1. 1. Zunajcelični vezikli
Zunajcelični vezikli (EV, ang. extracellular vesicles) so raznolika skupina veziklov z membrano, ki jih celice izločajo v zunajcelični prostor. EV, ki jih sproščajo tako prokariontske kot evkariontske celice, sodelujejo v številnih fizioloških (imunski odziv, regeneracija tkiv) in patoloških (rakava obolenja, vnetje) procesih. Udeleženi so tudi v medcelični komunikaciji, saj prenašajo številne signalne molekule, lipide, proteine in nukleinske kisline (DNA, mRNA, miRNA) (1, 2).
Glede na njihovo velikost, mesto nastanka, poti sproščanja ter funkcije, jih delimo na tri večje skupine, in sicer na eksosome, mikrovezikle in apoptotska telesca. Slednja so po velikosti največja, saj v premeru merijo od 1000 do 5000 nm, sproščajo pa se ob celični apoptozi. Po sestavi se razlikujejo od ostalih dveh skupin, saj vsebujejo tudi celične organele. Mikrovezikli nastanejo z vihanjem plazemske membrane, njihov premer pa znaša 100–1000 nm. Najmanjši med vezikli so eksosomi (premer 30–150 nm), ki so endocitotskega izvora (3).
1. 2. Biogeneza eksosomov
Eksosomi nastajajo znotraj celice z endocitozo. Najprej se tvorijo zgodnji endosomi, ki nastanejo z brstenjem celične membrane, ti pa kasneje dozorijo v pozne endosome ali multivezikularna telesca (MVB) (ang. multivesicular bodies). V teh postopoma rastejo intraluminalni vezikli (ILV) (ang. intraluminar vesicles), ki so bogati z lipidi, nukleinskimi kislinami in citosolnimi proteini. Zrela MVB se nato preko mikrotubolov prenesejo do plazemske membrane, pri čemer se sprostijo ILV v obliki eksosomov. Ostala MVB pa se razgradijo z lizosomi. Nastanek MVB nadzorujejo številnimi mehanizmi, pri tem pa igra najpomembnejšo vlogo kompleks ESCRT (ang. endosomal complexes required for transport). Ta je sestavljen iz 5 enot, in sicer ESCRT-0, -I, -II, -III in Vps4.
ESCRT-0 sodeluje pri razvrščanju proteinov, vezanih na ubikvitin, ki jih bodo nato vsebovali ILV in kasneje tudi eksosomi. ESCRT-0 je sestavljen iz dveh podenot. Prva je substrat tirozin kinaze Hrs (ang. hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), ki ga uravnava hepatocitni rastni dejavnik, druga pa adaptorska molekula STAM (ang. signal transducing adaptor molecule), ki prevaja signal. Vsaka od podenot
ima dve domeni UBD (ang. ubiquitin binding domain), ki vežeta ubikvitin. ESCRT-0 nato aktivira kompleks ESCRT-I, in sicer tako, da se veže na njegovo proteinsko podenoto Tsg101 (ang. tumor suspectibility gene 101). ESCRT-I skupaj z ESCRT-II spodbudi brstenje membrane okrog proteinov, vezanih na ubikvitin, pri čemer nastane žepek v katerega se razporedijo citosolski proteini in nukleinske kisline. V zadnji stopnji nastanka ILV pa se na ESCRT-II veže ESCRT-III in polimerizira zanko okrog žepka. Nato se sprostijo ILV, Vps4 pa hidrolizira ATP ter tako reciklira ESCRT-III (2, 4). Biogeneza eksosomov je prikazana na Sliki 1.
MVB nastajajo tudi z drugimi mehanizmi, med katere spada npr. pot sindekan-sintetin-ALIX. V tem primeru se sintetin veže na transmembranski protein sindekan, nato pa še na ALIX. Ta je odgovoren za razvrščanje tovora ter brstenje membrane, ki poteka brez ubikvitina in ESCRT-0. Tudi v tej poti sodeluje ESCRT-III. Obstajajo pa tudi druge poti, ki so neodvisne od ESCRT, med katere sodita ceramidna in tetraspaninska (5).
Slika 1: Biogeneza eksosomov; prirejeno po (2).
1. 3. Privzem eksosomov
Sproščeni eksosomi v zunajceličnem prostoru potujejo do tarčnih celic in nanje vplivajo preko različnih mehanizmov: i) z neposredno interakcijo med receptorji na tarčni celici in površinskimi molekulami, izraženimi na eksosomih, ii) s fuzijo eksosomov s celično membrano ter iii) z endocitozo (2).
Transmembranski ligandi, izraženi na površini eksosoma se lahko vežejo neposredno na površinske receptorje na tarčni celici in tako sprožijo njen odziv. Takšen mehanizem je običajen pri posredovanju imunomodulatornih in apoptotičnih učinkov eksosomov.
Eksosomi aktvirajo celice T pomagalke (CD4+) in citotoksične limfocite T (CD8+) z interakcijo med molekulami poglavitnega kompleksa tkivne skladnosti razredov I in II (MHC I, II; ang. major histocompatibility complex class I and II) in T-celičnimi receptorji (TCR). Ostale molekule, ki jih izražajo eksosomi na svojih površinah pa so: tetraspanini CD34 in CD80, ki spodbujajo proliferacijo limfocitov T, dejavnik tumorske nekroze (TNF; ang. tumor necrosis factor), ligand Fas (FasL) ter TNF-u sorodni ligand, ki inducira apoptozo (TRAIL; ang. TNF-related apoptosis-inducing ligand) (2).
Eksosomi se lahko tudi zlijejo s plazemsko membrano in sprostijo svojo vsebino neposredno v citosol tarčne celice. EV, pridobljeni iz monocitov, se vežejo na oz. se spojijo s plazemsko membrano aktiviranih trombocitov ter tako vanje prenesejo beljakovine, kot sta npr. tkivni faktor in P-selektinski glikoproteinski ligand-1 (PSGL-1).
Za razliko od endocitoze, ki je na molekularni ravni podrobno opisan proces, pa mehanizem fuzije celic z eksosomi ni dobro poznan. Eksosomi seveda vstopajo v tarčne celice tudi z različnimi oblikami endocitoze, npr. z makropinocitozo, fagocitozo in receptorsko pogojeno endocitozo (6).
1. 4. Sestava eksosomov
Eksosomi vsebujejo številne proteine, lipide ter nukleinske kisline. Sestava le-teh pa je odvisna od celice izvora ter njenega fiziološkega stanja. Membrana eksosomov je sestavljena iz fosfolipidnega dvosloja ter zajema raznovrstne lipide kot so holesterol, ceramid, sfingomielin ter fosfatidilserin, ki vplivajo na razvrščanje tovora, izločanje eksosomov, njihovo strukturo in signalizacijo. Proteini se v eksosomih prenašajo tako v membrani kot v lumnu. Proteini, ki se nahajajo v membrani so: tetraspanini, integrini, molekule MHC I, II, ki so značilne za eksosome sproščne iz dendritičnih celice. Eksosomi
iz retikulocitov pa vsebujejo tudi receptorje za transferin (TfR; ang. transferrin receptor).
Lumen eksosomov vsebuje proteine, ki sodelujejo pri njihovi biogenzi (ALIX, Tsg-101), proteine udeležene v membranskem transportu (GTPaze, flotilin, aneksin), citoskeletne proteine (aktin, tubulin) ter proteine toplotnega šoka (Hsp, ang. heat shock proteins).
Eksosomi vsebujejo številne nukleinske kisline, kot so mRNA in nekodirajoče RNA (ncRNA; ang. non-coding RNA). Mikro RNA (miRNA) so ena izmed najpogostejših vrst RNA v eksosomih. (2,7). Sestava eksosomov je prikazana na Sliki 2.
Slika 2: Shematski prikaz sestave eksosomov; prirejeno po (2).
1. 5. Izolacija eksosomov
Izolacija eksosomov je zaradi njhove heterogenosti ter prisotnosti tudi drugih EV s podobnimi fizikalno-kemijskimi in biokemijskimi lastnostmi precej zahtevna.
Najpogosteje se v ta namen uporabljajo ultracentrifugiranje, tehnike izolacije glede na velikost veziklov, sedimentacija s polimeri, imunoafinitetna izolacija ter mikrofluidne tehnike (8).
1. 5. 1. Ultracentrifugiranje
Najpogosteje uporabljena metoda za izolacijo eksosomov je diferencialno centrifugiranje, sestavljeno iz 3 ciklov. V prvem ciklu biološki vzorec ali celično kulturo centrifugirajo pri nizkih obratih (300×g), s čimer odstranimo celice in njihove večje ostanke. Sledi centrifugiranje pri višjih obratih (10 000–20 000×g), ki odstrani celične organele in mikrovezikle. V tretjem, zadnjem ciklu pa izvedejo centrifugiranje pri visokih obratih (100 000–150 000×g). Za odstranjevanje nečistot se velikokrat uporablja gradientno ločevanje s saharozo ali jodiksanolom, ki razvrstita delce glede na njihovo gostoto.
Ultracentrifugiranje je zamudno in lahko povzroči poškodbe eksosomov (8).
1. 5. 2. Izolacija eksosomov glede na velikost veziklov
Ultrafiltracija in velikostno izključitvena kromatografija izkoriščata velikostno pogojeno sposobnost prehajanja eksosomov skozi fizične pregrade. Pri ultrafiltraciji uporabljajo bodisi nanomembrane ali pa membrane z ustreznimi mejnimi vrednostmi prehajanja glede na molekulske mase (MWCO; ang. molecular weight cut-off). Za izvedbo velikostno izključitvene kromatografije se uporabljajo porozne kolone. Obe metodi izolacije pogosto uporabljajo v kombinaciji z ultracentrifugiranjem in drugimi tehnikami, saj ne vplivata na strukturo eksosomov, sta precej zamudni (8).
1. 5. 3. Imunoafinitetna izolacija
Ta metoda temelji na interakciji med membranskimi proteini eksosomov, kot so npr. CD9, ALIX, EpCAM in protitelesi, ki jih specifično prepoznavajo. Slednja so kovalentno vezana na magnetne kroglice ali druge kromatografske nosilce. Metoda je primerna za ločevanje eksosomov, ki izražajo enako vrsto membranskih proteinov, njeni slabosti pa sta visoki stroški reagentov ter izguba aktivnosti eksosomov (9).
1. 5. 4. Sedimentacija s polimeri
V tem primeru vzorec najprej inkubirajo s polimeri, ki zmanjšajo topnost eksosomov, temu pa sledi centrifugiranje pri nižjih obratih. Postopek je sorazmerno enostaven in zanj ne potrebujemo posebne opreme. Na ta način izolirana populacija veziklov pa je raznovrstna, saj poleg eksosomov sedimetirajo tudi različne nečistote (9).
1. 5. 5. Mikrofluidne tehnike
Gre za tehniko ločevanja v mikro merilu, ki temelji na razlikah med biokemičnimi in fizikalnimi lastnostmi eksosomov, kot so: gostota, velikost in imunska afiniteta. Poleg tega pa se hitro razvijajo tudi novi mehanizmi ločevanja eksosomov, ki združujejo elektroforetsko, akustično in elektromagnetno delovanje. Ločevanje z uporabo mikrofluidnih naprav delimo v tri skupine: i) ločevanje z imunoafinitetnim zajemanjem eksosomov, ii) ločevanje s pomočjo sipanja in iii) ločevanje eksosomov z njihovo adsorpcijo v poroznih strukturah. Za izolacijo eksosomov z mikrofuldnimi napravami je potrebna predpriprava vzorca. Te metode so visoko občutljive in omogočajo hitrejšo izolacijo v primerjavi z ostalimi tehnikami, njihova slabost pa je, da izkazujejo nizek izkoristek izolacije, zato so trenutno primerne samo za diagnostične namene (9).
1. 6. Karakterizacija eksosomov
Eksosome lahko razvrstimo v različne skupine glede na njihove lastnosti, kot so: velikost, morfološke značilnosti, vsebnost proteinov, lipidov in RNA. Za njihovo določanje pa uporabljajo različne tehnike, ki jih opisujemo v nadaljevanju.
1. 6. 1. Določanje morfologije
Za opredelitev mikrostrukture eksosomov običajno uporabljajo metode transmisijske elektronske mikroskopije (TEM; ang. transmission electron microscopy), vrstične elektronske mikroskopije (SEM; ang. scanning electron microscopy), krio-elektronske mikroskopije (cryo-EM; ang. cryo-electron microscopy) in mikroskopije na atomsko silo (AFM; atomic force microscopy). SEM se uporablja za zajemanje tridimenzionalnih slik eksosomov, njena slabost pa je spremenjena morfologija eksosomov, ki je posledica fiksacije vzorca in uporabe vakuuma. S TEM lahko določimo topografijo, strukturo ter sestavo eksosomov, in sicer z mejo ločljivosti 1 nm. Pogosto TEM uporabljajo v
kombinaciji s protitelesi na katera so vezani zlati delci, kar omogoča molekularno karakterizacijo proučevanih struktur. Za razliko od SEM in TEM pri izvedbi cryo-EM ni potrebna predpriprava vzorca, saj ga analizirajo neposredno na amorfnem ledu. S tem se izognejo strukturnim spremembam vzorca. AFM pa omogoča pridobivanje 3-D slike površinske topografije, posnete z zelo visoko ločljivosto. Pomembna značilnost AFM je njena sposobnost merjenja vzorcev z minimalno pripravo vzorcev ter v različnih pogojih (9, 10).
1. 6. 2. Določanje velikostne porazdelitve in koncentracije
Za določanje velikostne porazdelitve eksosomov najpogosteje uporabljajo metodi dinamičnega sipanja svetlobe (DLS; ang. dynamic light scattering) in optično sledenje nanodelcev (NTA; ang. nanoparticle tracking analysis). DLS temelji na lomljenju monokromatske svetlobe laserskega žarka in Brownovega gibanja delcev. Največja prednost te metode je, da lahko zazna delce s premeri od 1 nm do 6 µm, vendar pa zagotavlja zanesljive podatke le takrat, ko so v suspenziji prisotni eksosomi podobnih velikosti (monodisperzne suspenzije). NTA je podobna tehniki DLS, pri čemer pa Brownovo gibanje beleži kamera. Njena prednost je, da lahko z njeno uporabo zaznajo delce velikosti 30–1000 nm. Priprava vzorca je zelo hitra in enostavna, sama meritev pa traja le nekaj minut. Glavna ovira pri izvedbi NTA je določitev ustreznega faktorja redčenja, ki preprečuje prekrivanje analiziranih delcev (11). Redkeje pa za določanje velikostne porazdelitve in koncentracije eksosomov uporabljajo rezistentno zaznavanje pulza (TRPS, ang. tunable resistive pulse sensing). Ta metoda omogoča zaznavanje posameznega vezikla na osnovi zmanjšanja ionskega toka, ki je posledica njegovega prehoda preko nanopore v membrani (10).
1. 6. 3. Določanje proteinske sestave
Za dokazovanje prisotnosti določenih eksosomskih proteinov se najpogosteje uporablja metoda Western-blot. Izolirane eksosome obdelajo s pufrskimi raztopinami za lizo, ki vsebujejo denaturante in zaviralce proteaz. Beljakovinske lizate nato ločijo s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega lavrilsulfata (SDS-PAGE;
ang. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis). Temu sledi prenos proteinov na nitrocelulozno membrano, ki jo v nadaljevanju analizirajo s primarnimi in
sekundarnimi oz. detekcijskimi protitelesi. Med pogosto uporabljane metode za analizo proteinov sodita tudi ELISA in masna spektrometrija (10, 11). Trenutno pa intenzivno razvijajo tudi številne metode, ki temeljijo na biosenzorjih, ki so zasnovani posebej za odkrivanje širše populacije EV. Za njihovo izvedbo so potrebne bistveno manjše količine minimalno obdelanih vzorcev, zato so primerne za biomedicinsko uporabo (10).
1. 6. 4. Določanje nukleniske sestave
Za ekstrakcijo eksosomskih nukleinskih kislin se uporabljata ekstrakcija v sistemu fenol-kloroform ter kolon s silikagelom. Nukleinske kisline se porazdelijo v vodno fazo, iz katere jih v nadaljevanju oborimo z etanolom. Uporaba kolon s silikagelom temelji na sposobnosti vezave nukleinskih kislin na silicijev dioksid v prisotnosti kaotropnih snovi. Poleg preverjanja kakovosti, izkoristka in velikosti izoliranih nukleinskih kislin se za njihovo kvalitativno in kvantitativno določanje običajno uporabljata tehniki pomnoževanja in sekvenciranja. Izbrano oz. ciljno zaporedje lahko selektivno pomnožimo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR), nato pa analiziramo z ustrezno metodo. Za visoko zmogljivo odkrivanje, kvantifikacijo in razumevanje vloge eksosomske RNA, je zelo pomemben nedavni napredek na področju sekvenciranja naslednje generacije (NGS; ang. next generation sequencing). Zaradi vse večjega zanimanja za uporabo nukleinskih kislin EV kot minimalno invazivno pridobljenih diagnostičnih označevalcev, so razvili nove biosenzorske tehnologije, ki omogočajo njihovo še učinkovitejšo in hitrejšo ekstrakcijo in analizo, pri čemer mnoge od njih zagotavljajo občutljivo količinsko določanje ciljnih nukleinskih kislin (10).
1. 7. Klinična uporabnost eksosomov
1. 7. 1. Diagnostika
Eksosomi so uporabni kot označevalci različnih bolezni ter stanj, saj jih izločajo vse somatske celice in so prisotni v vseh telesnih tekočinah. Biogeneza eksosomov omogoča zajem tako zunajceličnega kot znotrajceličnega molekulskega tovora, primernega za celovito, večparametrsko diagnostično testiranje (12). Eksosomi, ki vsebujejo tumorsko specifične RNA, se uporabljajo kot biološki označevalci v diagnostiki rakavih obolenj, makromolekulske sestavine eksosomov (npr. tetraspanina CD63 in CD81) pa imajo pomembno vlogo pri različnih stanjih, kot so: vnetje, imunski odzivi, angiogeneza, celična
smrt, nevrodegenerativne in rakave bolezni. Povišane ravni CD81 so povezane z vnetjem in fibrozo, zato preučujejo njegovo potencialno uporabnost za pri diagnozi hepatitisa C.
Eksosomi, ki vsebujejo fosforilirane amiloidne peptide, so potencialni biološki označevalci za Alzheimerjevo bolezen, tisti, obogateni z α-sinukleinom, avtolizomskimi proteini in katepsinom D, pa so pomembni za diagnostiko Parkinsonove bolezni (13).
Posamezne miRNA ali njihove skupine v eksosomih izkazujejo diagnostični ali prognostični potencial pri odkrivanju raka. Onkogene in tumorsko supresorske miRNA, prisotne v eksosomih imajo lahko veliko diagnostično vrednost zaradi razlik v njihovem izražanju v rakavih in zdravih celicah, kar je še posebej uporabno v zgodnji diagnostiki.
Ugotovili so, da so zvišane vrednosti eksosomske miRNA-21 v serumu povezane z glioblastomi, kolorektalnim rakom ter raki trebušne slinavke, debelega črevesa, jeter, dojk, jajčnikov in požiralnika, njeni povečani nivoji v urinu pa z rakom mehurja in prostate. Druge eksosomske onkogene miRNA, ki so povezane z več vrstami raka, so še:
miRNA-155, skupina miRNA-17-92 ter miRNA-1246. Z določanjem kombinacije več eksosomskih miRNA pa lahko še povečamo njihov diagnostični in prognostični potencial (12).
1. 7. 2. Terapija
Eksosomi sodelujejo v medcelični komunikaciji in v tarčne celice dostavljajo funkcionalen tovor, v obliki različnih bioaktivnih proteinov, mRNA in miRNA. S tem vplivajo na fiziološke in patološke procese v organizmu. Posledično so eksosomi primerni za potencialno terapevtsko uporabo, ki temelji predvsem na njihovih naslednjih lastnostih:
stabilnost v pogojih in vivo in in vitro, sposobnost prehajanja krvno-možganske pregrade ter vpliv na izražanje genov v tarčnih celic s prenosom miRNA in siRNA, pri čemer povzročajo manj neželenih učinkov kot npr. terapevtsko uporabljene mezenhimske/
stromalne matične celice (MMC). Eksosome, pridobljene iz MMC, so testirali na modelih različnih bolezni, predvsem dihalnih, srčno-žilnih, nevroloških, mišično-skeletnih, jetrnih, prebavnih, dermatoloških in ledvičnih. Ugotovili so, da zavirajo izražanje vnetnih citokinov in spodbujajo regeneracijo tkiv, predvsem s povečevanjem preoblikovanja zunajceličnega matriksa. Podobne lastnosti imajo tudi eksosomi induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC; ang. induced pluripotent stem cells) embrionalnih matičnih celic (EMC) in srčnih matičnih celic (13, 14).
1. 7. 3. Eksosomi kot nosilci za dostavo učinkovin
Eksosome raziskujejo tudi kot dostavne sisteme za različne učinkovine, proteine in RNA.
Prednosti eksosomov kot nosilcev učinkovin so številne, saj med drugim povečajo stabilnost tovora, ki ga prenašajo v krvi, s čimer podaljšajo čas njegovega kroženja v telesu, tako v patoloških kot fizioloških pogojih. Zaradi njihove polarne notranjosti so zlasti primerni za polnjenje z vodotopnimi učinkovinami in nukleinskimi kislinami.
Eksosomi imajo tudi manj učinkov izven tarčnih celic, saj so sposobni premagovati različne biološke ovire, prodirati v tkiva in se izogibati napadom imunskega sistema.
Eksosomi so tudi manj imunogeni kot virusni dostavni sistemi (12).