Kot vodno fazo smo pripravili modelno vodno raztopino (angl. stock) z 9,0 ut% 5-HMF-ja, ki smo jo naredili z dodatkom 49,5 g 5-HMF-ja in 0,74 g BHA-ja kot stabilizatorja v 500 ml destilirane vode. Raztopino smo zaradi prisotnosti morebitnih nečistoč tudi prefiltrirali.
Vsi dvofazni sistemi so bili pripravljeni v stekleničkah z volumnom 15 ml, v katere smo odpipetirali ustrezno količino modelne vodne raztopine in organskega topila, tako da smo dobili čim večji nabor volumskih razmerij (O/Aq)vol.
3.4.1 Priprava prve in druge skupine "screening" topil
Z namenom pridobitve okvirne informacije o porazdelitvenih koeficientih 5-HMF-ja za določena topila smo pripravili dvofazne sisteme za izbrano množico organskih topil v volumskem razmerju 1 : 1. Topila smo razdelili v skupino 1 in skupino 2. Prva je predstavljala bolj polarna, druga pa manj polarna topila. Topila prve skupine so bila MIBK, 2-SBP, GVL, 2-BuOH, 2-MTHF, EtAc, MTBE, ISP, BnOH in TAA, topila druge skupine pa kloroform, benzen, toluen, heptan, cikloheksan in p-ksilen. Dvofazni sistemi teh topil so bili pripravljeni okvirno z 5 ml 1,5 ut% modelne vodne raztopine in 5 ml topila. Pripravljene vzorce smo stresali dve uri, nato pa jih pustili mirovati 48 ur pri temperaturi 23 ℃, da so se faze ustrezno ločile.
0
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
15
Tabela 4: Volumska razmerja za "screening" topila prve in druge skupine
Topilo Aq O O/A
v prvi steklenički je zaradi visoke oz. popolne topnosti GVL v vodi bila prisotna ena faza, pri 2-SBP pa ni prišlo do popolne separacije obeh faz. Domneven razlog za slednje je majhna razlika v gostoti obeh komponent. GVL je bil posledično izvzet kot primerno topilo za ekstrakcijo 5-HMF-ja iz vode, 2-SBP pa smo se odločili predhodno centrifugirati.
Preostale vzorce za analizo smo pripravili v vialah in smo jih redčili na dva načina. Vzorci za topila prve skupine so bili pripravljeni z 40 μl vodne faze in 1 ml acetona ter 100 μl organske faze in 1 ml acetona, pri drugi skupini topil pa smo za razliko uporabili 50 μl vodne faze. Da bi preko izmerjenega utežnega deleža pri HPLC-analizi lahko določili utežni delež 5-HMF-ja v originalnem vzorcu, smo beležili maso vzorca po vsakem dodatku snovi v vialo.
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
16
3.4.2 Priprava dvofaznega sistema z 2-EtH in CPME
Pri uporabi 2-EtH smo pripravili sedem stekleničk z volumskimi razmerji organske in vodne faze med 0,3 in 2, v primeru CPME pa smo pripravili devet različnih vzorcev v območju med 0,33 in 3. Zaradi morebitnih odstopanj smo v obeh primerih pripravili dve paralelki z modelno vodno raztopino, ki je vsebovala 9 ut% 5-HMF.
Tabela 5: Volumska razmerja za posamezni dvofazni sistem z 2-EtH in CPME.
2-EtH CPME
Tako pripravljene vzorce smo kontaktirali na stresalniku dve uri, nato pa so mirovali vsaj 16 ur ter vse do 72 ur pri povprečni sobni temperaturi 23 ℃. V stopnji mirovanja želimo doseči čim boljšo porazdelitev 5-HMF-ja med fazama in popolno ločitev organske in vodne faze z jasno vidno mejo med njima, saj nam to omogoča učinkovito ločbo topil.
Po mirovanju smo iz stekleničke odvzeli del vsake izmed faz in ga prenesli v vialo, ki smo jo dopolnili z acetonom. Pri 2-etilheksan-1-olu je bilo razmerje v vialah enako 100 μl organske faze : 1 ml acetona in 40 μl vodne faze : 1 ml acetona, pri CPME pa 100 μl organske faze : 1 ml acetona in 50 μl vodne faze : 1 ml acetona. Z namenom določitve utežnega deleža 5-HMF-ja v originalnem vzorcu preko HPLC analize, smo beležili maso vzorca po vsakem dodatku snovi v vialo.
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
17
Tabela 6: Zatehte vzorcev za dvofazni sistem 9 ut% modelna vodna raztopina–2-EtH.
2-EtH
O (organska faza) Aq (modelna vodna raztopina)
100 μl O
1 ml
acetona+ 1 ml
acetona+
100 μl O 40 μl Aq 40 μl Aq oznaka zatehta (g) zatehta (g) oznaka zatehta (g) zatehta (g) 1a 2-EtH-O 0,08567 1,02644 1a 2-EtH-Aq 0,03788 0,96336 1b 2-EtH-O 0,08216 1,08876 1b 2-EtH-Aq 0,03727 0,99059 2a 2-EtH-O 0,08358 1,08905 2a 2-EtH-Aq 0,04000 0,99694 2b 2-EtH-O 0,08371 1,08470 2b 2-EtH-Aq 0,04189 0,99280 3a 2-EtH-O 0,08323 1,08191 3a 2-EtH-Aq 0,03829 1,01125 3b 2-EtH-O 0,08053 1,07974 3b 2-EtH-Aq 0,03732 0,99881 4a 2-EtH-O 0,08444 0,90874 4a 2-EtH-Aq 0,04117 1,00482 4b 2-EtH-O 0,08514 1,11203 4b 2-EtH-Aq 0,04057 1,00106 5a 2-EtH-O 0,08515 1,11206 5a 2-EtH-Aq 0,03816 1,00305 5b 2-EtH-O 0,08455 1,05108 5b 2-EtH-Aq 0,03760 0,99762 6a 2-EtH-O 0,08454 1,13454 6a 2-EtH-Aq 0,03708 0,99434 6b 2-EtH-O 0,08202 1,08097 6b 2-EtH-Aq 0,03923 0,99081 7a 2-EtH-O 0,08110 1,06959 7a 2-EtH-Aq 0,03913 1,00539 7b 2-EtH-O 0,08439 1,07920 7b 2-EtH-Aq 0,03561 0,97657
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
18
Tabela 7: Zatehte vzorcev za dvofazni sistem 9 ut% modelne vodne raztopine–CPME.
CPME
O (organska faza) Aq (modelna vodna raztopina)
Z namenom analize porazdelitvenega koeficienta v območju nižjih utežnih deležev 5-HMF-ja smo osnovno modelno vodno raztopino redčili v razmerju 100 ml modelna raztopina : 500 ml destilirana voda in tako dobili razredčeno modelno vodno raztopino z 1,5 ut% 5-HMF-ja. To raztopino smo uporabili za enak način priprave dvofaznega sistema, kot je bil opisan že zgoraj. Volumski deleži vodne in organske faze so enaki za 2-EtH in CPME ter znašajo 9 : 3, 7 : 4, 5 : 5, 4 : 7 in 3 : 9, kjer so volumni v ml. Vzorce za analizo smo pripravili iz 40 μl vodne faze in 1 ml acetona ter 100 μl organske faze in 1 ml acetona.
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
19
3.4.3 Priprava dvofaznega sistema z ISP in BnOH
Izoforon in benzil alkohol sta po opravljeni analizi izkazovala najboljši porazdelitveni koeficient HMF-ja, zato smo eksperimente razširil na širše koncentracijsko območje 5-HMF-ja. Analogno kot pri CPME smo z 1,5 ut% modelno vodno raztopino pripravili devet vzorcev različnih volumskih razmerij za ISP in BnOH. Naknadno smo z mešanjem 100 ml modelne vodne raztopine in 80 ml destilirane vode pripravili še razredčeno modelno vodno raztopino s 5 ut% 5-HMF-ja. S slednjo smo pripravili dodatnih pet vzorcev za obe analizirani spojini in dopolnili koncentracijsko območje med 1,5 in 10 ut% 5-HMF-ja. Pri enem od vzorcev z ISP (razmerje O/Aq = 0,33; 5 ut% modelna vodna raztopina) je prišlo do visoke stopnje disperzije ene faze v drugi, zaradi česar smo vzorec zavrgli.
Preostale vzorce smo pripravili v vialah za HPLC-analizo, in sicer v razmerju: 1 ml acetona + 100 μl ISP-O, 1 ml acetona + 50 μl ISP-Aq, 1 ml acetona + 70 μl BnOH-O, 1 ml acetona + 50 μl BnOH-Aq. Redčitve veljajo za 1,5 ut% in 5 ut% 5-HMF modelno vodno raztopino.
3.4.4 Priprava dvofaznega sistema s THF in 2-SBP
Mnogi viri, med njimi tudi J. Esteban s sodelavci, so dokazali pozitiven vpliv dodatka NaCl na dvofazna ravnotežja za ekstrakcijo 5-HMF-ja. Med ravnotežji je še posebej izstopal bifazni sistem THF–voda–5-HMF, ki je z dodatkom soli dosegel ločitev vodne in organske faze in učinkovito ekstrakcijo 5-HMF-ja v organsko fazo. Z namenom pridobitve konkretnih ravnotežnih podatkov in porazdelitvenih koef. 5-HMF-ja med fazama smo opravili analize za navedeni sistem. Pripravili smo več vzorcev z različnimi volumskimi razmerji, za vodno fazo pa smo uporabili 1,5 ut% in 5 ut% 5-HMF modelno vodno raztopino, nasičeno s soljo. Razmerja so navedena v Tabela 8.
Tabela 8: Volumska razmerja za THF.
1,5 ut% modelna vodna raztopina z
NaCl 5 ut% modelna vodna raztopina z NaCl
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
20
Po pripravi sistema smo tega kontaktirali dve uri, nato pa pustili mirovati 72 ur. Vsako od faz smo nato posamezno odvzeli iz stekleničke in iz nje pripravili vzorce za HPLC-analizo tako, da smo v ločenih vialah z 1 ml acetona redčili 100 μl organske faze in 50 μl vodne faze.
Dvofazni sistem z 2-SBP je pripravljen po enakem postopku kot sistem s THF, vendar brez dodatka soli. Za ustrezno ločitev faz smo sisteme pripravili v 15 ml centrifugirkah, kjer smo jih centrifugirali 10 minut na 4000 obratih. Po centrifugiranju smo fazi ločili in pripravili vzorce za analizo. Pri 1,5 ut% modelni vodni raztopini smo 100 μl organske faze in 65 μl vodne faze v ločenih vialah redčili z 1 ml acetona, za 5 ut% modelno vodno raztopino pa smo 1 ml acetona dodali v vialo z 80 μl organske faze in v vialo s 50 μl vodne faze.
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
21
4 Rezultati in razprava
5-HMF je spojina, ki je potencialen kandidat za platformno kemikalijo prihodnost i.
Njegova uporabnost in možnost pridobivanja iz lignocelulozne biomase ga uvrščata med ekološko zelo pomembne molekule, zato je razvoj učinkovite industrijske proizvodnje 5-HMF-ja ključen. Eden od proizvodnih korakov je ekstrakcija 5-HMF-ja iz vode v organsko topilo z namenom stabilizacije in lažje ekstrakcije produkta. S tem namenom smo se odločili analizirati množico organskih topil, ki bi jih lahko uporabili v tem koraku, in za stacionarne dvofazne sisteme voda–organsko topilo izdelati ravnotežne krivulje porazdelitve 5-HMF-ja med obema fazama.
4.1 Določitev koncentracij oz. 5-HMF-ja v vodni in organski fazi
S HPLC-analizo smo za vsak vzorec pridobili signal v enotah mAU*min, ki je pripadal določenemu utežnemu deležu 5-HMF-ja na kalibracijski krivulji.
𝐴[𝑚𝐴𝑈 ∗ min] = 1503,2 ∗ 𝑤[𝑢𝑡%] (4.1.1) 𝑤[𝑢𝑡%] =𝐴[𝑚𝐴𝑈 ∗ min]
1503,2 (4.1.2)
Iz dobljenih utežnih deležev smo preko celotne mase vsebine viale izračunali maso HMF-ja v zatehti organske faze (enačba 4.1.3), nato pa iz te vrednosti izračunali delež 5-HMF-ja v organski in vodni fazi v 15 ml steklenički (enačbi 4.1.4 in 4.1.5).
𝐻𝑃𝐿𝐶[𝑢𝑡%] ∗ 𝑐𝑒𝑙. 𝑧𝑎𝑡𝑒ℎ𝑡𝑎[𝑔] = 𝑚(5-𝐻𝑀𝐹)[𝑔] (4.1.3) 𝑚(5-𝐻𝑀𝐹)[𝑔]
𝑧𝑎𝑡𝑒ℎ𝑡𝑎 𝑜𝑟𝑔. 𝑓𝑎𝑧𝑒 [𝑔]= 𝑤(5-𝐻𝑀𝐹) (4.1.4) 𝑤(5-𝐻𝑀𝐹) ∗ 100% = 𝑤(5-𝐻𝑀𝐹)[𝑢𝑡%] (4.1.5)
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
22
4.2 Določitev porazdelitvenega koeficienta (Kd)
Glavna spremenljivka, ki smo jo določali iz izračunanih utežnih deležev, je porazdelitveni koeficient Kd oziroma razmerje med ravnotežno količino 5-HMF-ja v organski in vodni fazi. Ta je odvisen poglavitno od izbire organskega topila, pa tudi od začetne sestave (začetnih volumnov) dvofaznega sistema oz. koncentracije 5-HMF-ja v ravnotežni vodni fazi. Za posamezno topilo smo pripravili dva grafa. Prvi graf prikazuje odvisnost količine 5-HMF-ja v organski fazi od tiste v vodni fazi. Drug graf podaja odvisnost Kd od utežnega deleža 5-HMF-ja v vodni fazi.
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
23
4.3 Predstavitev rezultatov za posamezno topilo
V Tabela 9 in Tabela 10 so zbrani ravnotežni podatki porazdelitve 5-HMF-ja med fazama za izbrana "screening" topila prve in druge skupine v volumskem razmerju 1 : 1. Topila prve skupine predstavljajo bolj polarna topila, topila druge skupine pa manj polarna. V zadnjem stolpcu so navedeni izračunani ravnotežni porazdelitveni koeficienti.
Tabela 9: Ravnotežni utežni delež 5-HMF-ja v organski in vodni fazi ter porazdelitveni koeficient za "screening" topila prve skupine.
(O/Aq)v = 1/1
Topilo O (ut% 5-HMF) Aq (ut% 5-HMF) Kd (w/w)
benzil alkohol 1,10605 0,29231 3,78
izoforon 1,21917 0,33743 3,61
Iz Tabela 9 je razvidno, da je porazdelitveni koeficient za topili ISP in BnOH efektivno 1,8-krat večji od preostalih "screening" topil. V primerjavi s topiloma 2-EtH in CPME, katerih vrednosti za Kd pri nizkih koncentracijah dosegata zgolj 0,55 in 0,38, gre tu za kar več kot šestkratno povečanje v porazdelitvi 5-HMF-ja med organsko in vodno fazo.
2-MTHF, TAA, 2-BuOH, EtAc in MIBK kljub temu izkazujejo relativno visok Kd.
Tabela 10: Ravnotežni utežni delež 5-HMF-ja v organski in vodni fazi ter porazdelitveni koeficient za "screening" topila druge skupine.
(O/Aq)vol = 1/1
Topilo O (ut% 5-HMF) Aq (ut% 5-HMF) Kd (w/w)
kloroform 1,15415 0,26543 4,348
benzen 0,09522 1,46633 0,065
toluen 0,06448 1,49873 0,043
p-ksilen 0,04815 1,50392 0,032
cikloheksan 0,00537 1,54618 0,003
heptan 0,00250 1,53100 0,002
Vsa topila druge skupine, izključujoč kloroform, izkazujejo zelo nizke vrednosti Kd.
Kloroform, ki je v literaturi naveden kot dobro ekstrakcijsko topilo za 5-HMF, pa je rakotvoren in uvrščen na evropsko regulacijsko listo »REACH«, zato ga je zaželeno nadomestiti z bolj zelenimi topili [22].
Izbira topila za ekstrakcijo 5-hidroksimetilfurfurala iz vodne faze Jaka Komar
24
Ravnotežna porazdelitev 5-HMF-ja med organsko in vodno fazo za topilo 2-EtH je predstavljena na Slika 4.1, Slika 4.2 pa podaja izračunane porazdelitvene koeficiente 5-HMF-ja med vodno in organsko fazo v odvisnosti od koncentracije 5-5-HMF-ja v ravnotežni vodni fazi.
Slika 4.1: Ravnotežna porazdelitev 5-HMF-ja med organsko in vodno fazo za topilo