V analizo smo vključili 62 konj pasme paint in quarter. V prvem delu smo se osredotočili na genotipizacijo ter primerjavo s fenotipom za tri alele dun (D, nd1 in nd2). Za večino konj je bil genotip že poznan, za manjkajoče po smo genotipizacijo izvedli sami. Za alela nd1 in nd2 so nekateri konji, katerih vzorcev grive nismo mogli dobiti, ostali negenotipizirani.
Genotip smo nato primerjali s fenotipom, ki smo ga opisali s pomočjo fotografij in vizualne ocene. Glede na primerjavo smo potrdili, da imajo konji z alelom nd1 vidne nekatere primitivne znake in svetlejše odtenke dlake, ki so še bolj opazni pri tistih z obema aleloma nd1 (homozigoti nd1). Konji z dvema aleloma nd2 nimajo primitivnih znakov in posvetljene dlake. Konji, ki imajo genotip D/nd1, imajo večinoma bolj izrazite primitivne znake in posvetljeno dlako v primerjavi z genotipom D/nd2. Za določanje fenotipa vseh konj in primerjavo z genotipom (Priloga C), so služile fotografije (Priloga D).
3.4 GENOTIPIZACIJA D/Nd2
Razlikovanje med aleloma D in nd2 temelji na detekciji 1,6 kb dolge delecije v 3'-koncu gena TBX3. Na sliki 17 so predstavljeni rezultati genotipizacije za ta dva alela.
Slika 47: Gelska elektroforeza PCR pomnožkov z začetnimi nukleotidi za diskriminacijo alelov D in nd2.
S kombinacijo začetnih oligonukleotidov, ki smo jih označili s TBX3InDel_F1/TBX3InDel_R in NonDun1F/NonDun1_R, smo lahko detektirali prisotnost delecije in dominantnega alela D. Ker se alela D in nd1 le malo razlikujeta, smo za njuno
16
razločevanje uporabili ciljno sekvenciranje na mestu, kjer je prisotna točkasta mutacija, ki razlikuje oba alela (Slika 18).
A
B
Slika 18: A) Fragment nukleotidnega zaporedja gena TBX3 v območju delecije, ki razlikuje alela D in nd1.
Polimorfno mesto je označeno; B) nukelotidna zaporedja treh genotipov (D/D, D/nd1 in nd1/nd1) na mestu, kjer se alela D in nd1 razlikujeta.
17
Preglednica 2: Genotipi lokusa TBX3, ki smo jih določili s sekvenciranjem območja delecije v genu TBX3
Ime Spol Leto rojstva Genotip Dun
JMJ CHAMPAGNE REVENUE moški 2010 EE aa nCh TT nd1/nd2
JACKS BIGSTEPIN SKY ženski 2007 ee Aa nCr nCh Tt nd2/nd2
CHEYENNES CHARDONNAY ženski 2016 Ee Aa ChCh TT nd2/nd2
SQ COUGARET CASH ženski 2014 Ee aa nCh Tt nd1/nd2
CHEYENNES MERCIER ženski 2020 EE Aa nCh TT nd1/nd1
BELINDA SPATOLENA ženski 2014 ee Aa Tt nd2/nd2
CHEYENNES DESPERADOS moški 2020 Ee Aa TT nd2/nd2
FIFTY SHADES OF GREY ženski 2014 EE aa Dd Tt D/nd1
HIGHBROW VOODOO DOC moški 2014 EE aa Dd nCh D/nd2
TWARES MISS PEP ženski 2010 ee Aa Tt nd1/nd2
CHEYENNES MISTER VUDU moški 2020 Ee aa nCh nd1/nd2
KT SHES PERFECT ženski 2012 EE aa Dd TT D/nd2
CHEYENNES VOODOOQUEEN ženski 2018 EE aa Dd nCH Tt D/nd2
LUCKY SUSANNE ženski 2003 EE Aa nCr nd1/nd2
CHEYENNES LUCKY JUJU moški 2019 EE Aa nd1/nd2
CHEYENNES CHIMARAH ženski 2015 Ee aa TT nd1/nd2
CHEYENNES WYNN MIRAGE ženski 2014 ee Aa TT nd2/nd2
MISS FLYING OLENA ženski 2009 ee Aa Tt nd2/nd2
Z genotipizacijo (Preglednica 2) smo razjasnili fenotip pri osebkih, ki so bili prej zmotno genotipizirani kot D/-, dejansko pa je šlo za genotip nd1/nd1 ali nd1/nd2 (na primer Lucky Susanne ali Cheyennes Mercier).
Z analizo izražanja genov TBX3 in KITLG na različnih mestih grive kobile s kompleksnim fenotipom smo skušali pojasniti fenotipske razlike v obarvanosti grive. Ker je šlo v konkretnem primeru za kobilo, ki ima na lokusu dun alel D in na lokusu tobiano alel To, smo analizirali izražanje obeh genov, TBX3 in KITLG, slednja povzroča tobiano razbarvanje.
18
Slika 19: Kvantifikacija izražanja genov TBX3 in KITLG s qPCR
Na sliki 19 je predstavljen graf kvantifikacije izražanja genov TBX3 in KITL, normalizirana na lokus B2M. Na obeh lokusih so opazne razlike v ravni izražanja. Iz rezultatov lahko povzamemo, da je svetla barva dlake posledica nizke ravni izražanja KITLG v območju lise tobiano (vzorec1), v temnih delih grive pa je raven izražanja KITLG bistveno višja (vzorci 2-4). Razlike v izražanju gena TBX3 med vzorci niso zelo velike, kar kaže na dokaj enakomerno izražanje gena TBX3 na različnih lokacijah, kljub fenotipskim razlikam med njimi.
5 ZAKLJUČEK
Ameriški paint in quarter konji nam poleg dobrih delovnih sposobnosti ponujajo pestro paleto barv in vzorcev. Barve in odtenki so posledica delovanja in prepleta večjega števila genov, ki v kombinacijah dajejo različne barve dlake. Najbolj zanimiv pečat pustijo posvetljevalni geni kot so dun, champagne in cream. Ti geni posvetlijo osnovno barvo dlake, ji dodajo oznake ali kraljevi sijaj šampanjca. Konji, ki nosijo funkcionalne alele na posvetljevalnih lokusih, so dokaj redki, vsaj v našem predelu Evrope in v Sloveniji. In prav konj s fenotipom šampanjca, je v Sloveniji zelo malo. Zanimiv vpliv alela D na sam odtenek in primitivne oznake gotovo pritegne oko mnogih rejcev in poznavalcev pasme. Alel D je bil prisoten pri starodavnih in divjih pasmah konj ter njihovih sorodnikih, ker je njegov fenotip služil kot varovalna barva. Se je pa tekom domestikacije zgodila delecija, ki je izbrisala njegovo delovanje in tako ima večina udomačenih konj nd2 alel ter močne, izrazite in ne posvetljene barve (črno, rjavo, rdečo). Obstaja še tretji alel nd1, ki deluje kot pseudo dun alel, njegov vpliv na odtenek dlake je minimalen, vseeno pa so lahko prisotne, a veliko manj intenzivne, primitivne oznake. To smo tekom primerjave genotipov in fenotipov tudi dokazali. Razlike med temi tremi aleli se lepo vidijo po sprehodu skozi fotografije konj, ki so bili vključeni v diplomsko delo. Velikokrat nam podatki, ki jih pridobimo na ravni DNA ne podajo vseh odgovorov. Zato so študije na ravni RNA velikokrat primernejše in bolj
19
reprezentativne. Nam je podala odgovore o moči izražanja gena TBX3 (dun) in sodelujočega gena KITLG. Tako na ravni fenotipa kot na ravni RNA lahko vidimo razliko in prehod med predeli dlake in grive, kjer deluje le dun lokus in kjer deluje v kombinaciji s tobiano alelom, ki je odgovoren za bele vzorce, lise. Razumevanje dedovanja in kombinacij delovanja različnih genov, ki so odgovorni za barvo in vzorec dlake, je za rejce konj ključna. Naloga genetskih laboratorijev je, da genotipizacijo opravijo kar se da natančno in nenehno izboljšujejo in optimizirajo metode. Raziskovalci tako lahko odkrivajo vedno nove povzročitelje in vzroke za številne barvne odtenke, kar omogoča razumevanje njihovega delovanja in medsebojne prepletenosti. Naše raziskovalno delo ima tudi potencial za boljše razumevanje in odkrivanje vzrokov za kompleksne fenotipe, ki sprva odstopajo od pričakovanja samo na osnovi genotipa. V nalogi smo se podrobneje ukvarjali samo z enim posvetljevalnim genom, dun, drugih dveh, champagne in cream, pa nismo analizirali.
Dejstvo, da imam tri kobile, ki omogočajo raziskovanje vseh treh posvetljevalnih genov, je dobra iztočnica in motiv za nadaljnje raziskovalno delo.
6 VIRI
Baxter L.L., Watkins-Chow D.E., Pavan W.J., Loftus S.K. 2019. A curated gene list for expanding the horizons of pigmentation biology. Pigment Cell Melanoma Research, 32:
348-358
Brunberg E., Andersson L., Cothran G., Sandberg K., Mikko S., Lindgren G. 2006. A missense mutation in PMEL17 is associated with the Silver coat color in the horse. BMC Genetics, 7, 46, doi:10.1186/1471-2156-7-46: 12 str.
Cook D., Brooks S., Bellone R., Bailey E. 2008. Missense mutation in exon 2 of SLC36A1 responsible for champagne dilution in horses. PLoS Genetics, 19, 4: e1000195, doi:
10.1371/journal.pgen.1000195: 9 str.
Holl H.M., Pflug K.M., Yates K.M., Hoefs-Martin K., Shepard C., Cook D.G., Lafayette C., Brooks S.A. 2019. A candidate gene approach identifies variants in SLC45A2 that explain dilute phenotypes, pearl and sunshine, in compound heterozygote horses. Animal Genetics, 50: 271-274
Imsland F., McGowan K., Rubin C.J., Henegar C., Sundström E., Berglund J., Schwochow D., Gustafson U., Imsland P., Lindblad-Toh K., Lindgren G., Mikko S., Millon L., Wade C., Schubert M., Orlando L., Penedo M.C., Barsh G.S., Andersson L. 2016. Regulatory mutations in TBX3 disrupt asymmetric hair pigmentation that underlies Dun camouflage color in horses. Nature Genetics, 48: 152-158
Mariat D., Taourit S., Guérin G. 2003. A mutation in the MATP gene causes the cream coat colour in the horse. Genetics Selection Evolution, 35: 119-133
Rieder S., Taourit S., Mariat D., Langlois B., Guérin G. 2001. Mutations in the agouti (ASIP), the extension (MC1R), and the brown (TYRP1) loci and their association to coat color phenotypes in horses (Equus caballus). Mammalian Genome, 12: 450-455
Tanaka J., Leeb T., Rushton J., Famula T.R., Mack M., Jagannathan V., Flury C., Bachmann I., Eberth J., McDonnell S.M., Penedo M.C.T., Bellone R.R. 2019. Frameshift Variant in
20
MFSD12 Explains the Mushroom Coat Color Dilution in Shetland Ponies. Genes, 10(10):
826. doi: 10.3390/genes10100826: 15 str.
Mackowski M., Wodas L., Brooks S. A., Cieslak J. 2019. TBX3 and ASIP genotypes reveal discrepancies in officially recorded coat colors of Hucul horses. Animal Journal, 13, 9:
1811-1816
Imsland F., McGowan K., Rubin C. J., Henegar C., Sundström E., Berglund J., Schwochow D., Gustafson U., Imsland P., Lindblad-Toh K., Lindgren G., Mikko S., Millon L., Wade C., Schubert M., Orlando L., Cecilia T Penedo M., Barsh G.S., Andersson L. 2016.
Regulatory mutations in TBX3 disrupt asymmetric hair pigmentation that underlies Dun camouflage color in horses. Nature Genetics, 48(2): 152–158
Cook D., Brooks S., Bellone R., Bailey E. 2008. Missense Mutation in Exon 2 of SLC36A1 Responsible for Champagne Dilution in Horses. Plos Genetics, 4(9): e1000195, doi:
10.1371/journal.pgen.1000195: 9 str.
Brooks S. A., Lear T.L., Adelson D.L., Bailey E. 2008. A chromosome inversion near the KIT gene and the Tobiano spotting pattern in horses. Karger, Cytogenetic Genome Research, 119: 225–230
Andrersson L. 2020. Mutations in Domestic Animals Disrupting or Creating Pigmentation Patterns. Frontiers in Ecology and Evolution, 8:116, dioi: 10.3389/fevo.2020.00116: 8 str.
APHA. 2021. Coat Patterns, Paint Horse Association of America, http://www.painthorse.com.au/register/coat-patterns (13.8.2021)
ZAHVALA
Rada bi se zahvalila gospe, dolgoletni vzrediteljici ameriških paint in quarter konj ter moji prijateljici Myri Lejeune, da nam je omogočila dostop do tolikšnega števila vzorcev grive, ki so bili temelj našega raziskovalnega dela. Zahvalila bi se tudi mentorju prof. dr. Petru Dovču za mentorstvo ter za navdušenje nad mojo izbrano tematiko, genetiko barve dlake konj. Zahvala pa gre tudi mojemu fantu Mateju ter družini, ki mi pomagajo, da tudi sama stopam v svet reje konj ter me bodrijo in spodbujajo na moji izobraževalni in raziskovalni poti.
PRILOGA A Izolacija DNA
Uporabili smo DNA komplet (EZNA Tissue DNA kit, Omega, Bio-Tek)
Materiali: mikrocentrifuga, mikrocentrifugirne tube, inkubator z ogrevanjem in stresanjem, vortex, 100% etanol, reagenti iz DNA kompleta.
• Postopek izolacije DNA:
• Grivo odrežemo čim bližje mešička (približno 30 mg) v 1,5 ml centrifugirno tubo.
• Dodamo 200 µl TL Buffra
• Dodamo 25 µl Proteinase K Solution in nato vorteksiramo.
• Inkubiramo na 55°C na stresalniku.
• Centrifugiramo pri 10.000 x g 5 minut
• Prenesemo supernatant v sterilno 1,5 ml mikrocentrifugirno tubo. Pazljivi moramo biti, da ne zmotimo ali prenesemo peleta na dnu.
• Dodamo 220 µl BL Buffra in nato vorteksiramo.
• Inkubiramo na 70°C za 10 minut.
• Dodamo 220 µl 100% etanola, nato vorteksiramo.
• Vstavimo HiBind DNA Mini Column v 2 ml kolekcijsko tubo. Prenesemo celoten vzorec, tudi, če se je tvoril kakšen precipitat.
• Centrifugiramo pri 10.000 x g 1 minuto.
• Filtrat odstranimo in ponovno uporabimo kolekcijsko tubo.
• Dodamo 500 µl HBC Buffra, ki mora biti predhodno razredčen s 100% izopropanolom.
• Centrifugiramo pri 10.000 x g 30 sekund.
• Zavržemo filtrat in kolekcijsko tubo. HiBind DNA Mini Column vstavimo v novo 2 ml kolekcijsko tubo.
• Dodamo 700 µl DNA Wash Buffra, ki mora biti predhodno razredčen s 100% etanolom.
• Centrifugiramo pri 10.000 x g 30 sekund.
• Še enkrat ponovimo postopek spiranja z DNA Wash Buffrom.
• Centrifugiramo prazno HiBind DNA Mini Column pri 10.000 x g 2 minuti, da jo osušimo, s tem korakom odstranimo sledi etanola, ki bi lahko vplival na nadaljne korake izolacije.
• HiBlind DNA mini Column prenesemo v 1,5 ml mikrocentrifugirno tubo, ki je čista od nukleaz.
• Dodamo 100-200 µl Elution buffra, ki ga predhodno segrejemo na 70°C.
• Inkubiramo pri sobni temperaturi 2 minuti.
• Še enkrat ponovimo postopek izločanja z Elution buffrom.
Izolirano DNA shranimo pri -20°C.
PRILOGA B Izolacija RNA
Protokol izolacije RNA s TRIZOLOM (W.M. Keck Foundation Biotechnology Microarryay Resource Laboratory of Yale University).
Reagenti: DEPC voda, TRIzol reagent, kloroform, ledeno hladen PBS, 70% etanol, izopropil alkohol.
Pripomočki: centrifuga z ohlajevanjem, mikrocentrifugirke, mikropipete, tipsi z aerosol barierami, vortex, centrifugirne tube.
• Homogenizacija - ker je bilo dlako težje homogenizirati, smo si pomagali z UZ kopeljo in homogenizatorjem. Dlake smo čim bližje mešičku skrajšali in dali v epico ter dodali 500 µl TRIzola. Sledilo je 15 minut UZ kopeli.
• Faza separacije - vzorce smo vzeli iz kopeli. Dodali smo 100 µl kloroforma ter nato premešali ter inkubirali na sobni temperaturi za 3 minute. Centrifugiranje pri 12000 x g za 15 minut na 4°C. Pride do ločbe na fazi. Prenesli smo zgornjo fazo brez, da bi s tem zmotili notranjo, spodnjo fazo. RNA se nahaja v zgornji, tekoči, brezbarvni fazi.
• RNA precipitacija – uporabimo 1,5 ml tubice. Precipitiramo RNA iz tekoče faze tako, da primešamo 250 µl izopropil alkohola ter nato inkubiramo na 28°C za 10 minut in nato centrifugiramo 12000 x g 10 minut na 4°C. RNA precipitira, ponavadi vidno kot kupček na dnu epice.
• RNA spiranje – odstranimo 500 µl supernatanta. RNA pelet speremo s 75% etanolom, 500 µl.
Najprej vorteksiramo in nato centrifugiramo pri 10000 x g 20 minut na 4°C. Postopek spiranja ponovimo še enkrat in odstranimo ves preostal etanol.
• Redisolviranje RNA – RNA pelet osušimo z inkubacijo na 40°C za 15 minut. Pomembno je, da ga ne izsušimo do konca saj tako zmanjšamo topnost. RNA raztopimo v DEPC vodi tako, da parkrat premešamo skozi pipeto. Izmerimo koncentracijo RNA v vzorcu (A260/A280).
Postopek obdelave izolirane RNA z DNazo:
• Najprej izolirano RNA počasi odmrznemo in jo nežno premešamo.
• V RNase-free PCR tube dodamo celokupno RNA ( v našem primeru je to bilo 35 µl in vse nadaljnje navedene koncentracije so preračunane na ta volumen RNA). Dodamo 3,5 µl 10X Reaction Buffer in 3,5 µl DNase I.
• Nežno premešamo in inkubiramo na sobni temperaturi 15 minut.
• Dodamo 3,5 µl Stop Solution, ki veže kalcij in magnezij in inaktivira DNaso I.
• Inkubiramo na 70°C za 10 minut, da denturiramo DNazo I.
• Ohladimo na ledu.
Sledil je postopek reverzne transkripcije in pretvorba v cDNA.
Za sintezo eno-vijačne cDNA iz RNA smo uporabili High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.
Najprej smo pripravili 2X Reverse Transcription Master Mix, ki vsebuje; 2X RT Buffer, 25X dNTP Mix (100 mM), 10X RT Random Primers, MultiScribe Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, Nuclease-free H2O. Vse komponente morajo biti na ledu. Po pripravljenem Master Mixu premešamo in postavimo na led. Master Mix smo dodali naši izolirani RNA v razmerju 1:1. Sledi postopek reverzne transkripcije v štirih temperaturnih profilih. Navedeni pogoji so optimizirani za uporabo prej
navedenega kita. Korak 1 – 25°C za 10 minut. Korak 2 – 37°C za 120 minut. Korak 3 – 85°C za 5 minut.
Korak 4 – 4°C ∞.
PRILOGA C Podatki
Preglednice vsebujejo informacije o sorodstvenih razmerjih, spolu, letu rojstva, genotipu in fenotipu, ločene so po žrebcih.
Priloga C1: Genotipski in fenotipski podatki za žrebca JMJ Champagne Revenue, njemu pripadajoče kobile in njune potomce.
Priloga C2: Genotipski in fenotipski podatki za žrebca Wynnin Silver Mine in njegovo potomko.
Priloga C3: Genotipski in fenotipski podatki za žrebca Highbrow Voodoo Doc, kobile in njihove potomce.
PRILOGA D
Fotografije, ki so služile za primerjavo fenotipa z genotipom Konji z vsaj enim alelom D (dun)
Priloga D1: Fotografije 12 konj fenotipa classic dun champagne ali amber dun champagne, z vsaj enim alelom D (dun) in enim alelom CH (champagne).
Priloga D2: Fotografije 12 konj grullo, bay dun ali dunskin z vsaj enim alelom D (dun).
Konji z vsaj enim alelom nd1 (ne-dun 1)
Priloga D3: Fotografije 6 konj fenotipa classic champagne ali amber champagne, z vsaj enim alelom nd1 in enim alelom CH (champagne)
Priloga D4: Fotografije 6 konj fenotipa buckskin, sorrel, black ali bay, z vsaj enim alelom nd1
Konji z dvema ali vsaj enim alelom nd2
Priloga D5: Fotografije konj fenotipa classic champagne ali amber champagne, z dvema aleloma nd2 in enim alelom CH (champagne).
Priloga D6: Fotografije konj fenotipa sorrel, bay, z dvema (ali vsaj enim) aleloma nd2. Izjema je kobila na prvi fotografiji, ki je fenotipa gold champagne.
Priloga D7: Fotografije konj fenotipa black, z dvema (ali vsaj enim) alelom nd2