-II – angiotenzin II

COVID-19 – koronavirusna bolezen 2019 (angl. coronavirus disease 2019) DNA – deoksiribonukleinska kislina

ELISA – encimskoimunski test (angl. enzyme-linked immunosorbent assay) MERS-CoV – koronavirus, ki povzroča bližnjevzhodni respiratorni sindrom PCR – verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction) RAS – renin-angiotenzinski sistem

RBD – vezavna domena za receptor (angl. receptor binding domain) RNA – ribonukleinska kislina

SARS-CoV – koronavirus, ki povzroča hud akutni respiratorni sindrom (angl. severe acute respiratory syndrome coronavirus)

SARS-CoV-2 – koronavirus 2, ki povzroča hud akutni respiratorni sindrom (angl. severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)

TMPRSS2 – transmembranska serinska proteaza 2 (angl. transmembrane protease serine 2)

(14)

(15)

1

1 UVOD

1.1 Koronavirusi

Decembra 2019 so v mestu Wuhan na Kitajskem prvič opazili novi betakoronavirus, koronavirus 2, ki povzroča hud akutni respiratorni sindrom (SARS-CoV-2), in je povzročitelj koronavirusne bolezni 2019 (COVID-19). Virus se je hitro razširil, okužili so se milijoni ljudi po vsem svetu, 11. marca 2020 pa je bila razglašena pandemija COVID-19. Po SARS-CoV (koronavirus, ki povzroča hud akutni respiratorni sindrom) in MERS-CoV (koronavirus, ki povzroča bližnjevzhodni respiratorni sindrom) je SARS- CoV-2 tretji zoonotski koronavirus v tem stoletju, ki je povzročil epidemijo, vendar je SARS-CoV-2 bolj virulenten in okuži več ljudi kot druga dva virusa. Do konca avgusta 2021 se je s SARS-CoV-2 po vsem svetu okužilo že več kot 212 milijonov ljudi, umrlo pa jih je več kot 4,4 milijonov [1, 2, 3].

Do danes je znanih sedem človeških koronavirusov in vsi so verjetno živalskega izvora.

HCoV-OC43 in HCoV-HKU1, ki pri imunokompetentnih posameznikih povzročata le blago bolezen zgornjih dihal, verjetno izvirata iz glodalcev. Predhodne viruse HCoV- 229E in HCoV-NL63, ki prav tako običajno povzročajo le blage okužbe pri ljudeh, so nedavno našli pri afriških netopirjih. Bolj patogeni so virusi SARS-CoV (ki se je pojavil leta 2002 v provinci Guangdong na Kitajskem), MERS-CoV (2012), in trenutno aktualni SARS-CoV-2 iz leta 2019. SARS-CoV izvira iz netopirjev in se je na ljudi prenesel preko cibetovk, medtem ko se je MERS-CoV prenesel na človeka preko kamel. Zgodnja ugibanja so predlagala dve poti izvora SARS-CoV-2: naravna selekcija v okuženih ljudeh po zoonotskem prenosu, ali pa naravna selekcija v vmesnem živalskem gostitelju pred prenosom na človeka. Zoonoze so nalezljive bolezni, ki se z živali prenašajo na človeka.

Sprva so predvidevali, da so številni prvi okuženi s SARS-CoV-2 obiskali tržnico živih živali v mestu Wuhan, kjer je visoka gostota živali, kar kaže na to, da je žival na trgu morda prenesla virus na prve posameznike. Vendar je po sedanjih informacijah bolj verjetno, da to ni bilo mesto prvega prenosa virusa in je delovalo le kot dogodek superširjenja [4, 5, 6].

Koronavirusi spadajo v poddružino Coronavirinae družine Coronaviridae, poddružina pa vsebuje štiri rodove: alfakoronavirus, betakoronavirus, gamakoronavirus in deltakoronavirus. Coronaviridae je družina virusov, ki okuži številne različne razrede in vrste vretenčarjev, vključno z ljudmi. Povzročajo bolezni, ki segajo od lokaliziranih okužb dihal ali črevesja do sistemske bolezni. Koronavirusi povzročajo veliko obolevnost in umrljivost pri domačih živalih, vključno s psi, mačkami, belimi dihurji, konji,

(16)

2

alpakami, prašiči, govedom, perutnino ter številnimi prosto živečimi živalskimi vrstami [2, 7].

Bioinformacijske analize so pokazale, da SARS-CoV-2 spada v linijo betakoronavirusa 2B. SARS-CoV-2 je enoverižen RNA virus (+ssRNA), njegov genom pa obsega približno 30 000 nukleotidov. Koronavirusi imajo največji genom med RNA virusi s štirimi odprtimi bralnimi okviri (ORF). V začetku epidemije v Wuhanu so znanstveniki rekonstruirali celotno zaporedje genoma virusa, izoliranega iz petih bolnikov, okuženih s SARS-CoV-2. Ta genomska zaporedja imajo 79,5-odstotno identičnost genomskega zaporedja s SARS-CoV in se od njega očitno razlikujejo. Znanstveniki so primerjali celotno genomsko zaporedje SARS-CoV-2 in druge razpoložljive genome betakoronavirusov. Rezultati kažejo največjo podobnost (96 %) med SARS-CoV-2 in sevi koronavirusa BatCov RaTG13, kar kaže, da lahko SARS-CoV-2 prihaja iz netopirjev in se je naravno razvil iz koronavirusa netopirjev RaTG13 [2, 4].

Nejasno je, ali so poleg učinkovitega prenosa s človeka na človeka možne stalne zoonotske okužbe. Nasprotno pa lahko pride do prenosa s človeka na žival na podlagi dokazov, pridobljenih iz naravnih in eksperimentalnih okolij. Nekatere mesojede živali, vključno z domačimi mačkami, belimi dihurji in hermelini, so zelo dovzetne za SARS- CoV-2, v nasprotju s perutnino, govedom in prašiči [8].

Okužba s SARS-CoV-2 povzroča simptome, podobne gripi, ki lahko napredujejo do akutne dihalne stiske (ARDS), pljučnice, odpovedi ledvic in smrti. Najpogostejši simptomi so zvišana telesna temperatura, kašelj in dispneja. Inkubacijska doba pri COVID-19 traja okoli 5-6 dni. Znanstveniki ugotavljajo, da COVID-19 ne vključuje le kratkotrajnih bolezni dihal oziroma prebavil, temveč ima lahko tudi dolgotrajne posledice, kot je vnetje miokarda [9].

1.1.1 Struktura SARS-CoV-2

Struktura SARS-CoV-2 vključuje štiri glavne proteine, ki so pomembni za sestavljanje in infektivnost viriona: glikoprotein bodice (spike, S), protein ovojnice (E), membranski protein (M) in nukleokapsidni protein (N) (slika 1), in 16 glavnih nestrukturnih proteinov (nsp1−16). Protein N v tesni povezavi z genomsko virusno RNA (gRNA) tvori spiralno nukleokapsido, ki se stabilizira z vezavo na protein M. Virusni genom in spiralna nukleokapsida sta obdana z lipidnim dvoslojem, v katerem so zasidrani proteini S, E in M. Transmembranska proteina E in M sodelujeta pri sestavljanju virionov. Protein S virusa SARS-CoV-2 je 1273 aminokislin dolg protein, sestavljen iz dveh podenot, imenovanih S1 in S2, poleg tega pa vsebuje na N-koncu 19 aminokislin dolg signalni peptid in na C-koncu kratko transmembransko domeno ter kratko citoplazemsko domeno.

(17)

3

Regija S1 ima N-končno domeno (NTD) in C-končno domeno (CTD), ki delujeta kot receptor vezavna domena (RBD). Proteini bodice tvorijo homotrimere, ki štrlijo z virusne površine. Proteina S SARS-CoV-2 in SARS-CoV si delita 76,5 % identičnost aminokislinskega zaporedja [1, 7, 10].

Slika 1: Struktura SARS-CoV-2 [15].

Pri vseh koronavirusih gostiteljske proteaze cepijo glikoprotein S na mestu cepitve S2', in tako aktivirajo proteine, ki so ključnega pomena za zlitje membrane virusa in gostiteljske celice z ireverzibilnimi konformacijskimi spremembami. Po cepitvi nastaneta dve podenoti, S1 in S2. Funkcija podenote S1 je vezava na receptor na celici gostitelja, funkcija podenote S2 pa je fuzija membrane virusa in gostiteljske celice [2].

SARS-CoV-2 za vstop v gostiteljske celice prepoznajo receptor ACE2 (angiotenzin konvertaza 2 oz. angiotenzin pretvarjajoči encim 2) na celicah gostitelja preko vezavne domene za receptor (RBD). Protein S se lahko nahaja v dveh konformacijskih stanjih, zaprtem in odprtem. V zaprtem stanju trije motivi za prepoznavanje ne štrlijo navzven, v odprtem stanju pa je RBD v konformaciji, ki je potrebna za zlitje membrane SARS-CoV- 2 in membrane gostiteljske celice, da lahko SARS-CoV-2 vstopi v gostiteljsko celico [2].

Nestrukturni proteini vplivajo na procesiranje, translacijo in transport proteinov, s čimer lahko inhibirajo obrambo gostitelja. Ob okužbi s SARS-CoV-2 protein NSP16 veže mRNA prepoznavne domene U1 in U2 snRNA, da zavira procesiranje mRNA. NSP1 se veže na 18S ribosomsko RNA v mRNA vstopnem kanalu ribosoma in tako moti translacijo mRNA [2].

(18)

4

1.2 Angiotenzin konvertaza 2

Angiotenzin konvertaza 2 oz. angiotenzin pretvarjajoči encim 2 (ACE2) je peptidaza renin-angiotenzinskega sistema (RAS), in so jo prvotno opisali leta 2000 kot homologa angiotenzin konvertaze (ACE), s katero si deli 40 % identitete in 60 % podobnosti. Gen za ACE2 se nahaja na kromosomu X, na kromosomski lokaciji Xp22, in je sestavljen iz 19 eksonov, ki z alternativnim izrezovanjem ustvarijo 6 variant. ACE2, ki ga sestavlja 805 aminokislin, ima samo eno zunajcelično N-končno domeno, ki vsebuje aktivno katalitično mesto, C-končno membransko sidro in ohranjeno HEXXH cink vezavno domeno. Obstajata dve obliki ACE2. Daljši mACE2 je prisoten na celičnih membranah in je sestavljen iz transmembranskega dela in zunajcelične domene. Ta oblika je receptor za SARS-CoV-2. Druga oblika, sACE2, pa je topna oblika, ki nima membranskega dela in se izloči v krvni obtok, kjer kroži v nizkih koncentracijah [11, 12].

Renin-angiotenzinski sistem (RAS) vzdržuje homeostazo krvnega tlaka ter ravnovesje tekočin in soli. Homeostaza RAS je ključna za fiziološke in patološke procese v različnih organih, vključno s srcem, ledvicami in pljuči. Sestavljen je iz treh glavnih komponent:

renina, angiotenzina II in aldosterona. ACE2 je močan negativni regulator RAS, ki je ključnega pomena za vzdrževanje homeostaze RAS. V klasičnem RAS renin cepi substrat angiotenzinogen, da tvori neaktivni dekapeptid angiotenzin I (Ang-I), nato pa ACE (dipeptidil karboksipeptidaza) odstrani dve aminokislini na karboksilnem koncu Ang-I, da dobimo aktivni oktapeptid angiotenzin II (Ang-II), močan vazokonstriktor.

Angiotenzin II je najbolj reprezentativen bioaktivni peptid v RAS, sodeluje pri napredovanju bolezni srca in ožilja, kot so hipertenzija, miokardni infarkt in srčno popuščanje [1, 12, 13].

ACE2 razgradi angiotenzin II (odstrani C-končni fenilalanin v Ang II) in ga pretvori v Ang (1-7), ki je vazodilatator, antiproliferativen in apoptotičen peptid. Poleg sistemskega učinka pri uravnavanju krvnega tlaka ima ACE2 lokalne regulatorne učinke pri patoloških spremembah v več organih, vključno s srcem, ledvicami in pljuči. ACE2 uravnava tudi absorpcijo aminokislin v ledvicah in črevesju ter modulira izražanje transporterjev za aminokisline. Poleg tega lahko pri izmeničnih učinkih ACE2 in ACE angiotenzin (1–7) nastane brez Ang-II. Ang-I lahko neposredno pretvorimo v angiotenzin (1–7) tudi z endopeptidazami in oligopeptidazami. Zaradi večje afinitete med ACE in Ang-I je klasična pot Ang-II do angiotenzina (1–7) pogostejša. Angiotenzin (1–7) se kot ligand veže na receptor MAS, z G-proteinom sklopljen receptor, kar povzroči nasprotni učinek kot Ang-II [1, 12, 13].

(19)

5

SARS-CoV-2 okuži epitelijske in endotelijske celice, ki izražajo ACE2, v pljučih in drugih organih, kar vodi v znižanje delovanja ACE2 v endoteliju pljuč in verjetno tudi v drugih organih, kot so ledvice. Znižanje delovanja ACE2 vodi do nenadzorovanega kopičenja Ang II, kar lahko pospeši napredovanje COVID-19 s povečano aktivnostjo RAS (slika 2) [1].

Slika 2: Funkcija ACE2 v renin-angiotenzinskem sistemu (RAS) in vpliv SARS-CoV-2 na RAS [1].

ACE2 se izraža v skoraj vseh človeških organih. V dihalnem sistemu se ACE2 večinoma izraža na alveolarnih epitelijskih celicah tipa II, hkrati pa se šibko izraža na površini epitelijskih celic v ustni in nosni sluznici ter nazofarinksu, kar kaže, da so pljuča primarni cilj SARS-CoV-2. Poleg tega se ACE2 močno izraža na miokardnih celicah, ledvičnih celicah proksimalnih tubulov in urotelijskih celicah mehurja in je izrazito izražen na enterocitih tankega črevesa, zlasti v ileumu. Fagocitiran virus v makrofagih se lahko prek krvnega obtoka razširi iz pljuč v druge organe z visoko stopnjo izražanja ACE2. Poročali so o aktivni virusni replikaciji v enterocitih tankega črevesa, SARS-CoV-2 pa so uspešno izolirali tudi iz fekalnih vzorcev [13].

1.3 Vloga ACE2 pri okužbi s SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 vstopa v gostiteljsko celico preko istega receptorja kot SARS-CoV, angiotenzin konvertaze 2 (ACE2). Dokazali so, da lahko SARS-CoV-2 vstopi v celice, ki izražajo ACE2, ne pa tudi v celice brez ACE2 ali celice, ki izražajo druge receptorje za koronavirus, kot sta aminopeptidaza N in dipeptidil peptidaza 4 (DPP4), kar potrjuje, da je ACE2 edini celični receptor za SARS-CoV- 2. Nadaljnje študije so pokazale, da je

(20)

6

afiniteta vezave glikoproteina S SARS-CoV-2 na ACE2 10- do 20-krat večja kot afiniteta vezave SARS-CoV na ACE2. Znanstveniki so identificirali več aminokislin v SARS- CoV-2 v primerjavi s SARS-CoV, ki so v interakciji z ACE2, in tvorijo tudi več vodikovih in van der Waalsovih vezi [1, 13, 14].

Raziskovalci so z in vitro študijami ugotovili, da:

 ACE2 učinkovito veže S1 domeno proteina S SARS-CoV-2;

 je le topna oblika ACE2, ne pa ACE1, blokirala povezavo domene S1 z ACE2;

 se SARS-CoV-2 učinkovito razmnožuje v celicah 293T, transficiranih z zapisom za ACE2, vendar ne na celicah, ki niso bile transficirane;

 razmnoževanje virusa so blokirala le protitelesa proti ACE2, in ne protitelesa proti ACE1. Poskus so izvedli na celicah Vero E6 iz ledvic afriške zelene opice, ki so občutljive na okužbo s SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV- 2. Poleg tega eksogeno izražanje ACE2 omogoča, da refraktorne celične linije omogočajo replikacijo SARS-CoV-2.

Ti rezultati prepričljivo dokazujejo, da je ACE2 funkcionalni receptor za SARS-CoV-2 [1].

Pomanjkanje ACE2 pri miših povzroči dramatično zmanjšanje replikacije virusa in veliko manj hude patološke spremembe v pljučih v primerjavi z mišmi divjega tipa. Zaradi prekomerne ekspresije humanega ACE2 (hACE2) pri transgenih miših obstaja večja verjetnost, da bodo razvile hude fenotipske znake SARS, podobne tistim pri ljudeh.

Injekcija S proteina SARS-CoV v miši poslabša akutno pljučno odpoved in vivo.

Rekombinantni ACE2 lahko zaščiti miši pred hudo akutno poškodbo pljuč z blokiranjem vezave SARS-CoV na membransko obliko ACE2 v pnevmocitih, kar kaže, da ima lahko topni ACE2 terapevtski potencial za zdravljenje SARS in COVID-19 [1].

1.4 Vstop SARS-CoV-2 v celico

ACE2 je celični receptor, na katerega se veže glikoprotein bodice na ovojnici koronavirusa. Mehanizem vstopa SARS-CoV-2 v gostiteljske celice je sledeč: na ACE2 se veže receptor vezavna domena glikoproteina S SARS-CoV-2. Po vezavi se aktivira fuzija membrane virusa in gostiteljske celice, virusna RNA pa se nato sprosti v citoplazmo. Pri okužbi s SARS-CoV-2 se nepoškodovani ACE2 ali njegova transmembranska domena skupaj z virusom prenese v notranjost celice. Glikoprotein S ne inhibira katalitičnega aktivnega mesta ACE2, postopek vezave pa je neodvisen od aktivnosti peptidaze ACE2 [13].

(21)

7

V procesa vezave in fuzije membran so vključene celične proteaze (kot so domena dezintegrina in metalopeptidaze 17 [ADAM17], transmembranska serinska proteaza 2 [TMPRSS2], encim za pretvorbo TNF in endosomske cisteinske proteaze, katepsina B in L), ki cepijo protein S na S1 podenoto, ki vsebuje receptorsko vezavno domeno (RBD), in S2, ki omogoča fuzijo viriona s celično membrano. Proteolitična cepitev proteina S na dveh mestih (S1/S2 in S2´) je potrebna za fuzijo viriona in gostiteljske celice. Cepitev izvede transmembranska serinska proteaza TMPRSS2, vendar jo lahko v odsotnosti nadomesti lizosomska proteaza katepsin L [14].

Analiza zaporedja SARS-CoV-2 dokazuje prisotnost dodatnih štiri aminokislin (PRRA) med S1 in S2 v primerjavi s SARS-CoV, kar ima za posledico uvedbo mesta cepitve s furinom, ki spada med proprotein konvertaze. To zaporedje je ohranjeno med vsemi doslej sekvenciranimi izolati SARS-CoV-2, vendar ga ne najdemo v zaporedju proteina S njegovega najbližjega sorodnika, RaTG13. Cepitev s furinom povzroči povečano okužbo in so jo predlagali kot ključni dogodek v razvoju SARS-CoV-2, saj je za uspešno okužbo potrebna učinkovita cepitev proteina S in je glavni dejavnik pri premagovanju ovir za okužbe med različnimi vrstami živali. Dokazali so tudi, da je endosomski modulator pH, amonijev klorid, ki blokira aktivnost katepsina B in L, močno zaviral vstop SARS-CoV-2 v celice TMPRSS2-293T. Poleg tega je kamostat mezilat, inhibitor TMPRSS2, delno blokiral vstop SARS-CoV-2 v celice, medtem ko je E-64d, inhibitor katepsina B in L, v kombinaciji s kamostat mezilatom v celoti inhibiral s proteinom S posredovan vstop SARS-CoV-2 v celice [1, 13, 15].

TMPRSS2 proteolitično cepi in aktivira protein S v podenoti S1, kar olajša vezavo virusa na površino tarčnih celic. TMPRSS2 se izraža v pljučnem tkivu in podsegmentarnih bronhialnih vejah; v podsegmentarnih bronhialnih vejah se ACE2 pretežno izraža v prehodnem tipu sekretornih celic. Kolokalizacija TMPRSS2 z ACE2 poveča vstop virusa v celico, kar je povezano s TMPRSS2-posredovano proteolizo adsorbiranih kompleksov S in ACE2. Pomen TMPRSS2 pri posredovanju učinkovite virusne okužbe je dokazan pri miših s pomanjkanjem TMPRSS2, ki so po okužbi s SARS-CoV-2, prilagojeni za miši, zmanjšale izgubo telesne teže in imele nižji titer virusa v pljučih. Metaloproteaza ADAM17, prav tako lahko cepi ACE2. Ugotovili so, da TMPRSS2 tekmuje z ADAM17 pri procesiranju ACE2, kar kaže, da lahko ACE2, cepljena z ADAM17, ščiti organe.

Nasprotno pa lahko izločanje ektodomene ACE2, regulirano z ADAM17, ob sodelovanju s TMPRSS2 podpira tudi vstop SARS-CoV-2 v celice z endocitozo in s tem prispeva k okužbi. Tako natančna vloga izločanja ACE2, posredovanega z ADAM17, pri okužbi ledvic in pljuč s SARS-CoV-2 zahteva nadaljnje preiskave. Te ugotovitve kažejo, da

(22)

8

kompleks na celični površini, ki vsebuje primarni receptor, ACE2, in TMPRSS2, deluje kot glavni portal za aktivacijo SARS-CoV in SARS-CoV-2 ter njun vstop v celico [1].

Skupaj je 17 aminokislinskih ostankov proteina S v stiku z 20 aminokislinskimi ostanki ACE2, od katerih jih osem tvori vodikove vezi s 13 ostanki v proteinu S. Druge interakcije so večinoma hidrofobne in vključujejo veliko ostankov tirozina v virusni bodici.

Precejšen del vezavne energije bi lahko zagotovil nastanek solnega mostu med negativno nabitim Asp30 v ACE2 s pozitivno nabitim Lys417 v proteinu S, ki se nahaja na sredini interakcijske površine. Druga stična mesta so Ser19 v ACE2, ki se veže na Ala457 in Gly458; ter Leu45, ki se veže na Gln325 in Glu329 proteina S [14].

1.5 SARS-CoV-2 in živali

Ker ima SARS-CoV-2 zelo verjetno zoonotski izvor, je pomembno, da identificiramo prvotni rezervoar živali, da s tem preprečimo prihodnje podobne izbruhe. S tem namenom so v zadnjem letu izvedli veliko poskusov z vzorci različnih živalskih vrst, ki so jih bodisi vzorčili na terenu, bodisi poskusno okužili s SARS-CoV-2, da bi ocenili njihovo dovzetnost za okužbo. Glede na približno 96-odstotno podobnost zaporedja med SARS- CoV-2 in betakoronavirusi RaTG13, ki jih najdemo pri netopirju Rhinolophus affinis (vmesni podkovnjak) na Kitajskem, in odkritjem širokega spektra nadaljnjih koronavirusov pri netopirjih (red Chiroptera), raziskovalci sumijo, da so netopirji gostitelj za predhodnika virusa SARS-CoV-2 [5].

SARS-CoV-2 se lahko prenaša tudi s človeka na žival. Primarna struktura ACE2 kaže na veliko podobnost zaporedja pri različnih živalskih vrstah, vključno z ljudmi, nečloveškimi primati, hišnimi ljubljenčki, domačimi živalmi in divjimi živalmi. Zaradi podobnosti tarčnih proteinov za vezavo virusa SARS-CoV-2 s tarčnimi proteini človeka, nekatere vrste domačih živali predstavljajo potencialni rezervoar za razmnoževanje virusa in lahko povzročijo (ponovno) razširjanje okužb v človeški populaciji. Nekatere vrste živali razvijejo podobne klinične znake kot ljudje, zato predstavlja potencialna okužba s SARS-CoV-2 tudi nevarnost za preživetje predvsem majhnih živalskih populacij [10].

Do sedaj še ni popolnoma jasno, katere živalske vrste so bile vključene v razvoj SARS- CoV-2 in katere vrste se lahko okužijo tem virusom. V ACE2 je 20 ključnih aminokislinskih ostankov, ki so odločilni za vezavo proteina S SARS-CoV-2. Na podlagi teh 20 aminokislinskih ostankov so raziskovalci analizirali ACE2 sesalcev, ptic, želv in kač. Ugotovili so, da ACE2 želv in kač nima sposobnosti povezovanja s proteinom S, zato lahko plazilce izključimo s seznama potencialnih gostiteljev za SARS-CoV-2.

(23)

9

Ptičji ACE2 se tudi verjetno ne more povezati z RBD SARS-CoV-2, saj nima ključnega lizina, ki ustreza K31 v človeškem ACE2. Predvidevali so, da bo ACE2 luskavca manj učinkovito prepoznaval SARS-CoV-2 RBD, ker je ohranil le 14 od 20 kritičnih aminokislin. Ugotovili so tudi, da so ACE2 iz primatov, Bovidae (votlorogi), Cricetidae (glodavci) in kitov lahko prepoznali RBD SARS-CoV-2, saj imajo ohranjeno večino ključnih aminokislinskih ostankov v ACE2. Prašičji ACE2 ima ohranjenih 15 od 20 ključnih aminokislinskih ostankov, kar omogoča SARS-CoV-2 vstop v celice. ACE2 družin Bovidae in Cricetidae se ujemajo z več aminokislinami kot prašičji ACE2, zato bi morali prepoznati RBD SARS-CoV-2 [16].

Čeprav ni dokazov o okužbi s SARS-CoV-2 pri prostoživečih živalih, obstaja zaskrbljenost glede možnosti, da se zgodi reverzni zoonotski dogodek (t.j. prenos s človeka na žival) pri živalih, ki živijo v tesnem stiku z ljudmi, in s tem vzpostavitve stalnega virusnega rezervoarja v živalih. Živalske vrste, kot so govedo, ovca in drugi prežvekovalci, so lahko okužene z različnimi koronavirusi, vendar so dokazi o okužbi goveda s SARS-CoV-2 trenutno omejeni na eno samo študijo, kjer so eksperimentalno okužili šest goved (Bos taurus) po intranazalni poti in dvajset dni spremljali živali. Po 24 urah so vzpostavili stik s tremi neokuženimi živalmi, da bi preučili prenos. Pri dveh od šestih eksperimentalno okuženih goved so opazili izločanje virusa na nizki ravni, pri živalih, ki so bile v stiku z eksperimentalno okuženimi, pa niso opazili nobenega prenosa.

Do danes ni dokazov, da bi človek virus po naravni poti prenašal na govedo ali druge rejne živali. Prav tako trenutno še ni dokazov, da bi se ovce, konji, osli, kamele ali lame lahko okužili s SARS-CoV-2 [4].

1.5.1 Prašiči

Za Sus scrofa (prašiče), drugo glavno živinorejsko vrsto, so sumili na dovzetnost za SARS-CoV-2, saj so lahko okuženi z MERS-CoV in z več drugimi koronavirusi. Poleg tega so računalniške analize prašičjega ACE2 pokazale, da si deli velik del identitete s človeškim ACE2 v aminokislinskih ostankih, ki so pomembni za vezavo virusnega S proteina. In vitro se SARS-CoV-2 veže na HeLa celice z izraženim prašičjim ACE2, namesto človeškim. Poleg tega se SARS-CoV-2 razmnožuje v celičnih linijah prašičev SK-6 in ST, ne pa tudi v prašičjih sapnikih in pljučih. Na splošno je občutljivost prašičev na SARS-CoV-2 zelo nizka [5].

Prašičji ACE2 vsebuje pet aminokislinskih substitucij na interakcijski površini s proteinom S iz SARS-CoV-2 glede na človeški ACE2. Tri substitucije so na obrobju mesta vezave. Leu79 in Met82, ki sta v interakciji s Phe486 v S, sta konzervativno substituirana z izolevcinom oziroma treoninom. Gln24, ki tvori vodikovo vez z N487 v S

(24)

10

proteinu, je zamenjan z levcinom, ki ne more tvoriti vodikovih vezi. His34 v središču veznega mesta je prav tako zamenjan z ostankom levcina, ki je večji, vendar ne more tvoriti vodikove vezi. Asp30, ki tvori osrednji solni most, je zamenjan z glutamatom. Ker je tudi glutamat negativno nabit, solni most do Lys417 najverjetneje ostane nedotaknjen.

Lahko bi celo postal močnejši, saj je stranska veriga glutamata večja, zato je razdalja med negativno in pozitivno nabitimi ostanki manjša. Poleg tega se mesto N-glikozilacije Asn90 v človeškem ACE2 izgubi z izmenjavo v treonin [14].

1.5.2 Hermelini

Najtrdnejši dokazi o obratni zoonozi so zaenkrat na voljo pri hermelinih. Pri hermelinih je prišlo do več izbruhov okužb na farmah hermelinov v Španiji, ZDA, Franciji, Italiji, Kanadi, Grčiji, Litvi, na Danskem, Nizozemskem, Švedskem in na Poljskem. Na Nizozemskem so virus na kmetijo vnesli okuženi delavci. Na 16 prizadetih farmah hermelinov je 68 % zaposlenih imelo dokazano okužbo s SARS-CoV-2, vsaj dva delavca na kmetiji pa sta se okužila neposredno od živali. Do 6. januarja 2021 se je število okuženih kmetij samo na Nizozemskem povečalo na 69. To je edini dokaz, ki trenutno kaže na možen prenos z živali neposredno na človeka od začetka pandemije [4, 5].

Na petih farmah hermelinov na Danskem so se novembra 2020 pojavila poročila o

"hermelinski različici" SARS-CoV-2. S to različico (imenovano "grozd 5" – Cluster 5) se je okužilo 12 ljudi; "grozd 5" predstavlja različico virusa s kombinacijo mutacij, ki jih prej še niso videli. Vsi virusi, izolirani iz primerov v "grozdu 5", so imeli v proteinu S mutacijo Y453F. Znanstveniki menijo, da same mutacije niso zaskrbljujoče; ne pomenijo, da se bo virus učinkoviteje prenašal med ljudmi, za razliko od npr. britanske in južnoafriške različice. Poleg tega od septembra 2020 pri ljudeh niso odkrili nadaljnjih primerov različice "grozda 5". Naredili so tudi preiskave kuncev (Oryctolagus cuniculus) po okužbi s SARS-CoV-2. Nobena žival ni kazala kliničnih znakov, vendar so izločale virus iz nosu in grla in dokazali so, da so serokonvertirale. Serokonverzija ali serološki preobrat je pojav, ko se v krvi okužene osebe razvijejo zaznavne količine protiteles [4, 17].

1.5.3 Živali v živalskih vrtovih

S SARS-CoV-2 se lahko okužijo tudi divje mačke, kar so prvič opazili z okužbo tigra v živalskem vrtu Bronx v New Yorku. Kasneje so ugotovili, da so se okužili še štirje tigri in trije levi v istem živalskem vrtu. Zanimivo je, da je zaporedje celotnega genoma izoliranega virusa razkrilo, da sta bili obe vrsti mačk okuženi z različnima seva SARS- CoV-2, kar kaže na to, da sta virus pridobili z dvema različnima prenosoma. Testiranje oskrbnikov živalskega vrta, ki so bili v stiku z živalmi, je razkrilo genetske in

(25)

11

epidemiološke podobnosti med virusi, izoliranimi iz oskrbnikov in izolati živalskih virusov, kar kaže na prenos s človeka na tigra. Vendar za okužbo levov niso ugotovili jasne poti prenosa. S SARS-CoV-2 je bil okužen tudi lev v Španiji. Tudi druge velike vrste mačk so lahko okužene; puma v živalskem vrtu v Južni Afriki je bila pozitivna na virusno RNA po stiku z okuženim oskrbnikom, prav tako tudi snežni leopard v živalskem vrtu v Kentuckyju v ZDA. Poleg tega so se pojavila tudi poročila o okužbi treh goril v živalskem vrtu v San Diegu v Kaliforniji, ki dokazujejo, da je treba v živalskih vrtovih sprejeti širše varnostne ukrepe, da se prepreči širjenje okužbe z ljudi na znane dovzetne živalske vrste [4].

1.5.4 Mačke

Domače mačke so prav tako dovzetne za okužbo s SARS-CoV-2. Obstajajo mačji koronavirusi, FCoV I in II, ki so le daljno sorodni s SARS-CoV-2, so pa odkrili tudi okužbe s SARS-CoV pri mačkah s trga živih živali v Guangdžovu leta 2004. Tekom pandemije se je po svetu pojavilo več primerov okužb s SARS-CoV-2 pri domačih mačkah, na primer RNA SARS-CoV-2 so našli pri 47 % od 17 testiranih mačk v ZDA, pri mačkah v Belgiji, Grčiji, Švici, Braziliji, Italiji, Hongkongu, Franciji, Kanadi, Nemčiji, Španiji, Japonski, Rusiji, na Nizozemskem in v Združenem kraljestvu. V Čilu so izvedli raziskavo, ki je pokazala, da mačke izločajo virusno RNA krajši čas kot ljudje.

Glede na podobnost nukleotidnega zaporedja virusne RNA so ugotovili tudi, da je prišlo do neposrednega prenosa s človeka na žival, niso pa ugotovili, ali je prišlo tudi do prenosa z živali na žival [4].

Ena od 22 testiranih mačk v Franciji iz domov okuženih oseb je bila pozitivna na virusno RNA in nato serokonvertirana (izmerjena s prilagojenim komercialnim ELISA testom).

Nadaljnja študija seroprevalence je pokazala, da je imelo protitelesa 23,5 % (8/34) mačk iz COVID-19 pozitivnih gospodinjstev, medtem ko je bila ena od 16 mačk iz gospodinjstev neznanega statusa pozitivna na protitelesa. Testirali so tudi 24 mačk iz okolice nizozemskih farm z okuženimi hermelini, pri čemer je bila ena pozitivna na virusno RNA in sedem pozitivnih na protitelesa. Ni znano, ali so virus pridobile s stikom z okuženimi ljudmi, hermelini ali okuženimi predmeti. Obširna italijanska študija seroprevalence je zagotovila nadaljnje dokaze o okužbi s SARSCoV-2 pri mačkah.

Nevtralizirajoča protitelesa so bila odkrita pri 3,9 % (6/152) testiranih mačk v Italiji.

Študija ni odkrila povezave med seropozitivnostjo mačk in statusom okužbe s COVID- 19 v gospodinjstvu. Obstajajo tudi dokazi, da mačke, ki so bile predhodno okužene s SARS-CoV-2, razvijejo delno imunost in jih virus lahko ponovno okuži, vendar pa pri tej sekundarni okužbi virusa ne izločajo v zadostnih količinah, da bi ga prenesle na še neokužene mačke [4].

(26)

12

Vsaka študija se je razlikovala glede na strategijo vzorčenja živali iz na COVID-19 pozitivnih in domnevno pozitivnih gospodinjstev, število testiranih živali in izbiro testa za odkrivanje protiteles, kar morda lahko pojasni razlike v rezultatih. Čeprav trenutno ni dokazov, ki bi nakazovali, da bi mačke lahko okužbo prenašale na ljudi, kar pri domačih mačkah nakazuje, da bi bila rutinska testiranja in pazljivost pri stiku s hišnimi mačkami smiseln varnostni ukrep. Potrebne so dobro zasnovane študije, ki bi razkrile resnično razširjenost bolezni pri mačkah po vsem svetu [4].

1.5.5 Psi

Ena študija je pokazala, da so virusna nukleotidna zaporedja SARS-CoV-2, odkrita pri dveh psih, enaka kot SARS-CoV-2, najden v lastnikih psov, kar kaže na prenos s človeka na žival. Vendar ostaja neznano, ali lahko okuženi psi virus prenesejo nazaj na ljudi. O prvem primeru so poročali februarja 2020 v Hongkongu, kjer je bil hišni pes, katerega lastnika je prizadel COVID-19, na testu šibko pozitiven. Pes ni imel simptomov, vendar je bil v vladni ustanovi v karanteni. Kvantitativno testiranje z verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (RT-PCR) je pokazalo prisotnost RNA SARS-CoV-2 v pasjih nosnih brisih, rektalni in fekalni vzorci pa so bili negativni [2] .

V eni študiji je bilo 15 od 451 (3,3 %) psov pozitivnih na nevtralizirajoča protitelesa. V študiji, izvedeni v Franciji, sta bila dva od 13 psov (15,4 %) iz gospodinjstev, za katera je bilo znano, da so prebivalci okuženi s SARS-CoV-2, pozitivna na SARS-CoV-2 specifična protitelesa. Poročali so, da je 42,9 % psov kazalo respiratorne znake bolezni, od tega 44,4 % kot blage, 38,1 % kihanje in 23,8 % izcedek iz nosu [5, 18, 19].

Če povzamemo, prenos SARS-CoV-2 z okuženih ljudi na živali se dogaja relativno pogosto. Ker so klinični znaki večinoma opisani kot blagi ali v kontekstu hudih sočasnih bolezni, ter glede na eksperimentalne študije okužb se zdi, da je potek okužb pri mačkah in psih blag. Doslej ni bil opisan noben prenos virusa SARS-CoV-2 od okuženega hišnega ljubljenčka na njegovega lastnika ali na drugega hišnega ljubljenčka [5].

(27)

13

2 NAMEN DELA IN HIPOTEZA

Namen diplomske naloge je bil določiti nukleotidno zaporedje kodogenih regij zapisa za ACE2 v genomu prašičev različnih pasem in z uporabo bioinformacijskih orodij oceniti genetsko variabilnost teh regij. Na osnovi teh podatkov želimo napovedati verjetnost interakcije proteina S SARS-CoV-2 z ACE2 pri prašiču. Na ta način bomo lahko ocenili potencialno nevarnost, da bi naše lokalne populacije prašičev predstavljale potencialni rezervoar za SARS-CoV-2.

Hipoteza: nukleotidna zaporedja, ki zapisujejo ACE2 pri krškopoljskih prašičih, so na mestih, ki določajo interakcijo s proteinom S virusa SARS-CoV-2, enaka kot pri prašiču pasme duroc, in krškopoljski prašiči zato niso v veliki nevarnosti za okužbo s SARS- CoV-2.

(28)

(29)

15

3 MATERIALI IN METODE 3.1 Izolacija DNA

Materiali za izolacijo DNA:

 komplet reagentov za izolacijo DNA: E.Z.N.A. Tissue DNA Kit (OMEGA bio-tek)

 mikrocentrifugirke (Brand)

 pipete (Gilson)

 centrifuga (5430 R Eppendorf)

 termostat (Thermal Shake lite)

 spektrofotometer (NanoVue, GE Healthcare)

DNA smo izolirali s kompletom reagentov za izolacijo DNA, E.Z.N.A. Tissue DNA Kit, po navodilih proizvajalca. Pri vzorcih prašičjih uhljev je liza celic potekala čez noč pri 56 °C;

elucijo smo izvedli v dveh korakih (po 50 μl), da ne bi preveč razredčili izolirane DNA. DNA smo izolirali iz vzorcev prašičev krškopoljske pasme in nemške pasme Schwäbisch-Hällische in divjih prašičev z različnih lokacij v Sloveniji.

Za analizo izolirane DNA smo izvedli agarozno gelsko elektroforezo (AGE). Materiali:

 agaroza (SeaKem, Pharmacia)

 etidijev bromid (Thermo Fischer, 10 mg/mL)

 TBE pufer (Thermo Fischer)

 nanašalni pufer (Invitrogen)

 standard velikosti 100 kb (Sigma)

 mikrovalovna pečica (R-2V26 Sharp)

 kadička za elektroforezo (Pharmacia)

 kalup za gel z glavnički (Pharmacia)

 pipete (Gilson)

 CAMERA FOR U:GENIUS (Synoptics)

Agarozno gelsko elektroforezno smo izvedli na 1 % gelu, ki smo ga pripravili tako, da smo 0,6 g agaroze raztopili v 60 ml 0,5 x TBE. Nato smo mešanico segreli v mikrovalovni pečici do vretja, premešali in zavreli še dvakrat. Dodali smo 2 μl etidijevega bromida, dobro premešali in počakali da se nekoliko ohladi, nato pa smo mešanico vlili v pripravljen kalup za gel z glavnički. Nato smo pustili stati vsaj 30 min. Gel smo nato položili v kadičko za elektroforezo s 0,5 x TBE, odstranili glavničke in nanesli vzorce. Na gel smo nanesli 6 μl vzorca s 3 μl nanašalnega pufra, elektroforeza je tekla 30 min pri 100 V.

(30)

16

3.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR)

Materiali:

 10 μM začetni oligonukleotidi (Novogene)

 DNA-polimeraza (OneTaq New England BioLabs)

 5x OneTaq standardni reakcijski pufer (New England BioLabs)

 10 mM dNTP-ji (Sigma)

 H2O (za celične kulture, Sigma)

 MiniAmp Thermal Cycler (Thermo Fischer) Začetni oligonukleotidi:

 Smerni začetni oligonukleotid za ekson 2 (F_SSC_E2):

GTCCTCTCCGGGATGAATTT, Tm=54 °C

 Protismerni začetni oligonukleotid za ekson 2 (R_SSC_E2):

CCATCTGGGACTCAGAATCAG, Tm=54 °C

TAGGCACTAGGCCAGAAGGA, Tm=56 °C

TCCCACTGTAACCACGTGTC, Tm=56 °C

GCCTAATTTTTGAGAATTTCCTACA, Tm=51 °C

AAGTTAGGGCCTGCTGACAA, Tm=51 °C

AGCTGGAGAGCAGGATTCG, Tm=55 °C

CAGAAGTTGGCCTGTTGTGA, Tm=55 °C

Tabela 1: Količine reagentov za 20 μl PCR reakcijo.

Reagent Količine za 20 μl reakcijo [μl]

pufer (5x) 4,0

dNTP (10 μM) 2,0

začetni oligonukleotid (smerni) 1,5 začetni oligonukleotid (protismerni) 1,5

polimeraza 0,2

H2O 9,3

matrična DNA 1,5

(31)

17

Za analizo nukleotidnega zaporedja smo uporabili vzorce krškopoljskih prašičev, ki smo jih primerjali z vzorcem 4295/21 (Schwäbisch-Hällische) in referenčnim zaporedjem iz genske banke. PCR smo izvedli za eksone 2, 3, 9 in 10. V teh eksonih so namreč zapisana ključna mesta za vezavo proteina S na ACE2. Količine reagentov za eno reakcijo so navedene v tabeli 1. PCR je potekal pri pogojih:

 Za eksona 2 in 9: 30 s pri 95 °C, 45 s pri 52 °C, 45 s pri 72 °C, 5 min pri 72 °C, 4 °C; 30 ciklov.

 Za eksona 3 in 10: 30 s pri 95 °C, 45 s pri 55 °C, 45 s pri 72 °C, 5 min pri 72 °C, 4 °C;

30 ciklov.

Za analizo PCR produktov smo izvedli agarozno gelsko elektroforezo v 1,5 % gelu. Na gel smo nanesli 7 μl vzorca s 3 μl nanašalnega pufra. Elektroforeza je tekla 35 min pri 100 V.

3.3 Določanje nukleotidnega zaporedja

Najprej smo po Thermo Fisher protokolu očistili PCR produkte z eksonukleazo in alkalno fosfatazo, da smo odstranili začetne oligonukleotide in dNTP-je.

Tabela 2: Reagenti in njihove količine za čiščenje PCR produkta.

Reagent Volumen reagenta [μl]

PCR produkt 5,0

Exo I (Thermo Fischer) 0,5

Fast AP (Thermo Fischer) 1,0

Reagente (tabela 2) smo premešali in inkubirali 45 min pri 37 °C in 15 min pri 85 °C.

Sledila je sekvenčna reakcija (BigDye v3.1): najprej smo odtajali začetne oligonukleotide in BD pufer, premešali, kratko centrifugirali in shranili na ledu. Reagenti in njihove količine so navedene v tabeli 3.

Tabela 3: Reagenti za sekvenčno reakcijo in njihove količine.

Reagent Volumen reagenta [μl]

začetni oligonukleotid 1,0

BigDye (neredčen) (Thermo Fischer) 0,5

BD pufer 5x 1,5

DNA (PCR produkt) 3,0

H2O (za celične kulture, Sigma) 4,0

Reakcija je potekala pri pogojih: 1-2 min pri 96 °C, nato 25 ciklov: 10 s pri 96 °C, 10 s pri 5 °C, 4 min pri 60 °C, na koncu pa stoji pri 4 °C.

Sledilo je čiščenje sekvenčnih produktov.

(32)

18

Materiali:

 70 mM EDTA, pH 8

 100 % etanol

 formamid

 1,5 ml mikrocentrifugirke (Brand)

 centrifuga (5430 R Eppendorf)

 stresalnik (CLASSIC Advanced Vortex Mixer)

Postopek: kratko smo centrifugirali PCR mikrocentrifugirke in PCR produkte prenesli v 1,5 ml mikrocentrifugirke, dodali 5 μl EDTA in 30 μl etanola ter temeljito premešali in inkubirali 15 min pri sobni temperaturi. Nato smo 30 min centrifugirali pri 2500 g in nato še 5 min pri 15 000 g. Nato smo odpipetirali supernatant, še enkrat na kratko centrifugirali in dodali 30 μl etanola. Nato smo centrifugirali 10 min pri 2500 g in 5 min pri 15 000 g. Nato smo odpipetirali etanol in posušili mikrocentrifugirke tako, da smo jih pri sobni temperaturi pustili odprte 15 min. Nato smo vsebino mikrocenrifugirk resuspendirali v 12 μl formamida, premešali in centrifugirali.

Določanje DNA zaporedja:

Materiali:

 ABI 3500 Genetic Analyser

 Plošča za sekvenciranje (Costar)

 Led

Postopek: 10 μl vzorca smo nanesli na plošče za sekvenciranje, denaturirali 3 min pri 95 °C in nato za nekaj minut prestavili na led. Nato smo kratko premešali in centrifugirali ploščo in jo shranili v hladilniku.

(33)

19

4 REZULTATI

DNA smo izolirali iz 14 vzorcev prašičev, od tega so bili štirje krškopoljski (04, 23, 25, 30) in dva divja prašiča (V1, K1), ostali pa pasme Schwäbisch-Hällische. V tabeli 4 so zapisane koncentracije izolirane DNA.

Tabela 4: Koncentracije DNA, izolirane iz prašičjega uhlja..

Vzorec Koncentracija [ng/μl]

04 35,0

23 43,0

25 38,0

30 54,0

4295/21 484,5

4320/7 217,5

4322/11 347,5

4325/8 245,5

4321/9 290,0

4289/17 329,0

4230/67 453,0

4320/12 222,0

V1 324,0

K1 304,0

Kakovost izolirane DNA smo preverili z agarozno gelsko elektroforezo, kar vidimo na slikah 3 in 4.

(34)

20

Slika 3: DNA, izolirana iz vzorcev prašičjih uhljev. ST - standard velikosti, vzorci levo od standarda velikosti so DNA po prvi eluciji, vzorci desno pa po drugi eluciji.

Slika 4: DNA, izolirana iz ušes divjih prašičev.

Za analizo zaporedja DNA smo si izbrali vzorce krškopoljskih prašičev (04, 23, 25, 30) in 4295/21 (pasme Schwäbisch-Hällische), zato smo za te izvedli tudi PCR reakcije. Po analizi z AGE smo ugotovili, da za ekson 3 reakcija ni bila uspešna, saj na agaroznem gelu nismo opazili produkta, za ostale eksone pa so rezultati prikazani na slikah 5 in 6.

(35)

21

Slika 5: PCR produkti za ekson 2. ST - standard velikosti, 04/2, 23/2, 25/2, 30/2 - vzorci krškopoljskih prašičev, 4295/21/2 - vzorec pasme Schwäbisch-Hällische.

Slika 6: PCR produkti za eksona 9 in 10. ST - standard velikosti, 04/9, 23/9, 25/9, 30/9, 4295/21/9 – PCR produkti za ekson 9; 04/10, 23/10, 25/10, 30/10, 4295/21/10 – PCR produkti za ekson 10.

Pomnoževanje eksonov je potekalo različno uspešno, zato smo za določanje nukleotidnega zaporedja izbrali po pet vzorcev (04, 23, 25, 30 in 4295/21) za eksone 2, 9 in 10, za ekson 3 pa nukleotidna zaporedja zaradi neuspešnosti PCR reakcije nismo določili.

Kromatograme sekvenciranih vzorcev smo odčitali in nukleotidna zaporedja v formatu FASTA poravnali z referenčnim zaporedjem prašiča pasme duroc iz baze podatkov (slike 7, 9 in 11).

Nukleotidna zaporedja smo prevedli v aminokislinska zaporedja in jih poravnali (slike 8, 10 in 12).

(36)

22 Slika 7: Poravnava nukleotidnih zaporedij za ekson 2.

Slika 8: Poravnava aminokislinskih zaporedij za ekson 2.

Pri eksonu 2 lahko opazimo, da v primerjavi z referenčnim zaporedjem prišlo do veliko aminokislinskih zamenjav, kar lahko delno pripišemo slabi kvaliteti PCR produktov in napakam pri določanju nukleotidnega zaporedja, nekatere zamenjave pa so produkt genetske variabilnosti vzorcev.

(37)

Kot pri eksonu 2 lahko tudi tu opazimo, da je v primerjavi z referenčnim zaporedjem prišlo do veliko aminokislinskih zamenjav, vendar pa je tu do večine zamenjav prišlo pri vseh vzorcih krškopoljskih prašičev, torej verjetno tu ni prišlo do napake pri določanju nukleotidnega zaporedja, ampak je to dejansko nukleotidno zaporedje krškpoljskih prašičev.

(38)

Pri eksonu 10 pa je v primerjavi z referenčnim zaporedjem ohranjenih večina aminokislin pri vseh vzorcih, torej v tem eksonu ne opazimo velike genetske variabilnosti med pasmami prašičev.

(39)

25

5 RAZPRAVA

DNA smo izolirali iz klasičnih biopsij ušesnega tkiva in mikro biopsij, pridobljenih z ušesnimi kleščami. V obeh primerih je bilo tkiva dovolj za uspešno izolacijo DNA, ki je omogočala pomnoževanje genomskih odsekov z verižno rekcijo s polimerazo. Količine izolirane DNA so bile v vseh primerih znotraj območja, ki zagotavlja uspešno pomnoževanje (1 do 1000 ng) [20].

Za določanje nukleotidnega zaporedja smo uporabili DNA krškopoljskih prašičev (04, 23, 25, 30) in vzorec nemškega prašiča (4295/21). Izvedli smo po štiri 20 μl PCR reakcije, za eksone 2, 3, 9 in 10. Za eksona 2 in 9 sta bili reakciji uspešni (slika 5 in 6), saj na gelu vidimo le eno specifično progo. Za ekson 10 je bila PCR manj uspešna, manj specifična, saj je na gelu vidnih več lis (slika 6). Za ekson 3 reakcija ni uspela. Po določitvi nukleotidnega zaporedja eksonov 2, 9 in 10 smo ugotovili, da dve nukleotidni zaporedji nista dovolj kvalitetni za nadaljnjo analizo (04 in 4295/21) za ekson 9.

Na podlagi strukture proteina ACE2 pri človeku in proteina S so aminokislinski ostanki, ki so pri ACE2 ključni za vodikove vezi in hidrofobne interakcije z receptor vezavno domeno proteina S, Ser19, Gln24, Asp30, Lys31, His34, Glu35, Asp38, Tyr41, Gln42, Tyr83, Asn330, Lys353, Asp355 in His377 [14, 21].

Pri referenčnem zaporedju pasme duroc so od teh aminokislin ohranjeni ostanki Ser19, Lys31, Glu35, Asp38, Tyr41, Gln42, Asn330, Lys353, Asp355 in His377. Do neujemanj pride pri Gln24 in His34, ki sta zamenjana z Leu, in Asp30, ki je zamenjan z Glu. Gln24 tvori vodikovo vez z N487 v proteinu S, in ker je zamenjan z levcinom, ne more več tvoriti vodikove vezi.

His34 v središču veznega mesta je prav tako zamenjan z levcinskim ostankom, ki je večji in ne more tvoriti vodikove vezi. Asp30, ki tvori osrednji solni most, je zamenjan z glutamatom. Ker je tudi glutamat negativno nabit, solni most do Lys417 najverjetneje ostane nedotaknjen [14].

Pri naših analiziranih vzorcih krškopoljske pasme pride do več substitucij aminokislin; v primerjavi z ACE2 pri človeku so ohranjeni le Glu35, Asn330, Asp355 in His377. V primerjavi z referenčno sekvenco pasme duroc sta ohranjena Glu30 in Lys34, pri vseh naših analiziranih vzorcih pa so zamenjani Ser19 s Pro, Gln24 z Arg, Lys31 in Asp38 z Asn. Pri vseh vzorcih krškopoljskih prašičev (04, 23, 25 in 30) je namesto Tyr41 Asn in namesto Gln42 Lys; vzorec 4295/21 ima ta dva aminokislinska ostanka ohranjena. Pri vzorcu 30 je Lys353 zamenjan z Glu.

Že iz prejšnjih študij [5, 14, 21] lahko razberemo, da je afiniteta prašičjega ACE2 za vezavo virusnega proteina S manjša od afinitete človeškega. Izračunali so tudi Gibbsovo prosto energijo vezave ACE2 s proteinom S, in pri prašiču je ta v primerjavi s človekom znatno večja (- 128,67 kcal/mol pri človeku in − 46.31 kcal/mol pri prašiču), kar kaže, da pri prašiču ne pride do nekaterih ključnih interakcij med ACE2 in proteinom S [21].

(40)

26

V analiziranih vzorcih krškopoljskih praščev so popolnoma ohranjeni le štirje ključni aminokislinski ostanki, pasma duroc pa jih ima ohranjenih 10. To ovrže našo hipotezo, da imata pasmi duroc in krškopoljski prašič enako nukleotidno zaporedje za zapis za ACE2. To nakazuje, da je afiniteta vezave receptorja ACE2 s proteinom S pri krškopoljskih prašičih še manjša kot pri referenčni pasmi duroc. Krškopoljski prašiči so zato najverjetneje v majhni nevarnosti za okužbo s SARS-CoV-2. Vendar ta napoved temelji le na podlagi poravnave aminokislinskih ostankov, in bi za natančnejše rezultate morali izvesti tudi analize na podlagi 3D strukture receptorja ACE2.

(41)

27

6 ZAKLJUČEK

SARS-CoV-2, ki se je pojavil leta 2019, je po vsem svetu okužil milijone ljudi in močno vplival na vse vidike življenja. Ker virus ne okužuje le ljudi, ampak tudi živali, je potrebno ugotoviti, katere živali, ki so v najtesnejšem stiku s človekom, so najbolj dovzetne za okužbo z virusom.

S tem znanjem lahko preprečimo nenadzorovano širitev virusa med človeškimi in živalskimi populacijami in zaščitimo predvsem manjše živalske populacije pred okužbo. SARS-CoV-2 v celice vstopa po vezavi svojega proteina S na receptor ACE2 na membrani tarčne celice. V svoji diplomi sem določila zaporedje treh eksonov receptorja ACE2 pri prašiču, za katere smo ugotovili, da so najpomembnejši pri vezavi proteina S na ACE2. S poravnavo zaporedij sem ugotovila, da je prišlo do več zamenjav nekaterih ključnih aminokislin, ki so v stiku s proteinom S, in se zato najverjetneje zniža afiniteta vezave. Zaradi nizke afinitete vezave so krškopoljski prašiči, katerim je pripadala večina analiziranih vzorcev, najverjetneje v razmeroma majhni nevarnosti za okužbo s SARS-CoV-2. Tako je tudi malo verjetno, da bi se virus preko prašičev vračal v človeško populacijo. Da bi to lahko z gotovostjo trdili, pa bi bile potrebne še natančnejše študije, ki bi temeljile tudi na 3D strukturi kompleksa ACE2 in proteina S.

(42)

(43)

29

7 LITERATURA

[1] P. K. Datta, F. Liu, T. Fischer, J. Rappaport, X. Qin: SARS-CoV-2 pandemic and research gaps: Understanding SARS-CoV-2 interaction with the ACE2 receptor and implications for therapy. Theranostics 2020, 10(16). doi: 10.7150/thno.48076

[2] M.Y. Wang, R. Zhao, L. J. Gao, X. F. Gao, D. P. Wang, J. M. Cao: SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2020, 10: 587269. doi: 10.3389/fcimb.2020.587269

[3] COVID-19 Dashboard by the Center for Systems Science and Engineering (CSSE) at Johns Hopkins University (JHU), posodobljeno 20. 8. 2021 ob 14:2, URL:

https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/dashboards/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6 [4] T. Prince, S.L. Smith, A. D. Radford, T. Solomon, G. L. Hughes, E. I. Patterson: SARS- CoV-2 Infections in animals: Reservoirs for reverse zoonosis and models for study. Viruses 2021, 13: 494. https://doi.org/10.3390/v13030494

[5] A. Michelitsch, K. Wernike, L. Ulrich, T. C. Mettenleiter, M. Beer: SARS-CoV-2 in animals: From potential hosts to animal models. Advances in Virus Research 2021, 110: 59- 102. doi: 10.1016/bs.aivir.2021.03.004

[6] Zoonoze. Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano. Novice, 15.3. 2021. URL:

https://www.nlzoh.si/objave/zoonoze/

[7] C. Haake, S. Cook, N. Pusterla, B. Murphy: Coronavirus infections in companion animals:

virology, epidemiology, clinical and pathologic features. Viruses 2020, 12(9):

1023. doi:10.3390/v12091023

[8] W. K. Jo, E. F. de Oliveira‐Filho, A. Rasche, A. D. Greenwood, K. Osterrieder, J. F. Drexler:

Potential zoonotic sources of SARS‐CoV‐2 infections. Transboundary and Emerging Diseases 2020, doi:10.1111/tbed.13872

[9] A. G. Harrison,T. Lin & P. Wang: Mechanisms of SARS-CoV-2 transmission and pathogenesis. Trends in Immunology 2020, doi:10.1016/j.it.2020.10.004

[10] A. Costagliola, G. Liguori, D. d'Angelo, C. Costa, F. Ciani, A. Giordano: Do animals play a role in the transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2)?

A commentary. Animals 2021, doi: https://dx.doi.org/10.3390/ani1101 0016

[11] F. Scialo, A. Daniele, F. Amato, L. Pastore, M. G. Matera, M. Cazzola, G. Castaldo, A.

Bianco: ACE2: The major cell entry receptor for SARS-CoV-2. Lung 2020, 198(6): 867-877.

doi: 10.1007/s00408-020-00408-4

[12] Y. Li, W. Zhou, L. Yang, R. You: Physiological and pathological regulation of ACE2, the SARS-CoV-2 receptor. Pharmacological Research 2020. doi:10.1016/j.phrs.2020.104833 [13] W. Ni, X. Yang, D. Yang, J. Bao, R. Li, Y. Xiao, C. Hou, H. Wang, J. Liu, D. Yang, Y.

Xu, Z. Cao, Z. Gao: Role of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) in COVID-19. Critical Care 2020, 24(1). doi:10.1186/s13054-020-03120-0

(44)

30

[14] X. Zhai, J. Sun, Z. Yan, J. Zhang, J. Zhao, Z. Zhao, Q. Gao, W. T. He, M. Veit, S. Su:

Comparison of SARS-CoV-2 spike protein binding to ACE2 receptors from human, pets, farm animals, and putative intermediate hosts. Journal of Virology 2020. doi:10.1128/jvi.00831-20 [15] P. V’kovski, A. Kratzel, S. Steiner, H. Stalder, V. Thiel: Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology 2020.

doi:10.1038/s41579-020-00468-6

[16] J. Luan, X. Jin, Y. Lu, L. Zhang: SARS-CoV-2 spike protein favors ACE2 from Bovidae and Cricetidae. Journal of Medical Virology2020, 92(9): 1649-1656. doi: 10.1002/jmv.25817 [17] Medical Definition of Seroconversion, Melissa Conrad Stöppler, pregledano 29. 3. 2021.

URL: https://www.medicinenet.com/seroconversion/definition.htm

[18] E. I. Patterson, G. Elia, A. Grassi, A. Giordano, C. Desario, M. Medardo, S. L. Smith, E.

R. Anderson, T. Prince, G. T. Patterson, E. Lorusso, M. S. Lucente, G. Lanave, S. Lauzi, U.

Bonfanti, A. Stranieri, V. Martella, F. Solari Basano, V. R. Barrs, A.D. Radford, U. Agrimi, G. L. Hughes, S. Paltrinieri, N. Decaro: Evidence of exposure to SARS-CoV-2 in cats and dogs from households in Italy. Nature Communications 2020. 11(1): 6231. doi: 10.1038/s41467- 020-20097-0

[19] M. Fritz, B. Rosolen, E. Krafft, P. Becquart, E. Elguero, O. Vratskikh, S. Denolly, B.

Boson, J. Vanhomwegen, M. A. Gouilh, A. Kodjo, C. Chirouze, S. G. Rosolen, V. Legros, E.

M. Leroy: High prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in pets from COVID-19+ households.

One Health 2021. doi: 10.1016/j.onehlt.2020.100192

[20] T. C. Lorenz: Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments 2012. doi:10.3791/3998

[21] T. Koley, S. Madaan, S. R. Chowdhury, M. Kumar, P. Kaur, T. P. Singh, A. S.

Ethayathulla: Structural analysis of COVID-19 spike protein in recognizing the ACE2 receptor of different mammalian species and its susceptibility to viral infection. 3 Biotech 2021. 11(2):

109. doi: 10.1007/s13205-020-02599-2.