UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA BIOTEHNOLOGIJO
Tajda HORVAT
VPLIV GENOTIPA KONJA NA LOKUSU DUN NA INTENZIVNOST IN VZOREC
OBARVANOSTI DLAKE
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij – 1. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA BIOTEHNOLOGIJO
Tajda HORVAT
VPLIV GENOTIPA KONJA NA LOKUSU DUN
NA INTENZIVNOST IN VZOREC OBARVANOSTI DLAKE
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij – 1. stopnja
IMPACT OF DUN LOCUS GENOTYPE ON THE PHENOTYPE OF THE HORSE
B.SC. THESIS
Academic Study Programmes: Biotechnology
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Biotehnologija. Delo je bilo opravljeno na Oddelku za zootehniko Biotehniške fakultete, na katedri za genetiko, animalno biotehnologijo in imunologijo,.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za biotehnologijo je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Petra Dovča, za somentorico pa doc. dr. Minjo Zorc.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Peter DOVČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: doc. dr. Minja ZORC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: doc. dr. Polonca ŠTEFANIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum zagovora: 6.9.2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 601.4:575: 577.212.3:636.1:575.22(043.2)
KG konjereja, konji, ameriški paint konj, ameriški quarter konj, genetika, genotip, fenotip, dun, champagne posvetlitev, tobiano
AV HORVAT, Tajda
SA DOVČ, Peter (mentor), ZORC, Minja (somentorica) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biotehnologijo, Univerzitetni študijski program 1. stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN VPLIV GENOTIPA KONJA NA LOKUSU DUN NA INTENZIVNOST IN VZOREC OBARVANOSTI DLAKE
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij – 1. stopnja) OP VIII, 22, [10] str., 2 pregl., 19 sl., 4 pril., 14 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V reji ameriških paint in quarter konj igrajo pomembno vlogo genetski testi za dedne bolezni in poznavanje genetskega ozadja za barvo in vzorec obarvanosti dlake. V rejskih programih so zelo priljubljene posvetljene barve, ki so posledica delovanja treh lokusov, dun, champagne in cream. Čeprav je dun fenotip značilen za prosto živeče vrste Equid (zebre), ga je pri udomačenih konjih malo, najdemo ga le pri nekaterih pasmah. Poleg funkcionalnega alela D na dun lokusu, sta prisotna še dva alela, ne-dun 1 (nd1) in ne-dun 2 (nd2). Alel D je dominanten in se fenotipsko izraža z močno temno dorzalno črto, zebrastimi oznakami na nogah, temnejšim predelom okrog gobca (primitivne oznake), temnejšo grivo in repom ter posvetljeno dlako. Alel nd1 ali pseudo dun na fenotipski ravni kaže nekatere značilnosti dun fenotipa, a z manjšo intenziteto, medtem, ko alel nd2 fenotipsko ne izraža primitivnih oznak in posvetljene dlake. Delovanje alelov na dun lokusu smo dokazali s primerjavo fenotipa in genotipa na dun lokusu za 62 konj. Naredili smo tudi ekspresijsko analizo gena TBX3 (dun) na ravni RNA za različne vzorce grive pri konju s kompleksnim fenotipom. Dun posvetlitev lahko najdemo tudi v kombinaciji z drugima dvema posvetljevalnima genoma, champagne in cream. Njihovo skupno izražanje povzroča močnejši učinek na fenotip, kar smo lahko predstavili s pomočjo fotografij. Predvsem priljubljena je kombinacija funkcionalnih alelov na lokusih dun in champagne.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 601.4:575: 577.212.3:636.1:575.22(043.2)
CX horse breeding, horses, American Paint Horse, American Quarter Horse, genetic, genotype, phenotype, dun, champagne dilution, tobiano
AU HORVAT, Tajda
AA DOVČ, Peter (supervisor), ZORC, Minja (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biotechnology, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TY IMPACT OF DUN LOCUS GENOTYPE ON THE PHENOTYPE OF THE HORSE
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VIII, 22, [10] p., 2 tab., 19 fig., 4 ann., 14 ref.
LA sl AI sl/en
AB Breeding programmes of American Paint and Quarter Horses relay strongly on genetic tests for genetic diseases and known genetic background of coat colour and pattern. Diluted colours which are caused by three loci, dun, cream and champagne, are very popular in breeding programmes. Although dun is a common phenotype in wild Equid species (zebras) it is rare in domestic horses and is present in only a few breeds. In addition to the functional D allele, there are two additional alleles, non- dun 1 (nd1) and non-dun 2 (nd2). The D allele is dominant and is phenotypically expressed by a strong dark dorsal stripe, zebra markings on the legs, darker area around the muzzle (primitive markings), darker mane and tail and diluted coat colour.
The nd1 allele or pseudo dun shows at the phenotypic level some characteristics of the dun phenotype, but with lower intensity, while the nd2 allele does not express primitive markings and diluted coat colour. The effect of alleles at the dun locus was shown by comparing the phenotype and genotype of 62 horses. We also made an expression analysis of the TBX3 (dun) gene at the RNA level for different mane samples of the horse with a complex phenotype. Dun dilution can be also found in combination with two other dilution genes, champagne and cream. When expressed together, they cause a more intense effect on the phenotype, which we presented with the help of photographs. Especially popular is the combination of functional alleles at the dun and champagne locus.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VI KAZALO SLIK VI
KAZALO PRILOG VIII
1 UVOD 1
2 PREGLED OBJAV 1
2.1 GENOTIP IN FENOTIP BARVE DLAKE 1
2.2 POSVETLITEV DLAKE DUN 2
2.3 POSVETLITEV DLAKE CHAMPAGNE 8
2.4 VZOREC TOBIANO 12
3 MATERIAL IN METODE 13
3.1 PODATKI 13
3.2 IZOLACIJA DNA IN GENOTIPIZACIJA 14
3.3 IZOLACIJA RNA IN RT-QPCR 14
4 REZULTATI Z RAZPRAVO 15
4.1 GENOTIPIZACIJA D/Nd2 15
5 ZAKLJUČEK 18
6 VIRI 90
ZAHVALA 20
PRILOGE
VI
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Vpliv alelov na lokusu TBX3 na osvetlitev dlake in prisotnost
primitivnih znakov 4
Preglednica 2: Genotipi lokusa TBX3, ki smo jih določili s sekvenciranjem
območja delecije v genu TBX3 17
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Kobila in žrebica smokey grullo z izrazitimi primitivnimi znaki. Kobila Reining In Diamonds ima genotip Ee aa DD nCr SW1 SW1, žrebica Shining C Cierra pa Ee aa DD nCr SW1 SW1. Obe sta dvojno registrirani kot konja pasem paint in quarter. (foto: Huckeba C., 2020)
3
Slika 2: Primitivni znaki pri fenotipu dun: dorzalna črta, horizontalne črte na nogah – zebrast vzorec, ter manj značilna temnejša obarvanost na plečih (zgornji srednja in desna ter spodnje fotografije: Huckeba C., 2020)
3
Slika 3: Poravnava zaporedij treh različic alelov dun (D: dun, d1: non-dun1 in d2:
non-dun2). Za različico d1 je značilna dodatna delecija dolžine 1 bp, zato je skupna dolžine delecje 1610 bp. Za d2 je značilna delecija 8 bp. Polimorfizma nista vzročna za fenotip dun (Imsland in sod., 2016).
4
Slika 4: Žrebica, stara 3 mesce, barve amber champagne, homozigotna za alel
non-dun1 (lastnica je Myre Lejeune, ranč Cheyennes v Nemčiji). 4 Slika 5: A) pravokotni prerez dlake pri konju z osvetljeno dlako (D/-), pri črnem
konju s primitivnimi znaki (d1/d1) in pri črnem konju brez primitivnih znakov (d2/d2), B) prerez dlake in kože, obarvanih s hematoksilinom in eozinom pri konjih z osvetljeno dlako (dun), C) pravokotni prerez dlake pri konjih z osvetljeno (dun) in neosvetljeno dlako (Imsland in sod., 2016).
5
Slika 6: Slike imunskega barvanja dlak glede na vse tri alelne oblike; z zeleno je prikazan izražen gen TBX3 in z rdečo izražen pigment. Opazno je asimetrično izražanje pri genotipu D/- (Imsland in sod., 2016)
6
Slika 7: Champagne (šampanjec) barva; modre oči žrebeta, jantarne oči odraslega konja, rožnato pegasta in lisasta koža po gobcu in okrog oči, sijoča dlaka, pozimi v temnejših odtenkih.
9
Slika 8: A) Gold champagne tobiano, genotipa ee Aa nCh Tt (nd2/nd2) B) classic champagne solid (enobarven, nd1/nd2) – genotipa Ee aa nCh; C in D) amber champagne tobiano, genotipa EE Aa nCh Tt; levi nd2/nd2, desni nd1/nd2); E in F) amber cream champagne tobiano, genotipa EE AA nCr nCh Tt (A, E in F foto:
Lejeune M., 2016)
9
Slika 9: A in B) Žrebec classic dun champagne z genotipom EE aa D/nd2 nCh in njegov potomec classic dun champagne tobiano z genotipom Ee aa D/nd2 nCh Tt;
C): Classic dun champagne tobiano z izredno svetlim odtenkom in genotipom EE aa D/nd2 nCh Tt.
10
VII
Slika 10: Poravnava zaporedij aminokislin pri sedmih vrstah sesalcev za
SLC36A1 v eksonih 1 in 2. Na mestu 63 je označena mutacija (zamenjava R s T), ki je povezana s fenotipom champagne (Cook in sod., 2008)
11
Slika 11: Kromatogram sekvenciranja lokusa SLC36A1 in poravnava med homozigotnim konjem champagne brez fenotipa champagne in referenčnim genomom konja. Bralni okvir je označen z izmeničnimi barvami (črna, modra) kodonov v referenčnem zaporedju (Ensembl v2). Spodaj je diagram strukture gena SLC36A1 (Cook in sod., 2008).
12
Slika 12: RT-PCR produkt za SLC36A1, SLC36A2 in SLC36A3 (Cook in sod.,
2008). 12
Slika 13: Prikaz različnih vzorcev tobiano (Paint Horse Association of America, 2021). Na sredini je kobila z minimalno belino, na desni pa kobila s skoraj maksimalno belino (prva slika: APHA, 2021).
13
Slika 14: Žrebec JMJ Champagne Revenu (desna slika foto: Lejeune M., 2018) 13
Slika 15: Žrebec Highbrow Voodoo Doc 14
Slika 16: Označena mesta na grivi za vzorčenje, 1) dlaka bele barve, 2) in 3)
dlaka z oranžnim odtenkom, 4) temna dlaka. 15
Slika 17: Gelska elektroforeza PCR pomnožkov z začetnimi nukleotidi za
diskriminacijo alelov D in nd2. 15
Slika 18: A) Fragment nukleotidnega zaporedja gena TBX3 v območju delecije, ki razlikuje alela D in nd1. Polimorfno mesto je označeno; B) nukelotidna zaporedja treh genotipov (D/D, D/nd1 in nd1/nd1) na mestu, kjer se alela D in nd1 razlikujeta.
16
Slika 19: Kvantifikacija izražanja genov TBX3 in KITLG s qPCR 18
VIII
KAZALO PRILOG Priloga A: Izolacija DNA
Priloga B: Izolacija RNA
Priloga C1: Genotipski in fenotipski podatki za žrebca JMJ Champagne Revenue, njemu pripadajoče kobile in njune potomce.
Priloga C2: Genotipski in fenotipski podatki za žrebca Wynnin Silver Mine in njegovo potomko
Priloga C3: Genotipski in fenotipski podatki za žrebca Highbrow Voodoo Doc, kobile in njihove potomce
Priloga D1: Fotografije 12 konj fenotipa classic dun champagne ali amber dun champagne, z vsaj enim alelom D (dun) in enim alelom CH (champagne).
Priloga D2: : Fotografije 12 konj grullo, bay dun ali dunskin z vsaj enim alelom D (dun).
Priloga D3: Fotografije 6 konj fenotipa classic champagne ali amber champagne, z vsaj enim alelom nd1 in enim alelom CH (champagne).
Priloga D4: Fotografije 6 konj fenotipa buckskin, sorrel, black ali bay, z vsaj enim alelom nd1
Priloga D5: Fotografije konj fenotipa classic champagne ali amber champagne, z dvema aleloma nd2 in enim alelom CH (champagne)
Priloga D6: Fotografije konj fenotipa sorrel, bay, z dvema (ali vsaj enim) aleloma nd2. Izjema je kobila na prvi fotografiji, ki je fenotipa gold champagne
Priloga D7: Fotografije konj fenotipa black, z dvema (ali vsaj enim) aleloma nd2
1 1 UVOD
Barva konj ima v reji poleg ostalih telesnih, atletskih in značajnih lastnosti zelo velik pomen, še posebej pri ameriški pasmi paint konj. Za dobre paritvene kombinacije in rejske načrte je zato nujno poznavanje dedovanja barvnih kombinacij ter genetskega ozadja vsakega plemenskega konja. V našem delu smo se osredotočili predvsem na konje s posvetljeno dlako in primitivnimi oznakami, ki so posledica delovanja lokusa dun v kombinaciji s še enim posvetljevalnim lokusom za barvo dlake, champagne. Zanimala nas je primerjava med fenotipi in genotipi konj glede na prisotnost treh dun alelov: dun (D), ne-dun 1 (nd1) in ne- dun 2 (nd2). V dokaj velikem vzorcu konj tako lahko dobimo reprezentativne rezultate. Gen TBX3 je odgovoren za posvetlitev dlake in za prisotnost primitivnih oznak kot sta dorzalna črta in zebraste črte na nogah. Posvetlitev dlake je posledica radialno asimetričnega odlaganja pigmenta. Čeprav je dun fenotip, značilen za prosto živeče vrste Equid (zebre), ga je pri udomačenih konjih malo, najdemo ga le pri nekaterih pasmah. Večina pasem ima prisoten alel nd2, pri katerem gre za mutacijo (delecijo), ki nima vpliva na barvo dlake in ne izraža primitivnih oznak. Delovanje in izražanje gena TBX3 smo preučili tudi na ravni RNA.
Za RNA analizo smo si izbrali žrebico s kompleksnim fenotipom, ki vključuje tudi delovanje lokusa tobiano. Proučevali smo intenziteto izražanja genov TBX3 in KITLG na štirih predelih grive.
2 PREGLED OBJAV
2.1 GENOTIP IN FENOTIP BARVE DLAKE
S pigmentacijo so povezani številni geni, ki vplivajo na tip in količino melanina, proizvedenega v koži in dlaki živali. Do danes je bila opisana vloga pri pigmentaciji sesalcev za več kot 300 genov (Baxter in sod., 2019). Melanociti pri sesalcih proizvajajo dve vrsti melanina, evmelanin (rjavi oziroma črni pigment) in fevmelanin (rdeči oziroma rumeni pigment). Fenotip je odvisen od količine in porazdelitve obeh pigmentov. Pri konjih se pojavljajo tri osnovne barve dlake, rjava, kostanjeva in črna, ki so večinoma odvisne od izražanja genov ASIP in MC1R (Rieder in sod., 2001). Lokus ASIP je povezan z lokacijo in vzorcem evmelanina (griva, rep, spodnji del nog, ušesa in gobec). Zaradi delecije 11 baznih parov na lokusu ASIP produkcija evmelanina ni omejena, kar na primer povzroči popolnoma črno dlako po celem telesu konja. Lokus MC1R je odločilen za izražanje evmelanina. Konji, homozigotni nosilci mutacije, ki povzroči izgubo funkcije MC1R, proizvajajo samo fevmelanin in so kostanjeve barve, ne glede na genotip na lokusu ASIP.
Med razvojem pasem konj so rejci odbirali živali z različnimi vrstami in količinami pigmenta in različnimi belimi vzorci. Količina pigmenta oziroma osvetlitev evmelanina, fevmelanina ali obeh hkrati, je opisana pri konjih z različnimi vrstami osvetlitve (cream, pearl, sunshine, champagne, dun, silver in mushroom). Tri vrste osvetlitve (cream, pearl in sunshine) lahko razložimo s polimorfizmi gena SLC45A2 (sinonimno ime gena je MATP) (Mariat in sod., 2003; Holl in sod., 2019). Do posvetlitve pride zaradi spremembe funkcije produkta gena SLC45A2, zaradi katere pride do znižane produkcije pigmenta. Pri vrstah posvetlitve pearl in sunshine gre za posvetlitev obeh, evmelanina in fevmelanina, medtem ko je pri osvetlitvi cream v heterozigotnem stanju osvetljen samo fevmelanin, evmelanin pa le v homozigotnem stanju. Osvetlitev champagne lahko razložimo s polimorfizmom gena SLC36A1, ki vpliva
2
na razvoj melanosomov (Cook in sod., 2008). Za osvetlitev tipa dun je značilna osvetlitev obeh pigmentov, fevmelanina in evmelanina, ter vzorec (dorzalna črta, plečni križec in zebraste proge po nogah), ki mu rečemo tudi primitivne oznake. Osvetlitev dun je ancestralni fenotip, ki je povezan z regulatornim polimorfizmom gena TBX3, ki vpliva na razporeditev pigmenta v lasnih mešičkih (Imsland in sod., 2016). Osvetlitev vrste silver povrzoča varianta gena PMEL17, ki vpliva na razporeditev evmelanina v razvijajočih se melanosomih (Brunberg in sod., 2006). Osvetlitev tipa mushroom, ki je značilna za šetlandske ponije, so povezali s polimorfizmom na lokusu MFSD12 (Tanaka in sod., 2019).
Barva dlake je pri paint in quarter konjih vedno bolj pomembna, saj vpliva na ceno, tržno atraktivnost in zaželenost posameznih konj. Posebna barva je le dodatni bonus k zdravemu, dobro grajenemu, genetsko neobremenjenemu (brez znanih genetskih bolezni) konju z dobrim rodovnikom. V zadnjih letih je imela barva dlake pomembno vlogo, saj vedno več rejcev svoje konje in žrebeta genetsko testira za znane genetskih bolezni, ki bremenijo to pasmo (HYPP, HERDA, GBED, MH, IMM, PSSM1) kot tudi za genetsko ozadje barve in vzorca obarvanosti konja. Brez poznavanja genotipa pogosto ne moremo določiti fenotipa barve, saj ti obstajajo v več odtenkih in so si med seboj lahko zelo podobni, še posebej kadar gre za delovanje kombinacij več lokusov. Številni laboratoriji ponujajo testiranja za alele, povezane z barvo dlake, najbolj znana sta Animal Genetics, UC Davis, in Etalon Diagnostics. Nekateri izmed lokusov, povezani s pigmentacijo in osvetlitvijo, ki jih genotipizirajo v diagnostičnih laboratorijih, so A (agouti), E (red/black factor), Cr (cream), D (dun), Ch (champagne), Z (silver), Prl (pearl), G (gray) in nekoliko manj pogosto Mu (mushroom). V genetskih testih za barvne vzorce pri konjih so zajeti lokusi T (tobiano), O (frame overo), Sb1 (sabino 1), SW1 (splashed white 1), SW2 (splashed white 2), SW3 (splashed white 3), SW4 (splashed wihite 4), SW6 (splashed white 6), LP (appaloosa – leopard print), PATN 1 (pattern 1) in Dominant White (poznanih je več različic, W10, W13 in W20 so značilne za paint in quarter konje).
2.2 POSVETLITEV DLAKE DUN
Za posvetlitev dlake pri konjih, ki jih označujemo z izrazom dun ali plavec, je značilna osvetlitev po celem telesu, s posameznimi močno pigmentiranimi področji, ki predstavljajo primitivne znake (zebraste črte na nogah, dorzalna črta, temnejši del v predelu gobca, ter manj značilna temnejša obarvanost na plečih) (Slika 1, Slika 2). Do osvetlitve dlake pride pogosto zaradi mutacij, ki povzročijo izgubo ali zmanjšanje funkcionalnosti katerega od elementov v mehanizmu pigmentacije. Pri konjih s fenotipom dun gre za ancestralno obliko, oziroma divji tip (angl. wild type; wt) z intaktno melanogenezo. Fenotip dun je značilen za przewalski konje in druge prostoživeče kopitarje (kiang, onager, Afriški divji osel in kvaga), pri katerih ima lahko posvetljena dlaka zaščitno vlogo v naravi. Na poslikavah konj izpod rok predjamskega človeka naj bi bili konji s fenotipom dun.
Za zadnjim eksonom gena TBX3 je 1609 baznih parov dolg genomski odsek, ki je ohranjen pri sesalcih in ima funkcijo pri uravnavanju izražanja gena TBX3 (Imsland in sod., 2016).
Pri večini domačih konj, vključno s kobilo Twilight pasme thoroughbred, katere DNA so uporabili za sekvenciranje referenčnega genoma konja, ni omenjenega odseka na lokusu TBX3. Udomačeni konji imajo intenzivno pigmentacijo, ki jo povzroča regulatorna delecija, ki znižuje izražanje gena TBX3. Do posvetlitve dlake pride zaradi radialno asimetričnega
3
odlaganja pigmenta v rastoči dlaki, ki je nadzorovano z lokaliziranim izražanjem gena TBX3 v dlačnih mešičkih.
Poleg delecije (1.6 kbp) poznamo še dva alela na lokusu TBX3, ki sta povezana s svetljenjem dlake in več variant interakcij med temi aleli (Preglednica 1). Znotraj delecije (1067 baznih parov od začetka delecije) je SNP (SNP1, G pri osvetljenih, sicer T), kjer je potencialno vezavno mesto za transkripcijska faktorja NF-Y in NF-I. Pred začetkom delecije (362 baznih parov) je SNP (SNP2, G pri osvetljenih, sicer A), ki lahko vpliva na potencialni vezavni mesti za transkripcijska faktorja ALX4 in MSX2, ki sta povezana z razvojem lasnih mešičkov. Za polimorfizem, ki se nahaja znotraj delecije, ocenjujejo, da se je pojavil pred več kot 40.000 leti, medtem ko se je SNP v genomskem odseku pred delecijo pojavil kasneje.
Slika 1: Kobila in žrebica smokey grullo z izrazitimi primitivnimi znaki. Kobila Reining In Diamonds ima genotip Ee aa DD nCr SW1 SW1, žrebica Shining C Cierra pa Ee aa DD nCr SW1 SW1. Obe sta dvojno registrirani kot konja pasem paint in quarter. (foto: Huckeba C., 2020)
Slika 2: Primitivni znaki pri fenotipu dun: dorzalna črta, horizontalne črte na nogah – zebrast vzorec, ter manj značilna temnejša obarvanost na plečih (zgornji srednja in desna ter spodnje fotografije: Huckeba C., 2020)
Z genotipizacijo 1814 konj več kot 45 pasem z znanim fenotipom so ugotovili, da se pri konjih pojavljajo trije haplotipi (Slika 3). Z delecijo je vezana varianta A na lokusu SNP2.
4
Kadar ni delecije, sta genotipa SNP2 in SNP1 bodisi GG (SNP2:G, SNP1:G) ali AT (SNP2:A, SNP1:T). Samo pri Estonskih nativnih konjih so odkrili redek haplotip AG (SNP2:A, SNP1:G). SNP1 v deleciji (T namesto G) zadošča, da povzroči fenotip brez osvetljene dlake (non-dun1). Fenotip brez osvetljene dlake povzroči tudi delecija (non- dun2). Primerjava haplotipov kaže, da se je delecija pojavila na kromosomu non-dun1, torej se je non-dun2 razvil iz non-dun1. Največji doprinos k udomačitvi konj naj bi imela populacija konj z visoko frekvenco alela non-dun1. Pri samo dveh tretjinah konj brez osvetljene dlake je genotipizacija pokazala homozigotno stanje delecije. Pri konjih, ki nosijo alel non-dun1, so pogosto prisotni primitivni znaki, ki pa so navadno zelo slabo vidni zaradi močno pigmentirane osnovne barve dlake.
Slika 3: Poravnava zaporedij treh različic alelov dun (D: dun, d1: non-dun1 in d2: non-dun2). Za različico d1 je značilna dodatna delecija dolžine 1 bp, zato je skupna dolžine delecje 1610 bp. Za d2 je značilna delecija 8 bp. Polimorfizma nista vzročna za fenotip dun (Imsland in sod., 2016).
Zanimiv primer je žrebica barve amber champagne tobiano (Slika 4) z genotipom EE Aa nCh TT nd1nd1, ki ima zelo močno izražene primitivne znake in ne nosi alela D na lokusu dun, temveč je homozigotna za alel nd1. Njena druga zanimivost je, da je homozigot za barvni vzorec tobiano, vendar nima lis, le štiri bele nogavičke.
Preglednica 1: Vpliv alelov na lokusu TBX3 na osvetlitev dlake in prisotnost primitivnih znakov Oznaka genotipa Genotip: TBX3 indel, TBX3 SNP1 Fenotip
D/D WT/WT, G/G dun
D/nd1 WT/WT, G/T dun
D/nd2 WT/del, G/- dun
nd1/nd1 WT/WT, T/T ni dun, lahko ima
primitivne znake
nd1/nd2 WT/del, T/- ni dun, lahko ima
primitivne znake
nd2/nd2 del/del, -/- ni dun, brez primitivnih
znakov
Slika 4: Žrebica, stara 3 mesce, barve amber champagne, homozigotna za alel nd1 (lastnica je Myre Lejeune, ranč Cheyennes v Nemčiji).
5
Gen TBX3 se pri konju nahaja na kromosomu 8 in kodira medvrstno ohranjen transkripcijski faktor z domeno T-box, jedrnim lokalizacijskim signalom (angl. nuclear localization signal;
NLS), dvema domenama transkripcijske represije (R1 in R2) in aktivacijsko domeno (A).
Transkripcijski faktorji iz družine T-box aktivirajo ali utišajo tarčne gene z vezavo na T- elemente in so pomembni med razvojem organizma, ker imajo ključno vlogo pri celični diferenciaciji in organogenezi. Pri človeku mutacija alela gena TBX3, povzroči razvojne napake mlečne žleze (Schinzel sindrom), nepravilnosti v razvoju okončin, apokrinih žlez, zob in spolovil. Za preučevanje teh nepravilnosti in njihovega mehanizma so izvedli poskuse na miših, kjer gen TBX3 sprva ni bil povezan z odlaganjem pigmenta, kot je to sedaj znano pri konjih. Gen TBX3, se običajno izraža v značilnem vzorcu in ima za posledico fenotip dun obarvanja in pojav primitivnih znakov.
Imsland in sod., 2016 so naredili mikroskopski pregled posvetljenih dlak in dlak iz primitivnega znaka (dorzalne hrbtne črte). V posvetljeni dlaki (dun) se je pokazalo zmanjšanje pigmentacije v radialno asimetričnem vzorcu. V odsekih, ki so pravokotni na dlako, so bila zrnca pigmenta v posvetljenih dlakah omejena na približno 20-25% skorje (Slika 5). Nasprotno pa so dlake iz temno obarvane dorzalne črte imele enakomerno razporejene pigmentne granule. Prav tako so imeli predstavniki ne-dun barve enakomerno razporeditev po skorji dlake, kar posledično ne povzroča posvetlitve dlake.
Slika 5: A) pravokotni prerez dlake pri konju z osvetljeno dlako (D/-), pri črnem konju s primitivnimi znaki (d1/d1) in pri črnem konju brez primitivnih znakov (d2/d2), B) prerez dlake in kože, obarvanih s hematoksilinom in eozinom pri konjih z osvetljeno dlako (dun), C) pravokotni prerez dlake pri konjih z osvetljeno (dun) in neosvetljeno dlako (Imsland in sod., 2016).
V prerezu dlak vidimo razporejenost pigmenta in melanocitov. Pri konju z alelom D je vidnega manj pigmenta, ki je porazdeljen radialno asimetrično, kot pri tistih z aleli non-dun1 in non-dun2, kjer je pigment porazdeljen enakomerno (Slika 5A). Na slikah odsekov dlake, obarvanih s hematoksilinom in eozinom, opazimo asimetrično razporejenost pigmenta ob prisotnosti alela D v primerjavi z alelom nd2 (Slika 5B in Slika 5C).
Imsland in sod., (2016) so raziskovali tudi diferencialno izražanje genov v koži konj in dobili vpogled v mehanizem redčenja pigmentov. Analizirali so transkriptomske podatke kože sedmih konj z osvetljeno (dun) in 11 konj z neosvetljeno dlako. Identificirali so 57 različno izraženih genov vključno s TBX3. S kvantitativnim RT-PCR (RT-qPCR) so potrdili znižanje izražanja TBX3 pri nosilcih alela non-dun1 (za 3,5x) in non-dun2 (za 2,5x), pri homozigotih.
Sosednji gen TBX5 ni bil diferencialno izražen. Rezultati sekvenciranja RNA so pokazali diferencialno uravnavanje osmih genov, povezanih s proizvodnjo pigmentov specifičnih za melanocite (TYR, DCT, MC1R, TRPM1, SLC24A5, MLANA, KIT in OCA2) v ne-dun koži, kar je povezano s povečano intenzivnostjo pigmentacije v dlaki. ASIP, EDN3 in KITLG so
6
trije geni z znano regulatorno vlogo pri oblikovanju barvnih vzorcev pri živalih. Med njimi je bil le KITLG diferencialno izražen. Prav tako so raziskali transkriptom primitivnega znaka (dorzalne črte) in ga primerjali s transkriptomom dlake iz enakega področja ne-dun konja in niso opazili diferencialnega izražanja melanogenskih in melanocitnih regulatornih genov. Z analizo RNA-seq niso zaznali razlike med dun in ne-dun v izražanju gena MITF, verjetno zaradi celic v dermisu, kjer genotip dun nima vpliva na izražanje MITF. RNA-seq je pokazalo veliko večjo ekspresijo gena KIT pri ne-dun v primerjavi z dun osebki. KITLG je pokazal asimetrično izražanje v keratinocitnih mešičkih pri dun živalih, skupaj z asimetrijo melanocitov in porazdelitvijo pigmenta.
Imsland in sod., (2016) so z imunohistokemijo odsekov kože dun odkrili vzorec izražanja TBX3 v dlačnih mešičkih, ki se zrcali kot vzorec odlaganja pigmenta (Slika 6). V zaporednih odsekih anagenih mešičkov dlake je bil TBX3 lokaliziran v gruči keratinocitov v razvijajoči se skorji dlake, medtem, ko TBX3 ni bil izražen v keratinocitnem korteksu dlake iz kože ne- dun konja, niti v dorzalni temni črti dun in ne-dun1 osebkov. Bil pa je izražen v zunanji kutikularni plasti mešičkov dlake v vseh vzorcih. Ti rezultati kažejo, da TBX3 deluje v keratunocitni skorji dlake in zavira sintezo pigmentov pri dun konjih, kar povzroči posvetlitev odtenka dlake. Tako histološke kot transkriptomske razlike med dun in ne-dun genotipi se odražajo v različni porazdelitvi melanocitov znotraj dlačnega mešička.
Proučevanje mehanizma, s katerim TBX3 vpliva izražanje gena KITLG in lokalizacijo melanocitov, je poleg asimetrije v pigmentu pokazalo tudi razlike v volumnu dlačnih mešičkov. Mešički konj dun so pokazali večjo asimetrijo v prostornini dlačnega mešička.
Razlik niso opazili v dorzalnih srednjih mešičkih. Za boljšo lokalizacijo izražanja TBX3 so uporabili dodatne označevalce, AE13 (korteks), KI67 (proliferativne celice), AE15 (medula, notrajni koreninski ovoj) in KRT6 (keratin 6 – plast spremljevalnih celic).
Slika 6: Slike imunskega barvanja dlak glede na vse tri alelne oblike; z zeleno je prikazan izražen gen TBX3 in z rdečo izražen pigment. Opazno je asimetrično izražanje pri genotipu D/- (Imsland in sod., 2016)
Vzorec izražanja KRT6 in AE15 se je zelo razlikoval od vzorca izražanja TBX3. Celice, kjer se izraža TBX3, ležijo v neposredni bližini razvijajoče se skorje dlake. Celice z izraženim KI67 so imele izražen tudi TBX3. Tako pride do izražanja TBX3 med zgodnjo diferenciacijo
7
keratinocitov mešička dlake. Zdi se, da TBX3 premakne ravnovesje med delečimi in diferencirajočimi se celicami, kar potem vodi do zmanjšanja prostornine mešičkov dlake.
Asimetrično izražanje TBX3 v keratinocitih konj dun vodi do asimetrične pigmentacije preko spremenjenega izražanja KITLG, mutacije pri ne-dun konjih pa motijo ta mehanizem.
Dun obarvanost ponazarja nov vidik pigmentacijskih variacij s posledicami za biologijo epitelja. V nasprotju s tem mutacije gena TBX3 pri drugih vrstah rezultirajo tudi v izgubi funkcije in v defektih. Pri drugih vrstah mutacije predstavljajo razredčeno pigmentacijo, in posvetlitev dlake. Razredčena pigmentacija pri konjih predstavlja divji tip in ohranja nedotaknjeno melanogenezo. Učinek gena TBX3 na odlaganje pigmenta je alternativen in nepričakovan mehanizem, ki spreminja videz posameznih dlak na različnih področjih telesa.
Celice mešičkov dlak, ki izražajo TBX3, vključujejo keratinocite in skorjo lasnice (dlake).
Delecije tako v nd1 kot v nd 2 so motilci delovanja transkripcijskega faktorja v karatinocitih čebulic dlak med rastjo. Te mutacije pri konjih ne kažejo drugih učinkov in motenj pri razvoju okončin ali drugih pleiortopnih učinkov zunaj mešička dlake. Tovrstni učinek TBX3 lahko omejimo le na kopitarje (katerih zadnji skupni prednik je bil pred 4-4.5 milijoni let).
Delecije v nd2 imajo veliko večji učinek kot v nd1. Nukleotidna pestrost nd2 je nizka in značilna za domače konje, kar kaže na relativno mlad izvor (verjetno zadnjih tisoč let, verjetno po udomačitvi konja). V nasprotju pa ima nd1 veliko večjo nukleotidno raznolikost in posledično starejši izvor.
Hucul konji so manjše rasti iz izvirajo iz področja Karpatov. Mackowski in sod., 2019 so analizirali vpliv genov dun (TBX3) in agouti (ASIP) na barvo in odtenek dlake pri konjih pasme hucul. V študiji so uporabili 462 vzorcev genomske DNA, večino teh vzorcev (414) je zagotovil genetski laboratorij z univerze v Poznanu, preostalih 48 pa so pridobili sami iz nacionalne kobilarne hucul konj na Poljskem. Pogostosti variant na lokusih TBX3 in ASIP v manjšem vzorcu so primerjali z zabeleženimi, registriranimi barvnimi fenotipi v večjem vzorcu. V raziskavo so vključili tudi tiste konje, ki niso bili vpisani v rodovniško knjigo. Po končani genotipizaciji je bila izbrana skupina naključnih 74 konj na kateri so izvedli test za Hardy-Weinbergovo ravnovesje, ob upoštevanju dveh (A ali a) ali treh (D, nd1 ali nd2) aleov na lokusih ASIP in TBX3. Po pridobljenih rezultatih so primerjali dobljene genotipe z registriranimi fenotipi ter zabeležili odstopanja. Največ napak je bilo pri konjih z genotipom nd1/nd1 in nd1/nd2, kar lahko pripišemo psevdo delovanju posvetljevanja dlake in nastanka primitivnih znakov zaradi psevdo dun alela nd1. Izkazalo se je, da je prisotnost alela D višja od predhodno pričakovane. Genotipizacija gena TBX3 pri naključno izbranih 74 hucul konjih je potrdila prisotnost vseh šestih možnih genotipov. Najvišjo frekvenco je imel alel nd1. Pri genu ASIP je imel najvišjo frekvenco genotip aa, najnižjo pa AA. Oba lokusa sta v Hardy- Weunbergovem ravnotežju. Pri primerjanju rezultatov genotipizacije z registriranimi barvami konj so naleteli na približno 35% odstopanje. Pri konjih hucul so opazili višjo frekvenco alela nd1 kot pri drugih pasmah in relativno nizko frekvenco nd2. To bi lahko pripisali selekciji, ki daje prednost barvam, ki jih povzroča alel nd1. Pri tej pasmi je šlo za močno negativno selekcijo proti nd2 (odsotnost primitivnih znakov).Ugotovili so, da je več hucul konj nosilcev alela D, kot je bilo zabeleženo v registru. Raziskava je pokazala 30%
prisotnost alela D. Omenjajo možnost prisotnosti dodatnega genetskega modifikatorja pri hucul konjih, ki prekriva učinek redčenja barve zaradi lokusa dun. Pri miših so tovrsten modifikator že odkrili (MREG) in ga poimenovali represor redčenja (Moorein sod., 1998).
Zaenkrat ni dokazov, da bi imel gen MREG kakršen koli vpliv na variabilnost barve dlake
8
pri hucul konjih in konjih drugih pasem. Prav tako so izpostavili možnost prisotnosti drugih genov, na primer za vzorec tobiano, ki lahko zakrije prisotnost dorzalne črte pri fenotipu dun.
Poudarili so pomembnost genetskih testiranj z namenom izogibanja napakam v vzrejnih dokumentih. V raziskavi so poleg alelov na lokusu dun raziskovali še lokus agouti.
Homozigotno stanje aa povzroči enakomerno temno obarvanje dlake (črna barva dlake), v takšnem stanju govorimo o mutaciji. Ko pa gre za divji tip in prisotnost vsaj ene kopije alela A (Aa ali AA), pa pride do omejene porazdelitve evmelanina na več predelih (griva, rep, sprednji del, ušesa so temnejše barve kot preostali deli telesa – bay barva konja). Pri konjih pasme hucul kostanjeva barva (posledica mutacije v MC1R) ni zaželena in jo velikokrat izločijo iz reje.
2.3 POSVETLITEV DLAKE CHAMPAGNE
Champagne ali šampanjec barva konja je ena izmed najbolj redkih tako pri paint in quarter konjih kot tudi med drugimi pasmami, je pa vedno bolj zaželena in priljubljena. Gen, ki je odgovoren za odtenek champagne, posvetli osnovno barvo dlake. Poleg sijoče, posvetljene dlake, ki pozimi postane temnejša, je značilna rožnato progasta in lisasta koža v predelu gobca in okrog oči ter spreminjajoča se barva in odtenek oči skozi obdobje odraščanja (od modre, preko sive do jantarne in oranžne barve oči) (Slika 7). Končni fenotip je odvisen od osnovne barvne podlage (gena agouti in geni za rdeči in črni pigment) ter kombinacije z drugimi posvetlitvenimi aleli (dun, cream in pearl). Ob rojstvu imajo konji s fenotipom champagne predele okrog gobca in oči ter pod repom bolj rožnate barve, tekom odraščanja pa pridobijo vedno več peg in lis.
Barva champagne predstavlja mnoge odtenke (Slike 7, 8 in 9), vsak od njih pa dobi na soncu poseben sijaj. Poznamo odtenke classic, amber in gold champagne šampanjec barve. Amber in classic (Slika 7B) je včasih fenotipsko težko ločiti ne da bi določili genotip. Barva gold champagne predstavlja osnovo palomino (red faktor ee) z alelom champagne namesto alela cream (kombinacija obeh pa je gold cram champagne). Amber champagne predstavlja osnovo buckskin (black faktor in agouti gen) z alelom champagne nemesto alela cream (kombinacija obeh je amber cream champagne). Classic champagne predstavlja črno osnovo (black faktor, brez agouti) oziroma osnovo smokey black namesto alela cream (kombinacija obeh je classic cream champagne).
9
Slika 7: Champagne (šampanjec) barva; modre oči žrebeta, jantarne oči odraslega konja, rožnato pegasta in lisasta koža po gobcu in okrog oči, sijoča dlaka, pozimi v temnejših odtenkih.
Slika 8: A) Gold champagne tobiano, genotipa ee Aa nCh Tt (nd2/nd2) B) classic champagne solid (enobarven, nd1/nd2) – genotipa Ee aa nCh; C in D) amber champagne tobiano, genotipa EE Aa nCh Tt; levi nd2/nd2,
10
desni nd1/nd2); E in F) amber cream champagne tobiano, genotipa EE AA nCr nCh Tt (A, E in F foto: Lejeune M., 2016)
Slika 9: A in B) Žrebec classic dun champagne z genotipom EE aa D/nd2 nCh in njegov potomec classic dun champagne tobiano z genotipom Ee aa D/nd2 nCh Tt; C): Classic dun champagne tobiano z izredno svetlim odtenkom in genotipom EE aa D/nd2 nCh Tt.
Gen, odgovoren za barvo champagne, je bil odkrit in povezan z njo šele leta 2008. Barvni odtenek champagne so prej pripisovali drugim barvam (palomino in buckskin), ki so jih imenovali tudi bučno obarvan palomino (pumpkin-skin palomino). Raziskovalci, ki so to mutacijo odkrili, menijo, da bi lahko šlo za vpliv na pH melanosoma in s tem vpliv na predelavo tirozina, ki je ključni element melanogeneze.
11
S posvetlitvijo champagne je povezan gen SLC36A1 na kromosomu 14 pri konju, njegova vloga v posvetlitvi dlake pa še ni povsem znana. Mutacija na lokusu SLC36A1 je do danes edina znana različica, povezana s fenotipom barve champagne. Gre za alel CH (SNP C/G), ki povzroči aminokislinsko spremembo (T63R) in s tem spremeni funkcijo proteina (Slika 10). Gen SLC36A1 ni bil povezan s pigmentacijo pri nobeni drugi vrsti živali razen pri konju in je slabo raziskan. Poravnava aminokislinskega zaporedja za eksona 1 in 2 gena SLC36A1 pri sedmih vrstah sesalcev (konj, šimpanz, govedo, človek, pes, podgana in miš) je pokazala, da je to območje zelo ohranjeno med vrstami. Na aminokislinski poziciji 63 je zaporedje pri vseh vrstah popolnoma ohranjeno, razen pri konjih, ki imajo fenotip champagne (Slika 11).
Gen SLC36A1 sodi v skupino proteinov aktivnega transporta in difuzije, kamor spada tudi gen SLC45A2, ki je odgovoren za posvetlitev cream (CR), ki je posledica spremembe ene same baze eksona 2 gena SLC45A2, ki povzroči zamenjavo aspartata z asparginom. Ima nepopolno dominanten način izražanja, pri le enem alelu CR je razredčen feomelanin (rdeč pigment), pri homozigotni obliki pa povzroči ekstremno redčenje tega pigmenta, in tudi evmelanina (črni pigment). Prav tako pa CH vpliva na redčenje feomelanina in evmelanina, vendar so razlike med heterozigotni in homozigotno obliko veliko manj opazne kot pri CR.
Alel CH so mapirali z asociacijsko analizo z uporabo mikrosatelitnih označecalcev v 6 cM dolgi regiji na kromosomu 14 (Cook in sod., 2008). Štirje mikrosateliti (VHL209, TKY329, UM010 in COOK007) so pokazali povezavo z alelom CH. Testirali so potomce treh družin enakih očetov. Kandidatni geni (SPARC, SLC36A1, SLC36A2 in SLC36A3) so bili izbrani na podlagi bližine markerja COOK007 in kriterija, da sodelujejo pri migraciji pigmenta. Gen SPARC se nahaja najbližje markerju in je odgovoren za migracijo pigmentnih epiteljskih celic pri miših. Geni družine SLC36 so odgovorni za transport topnih snovi in imajo vlogo pri formiranju barve kože in dlake (pri miši in tudi človeku). SLC36A3 ni izražen v kožnem tkivu, zato ga v nadaljevanju niso obravnavali. Za ugotavljanje izražanja genov SLC36A1, SLC36A2 in SLC36A3 v koži so uporabili RT-PCR (Slika 12). Tri gene (SPARC, SLC36A1 in SLC36A2) so sekvencirali v homozigotni obliki za CH in v homozigotni obliki ob odsotnosti posvetlitve champagne (ch). Povezava SNP-ja v SLC45A2 s fenotipom champagne je bila popolna. Ta ugotovitev se je ujemala pri vseh 85 testiranih konjih fenotipa champagne, odsotnost tega SNP-ja so evidentirali pri vseh 97 konjih brez fenotipa champagne.
Slika 10: Kromatogram sekvenciranja lokusa SLC36A1in poravnava med homozigotnim konjem champagne brez fenotipa champagne in referenčnim genomom konja. Bralni okvir je označen z izmeničnimi barvami (črna, modra) kodonov v referenčnem zaporedju (Ensembl v2). Spodaj je diagram strukture gena SLC36A1 (Cook in sod., 2008)
12
Slika 11: Poravnava zaporedij aminokislin pri sedmih vrstah sesalcev za SLC36A1 v eksonih 1 in 2. Na mestu 63 je označena mutacija (zamenjava R s T), ki je povezana s fenotipom champagne (Cook in sod., 2008)
Slika 32: RT-PCR produkt za SLC36A1, SLC36A2 in SLC36A3 (Cook in sod., 2008)
2.4 VZOREC TOBIANO
Tobiano ali vzorec belih lis je kontroliran z dominantnim alelom. Kot vsi ostali vzorci belih lis, se tudi tobiano konji med seboj lahko zelo razlikujejo glede na količino beline, ki prečka hrbtno linijo konja nekje med ušesi in repom (Slika 13). Koža pod belimi lisami je rožnata, pod pigmentirano dlako pa temna. Oči so v večini primerov rjave barve, lahko so pa tudi modre ali delno modre barve. Glava je temna oziroma v osnovni barvi dlake z belimi oznakami (ki so značilne tudi za enobarvne konje). V večini primerov imajo vse štiri noge bele od kolena in skočnega sklepa navzdol. Rep je lahko dvobarven kar je zelo redko pri konjih, ki ne nosijo gena tobiano.
Dominanti alel T (ali TO) povzroča vzorec tobiano, recesiven alel t (ali to) pa ne. Za razliko od drugih vzorcev obarvanosti, tobiano ni odvisen od mutacije manjšega obsega, ampak je povezan z veliko kromosomsko inverzijo, ki vpliva na funkcijo gena KIT, povezanega s pigmentacijo. Povezavo med inverzijo in vzorcem tobiano so odkrili raziskovalci univerze v Kentucky-ju. Mutacije v genu KIT so odgovorne za vzorce obarvanosti tudi pri drugih vrstah (mačka, pes, krava, prašič in podgana).
13
Slika 13: Prikaz različnih vzorcev tobiano (Paint Horse Association of America, 2021). Na sredini je kobila z minimalno belino, na desni pa kobila s skoraj maksimalno belino (prva slika: APHA, 2021).
3 MATERIAL IN METODE 3.1 PODATKI
Za namen našega dela smo sestavili pregled 62 konj pasme paint in quarter, nekateri izmed njih so v sorodstvenem odnosu. Vsi konji so last ali produkt reje gospe Myre Lejeune, dolgoletne vzrediteljice paint in quarter Horse konj. Trenutno ima 3 plemenske žrebce, dva pasme paint horse in enega quarter horse ter 23 plemenskih kobil (od tega smo jih 20 vključili v našo mrežo podatkov) pasme paint in quarter horse. Žrebeta, ki so plod njene reje, odražajo kvaliteto ter so dobri predstavniki pasme brez genetskih bolezni. Za našo analizo smo uporabili grivo z mešički, večino smo pridobili oktobra 2020, za RNA analizo pa maja 2021.
Konje smo razdelili v dve skupini glede na dva plemenska žrebca in njim pripadajoče plemenske kobile ter žrebeta zadnjih štirih generacij (2017-2020).
Slika 14: Žrebec JMJ Champagne Revenu (desna slika foto: Lejeune M., 2018)
Žrebec JMJ Champagne Revenue (Slika 14) pasme Paint Horse s fenotipom amber champagne je bil rojen 2010 v Ameriki in ima genotip EE Aa nCh nd1/nd2 TT. V analizo smo vključili 16 njegovih potomcev, od tega osem s fenotipom champagne, tri z alelom dun (podedovanim od kobile) in z dvema aleloma nd1.
Highbrow Voodoo Do (Slika 15) je žrebec barve classic dun champagne in je pasme Quarter Horse, rojen je bil 2014 v Ameriki, njegov genotip je EE aa nCh D/nd2. V analizi je sodelovalo 27 njegovih potomcev od tega 15 s fenotipom champagne, 12 z alelom dun (vsaj enim) in 4 z alelom nd1.
14
Slika 15: Žrebec Highbrow Voodoo Doc
Vsi konji, ki so predmet raziskave in vključeni v rejski program, so bili predhodno genetsko testirani za genetske bolezni, tudi barvo dlake in vzorec. Ker pa je bilo testiranje za lokus psevdo dun vpeljalo šele leta 2018, so bili konji rojeni pred letom 2018 brez znanega genotipa za lokus dun (nd1 in nd2). Manjkajoče genotipe smo genotipizirali. Žrebeta, ki so letnik 2017 in 2018 in so bila prodana, njihovih vzorcev pa nismo mogli dobiti, so ostala negenotipizirana za lokus dun.
3.2 IZOLACIJA DNA IN GENOTIPIZACIJA
DNA smo izolirali iz vzorcev grive, ki smo jih pridobili na ranču Cheyennes oktobra 2020.
Griva je bila izpuljena skupaj z mešički, DNA smo izolirali po standardnem postopku (Priloga A). Vsi pridobljeni vzorci so imeli koncentracijo nad 5 ng/μl, tiste s koncentracijo nad 70 ng/μl pa smo redčili. Temperaturo prileganja začetnih oligonukleotidov v PCR smo prilagodili talilni temperaturi kombinacij začetnih ologonukleotidov. Zaporedja začetnih oligonukleotidov smo prevzeli iz študij Imsland in sod., 2016 in Mackowski in sod., 2019.
3.3 IZOLACIJA RNA IN RT-QPCR
Drugi del raziskave je temeljil na primeru, ki po fenotipu odstopa od večine. Žrebico barve classic dun champagne tobiano z genotipom E/E aa D/nd2 n/Ch T/t smo analizirali na ravni RNA. Zanimalo nas je, kakšno je izražanje gena dun na različnih delih njene grive. Iz dlak grive smo izolirali celokupno RNA, izvedli RT-qPCR reakcijo za TBX3 (dun), KITLG in B2M. Β2-mikroglobulin (B2M) smo uporabili za primerjavo relativne ravni ekspresije.
Uporabili smo štiri različne vzorce grive, ki so se razlikovali glede na barvo in odtenek. En vzorec dlake je bil bele barve (iz tobiano lise), dva sta bila zelo temna in en oranžnega odtenka (Slika 16). Postopku izolacije RNA s TRIzolom je sledila reakcija RT-qPCR (Priloga B).
15
Slika 16: Označena mesta na grivi za vzorčenje, 1) dlaka bele barve, 2) in 3) dlaka z oranžnim odtenkom, 4) temna dlaka.
4 REZULTATI Z RAZPRAVO
V analizo smo vključili 62 konj pasme paint in quarter. V prvem delu smo se osredotočili na genotipizacijo ter primerjavo s fenotipom za tri alele dun (D, nd1 in nd2). Za večino konj je bil genotip že poznan, za manjkajoče po smo genotipizacijo izvedli sami. Za alela nd1 in nd2 so nekateri konji, katerih vzorcev grive nismo mogli dobiti, ostali negenotipizirani.
Genotip smo nato primerjali s fenotipom, ki smo ga opisali s pomočjo fotografij in vizualne ocene. Glede na primerjavo smo potrdili, da imajo konji z alelom nd1 vidne nekatere primitivne znake in svetlejše odtenke dlake, ki so še bolj opazni pri tistih z obema aleloma nd1 (homozigoti nd1). Konji z dvema aleloma nd2 nimajo primitivnih znakov in posvetljene dlake. Konji, ki imajo genotip D/nd1, imajo večinoma bolj izrazite primitivne znake in posvetljeno dlako v primerjavi z genotipom D/nd2. Za določanje fenotipa vseh konj in primerjavo z genotipom (Priloga C), so služile fotografije (Priloga D).
3.4 GENOTIPIZACIJA D/Nd2
Razlikovanje med aleloma D in nd2 temelji na detekciji 1,6 kb dolge delecije v 3'-koncu gena TBX3. Na sliki 17 so predstavljeni rezultati genotipizacije za ta dva alela.
Slika 47: Gelska elektroforeza PCR pomnožkov z začetnimi nukleotidi za diskriminacijo alelov D in nd2.
S kombinacijo začetnih oligonukleotidov, ki smo jih označili s TBX3InDel_F1/TBX3InDel_R in NonDun1F/NonDun1_R, smo lahko detektirali prisotnost delecije in dominantnega alela D. Ker se alela D in nd1 le malo razlikujeta, smo za njuno
16
razločevanje uporabili ciljno sekvenciranje na mestu, kjer je prisotna točkasta mutacija, ki razlikuje oba alela (Slika 18).
A
B
Slika 18: A) Fragment nukleotidnega zaporedja gena TBX3 v območju delecije, ki razlikuje alela D in nd1.
Polimorfno mesto je označeno; B) nukelotidna zaporedja treh genotipov (D/D, D/nd1 in nd1/nd1) na mestu, kjer se alela D in nd1 razlikujeta.
17
Preglednica 2: Genotipi lokusa TBX3, ki smo jih določili s sekvenciranjem območja delecije v genu TBX3
Ime Spol Leto rojstva Genotip Dun
JMJ CHAMPAGNE REVENUE moški 2010 EE aa nCh TT nd1/nd2
JACKS BIGSTEPIN SKY ženski 2007 ee Aa nCr nCh Tt nd2/nd2
CHEYENNES CHARDONNAY ženski 2016 Ee Aa ChCh TT nd2/nd2
SQ COUGARET CASH ženski 2014 Ee aa nCh Tt nd1/nd2
CHEYENNES MERCIER ženski 2020 EE Aa nCh TT nd1/nd1
BELINDA SPATOLENA ženski 2014 ee Aa Tt nd2/nd2
CHEYENNES DESPERADOS moški 2020 Ee Aa TT nd2/nd2
FIFTY SHADES OF GREY ženski 2014 EE aa Dd Tt D/nd1
HIGHBROW VOODOO DOC moški 2014 EE aa Dd nCh D/nd2
TWARES MISS PEP ženski 2010 ee Aa Tt nd1/nd2
CHEYENNES MISTER VUDU moški 2020 Ee aa nCh nd1/nd2
KT SHES PERFECT ženski 2012 EE aa Dd TT D/nd2
CHEYENNES VOODOOQUEEN ženski 2018 EE aa Dd nCH Tt D/nd2
LUCKY SUSANNE ženski 2003 EE Aa nCr nd1/nd2
CHEYENNES LUCKY JUJU moški 2019 EE Aa nd1/nd2
CHEYENNES CHIMARAH ženski 2015 Ee aa TT nd1/nd2
CHEYENNES WYNN MIRAGE ženski 2014 ee Aa TT nd2/nd2
MISS FLYING OLENA ženski 2009 ee Aa Tt nd2/nd2
SHELBIE DUN IT ženski 2010 Ee Aa Dd nCr D/nd2
RUBY WR BEAR ženski 2012 Ee aa Dd TT D/nd2
CHEYENNES VOODOO BEAR moški 2020 Ee aa Dd nCh Tt D/nd2
CHEYENNES CHIC SEVEN ženski 2015 Ee aa Dd TT D/nd1
GLADYS LONG ženski 2014 Ee aa Dd nCh D/nd2
Z genotipizacijo (Preglednica 2) smo razjasnili fenotip pri osebkih, ki so bili prej zmotno genotipizirani kot D/-, dejansko pa je šlo za genotip nd1/nd1 ali nd1/nd2 (na primer Lucky Susanne ali Cheyennes Mercier).
Z analizo izražanja genov TBX3 in KITLG na različnih mestih grive kobile s kompleksnim fenotipom smo skušali pojasniti fenotipske razlike v obarvanosti grive. Ker je šlo v konkretnem primeru za kobilo, ki ima na lokusu dun alel D in na lokusu tobiano alel To, smo analizirali izražanje obeh genov, TBX3 in KITLG, slednja povzroča tobiano razbarvanje.
18
Slika 19: Kvantifikacija izražanja genov TBX3 in KITLG s qPCR
Na sliki 19 je predstavljen graf kvantifikacije izražanja genov TBX3 in KITL, normalizirana na lokus B2M. Na obeh lokusih so opazne razlike v ravni izražanja. Iz rezultatov lahko povzamemo, da je svetla barva dlake posledica nizke ravni izražanja KITLG v območju lise tobiano (vzorec1), v temnih delih grive pa je raven izražanja KITLG bistveno višja (vzorci 2-4). Razlike v izražanju gena TBX3 med vzorci niso zelo velike, kar kaže na dokaj enakomerno izražanje gena TBX3 na različnih lokacijah, kljub fenotipskim razlikam med njimi.
5 ZAKLJUČEK
Ameriški paint in quarter konji nam poleg dobrih delovnih sposobnosti ponujajo pestro paleto barv in vzorcev. Barve in odtenki so posledica delovanja in prepleta večjega števila genov, ki v kombinacijah dajejo različne barve dlake. Najbolj zanimiv pečat pustijo posvetljevalni geni kot so dun, champagne in cream. Ti geni posvetlijo osnovno barvo dlake, ji dodajo oznake ali kraljevi sijaj šampanjca. Konji, ki nosijo funkcionalne alele na posvetljevalnih lokusih, so dokaj redki, vsaj v našem predelu Evrope in v Sloveniji. In prav konj s fenotipom šampanjca, je v Sloveniji zelo malo. Zanimiv vpliv alela D na sam odtenek in primitivne oznake gotovo pritegne oko mnogih rejcev in poznavalcev pasme. Alel D je bil prisoten pri starodavnih in divjih pasmah konj ter njihovih sorodnikih, ker je njegov fenotip služil kot varovalna barva. Se je pa tekom domestikacije zgodila delecija, ki je izbrisala njegovo delovanje in tako ima večina udomačenih konj nd2 alel ter močne, izrazite in ne posvetljene barve (črno, rjavo, rdečo). Obstaja še tretji alel nd1, ki deluje kot pseudo dun alel, njegov vpliv na odtenek dlake je minimalen, vseeno pa so lahko prisotne, a veliko manj intenzivne, primitivne oznake. To smo tekom primerjave genotipov in fenotipov tudi dokazali. Razlike med temi tremi aleli se lepo vidijo po sprehodu skozi fotografije konj, ki so bili vključeni v diplomsko delo. Velikokrat nam podatki, ki jih pridobimo na ravni DNA ne podajo vseh odgovorov. Zato so študije na ravni RNA velikokrat primernejše in bolj
19
reprezentativne. Nam je podala odgovore o moči izražanja gena TBX3 (dun) in sodelujočega gena KITLG. Tako na ravni fenotipa kot na ravni RNA lahko vidimo razliko in prehod med predeli dlake in grive, kjer deluje le dun lokus in kjer deluje v kombinaciji s tobiano alelom, ki je odgovoren za bele vzorce, lise. Razumevanje dedovanja in kombinacij delovanja različnih genov, ki so odgovorni za barvo in vzorec dlake, je za rejce konj ključna. Naloga genetskih laboratorijev je, da genotipizacijo opravijo kar se da natančno in nenehno izboljšujejo in optimizirajo metode. Raziskovalci tako lahko odkrivajo vedno nove povzročitelje in vzroke za številne barvne odtenke, kar omogoča razumevanje njihovega delovanja in medsebojne prepletenosti. Naše raziskovalno delo ima tudi potencial za boljše razumevanje in odkrivanje vzrokov za kompleksne fenotipe, ki sprva odstopajo od pričakovanja samo na osnovi genotipa. V nalogi smo se podrobneje ukvarjali samo z enim posvetljevalnim genom, dun, drugih dveh, champagne in cream, pa nismo analizirali.
Dejstvo, da imam tri kobile, ki omogočajo raziskovanje vseh treh posvetljevalnih genov, je dobra iztočnica in motiv za nadaljnje raziskovalno delo.
6 VIRI
Baxter L.L., Watkins-Chow D.E., Pavan W.J., Loftus S.K. 2019. A curated gene list for expanding the horizons of pigmentation biology. Pigment Cell Melanoma Research, 32:
348-358
Brunberg E., Andersson L., Cothran G., Sandberg K., Mikko S., Lindgren G. 2006. A missense mutation in PMEL17 is associated with the Silver coat color in the horse. BMC Genetics, 7, 46, doi:10.1186/1471-2156-7-46: 12 str.
Cook D., Brooks S., Bellone R., Bailey E. 2008. Missense mutation in exon 2 of SLC36A1 responsible for champagne dilution in horses. PLoS Genetics, 19, 4: e1000195, doi:
10.1371/journal.pgen.1000195: 9 str.
Holl H.M., Pflug K.M., Yates K.M., Hoefs-Martin K., Shepard C., Cook D.G., Lafayette C., Brooks S.A. 2019. A candidate gene approach identifies variants in SLC45A2 that explain dilute phenotypes, pearl and sunshine, in compound heterozygote horses. Animal Genetics, 50: 271-274
Imsland F., McGowan K., Rubin C.J., Henegar C., Sundström E., Berglund J., Schwochow D., Gustafson U., Imsland P., Lindblad-Toh K., Lindgren G., Mikko S., Millon L., Wade C., Schubert M., Orlando L., Penedo M.C., Barsh G.S., Andersson L. 2016. Regulatory mutations in TBX3 disrupt asymmetric hair pigmentation that underlies Dun camouflage color in horses. Nature Genetics, 48: 152-158
Mariat D., Taourit S., Guérin G. 2003. A mutation in the MATP gene causes the cream coat colour in the horse. Genetics Selection Evolution, 35: 119-133
Rieder S., Taourit S., Mariat D., Langlois B., Guérin G. 2001. Mutations in the agouti (ASIP), the extension (MC1R), and the brown (TYRP1) loci and their association to coat color phenotypes in horses (Equus caballus). Mammalian Genome, 12: 450-455
Tanaka J., Leeb T., Rushton J., Famula T.R., Mack M., Jagannathan V., Flury C., Bachmann I., Eberth J., McDonnell S.M., Penedo M.C.T., Bellone R.R. 2019. Frameshift Variant in
20
MFSD12 Explains the Mushroom Coat Color Dilution in Shetland Ponies. Genes, 10(10):
826. doi: 10.3390/genes10100826: 15 str.
Mackowski M., Wodas L., Brooks S. A., Cieslak J. 2019. TBX3 and ASIP genotypes reveal discrepancies in officially recorded coat colors of Hucul horses. Animal Journal, 13, 9:
1811-1816
Imsland F., McGowan K., Rubin C. J., Henegar C., Sundström E., Berglund J., Schwochow D., Gustafson U., Imsland P., Lindblad-Toh K., Lindgren G., Mikko S., Millon L., Wade C., Schubert M., Orlando L., Cecilia T Penedo M., Barsh G.S., Andersson L. 2016.
Regulatory mutations in TBX3 disrupt asymmetric hair pigmentation that underlies Dun camouflage color in horses. Nature Genetics, 48(2): 152–158
Cook D., Brooks S., Bellone R., Bailey E. 2008. Missense Mutation in Exon 2 of SLC36A1 Responsible for Champagne Dilution in Horses. Plos Genetics, 4(9): e1000195, doi:
10.1371/journal.pgen.1000195: 9 str.
Brooks S. A., Lear T.L., Adelson D.L., Bailey E. 2008. A chromosome inversion near the KIT gene and the Tobiano spotting pattern in horses. Karger, Cytogenetic Genome Research, 119: 225–230
Andrersson L. 2020. Mutations in Domestic Animals Disrupting or Creating Pigmentation Patterns. Frontiers in Ecology and Evolution, 8:116, dioi: 10.3389/fevo.2020.00116: 8 str.
APHA. 2021. Coat Patterns, Paint Horse Association of America, http://www.painthorse.com.au/register/coat-patterns (13.8.2021)
ZAHVALA
Rada bi se zahvalila gospe, dolgoletni vzrediteljici ameriških paint in quarter konj ter moji prijateljici Myri Lejeune, da nam je omogočila dostop do tolikšnega števila vzorcev grive, ki so bili temelj našega raziskovalnega dela. Zahvalila bi se tudi mentorju prof. dr. Petru Dovču za mentorstvo ter za navdušenje nad mojo izbrano tematiko, genetiko barve dlake konj. Zahvala pa gre tudi mojemu fantu Mateju ter družini, ki mi pomagajo, da tudi sama stopam v svet reje konj ter me bodrijo in spodbujajo na moji izobraževalni in raziskovalni poti.
PRILOGA A Izolacija DNA
Uporabili smo DNA komplet (EZNA Tissue DNA kit, Omega, Bio-Tek)
Materiali: mikrocentrifuga, mikrocentrifugirne tube, inkubator z ogrevanjem in stresanjem, vortex, 100% etanol, reagenti iz DNA kompleta.
• Postopek izolacije DNA:
• Grivo odrežemo čim bližje mešička (približno 30 mg) v 1,5 ml centrifugirno tubo.
• Dodamo 200 µl TL Buffra
• Dodamo 25 µl Proteinase K Solution in nato vorteksiramo.
• Inkubiramo na 55°C na stresalniku.
• Centrifugiramo pri 10.000 x g 5 minut
• Prenesemo supernatant v sterilno 1,5 ml mikrocentrifugirno tubo. Pazljivi moramo biti, da ne zmotimo ali prenesemo peleta na dnu.
• Dodamo 220 µl BL Buffra in nato vorteksiramo.
• Inkubiramo na 70°C za 10 minut.
• Dodamo 220 µl 100% etanola, nato vorteksiramo.
• Vstavimo HiBind DNA Mini Column v 2 ml kolekcijsko tubo. Prenesemo celoten vzorec, tudi, če se je tvoril kakšen precipitat.
• Centrifugiramo pri 10.000 x g 1 minuto.
• Filtrat odstranimo in ponovno uporabimo kolekcijsko tubo.
• Dodamo 500 µl HBC Buffra, ki mora biti predhodno razredčen s 100% izopropanolom.
• Centrifugiramo pri 10.000 x g 30 sekund.
• Zavržemo filtrat in kolekcijsko tubo. HiBind DNA Mini Column vstavimo v novo 2 ml kolekcijsko tubo.
• Dodamo 700 µl DNA Wash Buffra, ki mora biti predhodno razredčen s 100% etanolom.
• Centrifugiramo pri 10.000 x g 30 sekund.
• Še enkrat ponovimo postopek spiranja z DNA Wash Buffrom.
• Centrifugiramo prazno HiBind DNA Mini Column pri 10.000 x g 2 minuti, da jo osušimo, s tem korakom odstranimo sledi etanola, ki bi lahko vplival na nadaljne korake izolacije.
• HiBlind DNA mini Column prenesemo v 1,5 ml mikrocentrifugirno tubo, ki je čista od nukleaz.
• Dodamo 100-200 µl Elution buffra, ki ga predhodno segrejemo na 70°C.
• Inkubiramo pri sobni temperaturi 2 minuti.
• Še enkrat ponovimo postopek izločanja z Elution buffrom.
Izolirano DNA shranimo pri -20°C.
PRILOGA B Izolacija RNA
Protokol izolacije RNA s TRIZOLOM (W.M. Keck Foundation Biotechnology Microarryay Resource Laboratory of Yale University).
Reagenti: DEPC voda, TRIzol reagent, kloroform, ledeno hladen PBS, 70% etanol, izopropil alkohol.
Pripomočki: centrifuga z ohlajevanjem, mikrocentrifugirke, mikropipete, tipsi z aerosol barierami, vortex, centrifugirne tube.
• Homogenizacija - ker je bilo dlako težje homogenizirati, smo si pomagali z UZ kopeljo in homogenizatorjem. Dlake smo čim bližje mešičku skrajšali in dali v epico ter dodali 500 µl TRIzola. Sledilo je 15 minut UZ kopeli.
• Faza separacije - vzorce smo vzeli iz kopeli. Dodali smo 100 µl kloroforma ter nato premešali ter inkubirali na sobni temperaturi za 3 minute. Centrifugiranje pri 12000 x g za 15 minut na 4°C. Pride do ločbe na fazi. Prenesli smo zgornjo fazo brez, da bi s tem zmotili notranjo, spodnjo fazo. RNA se nahaja v zgornji, tekoči, brezbarvni fazi.
• RNA precipitacija – uporabimo 1,5 ml tubice. Precipitiramo RNA iz tekoče faze tako, da primešamo 250 µl izopropil alkohola ter nato inkubiramo na 28°C za 10 minut in nato centrifugiramo 12000 x g 10 minut na 4°C. RNA precipitira, ponavadi vidno kot kupček na dnu epice.
• RNA spiranje – odstranimo 500 µl supernatanta. RNA pelet speremo s 75% etanolom, 500 µl.
Najprej vorteksiramo in nato centrifugiramo pri 10000 x g 20 minut na 4°C. Postopek spiranja ponovimo še enkrat in odstranimo ves preostal etanol.
• Redisolviranje RNA – RNA pelet osušimo z inkubacijo na 40°C za 15 minut. Pomembno je, da ga ne izsušimo do konca saj tako zmanjšamo topnost. RNA raztopimo v DEPC vodi tako, da parkrat premešamo skozi pipeto. Izmerimo koncentracijo RNA v vzorcu (A260/A280).
Postopek obdelave izolirane RNA z DNazo:
• Najprej izolirano RNA počasi odmrznemo in jo nežno premešamo.
• V RNase-free PCR tube dodamo celokupno RNA ( v našem primeru je to bilo 35 µl in vse nadaljnje navedene koncentracije so preračunane na ta volumen RNA). Dodamo 3,5 µl 10X Reaction Buffer in 3,5 µl DNase I.
• Nežno premešamo in inkubiramo na sobni temperaturi 15 minut.
• Dodamo 3,5 µl Stop Solution, ki veže kalcij in magnezij in inaktivira DNaso I.
• Inkubiramo na 70°C za 10 minut, da denturiramo DNazo I.
• Ohladimo na ledu.
Sledil je postopek reverzne transkripcije in pretvorba v cDNA.
Za sintezo eno-vijačne cDNA iz RNA smo uporabili High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.
Najprej smo pripravili 2X Reverse Transcription Master Mix, ki vsebuje; 2X RT Buffer, 25X dNTP Mix (100 mM), 10X RT Random Primers, MultiScribe Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, Nuclease-free H2O. Vse komponente morajo biti na ledu. Po pripravljenem Master Mixu premešamo in postavimo na led. Master Mix smo dodali naši izolirani RNA v razmerju 1:1. Sledi postopek reverzne transkripcije v štirih temperaturnih profilih. Navedeni pogoji so optimizirani za uporabo prej
navedenega kita. Korak 1 – 25°C za 10 minut. Korak 2 – 37°C za 120 minut. Korak 3 – 85°C za 5 minut.
Korak 4 – 4°C ∞.
PRILOGA C Podatki
Preglednice vsebujejo informacije o sorodstvenih razmerjih, spolu, letu rojstva, genotipu in fenotipu, ločene so po žrebcih.
Priloga C1: Genotipski in fenotipski podatki za žrebca JMJ Champagne Revenue, njemu pripadajoče kobile in njune potomce.
Priloga C2: Genotipski in fenotipski podatki za žrebca Wynnin Silver Mine in njegovo potomko.
Priloga C3: Genotipski in fenotipski podatki za žrebca Highbrow Voodoo Doc, kobile in njihove potomce.
PRILOGA D
Fotografije, ki so služile za primerjavo fenotipa z genotipom Konji z vsaj enim alelom D (dun)
Priloga D1: Fotografije 12 konj fenotipa classic dun champagne ali amber dun champagne, z vsaj enim alelom D (dun) in enim alelom CH (champagne).
Priloga D2: Fotografije 12 konj grullo, bay dun ali dunskin z vsaj enim alelom D (dun).
Konji z vsaj enim alelom nd1 (ne-dun 1)
Priloga D3: Fotografije 6 konj fenotipa classic champagne ali amber champagne, z vsaj enim alelom nd1 in enim alelom CH (champagne)
Priloga D4: Fotografije 6 konj fenotipa buckskin, sorrel, black ali bay, z vsaj enim alelom nd1
Konji z dvema ali vsaj enim alelom nd2
Priloga D5: Fotografije konj fenotipa classic champagne ali amber champagne, z dvema aleloma nd2 in enim alelom CH (champagne).
Priloga D6: Fotografije konj fenotipa sorrel, bay, z dvema (ali vsaj enim) aleloma nd2. Izjema je kobila na prvi fotografiji, ki je fenotipa gold champagne.
Priloga D7: Fotografije konj fenotipa black, z dvema (ali vsaj enim) alelom nd2
