UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
VID VEDLIN
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2022
VID VEDLIN
TERAPEVTSKA IN DIAGNOSTIČNA UPORABA ČLOVEŠKIH EKSOSOMOV:
SISTEMATIČNI PREGLED IN ANALIZA GLOBALNIH TRENDOV IZVAJANJA KLINIČNIH RAZISKAV
THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC USE OF HUMAN EXOSOMES: SYSTEMATIC REVIEW AND ANALYSIS OF GLOBAL TRENDS IN PERFORMING CLINICAL
STUDIES
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2022
Magistrsko nalogo sem opravljal na Katedri za klinično biokemijo na Fakulteti za farmacijo, Univerzi v Ljubljani, pod mentorstvom prof. dr. Matjaža Jerasa, mag. farm.
ZAHVALA:
Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Matjažu Jerasu za spodbudo, nasvete in predano znanje pri pisanju magistrske naloge. Rad bi se zahvalil tudi izr. prof. dr. Igorju Locatelliju za odgovore na vsa moja vprašanja tekom pisanja naloge.
Posebej bi pa se rad zahvalil svoji družini, ki me je tekom celotnega izobraževanja ves čas podpirala in bodrila.
IZJAVA
Izjavljam, da sem diplomsko/magistrsko nalogo samostojno izdelal pod mentorstvom prof. dr. Matjaža Jerasa, mag. farm..
Ljubljana, 2022 Vid Vedlin
Komisija za oceno in zagovor magistrske naloge
Mentor: prof. dr. Matjaž Jeras
Predsednik komisije: prof. dr. Robert Roškar Članica komisije: doc. dr. Anja Pišlar
KAZALO VSEBINE
KAZALO VSEBINE ... I KAZALO PREGLEDNIC ... III KAZALO SLIK IN GRAFOV ... III POVZETEK ... V ABSTRACT ... VI SEZNAM OKRAJŠAV ... VII
1. UVOD ... 1
1. 1. Zunajcelični vezikli ... 1
1. 2. Biogeneza eksosomov ... 1
1. 3. Privzem eksosomov... 3
1. 4. Sestava eksosomov ... 3
1. 5. Izolacija eksosomov ... 5
1. 5. 1. Ultracentrifugiranje ... 5
1. 5. 2. Izolacija eksosomov glede na velikost veziklov ... 5
1. 5. 3. Imunoafinitetna izolacija ... 5
1. 5. 4. Sedimentacija s polimeri ... 6
1. 5. 5. Mikrofluidne tehnike ... 6
1. 6. Karakterizacija eksosomov ... 6
1. 6. 1. Določanje morfologije ... 6
1. 6. 2. Določanje velikostne porazdelitve in koncentracije ... 7
1. 6. 3. Določanje proteinske sestave ... 7
1. 6. 4. Določanje nukleniske sestave ... 8
1. 7. Klinična uporabnost eksosomov ... 8
1. 7. 1. Diagnostika... 8
1. 7. 2. Terapija... 9
1. 7. 3. Eksosomi kot nosilci za dostavo učinkovin ... 10
2. NAMEN DELA ... 11
3. METODE ... 12
3. 1. Sistematični pregled ... 12
3. 1. 1. Iskanje kliničnih raziskav ... 12
3. 1. 2. Raziskovalno vprašanje ... 13
3. 1. 3. Izbor člankov ... 14
3. 1. 4. Zbiranje podatkov kliničnih raziskav terapevtske uporabe eksosomov ... 14
3. 1. 5. Zbiranje podatkov kliničnih raziskav diagnostične uporabe eksosomov ... 15
4. REZULTATI ... 16
4. 1. Iskanje objavljenih raziskav terapevtske uporabnosti človeških eksosomov ... 16
4. 2. Iskanje objavljenih raziskav diagnostične uporabnosti eksosomov ... 17
4. 3. Rezultati kliničnih raziskav terapevtske uporabe eksosomov ... 20
4. 3. 1. Porazdelitev kliničnih preskušanj po državah ... 20
4. 3. 2. Število sodelujočih v kliničnih preskušanjih po državah ... 20
4. 3. 3. Porazdelitev kliničnih preskušanj glede na vrsto bolezni oziroma zdravstvenega stanja ... 21
4. 3. 4. Porazdelitev kliničnih preskušanj glede na izvor eksosomov ... 22
4. 3. 5. Porazdelitev kliničnih preskušanj glede na njihovo zasnovo in fazo ... 23
4. 3. 6. Trajanje kliničnih preskušanj ... 25
4. 3. 7. Splošni podatki o izbranih kliničnih študijah terapevtske uporabe eksosomov in njihovih osnovnih lastnostih. ... 27
4. 4. Rezultati kliničnih raziskav diagnostične uporabe eksosomov ... 34
4. 4. 1. Porazdelitev kliničnih raziskav po državah ... 34
4. 4. 2. Število sodelujočih v kliničnih raziskavah diagnostične uporabe eksosomov po posameznih državah ... 34
4. 4. 3. Porazdelitev kliničnih raziskav glede na njihovo zasnovo ... 35
4. 4. 4. Trajanje kliničnih raziskav glede na vrsto rakavega obolenja ... 36
4. 4. 5. Splošni podatki o izbranih kliničnih študijah diagnostične uporabe eksosomov in njihovih osnovnih lastnostih. ... 38
5. RAZPRAVA ... 44
6. SKLEP ... 46
7. LITERATURA ... 47
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Iskalni profili terapevtske uporabnosti eksosomov za posamezne bibliografske zbirke. ... 12 Preglednica II: Iskalni profili diagnostične uporabnosti eksosomov za posamezne bibliograske zbirke. ... 13 Preglednica III: Vključitveni in izključitveni kriteriji na področju terapevtske uporabnosti eksosomov. ... 13 Preglednica IV: Vključitveni in izključitveni kriteriji na področju diagnostične uporabnosti eksosomov. ... 14 Preglednica V: Lastnosti posameznih kliničnih raziskav terapevtske uporabe človeških eksosomov. ... 27 Preglednica VI: Lastnosti posameznih kliničnih raziskav diagnostične uporabe eksosomov. ... 38
KAZALO SLIK IN GRAFOV
Slika 1: Biogeneza eksosomov; prirejeno po (2). ... 2 Slika 2: Shematski prikaz sestave eksosomov; prirejeno po (2). ... 4 Slika 3: Shematski prikaz pregleda in izbora člankov, ki obravnavajo terapevtsko uporabo človeških eksosomov. ... 17 Slika 4: Shematski prikaz pregleda in izbora člankov, ki obravnavajo diagnostično uporabo človeških eksosomov. ... 19
Graf 1: Porazdelitev števila kliničnih preskušanj terapevtske uporabe eksosomov po državah... 20 Graf 2: Prikaz porazdelitve števila preiskovancev, vključenih v klinične študije terapevtske uporabe eksosomov, po posameznih državah... 21 Graf 3: Prikaz porazdelitve števila kliničnih preskušanj eksosomov, glede na vrsto bolezni oz. zdravstveno stanje. ... 22 Graf 4: Prikaz porazdelitve kliničnih preskušanj glede na izvor oz. vrsto proučevanih eksosomov. ... 23 Graf 5: Prikaz porazdelitve kliničnih preskušanj glede na zaslepitev. ... 23
Graf 6: Prikaz porazdelitve preskušanj glede na randomizacijo kliničnih študij. ... 24 Graf 7: Prikaz števila enoskupinskih in večskupinskih kliničnih preskušanj. ... 24 Graf 8: Prikaz porazdelitve kliničnih preskušanj glede na njihovo fazo. ... 25 Graf 9: Predstavitev trajanja kliničnih preskušanj glede na vrsto oz. izvor eksosomov. .... 26 Graf 10: Porazdelitev števila kliničnih raziskav diagnostične uporabe človeških eksosomov po državah... 34 Graf 11: Prikaz porazdelitve števila preiskovancev v okviru kliničnih raziskav diagnostične uporabnosti človeških eksosomov, po posameznih državah. ... 35 Graf 12: Prikaz števila porazdelitve diagnostične uporabnosti eksosomov glede na njihovo zasnovo. ... 36 Graf 13: Trajanje kliničnih raziskav diagnostične uporabnosti človeških eksosomov glede na vrsto rakavega obolenja. ... 37
POVZETEK
Ozadje: Eksosomi so membranski vezikli, ki jih celice izločajo v zunajcelični prostor.
Sodelujejo pri številnih fizioloških in patoloških procesih, kot so: imunski odziv, obnavljanje tkiv, vnetje in rak. Udeleženi so tudi v medcelični komunikaciji, saj prenašajo številne signalne molekule: proteine, lipide in nukleinske kisline (DNA, mRNA, mikro RNA). Tovor, ki ga eksosomi prenašajo, odraža sestavo celic iz katerih izvirajo, zato so pomemben vir raznolikih diagnostičnih označevalcev. Vse več kliničnih raziskav se ukvarja predvsem s terapevtsko rabo eksosomov matičnih celic, ki imajo številne prednosti v primerjavi s samimi celicami.
Metode: Sistematični pregled literature smo izvedli v bibliografskih spletnih bazah, Clinicaltrials.gov, Cochrane library ter MEDLINE. Za analizo smo izbrali tiste raziskave, v okviru katerih so proučevali normalne in spremenjene človeške eksosome za terapevtske ter diagnostične namene. Pri slednjih smo se omejili na rakava obolenja prostate in pljuč.
Zaradi velikega števila še potekajočih študij smo izvedli analizo globalnih trendov izvajanja omenjenih raziskav. Izbrane parametre kot so število preiskovancev, vrsta uporabljenih eksosomov, itd., smo prikazali v obliki grafov. Značilnosti vseh analiziranih raziskav pa smo predstavili v preglednicah.
Rezultati: S sistematičnim pregledom smo pridobili skupno 53 raziskav, od katerih jih je 30 obravnavalo terapevtsko, 23 pa diagnostično rabo človeških eksosomov. V terapevtske namene največkrat uporabljajo eksosome iz mezenhimskih/ stromalnih matičnih celic, s katerimi eksperimentalno tretirajo predvsem bolezni dihal, neoplazme, nevrološke in kožne bolezni. Večina analiziranih kliničnih preskušanj je bila odprtih, nerandomiziranih in v fazi I kliničnih raziskav. V povprečju so te raziskave trajale 1,9 let. V primeru diagnostične rabe eksosomov pa smo zasledili največ kohortnih študij. Veliko je takih, ki validirajo teste na podlagi eksosomskih označevalcev. Kot nove diagnostične označevalce pa raziskujejo predvsem eksosomske mikro RNA. Tovrstne raziskave trajajo v povprečju 3 leta.
Sklep: Področje uporabe eksosomov je novo in nakazuje njihov velik potencial za terapevtsko in diagnostično uporabo, pri čemer je slednja pravzaprav že postala realnost.
Ključne besede: eksosomi, terapevtska uporaba, diagnostika, rak prostate, rak pljuč
ABSTRACT
Background: Exosomes are membrane vesicles which cells secrete into the extracellular space. They are involved in many physiological processes, like immune response and tissue regeneration, as well as pathological processes, e.g. inflammation and cancer. They are also involved in intercellular communication, as they carry many signaling molecules, such as proteins, lipids and nucleic acids (DNA, mRNA, microRNA). Due to their load, which reflects the composition of the originating cell, they are an important source of various diagnostic markers. More and more clinical research is conducted in the therapeutic use of exosomes, which have many advantages especially compared to stem cells from which they originate.
Methods: Systematic review of literature has been performed using the following online bibliographic databases: Clinicaltrials.gov, Cochrane library and MEDLINE. We have selected those clinical research studies in which human exosomes or altered human exosomes were used for therapeutic or diagnostic purposes. In the latter case, we limited ourselves to prostate and lung cancers. Due to a large number of ongoing studies, we performed the analysis of their global trends. Selected parameters, such as number of participating subjects, types of exosomes used, etc., were presented graphically. The selected properties of all studies were presented in tables.
Results: Following stringent inclusion/ exclusion criteria, 53 studies were selected for analysis. Thirty of them were dealing with therapeutic and 23 with diagnostic use of human exosomes. In the first group the most commonly used exosomes in clinics were derived from mesenchymal stem cells, and were mostly investigated in treatment of respiratory diseases, neoplasms, and neurological and skin diseases. Most clinical trials were open-label, non-randomised, and phase I. Therefore, the average length of a clinical trial in this group is 1,9 years. Most of the analysed diagnostic studies were cohort studies.
There were also many validating diagnostic tests based on exosomal markers. In terms of new diagnostic markers, microRNAs were those being mainly investigated. On average, this type of research takes 3 years.
Conclusion: The field of exosomes is rather new, and holds a great potential for their therapeutic and diagnostic use.
Key words: exosomes, therapeutic use, diagnostics, prostate cancer, lung cancer
SEZNAM OKRAJŠAV
AFM mikroskopija na atomsko silo (ang. atomic force microscopy) ALIX s programirano celično smrtjo 6 vzajemno delujoči protein (ang.
programmed cell death 6-interacting protein)
ALK anaplastična limfomska kinaza (ang. anaplastic lymphoma kinase) ARDS sindrom akutne dihalne stiske (ang. accute respiratory distress syndrom)
CD označevalec celične pripadnosti (ang. cluster of differentiation) cGVHD kronična bolezen presadka proti gostitelju (ang. chronic graft versus
host disease)
circRNA krožne RNA (ang. circular RNA)
COVID-19 koronavirusna bolezen 2019 (ang. coronavirus disease 2019) cryo-EM krio-elektronska mikroskopija (ang. cryo-electron microscopy) CSTC-EXO eksosomi pridobljeni iz specifičnih T celic (ang.
specific T cell derived exosomes)
CTC tumorske celice v krvnem obtoku (ang. circulating tumor cells)
ctDNA tumorska DNA v krvnem obtoku (ang. circulating tumor DNA) DC dendritične celice (ang. dendritic cells)
DLS dinamično sipanje svetlobe (ang. dynamic light scaterring) DNA deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxyribonucleic acid)
ELISA encimsko-imunski test (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) EMC embrionalne matične celice
EML4 protein, nujno potreben za tvorbo mikrotubulov (ang. echinoderm microtubule-associated protein-like 4)
EpCAM adhezijska molekula epitelijskih celic (ang. epithelial cell adhesion molecule)
ESCRT endosomski sortirni kompleksi, nujni za transportne mehanizme (ang. endosomal sorting complexes required for transport machinery)
EV zunajcelični vezikli (ang. extracellular vesicles)
EXO eksosomi (ang. exosomes)
FasL ligand receptorja Fas (ang. Fas ligand)
GM gangliozid (ang. ganglioside)
GM-CSF dejavnik, ki stimulira kolonije granulocitov in makrofagov (ang.
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) GTPase gvanozintrifosfataza (ang. guanosine triphosphatase)
Hr substrat tirozin kinaze, ki ga uravnava hepatocitni rastni dejavnik (ang. hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate) Hsp protein toplotnega šoka (ang. heat shock protein)
ILV intraluminalni vezikli (ang. intraluminar vesicles)
iPSC eksosomi induciranih pluripotentnih matičnih celic (ang. induced pluripotent stem cells)
MAGE z melanomom povezani antigen (ang. melanoma associateed antigen)
MART-1 z melanomom povezani antigen, ki ga prepoznavajo limfociti T1 (ang. melanoma antigen recognized by T cells 1)
MHC molekule poglavitnega kompleksa tkivne skladnosti (ang. major histocompatibility complex)
miRNA mikro ribonukleniska kislina (ang. micro ribonucleic acid)
mRNA informacijska ribonukleinska kislina (ang. messenger ribonucleic acid)
MMC mezenhimske stromalne matične celice
MODS sindrom množične odpovedi organov (ang. multiple organ dysfunction syndrome)
MVB multivezikularna telesca (ang. multivesicular bodies)
MWCO mejna vrednost molekulske mase topljenca, ki ga v 90% zadrži membrana filtra (ang. molecular weight cut-off)
ncRNA nekodirajoča RNA (ang. non-coding RNA)
NGS sekvenciranje naslednje generacije (ang. next generation sequencing)
NSCLC nedrobnocelični pljučni rak (ang. non-small cell lung carcinoma) NTA optično sledenje nanodelcev (ang. nanoparticle tracking analysis) NY-ESO-1 antigen raka testisov 1B (ang. New York esophageal squamous cell
carcinoma-1 or cancer-testis antigen 1B)
P4HA1 podenota alfa 1 prolil 4-hidroksilaze (ang. prolyl 4-hydroxylase subunit alpha 1)
PC fosfatidilholin (ang. phosphatidylcholine)
PCA 3 gen za antigen 3 raka prostate (ang. prostate cancer antigen 3 gene)
PCR verižna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction) PE fosfatidiletanolamin (ang. phosphatidylethanolamine)
PI fosfatidilinozitol (ang. phosphatidylinositol)
PRAC kandidatni protein dovzetnosti za rak prostate (ang.
prostate cancer susceptibility candidate protein 1) PS fosfatdilserin (ang. phosphatidylserine)
PSA za prostato specifični antigen (ang. prostate specific antigen) PSGL-1 P-selektinski glikoproteinski ligand-1 (ang. P-selectin glycoprotein
ligand-1)
Rab vezavni proteini, monomerne GTP-aze, iz naddružine Ras (ang.
Ras-associated binding proteins)
SARS-CoV-2 novi koronavirus (ang. severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)
SDS-PAGE poliakrilamidna elektroforeza v prisotnosti natrijevega lavrilsulfata (ang. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)
SEM vrstična elektronska mikroskopija (ang. scanning electron microscopy)
siRNA kratka interferenčna RNA (ang. small interfering RNA)
SNARE proteinski receptor za vezavo topnega dejavnika, občutljivega na N- etilmaleimid (ang. soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)
STAM adaptorska molekula, ki prevaja signal (ang. signal transducing adaptor molecule)
T790M EGFR mutacija na položaju 790 receptorja za epidermalni rastni dejavnik (ang. gatekeeper mutation of the epidermal growth factor receptor (EGFR))
TCR T-celični receptor (ang. T-cell receptor)
TEM transmisijska elektronska mikroskopija (ang. transmission electron microscopy),
TfR receptor za transferin (ang. transferrin receptor)
TNF dejavnik tumorske nekroze (ang. tumor necrosis factor)
TRAIL TNF-u sorodni ligand, ki inducira apoptozo (ang. TNF-related apoptosis-inducing ligand)
TRPS rezistentno zaznavanje pulza (ang. tunable resistive pulse sensing) Tsg101 gen 101 za dovzetnost na tumor (ang. tumor suspectibility gene
101)
UBDs domene, ki vežejo ubikvitin (ang. ubiquitin binding domains) UMSC mezenhimske matične celice pridobljene iz popkovine (ang.
umbilical mesenchymal stem cell)
VPS4 s sortiranjem vakuolnih proteinov povezani protein 4 (ang. vacuolar protein sorting-associated protein 4)
1. UVOD
1. 1. Zunajcelični vezikli
Zunajcelični vezikli (EV, ang. extracellular vesicles) so raznolika skupina veziklov z membrano, ki jih celice izločajo v zunajcelični prostor. EV, ki jih sproščajo tako prokariontske kot evkariontske celice, sodelujejo v številnih fizioloških (imunski odziv, regeneracija tkiv) in patoloških (rakava obolenja, vnetje) procesih. Udeleženi so tudi v medcelični komunikaciji, saj prenašajo številne signalne molekule, lipide, proteine in nukleinske kisline (DNA, mRNA, miRNA) (1, 2).
Glede na njihovo velikost, mesto nastanka, poti sproščanja ter funkcije, jih delimo na tri večje skupine, in sicer na eksosome, mikrovezikle in apoptotska telesca. Slednja so po velikosti največja, saj v premeru merijo od 1000 do 5000 nm, sproščajo pa se ob celični apoptozi. Po sestavi se razlikujejo od ostalih dveh skupin, saj vsebujejo tudi celične organele. Mikrovezikli nastanejo z vihanjem plazemske membrane, njihov premer pa znaša 100–1000 nm. Najmanjši med vezikli so eksosomi (premer 30–150 nm), ki so endocitotskega izvora (3).
1. 2. Biogeneza eksosomov
Eksosomi nastajajo znotraj celice z endocitozo. Najprej se tvorijo zgodnji endosomi, ki nastanejo z brstenjem celične membrane, ti pa kasneje dozorijo v pozne endosome ali multivezikularna telesca (MVB) (ang. multivesicular bodies). V teh postopoma rastejo intraluminalni vezikli (ILV) (ang. intraluminar vesicles), ki so bogati z lipidi, nukleinskimi kislinami in citosolnimi proteini. Zrela MVB se nato preko mikrotubolov prenesejo do plazemske membrane, pri čemer se sprostijo ILV v obliki eksosomov. Ostala MVB pa se razgradijo z lizosomi. Nastanek MVB nadzorujejo številnimi mehanizmi, pri tem pa igra najpomembnejšo vlogo kompleks ESCRT (ang. endosomal complexes required for transport). Ta je sestavljen iz 5 enot, in sicer ESCRT-0, -I, -II, -III in Vps4.
ESCRT-0 sodeluje pri razvrščanju proteinov, vezanih na ubikvitin, ki jih bodo nato vsebovali ILV in kasneje tudi eksosomi. ESCRT-0 je sestavljen iz dveh podenot. Prva je substrat tirozin kinaze Hrs (ang. hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), ki ga uravnava hepatocitni rastni dejavnik, druga pa adaptorska molekula STAM (ang. signal transducing adaptor molecule), ki prevaja signal. Vsaka od podenot
ima dve domeni UBD (ang. ubiquitin binding domain), ki vežeta ubikvitin. ESCRT-0 nato aktivira kompleks ESCRT-I, in sicer tako, da se veže na njegovo proteinsko podenoto Tsg101 (ang. tumor suspectibility gene 101). ESCRT-I skupaj z ESCRT-II spodbudi brstenje membrane okrog proteinov, vezanih na ubikvitin, pri čemer nastane žepek v katerega se razporedijo citosolski proteini in nukleinske kisline. V zadnji stopnji nastanka ILV pa se na ESCRT-II veže ESCRT-III in polimerizira zanko okrog žepka. Nato se sprostijo ILV, Vps4 pa hidrolizira ATP ter tako reciklira ESCRT-III (2, 4). Biogeneza eksosomov je prikazana na Sliki 1.
MVB nastajajo tudi z drugimi mehanizmi, med katere spada npr. pot sindekan-sintetin- ALIX. V tem primeru se sintetin veže na transmembranski protein sindekan, nato pa še na ALIX. Ta je odgovoren za razvrščanje tovora ter brstenje membrane, ki poteka brez ubikvitina in ESCRT-0. Tudi v tej poti sodeluje ESCRT-III. Obstajajo pa tudi druge poti, ki so neodvisne od ESCRT, med katere sodita ceramidna in tetraspaninska (5).
Slika 1: Biogeneza eksosomov; prirejeno po (2).
1. 3. Privzem eksosomov
Sproščeni eksosomi v zunajceličnem prostoru potujejo do tarčnih celic in nanje vplivajo preko različnih mehanizmov: i) z neposredno interakcijo med receptorji na tarčni celici in površinskimi molekulami, izraženimi na eksosomih, ii) s fuzijo eksosomov s celično membrano ter iii) z endocitozo (2).
Transmembranski ligandi, izraženi na površini eksosoma se lahko vežejo neposredno na površinske receptorje na tarčni celici in tako sprožijo njen odziv. Takšen mehanizem je običajen pri posredovanju imunomodulatornih in apoptotičnih učinkov eksosomov.
Eksosomi aktvirajo celice T pomagalke (CD4+) in citotoksične limfocite T (CD8+) z interakcijo med molekulami poglavitnega kompleksa tkivne skladnosti razredov I in II (MHC I, II; ang. major histocompatibility complex class I and II) in T-celičnimi receptorji (TCR). Ostale molekule, ki jih izražajo eksosomi na svojih površinah pa so: tetraspanini CD34 in CD80, ki spodbujajo proliferacijo limfocitov T, dejavnik tumorske nekroze (TNF; ang. tumor necrosis factor), ligand Fas (FasL) ter TNF-u sorodni ligand, ki inducira apoptozo (TRAIL; ang. TNF-related apoptosis-inducing ligand) (2).
Eksosomi se lahko tudi zlijejo s plazemsko membrano in sprostijo svojo vsebino neposredno v citosol tarčne celice. EV, pridobljeni iz monocitov, se vežejo na oz. se spojijo s plazemsko membrano aktiviranih trombocitov ter tako vanje prenesejo beljakovine, kot sta npr. tkivni faktor in P-selektinski glikoproteinski ligand-1 (PSGL-1).
Za razliko od endocitoze, ki je na molekularni ravni podrobno opisan proces, pa mehanizem fuzije celic z eksosomi ni dobro poznan. Eksosomi seveda vstopajo v tarčne celice tudi z različnimi oblikami endocitoze, npr. z makropinocitozo, fagocitozo in receptorsko pogojeno endocitozo (6).
1. 4. Sestava eksosomov
Eksosomi vsebujejo številne proteine, lipide ter nukleinske kisline. Sestava le-teh pa je odvisna od celice izvora ter njenega fiziološkega stanja. Membrana eksosomov je sestavljena iz fosfolipidnega dvosloja ter zajema raznovrstne lipide kot so holesterol, ceramid, sfingomielin ter fosfatidilserin, ki vplivajo na razvrščanje tovora, izločanje eksosomov, njihovo strukturo in signalizacijo. Proteini se v eksosomih prenašajo tako v membrani kot v lumnu. Proteini, ki se nahajajo v membrani so: tetraspanini, integrini, molekule MHC I, II, ki so značilne za eksosome sproščne iz dendritičnih celice. Eksosomi
iz retikulocitov pa vsebujejo tudi receptorje za transferin (TfR; ang. transferrin receptor).
Lumen eksosomov vsebuje proteine, ki sodelujejo pri njihovi biogenzi (ALIX, Tsg-101), proteine udeležene v membranskem transportu (GTPaze, flotilin, aneksin), citoskeletne proteine (aktin, tubulin) ter proteine toplotnega šoka (Hsp, ang. heat shock proteins).
Eksosomi vsebujejo številne nukleinske kisline, kot so mRNA in nekodirajoče RNA (ncRNA; ang. non-coding RNA). Mikro RNA (miRNA) so ena izmed najpogostejših vrst RNA v eksosomih. (2,7). Sestava eksosomov je prikazana na Sliki 2.
Slika 2: Shematski prikaz sestave eksosomov; prirejeno po (2).
1. 5. Izolacija eksosomov
Izolacija eksosomov je zaradi njhove heterogenosti ter prisotnosti tudi drugih EV s podobnimi fizikalno-kemijskimi in biokemijskimi lastnostmi precej zahtevna.
Najpogosteje se v ta namen uporabljajo ultracentrifugiranje, tehnike izolacije glede na velikost veziklov, sedimentacija s polimeri, imunoafinitetna izolacija ter mikrofluidne tehnike (8).
1. 5. 1. Ultracentrifugiranje
Najpogosteje uporabljena metoda za izolacijo eksosomov je diferencialno centrifugiranje, sestavljeno iz 3 ciklov. V prvem ciklu biološki vzorec ali celično kulturo centrifugirajo pri nizkih obratih (300×g), s čimer odstranimo celice in njihove večje ostanke. Sledi centrifugiranje pri višjih obratih (10 000–20 000×g), ki odstrani celične organele in mikrovezikle. V tretjem, zadnjem ciklu pa izvedejo centrifugiranje pri visokih obratih (100 000–150 000×g). Za odstranjevanje nečistot se velikokrat uporablja gradientno ločevanje s saharozo ali jodiksanolom, ki razvrstita delce glede na njihovo gostoto.
Ultracentrifugiranje je zamudno in lahko povzroči poškodbe eksosomov (8).
1. 5. 2. Izolacija eksosomov glede na velikost veziklov
Ultrafiltracija in velikostno izključitvena kromatografija izkoriščata velikostno pogojeno sposobnost prehajanja eksosomov skozi fizične pregrade. Pri ultrafiltraciji uporabljajo bodisi nanomembrane ali pa membrane z ustreznimi mejnimi vrednostmi prehajanja glede na molekulske mase (MWCO; ang. molecular weight cut-off). Za izvedbo velikostno izključitvene kromatografije se uporabljajo porozne kolone. Obe metodi izolacije pogosto uporabljajo v kombinaciji z ultracentrifugiranjem in drugimi tehnikami, saj ne vplivata na strukturo eksosomov, sta precej zamudni (8).
1. 5. 3. Imunoafinitetna izolacija
Ta metoda temelji na interakciji med membranskimi proteini eksosomov, kot so npr. CD9, ALIX, EpCAM in protitelesi, ki jih specifično prepoznavajo. Slednja so kovalentno vezana na magnetne kroglice ali druge kromatografske nosilce. Metoda je primerna za ločevanje eksosomov, ki izražajo enako vrsto membranskih proteinov, njeni slabosti pa sta visoki stroški reagentov ter izguba aktivnosti eksosomov (9).
1. 5. 4. Sedimentacija s polimeri
V tem primeru vzorec najprej inkubirajo s polimeri, ki zmanjšajo topnost eksosomov, temu pa sledi centrifugiranje pri nižjih obratih. Postopek je sorazmerno enostaven in zanj ne potrebujemo posebne opreme. Na ta način izolirana populacija veziklov pa je raznovrstna, saj poleg eksosomov sedimetirajo tudi različne nečistote (9).
1. 5. 5. Mikrofluidne tehnike
Gre za tehniko ločevanja v mikro merilu, ki temelji na razlikah med biokemičnimi in fizikalnimi lastnostmi eksosomov, kot so: gostota, velikost in imunska afiniteta. Poleg tega pa se hitro razvijajo tudi novi mehanizmi ločevanja eksosomov, ki združujejo elektroforetsko, akustično in elektromagnetno delovanje. Ločevanje z uporabo mikrofluidnih naprav delimo v tri skupine: i) ločevanje z imunoafinitetnim zajemanjem eksosomov, ii) ločevanje s pomočjo sipanja in iii) ločevanje eksosomov z njihovo adsorpcijo v poroznih strukturah. Za izolacijo eksosomov z mikrofuldnimi napravami je potrebna predpriprava vzorca. Te metode so visoko občutljive in omogočajo hitrejšo izolacijo v primerjavi z ostalimi tehnikami, njihova slabost pa je, da izkazujejo nizek izkoristek izolacije, zato so trenutno primerne samo za diagnostične namene (9).
1. 6. Karakterizacija eksosomov
Eksosome lahko razvrstimo v različne skupine glede na njihove lastnosti, kot so: velikost, morfološke značilnosti, vsebnost proteinov, lipidov in RNA. Za njihovo določanje pa uporabljajo različne tehnike, ki jih opisujemo v nadaljevanju.
1. 6. 1. Določanje morfologije
Za opredelitev mikrostrukture eksosomov običajno uporabljajo metode transmisijske elektronske mikroskopije (TEM; ang. transmission electron microscopy), vrstične elektronske mikroskopije (SEM; ang. scanning electron microscopy), krio-elektronske mikroskopije (cryo-EM; ang. cryo-electron microscopy) in mikroskopije na atomsko silo (AFM; atomic force microscopy). SEM se uporablja za zajemanje tridimenzionalnih slik eksosomov, njena slabost pa je spremenjena morfologija eksosomov, ki je posledica fiksacije vzorca in uporabe vakuuma. S TEM lahko določimo topografijo, strukturo ter sestavo eksosomov, in sicer z mejo ločljivosti 1 nm. Pogosto TEM uporabljajo v
kombinaciji s protitelesi na katera so vezani zlati delci, kar omogoča molekularno karakterizacijo proučevanih struktur. Za razliko od SEM in TEM pri izvedbi cryo-EM ni potrebna predpriprava vzorca, saj ga analizirajo neposredno na amorfnem ledu. S tem se izognejo strukturnim spremembam vzorca. AFM pa omogoča pridobivanje 3-D slike površinske topografije, posnete z zelo visoko ločljivosto. Pomembna značilnost AFM je njena sposobnost merjenja vzorcev z minimalno pripravo vzorcev ter v različnih pogojih (9, 10).
1. 6. 2. Določanje velikostne porazdelitve in koncentracije
Za določanje velikostne porazdelitve eksosomov najpogosteje uporabljajo metodi dinamičnega sipanja svetlobe (DLS; ang. dynamic light scattering) in optično sledenje nanodelcev (NTA; ang. nanoparticle tracking analysis). DLS temelji na lomljenju monokromatske svetlobe laserskega žarka in Brownovega gibanja delcev. Največja prednost te metode je, da lahko zazna delce s premeri od 1 nm do 6 µm, vendar pa zagotavlja zanesljive podatke le takrat, ko so v suspenziji prisotni eksosomi podobnih velikosti (monodisperzne suspenzije). NTA je podobna tehniki DLS, pri čemer pa Brownovo gibanje beleži kamera. Njena prednost je, da lahko z njeno uporabo zaznajo delce velikosti 30–1000 nm. Priprava vzorca je zelo hitra in enostavna, sama meritev pa traja le nekaj minut. Glavna ovira pri izvedbi NTA je določitev ustreznega faktorja redčenja, ki preprečuje prekrivanje analiziranih delcev (11). Redkeje pa za določanje velikostne porazdelitve in koncentracije eksosomov uporabljajo rezistentno zaznavanje pulza (TRPS, ang. tunable resistive pulse sensing). Ta metoda omogoča zaznavanje posameznega vezikla na osnovi zmanjšanja ionskega toka, ki je posledica njegovega prehoda preko nanopore v membrani (10).
1. 6. 3. Določanje proteinske sestave
Za dokazovanje prisotnosti določenih eksosomskih proteinov se najpogosteje uporablja metoda Western-blot. Izolirane eksosome obdelajo s pufrskimi raztopinami za lizo, ki vsebujejo denaturante in zaviralce proteaz. Beljakovinske lizate nato ločijo s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega lavrilsulfata (SDS-PAGE;
ang. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis). Temu sledi prenos proteinov na nitrocelulozno membrano, ki jo v nadaljevanju analizirajo s primarnimi in
sekundarnimi oz. detekcijskimi protitelesi. Med pogosto uporabljane metode za analizo proteinov sodita tudi ELISA in masna spektrometrija (10, 11). Trenutno pa intenzivno razvijajo tudi številne metode, ki temeljijo na biosenzorjih, ki so zasnovani posebej za odkrivanje širše populacije EV. Za njihovo izvedbo so potrebne bistveno manjše količine minimalno obdelanih vzorcev, zato so primerne za biomedicinsko uporabo (10).
1. 6. 4. Določanje nukleniske sestave
Za ekstrakcijo eksosomskih nukleinskih kislin se uporabljata ekstrakcija v sistemu fenol- kloroform ter kolon s silikagelom. Nukleinske kisline se porazdelijo v vodno fazo, iz katere jih v nadaljevanju oborimo z etanolom. Uporaba kolon s silikagelom temelji na sposobnosti vezave nukleinskih kislin na silicijev dioksid v prisotnosti kaotropnih snovi. Poleg preverjanja kakovosti, izkoristka in velikosti izoliranih nukleinskih kislin se za njihovo kvalitativno in kvantitativno določanje običajno uporabljata tehniki pomnoževanja in sekvenciranja. Izbrano oz. ciljno zaporedje lahko selektivno pomnožimo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR), nato pa analiziramo z ustrezno metodo. Za visoko zmogljivo odkrivanje, kvantifikacijo in razumevanje vloge eksosomske RNA, je zelo pomemben nedavni napredek na področju sekvenciranja naslednje generacije (NGS; ang. next generation sequencing). Zaradi vse večjega zanimanja za uporabo nukleinskih kislin EV kot minimalno invazivno pridobljenih diagnostičnih označevalcev, so razvili nove biosenzorske tehnologije, ki omogočajo njihovo še učinkovitejšo in hitrejšo ekstrakcijo in analizo, pri čemer mnoge od njih zagotavljajo občutljivo količinsko določanje ciljnih nukleinskih kislin (10).
1. 7. Klinična uporabnost eksosomov
1. 7. 1. Diagnostika
Eksosomi so uporabni kot označevalci različnih bolezni ter stanj, saj jih izločajo vse somatske celice in so prisotni v vseh telesnih tekočinah. Biogeneza eksosomov omogoča zajem tako zunajceličnega kot znotrajceličnega molekulskega tovora, primernega za celovito, večparametrsko diagnostično testiranje (12). Eksosomi, ki vsebujejo tumorsko specifične RNA, se uporabljajo kot biološki označevalci v diagnostiki rakavih obolenj, makromolekulske sestavine eksosomov (npr. tetraspanina CD63 in CD81) pa imajo pomembno vlogo pri različnih stanjih, kot so: vnetje, imunski odzivi, angiogeneza, celična
smrt, nevrodegenerativne in rakave bolezni. Povišane ravni CD81 so povezane z vnetjem in fibrozo, zato preučujejo njegovo potencialno uporabnost za pri diagnozi hepatitisa C.
Eksosomi, ki vsebujejo fosforilirane amiloidne peptide, so potencialni biološki označevalci za Alzheimerjevo bolezen, tisti, obogateni z α-sinukleinom, avtolizomskimi proteini in katepsinom D, pa so pomembni za diagnostiko Parkinsonove bolezni (13).
Posamezne miRNA ali njihove skupine v eksosomih izkazujejo diagnostični ali prognostični potencial pri odkrivanju raka. Onkogene in tumorsko supresorske miRNA, prisotne v eksosomih imajo lahko veliko diagnostično vrednost zaradi razlik v njihovem izražanju v rakavih in zdravih celicah, kar je še posebej uporabno v zgodnji diagnostiki.
Ugotovili so, da so zvišane vrednosti eksosomske miRNA-21 v serumu povezane z glioblastomi, kolorektalnim rakom ter raki trebušne slinavke, debelega črevesa, jeter, dojk, jajčnikov in požiralnika, njeni povečani nivoji v urinu pa z rakom mehurja in prostate. Druge eksosomske onkogene miRNA, ki so povezane z več vrstami raka, so še:
miRNA-155, skupina miRNA-17-92 ter miRNA-1246. Z določanjem kombinacije več eksosomskih miRNA pa lahko še povečamo njihov diagnostični in prognostični potencial (12).
1. 7. 2. Terapija
Eksosomi sodelujejo v medcelični komunikaciji in v tarčne celice dostavljajo funkcionalen tovor, v obliki različnih bioaktivnih proteinov, mRNA in miRNA. S tem vplivajo na fiziološke in patološke procese v organizmu. Posledično so eksosomi primerni za potencialno terapevtsko uporabo, ki temelji predvsem na njihovih naslednjih lastnostih:
stabilnost v pogojih in vivo in in vitro, sposobnost prehajanja krvno-možganske pregrade ter vpliv na izražanje genov v tarčnih celic s prenosom miRNA in siRNA, pri čemer povzročajo manj neželenih učinkov kot npr. terapevtsko uporabljene mezenhimske/
stromalne matične celice (MMC). Eksosome, pridobljene iz MMC, so testirali na modelih različnih bolezni, predvsem dihalnih, srčno-žilnih, nevroloških, mišično-skeletnih, jetrnih, prebavnih, dermatoloških in ledvičnih. Ugotovili so, da zavirajo izražanje vnetnih citokinov in spodbujajo regeneracijo tkiv, predvsem s povečevanjem preoblikovanja zunajceličnega matriksa. Podobne lastnosti imajo tudi eksosomi induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC; ang. induced pluripotent stem cells) embrionalnih matičnih celic (EMC) in srčnih matičnih celic (13, 14).
1. 7. 3. Eksosomi kot nosilci za dostavo učinkovin
Eksosome raziskujejo tudi kot dostavne sisteme za različne učinkovine, proteine in RNA.
Prednosti eksosomov kot nosilcev učinkovin so številne, saj med drugim povečajo stabilnost tovora, ki ga prenašajo v krvi, s čimer podaljšajo čas njegovega kroženja v telesu, tako v patoloških kot fizioloških pogojih. Zaradi njihove polarne notranjosti so zlasti primerni za polnjenje z vodotopnimi učinkovinami in nukleinskimi kislinami.
Eksosomi imajo tudi manj učinkov izven tarčnih celic, saj so sposobni premagovati različne biološke ovire, prodirati v tkiva in se izogibati napadom imunskega sistema.
Eksosomi so tudi manj imunogeni kot virusni dostavni sistemi (12).
2. NAMEN DELA
V okviru magistrske naloge bomo izvedli sistematični pregled različnih podatkovnih baz za pridobitev informacij o prijavljenih, potekajočih in že zaključenih kliničnih študijah terapevtske in diagnostične uporabnosti človeških eksosomov. Ker je to področje še zelo novo, bomo izvedli analizo globalnih trendov izvajanja omenjenih raziskav. Pri tem pa se bomo, na področju proučevanja eksosomov kot obetavnih diagnostičnih označevalcev, zaradi izjemne raznolikosti, omejili le na rakava obolenja prostate in pljuč.
3. METODE
Raziskovalno delo smo zasnovali na sistematičnem pregledu objavljenih študij in analizi njihovih izbranih lastnosti na področjih terapevtske in diagnostične uporabnosti človeških eksosomov. Objave smo iskali v elektronskih bibliografskih zbirkah. Po pregledu smo izbrali tiste, ki so izpolnjevale naše vključitvene kriterije, zbrane podatke raziskav pa uredili in jih prikazali v obliki grafov. Vse študije in njihove izbrane lastnosti, smo prikazali tudi v obliki preglednic.
3. 1. Sistematični pregled
Namen sistematičnega pregleda je zbiranje dokazov iz literature, z uporabo sistematičnih in jasno določenih metod, za odgovor na oblikovano raziskovalno vprašanje (15).
3. 1. 1. Iskanje kliničnih raziskav
Raziskave smo iskali v bibliografskih zbirkah na spletu. Pred začetkom iskanja smo zastavili iskalne nize, in sicer posebej za detekcijo raziskav, ki proučujejo človeške eksosome za terapevtsko ter posebej tistih za njihovo diagnostično uporabo. Prikazani so v Preglednicah I in II. Najprej smo iskanje izvedli v največji podatkovni zbirki kliničnih preskušanj Clinicaltrials.gov (16). Nato pa smo iskanje razširili tudi na podatkovni zbirki Cochrane library in MEDLINE (17, 18). Pri terapevtski uporabi eksosomov smo v omenjenih bibliografskih zbirkah iskali klinična preskušanja, pri diagnostični uporabi pa opazovalne klinične raziskave.
Preglednica I: Iskalni profili terapevtske uporabnosti eksosomov za posamezne bibliografske zbirke.
Podatkovna baza Iskalni nizi
Clinicaltrials.gov Condition or disease: Other terms:
/ exosomes
Cochrane library (cell exosomes or cell derived exosomes) and clinical trials MEDLINE (cell exosomes or cell derived exosomes) and clinical trials
Preglednica II: Iskalni profili diagnostične uporabnosti eksosomov za posamezne bibliograske zbirke.
Podatkovna baza Iskalni nizi
Clinicaltrials.gov Condition or disease: Other terms:
cancer exosomes
Cochrane library exosomes and diagnostics and (prostate cancer or lung cancer) MEDLINE exosomes and diagnostics and (prostate cancer or lung cancer) and
clinical study
3. 1. 2. Raziskovalno vprašanje
Pred iskanjem želene literature smo za vsako izbrano področje posebej določili vključitvene in izključitvene kriterije, ki so predstavljeni v Preglednicah III in IV.
Preglednica III: Vključitveni in izključitveni kriteriji na področju terapevtske uporabnosti eksosomov.
Vključitveni kriteriji Izključitveni kriteriji
Populacija Bolniki z različnimi
bolezenskimi stanji, zdravi ljudje
Raziskave na živalih, raziskave in vitro
Intervencija Človeški eksosomi,
spremenjeni človeški eksosomi, pripravki, ki vsebujejo človeške eksosome
Rastlinski eksosomi
Jezik Angleščina Drugi jeziki
Preglednica IV: Vključitveni in izključitveni kriteriji na področju diagnostične uporabnosti eksosomov.
Vključitveni kriteriji Izključitveni kriteriji
Populacija Bolniki z rakavimi obolenji prostate ali pljuč
Raziskave na živalih, raziskave in vitro Intervencija Iskanje novih diagnostičnih
označevalcev,
kombinacija eksosomov z drugimi označevalci, vrednotenje morebitnih diagnostičnih testov na podlagi eksosomov
Jezik Angleščina Drugi jeziki
3. 1. 3. Izbor člankov
Po iskanju smo pregledali naslove vseh zadetkov ter izključili tiste raziskave, ki niso bile povezane z našim raziskovalnim vprašanjem, pregledne članke ter študije, ki so bile izvedene na živalih ter v pogojih in vitro. Izločili smo tudi tiste raziskave, ki niso bile objavljene v angleškem jeziku. Po prvem izboru smo natančno prebrali povzetke preostalih člankov in ponovno izločili vse, ki niso bili povezani z našim raziskovalnim vprašanjem ter preostale pregledne članke. Vse izbrane smo nato prebrali v celoti in izločili dvojnike.
3. 1. 4. Zbiranje podatkov kliničnih raziskav terapevtske uporabe eksosomov
Po pregledu objavljenih izsledkov kliničnih preskušanj smo iz vsake objave izbrali podatke o: registracijski številki raziskave, državi preskušanja, številu preiskovancev ter njihovi bolezni oz. zdravstvenem stanju, vrsti uporabljenih eksosomov oz. pripravkov, ki so jih vsebovali, zasnovi raziskave (slepljenje, randomizacija, enoskupinsko/večskupinsko preskušanje), fazi preskušanja, trajanju, načinu aplikacije eksosomov in statusu raziskave.
3. 1. 5. Zbiranje podatkov kliničnih raziskav diagnostične uporabe eksosomov Ob pregledu v literaturi objavljenih kliničnih preskušanj diagnostične uporabe eksosomov smo zbrali podatke o: registracijski številki raziskave, državi klinične raziskave, številu preiskovancev ter njihovi bolezni (rak prostate ali rak pljuč), vrsti uporabljenih bioloških vzorcev, vrsti diagnostičnega označevalca oz. uporabljenega diagnostičnega testa, vrsti klinične raziskave, njenem trajanju ter statusu.
4. REZULTATI
4. 1. Iskanje objavljenih raziskav terapevtske uporabnosti človeških eksosomov
Sistematični pregled literature, ki obravnava terapevtsko uporabo eksosomov, smo izvedli v drugi polovici marca 2021. Najprej smo preverili podatkovno bazo Clinicaltrials.gov, kjer smo z iskalnim nizom »exosomes« pridobili 211 zadetkov. Po nastavitvi filtra, ki uravnava status raziskave, smo izločili 6 raziskav, ki so bile ustavljene zaradi različnih vzrokov. Po pregledu preostalih zadetkov pa smo izločili tudi tiste, ki očitno niso bili povezani z našim raziskovalnim vprašanjem, področjem diagnostike, ter tiste, ki so se ukvarjale z rastlinskimi eksosomi ali so bile izvedene v pogojih in vitro. V tem koraku smo izločili 178 raziskav. V nadaljevanju smo natančno prebrali povzetke preostalih 27 ter izločili še 2 raziskavi.
Iskanje smo nadaljevali v zbirki Cochrane library, in sicer z iskalnim nizom »(cell exosomes or cell derived exosomes) and clinical trials«. Skupaj smo dobili 79 zadetkov.
Po pregledu smo izločili 69 raziskav, ki niso izpolnjevale naših vključitvenih kriterijev.
Po pregledu preostalih 10 smo jih izločili 7.
V spletni podatkovni bazi MEDLINE smo z iskalnim nizom »(cell exosomes or cell derived exosomes) and clinical trials« dobili skupno 185 zadetkov. S pomočjo filtra smo izločili 2 objavi, ki nista bili v angleškem jeziku, pri preostalih pa smo pregledali naslove in izločili 98 objav. Nato smo prebrali povzetke 85 zadetkov in izločili 82 raziskav ter odstranili dvojnike. Temu je sledil podroben pregled preostalih raziskav.
Eno raziskavo, ki izpolnjuje naše vključitvene kriterije smo med pisanjem uvoda zasledili v preglednem članku in jo naknadno vključili v nadaljnjo analizo (19). Postopek sistematičnega pregleda literature je predstavljen na Sliki 3.
Slika 3: Shematski prikaz pregleda in izbora člankov, ki obravnavajo terapevtsko uporabo človeških eksosomov.
4. 2. Iskanje objavljenih raziskav diagnostične uporabnosti eksosomov
Pregled objav, ki proučujejo diagnostične uporabnosti eksosomov, smo izvedli v drugi polovici maja 2021 in se zaradi velikega števila kliničnih raziskav na tem področju odločili, da bomo analizirali le dve tematski področji, rakava obolenja prostate in pljuč.
Zadetke smo razvrstili glede na pogostost študij, ki se ukvarjajo z rakavimi obolenji. V bazi Clinicaltrials.gov smo iskali s ključno besedo »exosomes«. Ta baza pa ima tudi možnost nastavitve filtra, da lahko sočasno iščemo zadetke tudi za določeno bolezen oz.
zdravstveno stanje, v našem primeru smo v ta namen uporabili ključno besedo »cancer«.
Tako smo dobili 101 zadetek, po nastavitvi filtra pa smo izločili 4 raziskave, ki so bile ustavljene. Po pregledu naslovov zbranih raziskav smo izločili tiste, ki niso izpolnjevale vključitvenih kriterijev. Takih je bilo 37. Nadalje smo raziskave razvrstili po pogostosti.
Največ je bilo takih, v okviru katerih so obravnavali rakava obolenja prostate in pljuč, sledila so rakava obolenja trebušne slinavke, kolorektalni raki, ter rak dojk. Izločili smo 34 raziskav, ki se navezujejo na druga rakava obolenja oz. bolezni. Nato smo pregledali povzetke preostalih raziskav ter izločili 4 s področja diagnostike raka prostate, ki niso bile povezane z raziskovalnim vprašanjem, ter 4 s področja pljučnega raka, pri čemer je bila ena od teh podvojena.
Iskanje smo nadaljevali v spletni bazi Cochrane library, kjer smo z iskalnim nizom
»exosomes and diagnostics and (prostate or lung cancer) and clinical study« dobili 4 zadetke, v nadaljevanju pregleda pa od teh izločili 3.
V podatkovni bazi MEDLINE smo iskali z enakim iskalnim nizom kot v Cochrane library in dobili 14 zadetkov. Od teh smo izločili 3, ki se niso navezovali na naše področje oz. so bili v obliki preglednega članka. Nato smo pregledali povzetke ostalih raziskav ter izločili dvojnike. Potek tega dela sistematičnega pregleda literature je shematsko predstavljen na Sliki 4.
Slika 4: Shematski prikaz pregleda in izbora člankov, ki obravnavajo diagnostično uporabo človeških eksosomov.
4. 3. Rezultati kliničnih raziskav terapevtske uporabe eksosomov
4. 3. 1. Porazdelitev kliničnih preskušanj po državah
Klinične raziskave, ki proučujejo terapevtsko uporabnost človeških eksosomov, smo razvrstili glede na države v katerih ta preskušanja potekajo oziroma so potekala (Graf 1).
Največ tovrstnih raziskav so izvedli na Kitajskem, 8 (27%), sledijo ZDA s 7 (23%,), Francija s 3 (10%), Egipt z 2 (7%), Rusija z 2 (7%) ter Indonezija, Iran, Izrael, Japonska, Južna Koreja in Turčija s po 1 (3%). Pri 2 kliničnih raziskavah (7%) pa lokacija ni bila navedena. Skupno je zajetih 30 kliničnih preskušanj.
Graf 1: Porazdelitev števila kliničnih preskušanj terapevtske uporabe eksosomov po državah (marec 2021).
4. 3. 2. Število sodelujočih v kliničnih preskušanjih po državah
Največje število sodelujočih v kliničnih raziskavah je v ZDA, in sicer 516 (35,8%) ter na Kitajskem, 400 (27,7%), sledi pa Rusija s 120 (8,3%) (Graf 2). V ostalih študijah v posamezni državi sodeluje <100 ljudi, lokacija izvajanja kliničnih študij pa ni bila podana za 130 (9%) preiskovancev. V vseh preskušanjih je skupno sodelovalo 1442 oseb.
Povprečno je torej v tovrstne študije vključenih 48,1 oseb.
7 3
2 1 1 1
1 1 1 2
8
Graf 2: Prikaz porazdelitve števila preiskovancev, vključenih v klinične študije terapevtske uporabe eksosomov, po posameznih državah (marec 2021).
4. 3. 3. Porazdelitev kliničnih preskušanj glede na vrsto bolezni oziroma zdravstvenega stanja
Za razvrstitev bolezni smo uporabili avstralsko modifikacijo 10. revizije Mednarodne klasifikacije bolezni in drugih zdravstvenih problemov (MKB-10AM, verzija 6), ki jo trenutno uporabljamo v Sloveniji (20). Večina kliničnih preskušanj, 10 (33,3%), poteka na področju bolezni dihal, pri čemer jih je kar 8 povezanih z zdravljenjem akutne dihalne stiske (ARDS; ang. accute respiratory distress syndrom) pri COVID-19. Sledi skupina neoplazem, s 6 (20%) študijami, v kateri so različne vrste rakavih obolenj, v kategorijo ostalo (2 primera ali 6,7%,) pa smo uvrstili klinično preskušanje eksosomov na zdravih preiskovancih ter primer tovrstnega eksperimentalnega zdravljenja oseb s sindromom množične odpovedi organov (MODS; ang. multiple organ dysfunction syndrome).
Izbrane klinične študije glede na vrste bolezni, smo predstavili tudi grafično (Graf 3).
516
400 130
120 78
60
38 35 30 25 5 5
ZDA Kitajska Ni podano Rusija Francija Turčija Indonezija Izrael Egipt Južna Koreja Iran Japonska
Graf 3: Prikaz porazdelitve števila kliničnih preskušanj eksosomov, glede na vrsto bolezni oz. zdravstveno stanje (marec 2021).
4. 3. 4. Porazdelitev kliničnih preskušanj glede na izvor eksosomov
V večini izbranih kliničnih preskušanj, in sicer v 16 (53,3%), so proučevali uporabo eksosomov, pridobljenih iz MMC. Mednje smo uvrstili tudi študijo, v kateri so uporabili pripravek iz samih MMC ter dve, v okviru katerih so proučevali terapevtski potencial zunajceličnih veziklov MMC. Posebej smo obravnavali 2 študiji (6,7%), kjer sicer preskušajo eksosome iz MMC, vendar pa so ti obogateni z RNA (KRAS G12D siRNA;
miRNA-124). Naslednjo skupino predstavljajo spremenjeni eksosomi iz dendritičnih celic (DC), v katero smo uvrstili 4 raziskave (13,3%), kjer so raziskovalci v eksosome vstavili različne tumorske antigene (MAGE; MAGE-3; MART1; MAGE-3 DP04, MAGE-1 A2, MAGE-3 A2, NY-ESO-1 A2, MART-1 A2). Pri 2 kliničnih raziskavah (6,7%) ni bilo navedenih podatkov o izvoru oz. vrsti eksosomov. V 1 (3,3%) klinični raziskavi, in sicer EXO-24, so eksosome pridobili iz celic T-REx™-293, ki so jih gensko spremenili tako, da so povečale površinsko izražanje molekul CD24 (sialoglikoprotein, izražen na zrelih granulocitih in limfocitih B, ki uravnava rastne in diferenciacijske signale za ti vrsti celic).
Vse vrste eksosomov, ki so jih uporabili oz. jih uporabljajo v izbranih raziskavah, so predstavljene na Grafu 4.
10
6 3
3 2 1 1
1 1
1 1 1 1
Bolezni dihal Neoplazme Bolezni živčevja Bolezni kože in podkožja Ostalo
Bolezni prebavil
Bolezni očesa in adneksov
Duševne in vedenjske motnje, bolezni živčevja
Prirojene malformacije, deformacije in kromosomske nepravilnosti
Okvare veke, solzil in očnice Bolezni obtočil
Endokrine, prehranske (nutricijske) in presnovne (metabolične) bolezni Duševne in vedenjske motnje
Graf 4: Prikaz porazdelitve kliničnih preskušanj glede na izvor oz. vrsto proučevanih eksosomov (marec 2021).
4. 3. 5. Porazdelitev kliničnih preskušanj glede na njihovo zasnovo in fazo Zaslepitev
Večina izbranih kliničnih preskušanj je odprtega tipa (17; 56,7%). Enojno slepih ter dvojno slepih je skupaj 10 (33,4%), pri 4 študijah (13,3%) pa podatkov o zaslepitvi nismo zasledili (Graf 5). Ena študija, ki je odprta v prvem delu ter dvojna slepa v drugem, je uvrščena v obe skupini.
Graf 5: Prikaz porazdelitve kliničnih preskušanj glede na zaslepitev (marec 2021).
16
4 2
2 1
1 1
1 1 1 Eksosomi iz MMC
Spremenjeni eksosomi iz DC Spremenjeni eksosomi iz MMC Ni podano
EXO-24
Zofin (pripravek iz amnijske tekočine)
Zunajcelični vezikli iz kostnega mozga
Eksosomi iz krvne plazme Eksosomi iz T celic
Eksosomi iz acsitesa in GM-CSF
17 8
4
2
Odprta
Dvojno slepa
Ni podano
Enojno slepa
Randomizacija
Večina preskušanj je bilo nerandomiziranih (17; 56,7%), 11 randomiziranih (36,7%), za 2 (6,7%) pa podatkov o randomizaciji nismo zasledili (Graf 6).
Graf 6: Prikaz porazdelitve preskušanj glede na randomizacijo kliničnih študij (marec 2021).
Enoskupinska in večskupinska klinična preskušanja
Število enoskupinskih preskušanj je bilo 16 (53,3%), večskupinskih pa 14 (Graf 7). Pri 9 raziskavah (30%) so vključili tudi kontrolno skupino.
Graf 7: Prikaz števila enoskupinskih in večskupinskih kliničnih preskušanj (marec 2021).
17 11
2
Nerandomizirana Randomizirana Ni podano
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Enoskupinska Večskupinska
Številopreskušanj
Faze kliničnih preskušanj
Večina kliničnih raziskav, 12 (40%) je potekala oz. poteka v fazi I in fazi I/II (9; 30%).
Štiri preskušanja (13,3%) sodijo v fazo II, v fazo II/III pa 1 (3,3%). Za 4 raziskave (13,3%) nismo našli podatkov o fazi preskušanja. Omenjeni podatki so slikovno prikazani na Grafu 8.
Graf 8: Prikaz porazdelitve kliničnih preskušanj glede na njihovo fazo (marec 2021).
4. 3. 6. Trajanje kliničnih preskušanj
Graf 9 prikazuje trajanje vsakega od izbranih 29 kliničnih preskušanj, in sicer glede na vrsto oz. izvor eksosomov, ki so bili uporabljeni. V povprečju je raziskava trajala 1,9 let.
Za 1 klinično preskušanje podatki niso bili podani. Za raziskave, ki še potekajo oz. se še niso začele, pa smo uporabili podatke o predvidenem začetku in koncu študije. Zaporedje kliničnih preskušanj na Grafu 9 sovpada z vrstnim redom raziskav v Preglednici V (1 na Grafu 9 je NCT04798716 v Preglednici V, itd. ).
0 2 4 6 8 10 12 14
Faza I Faza I/II Faza II Faza II/III Ni podano
Število preskušanj
Graf 9: Predstavitev trajanja kliničnih preskušanj glede na vrsto oz. izvor eksosomov (marec 2021).
Legenda:
▪ Eksosomi iz MMC
▪ Spremenjeni eksosomi iz MMC
▪ EXO-24
▪ Zofin (pripravek iz amnijske tekočine)
▪ Zunajcelični vezikli iz kostnega mozga
▪ Eksosomi iz krvne plazme
▪ Eksosomi iz limfocitov T
▪ Spremenjeni eksosomi iz DC
▪ Eksosomi iz acsitesa in GM-CSF
▪ Vrsta eksosomov ni podana
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 2022 2023 2024 2025 2026 2027 2028 2029 2030
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Leto
Vrstni red preskušanj
27
4. 3. 7. Splošni podatki o izbranih kliničnih študijah terapevtske uporabe eksosomov in njihovih osnovnih lastnostih.
Preglednica V: Lastnosti posameznih kliničnih raziskav terapevtske uporabe človeških eksosomov.
Oznaka Naslov klinične raziskave Država Vrsta raziskave Bolezen Št.
udel.
Vir EXO
Aplikacija Status razisk.
(2021) NCT04798716 The use of exosomes for the
treatment of acute respiratory distress syndrome or novel coronavirus pneumonia caused by COVID-19 (21)
ZDA Randomizirano, večskupinsko klinično preskušanje, odprto v prvem delu, dvojno slepo v drugem
COVID- 19, ARDS, kovidna pljučnica
55 MMC Intravenska Zbiranje prostovoljcev se še ni začelo
NCT04602442 Safety and efficiency of method of exosome inhalation in COVID-19 associated pneumonia (22)
Rusija Randomizirano večskupinsko, dvojno slepo klinično preskušanje
COVID- 19, ARDS, kovidna pljučnica
90 MMC Inhalacija Vključevanje s povabilom
NCT04602104 A clinical study of mesenchymal stem cell exosomes nebulizer for the treatment of ARDS (23)
Kitajska Randomizirano večskupinsko, dvojno slepo klinično preskušanje
ARDS 169 MMC Inhalacija Zbiranje
prostovoljcev se še ni začelo
NCT04544215 A clinical study of mesenchymal progenitor cell exosomes nebulizer for the treatment of pulmonary infection (24)
Kitajska Randomizirano večskupinsko, dvojno slepo klinično preskušanje
Pljučna okužba s po Gramu neg. bacili
60 MMC Inhalacija Zbiranje
prostovoljcev
28
Oznaka Naslov klinične raziskave Država Vrsta raziskave Bolezen Št.
udel.
Vir EXO
Aplikacija Status razisk.
(2021) NCT04491240 Evaluation of safety and
efficiency of method of exosome inhalation in SARS- CoV-2 associated pneumonia (25)
Rusija Randomizirano večskupinsko, dvojno slepo preskušanje
COVID-19, kovidna pljučnica
30 MMC Inhalacija Zaključena
(statistična analiza rezultatov ni podana) NCT04388982 The safety and the efficacy
evaluation of allogenic adipose MSC-exos in patients with Alzheimer's disease (26)
Kitajska Nerandomizirano, večskupinsko, odprto klinično preskušanje
Alzheimerjeva bolezen
9 MMC Nazalna Zbiranje
prostovoljcev
NCT04356300 Exosome of mesenchymal stem cells for multiple organ dysfuntion syndrome after surgical repaire of acute type A aortic dissection (27)
/ Randomizirano,
večskupinsko, enojno slepo klinično
preskušanje
MODS 60 MMC Intravenska Zbiranje
prostovoljcev se še ni začelo
NCT04313647 A tolerance clinical study on aerosol inhalation of mesenchymal stem cells exosomes in healthy volunteers (28)
Kitajska Nerandomizirano, večskupinsko, odprto klinično preskušanje
Zdravi prostovoljci
27 MMC Inhalacija Zbiranje
prostovoljcev
NCT04276987 A pilot clinical study on inhalation of mesenchymal stem cells exosomes treating severe novel coronavirus pneumonia (29)
Kitajska Enoskupinsko, odprto klinično preskušanje
COVID-19, kovidna pljučnica
24 MMC Inhalacija Zaključena
(rezultati še niso objavljeni)
29
Oznaka Naslov klinične raziskave Država Vrsta raziskave Bolezen Št.
udel.
Vir EXO Aplikacija Status razisk.
(2021) NCT04270006 Evaluation of adipose derived
stem cells exosomes in treatment of periodontitis (30)
Egipt Enoskupinsko, odprto klinično preskušanje
Periodontitis 10 MMC Lokalna
aplikacija
Zbiranje prostovoljcev
NCT04213248 Effect of UMSCs derived exosomes on dry eye in patients with cGVHD (31)
Kitajska Enoskupinsko, odprto klinično preskušanje
Bolezen suhega očesa pri reakciji presadka proti gostitelju
27 MMC Okularna
aplikacija
Zbiranje prostovoljcev
NCT04173650 MSC EVs in dystrophic epidermolysis bullosa (32)
/ Enoskupinsko,
odprto klinično preskušanje
Bulozna epidermoliza
10 AGLE-102
(proizvod z zunajceličnimi vezikli iz MMC)
Topikalna aplikacija
Zbiranje prostovoljcev se še ni začelo
NCT04134676 Therapeutic potential of stem cell conditioned medium on chronic ulcer wounds (33)
Indonezija Enoskupinsko, odprto klinično preskušanje
Kronične rane kože
38 Zunajcelični vezikli iz gojišča MMC
Topikalna aplikacija
Zaključena
(rezultati še niso
objavljeni) NCT03437759 MSC-Exos promote healing of
MHs (34)
Kitajska Randomizirano, večskupinsko, enojno slepo klinično preskušanje
Luknja makule
44 MMC Okularna
aplikacija
Zbiranje prostovoljcev
