Vrednotenje stabilnosti AP v dolgotrajni študiji

V drugem delu magistrske naloge smo izbrali sisteme, ki so v preliminarni študiji najboljše stabilizirali AP in jih vgradili v širši nabor sistemov. Dodatek vitamin C kot AO in sistemi z višjo koncentracijo učinkovine (5 in 10 % (m/m)) so najbolj stabilizirali AP, zato smo jih izdelali v širšem spektru sistemov z enakim razmerjem lipofilne faze in PAS ter različnimi deleži vode, in sicer v TK1, TK3, TK5, TK8 in SMES. Pospešeno stabilnostno študijo smo izvedli v klimatski komori pri 40 °C in 75 % RV, brez prisotnosti svetlobe ter vrednotili stabilnost AP s pomočjo HPLC metode ob času 0, 1, 3, 4, 6 in 8 tednov.

Pri vseh sistemih TK smo opazili enak trend naraščanja stabilnosti od TK8 do TK1 (Slika 23 – 26, ki povzemajo podatke, ki se nahajajo v Preglednici A (Priloga)). Delež ne razpadlega AP je v formulacijah s TK1 po 8 tednih znašal med 13 % (1 % (m/m) AP) in 36

% (stabilizacija z vit. C) ter v formulacijah s TK8 med 6 % (1 % (m/m) AP) in 15 % (10 % (m/m) AP). Na podlagi tega lahko sklepamo, da je AP v sistemih z manjšim deležem vode bolj stabilen. Špiclin in sodelavci, ki so določali stabilnost AP v ME, so ugotovili, da je razlog za večjo stabilnost v razporeditvi molekul AP. Različne koncentracije AP so vgradili v različne tipe ME, in sicer O/V ali V/O ter vzorce shranjevali zaščitene pred svetlobo na sobni temperaturi 28 dni. Višjo stabilnost so dosegli v sistemih z manjšim deležem vode (V/O ME). Ugotovili so, da se molekule AP na medfazi razporedijo tako, da je palmitinski del orientiran proti lipofilni fazi ter obroč proti hidrofilni fazi. Obroč, ki je občutljiv na oksidacijo, se nahaja v vodni fazi, zato je količina raztopljenega kisika v tej fazi izredno pomembna. Prišli so do zaključka, da je razgradnja AP v sistemih z večjim deležem vode (ME O/V) večja, saj se v njih raztopi več kisika, ki ga destabilizira (54). Naši

36

rezultati so v skladu z nedavno izvedeno študijo, kjer so dokazali enak trend naraščanja stabilnosti AP od TK8 do TK1. Upad stabilnosti AP pri večjem deležu vode so razlagali z možnostjo raztapljanja večjih količin kisika v intralamelarnem področju in s tem večjim vplivom na oksidacijo in razgradnjo AP (12).

Slika 23:Primerjava stabilnosti AP v sistemih z 1 % AP in 1 % vitaminom C.

Slika 24: Primerjava stabilnosti AP v sistemih s 5 % AP.

0

37

Slika 25: Primerjava stabilnosti AP v sistemih z 10 % AP.

Slika 26: Primerjava stabilnosti AP v sistemih z 1 % AP, ki je referenčni sistem.

Če primerjamo referenčni sistem (1 % (m/m) AP) s stabiliziranimi (5 in 10 % (m/m) AP ter vit. C) opazimo, da smo dosegli bistveno izboljšanje stabilnosti, saj je delež ne razpadlega AP po osmih tednih pri referenčnem znašal 13 % (TK1) pri stabiliziranih pa med 33 – 36 % (TK1). Rezultati so potrdili našo predpostavko, da bo stabilnost AP naraščala s povečanjem

0

38

deleža začetne koncentracije AP. Razlog temu je lahko višja viskoznost, ki s povečevanjem deleža AP v TK narašča (73). Višja viskoznost TK namreč upočasni difuzijo kisika in s tem oksidativno razgradnjo AP, zaradi tega so sistemi z višjo viskoznostjo bolj stabilni (12, 64).

Ugotovitve ostalih raziskav pav tako kažejo, da je stabilnost AP boljša v sistemih z večjim deležem vgrajenega AP (54, 69, 74). Špiclin in sodelavci so določali stabilnost različnih koncentracij AP (0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,50; 2,00 % (m/m)) v O/V in V/O ME zaščitenih pred svetlobo, na sobni temperaturi. Stabilnost 2 % (m/m) AP v V/O ME je bila po 28 dneh dvakrat višja od stabilnost 1 % (m/m) AP v V/O ME. Enak trend je veljal tudi pri sistemih O/V, kjer je stabilnost naraščala od najnižje do najvišje koncentracije AP (54).

Teeranachaideekul in sodelavci so potrdili, da višje koncentracije AP vgrajenega v NLC, doprinesejo h kemijski stabilnosti AP. Predpostavili so, da je pri višjih koncentracijah prišlo do večje vgradnje AP v lipidni matriks, kjer je bila zaščita pred vplivom kisika večja (69). Z vgradnjo višje koncentracije AP v O/V ME so dosegli stabilizacijo AP v sistemu tudi Rachmat in sodelavci. Ti so med drugim določali kemijsko stabilnost 1 % in 2 % (m/m) AP v ME, shranjevanega pri 40 °C. Po dveh mesecih je stabilnost vzorca z 1 % (m/m) AP znašala 21,65 %. Stabilnost vzorca z 2 % (m/m) AP pa je znašala 43,91 % (74). Na podlagi tega lahko zaključimo, da sistemi z višjo koncentracijo AP izkazujejo bistveno izboljšanje stabilnosti AP v formulaciji.

Dolgotrajna stabilnost AP je odvisna od sestave koloidnega disperznega sistema in razporeditve ZU v njem. Ker je v hidrofilnem okolju AP občutljiv na oksidacijo, je stabilnost slednjega najvišja v sistemih z najmanjšim vplivom hidrofilnega okolja (65). Lamelarni TK so sestavljeni iz izmenjujočih dvoslojev in intralamelarnega področja. Ker je AP amfifilna molekula, se delno porazdeljuje med dvosloje in delno v intralamelarno področje (1).

Predpostavili smo, da z večanjem deleža AP v sistemu, slednji v večji meri porazdeli v dvosloje in zmanjša interakcije z vodo, s čimer se zmanjša vpliv kisika, ki je tam prisoten.

Opazimo lahko tudi, da je sprememba 1 % na 5 % (m/m) AP bistveno doprinesla k stabilnosti. Če primerjamo sistema 5 in 10 % (m/m) AP razberemo, da je njuna stabilnost primerljiva. Sklepamo, da se stabilnost s povečevanjem koncentracije AP viša do določene koncentracije, nato pa doseže plato oz. nima več bistvenega vpliva.

Iz rezultatov dolgotrajne stabilnostne študije lahko razberemo, da je bil delež ne razpadlega AP v stabiliziranih sistemih TK1 po enem tednu znašal približno 90 %, po štirih tednih 60 % in po osmih tednih 35 %. Če pridobljene rezultate primerjamo z deležem ne razpadlega

39

AP po osmih tednih z 1 % (m/m) AP v TK1 (13 %) ugotovimo, da smo uspešno dosegli skoraj trikratno stabilizacijo AP (Slika 27).

Slika 27: Primerjava stabilnosti AP v sistemih TK1.

Podobne rezultate smo dobili tudi pri ostalih sistemih, in sicer pri TK3 in TK5 je delež ne razpadlega AP po osmih tednih pri stabiliziranih sistemih znašal med 18 in 25 %, pri referenčnemu (1 % (m/m) AP) pa med 4 in 5 %. Tudi pri sistemih T8 opazimo izboljšanje stabilnosti, kjer je delež ne razpadlega AP po osmih tednih znašal med 10 in 15 % pri stabiliziranih sistemih in 6 % pri referenčnem sistemu (Slika 28).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Vsebnost AP (%)

Čas (tedni)

TK1

C 5%

10%

40

Slika 28: Primerjava stabilnosti AP v sistemih TK8.

Poleg različnih sistemov TK, smo pripravili tudi sistem SMES, ki za razliko od TK ni vseboval vode, ampak le emulgatorsko zmes in lipofilno fazo. Iz rezultatov študije lahko razberemo, da je bila pri sistemih z 1 % (m/m) AP stabilnost AP v vseh časovnih točkah najslabša v SMES (Slika 29). Sklepamo lahko, da je AP bolj stabilen v TK, najverjetneje zaradi večje viskoznosti TK (47,3 Pas (TK1) pri 25 °C) napram SMES (8,2 Pas pri 25 °C) (12). V TK pride do tvorbe vodikovih vezi med hidrofilno glavo fosfatidilholina v lecitinu in vodo ter posledično do nabrekanja lecitina in povečanja konsistence, kar upočasni difuzijo kisika in s tem razgradnjo AP (48). Dodaten doprinos k stabilnosti ima že sama zgradba TK, ki zaščiti AP pred razgradnjo.

Nasprotne rezultate pa smo dobili v stabiliziranih sistemih. V primeru sistemov s 5 in 10 % (m/m) AP je bila stabilnost slednjega najvišja v SMES, kjer je delež ne razpadlega AP po osmih tednih znašal 50 % pri 10 % (m/m) AP in 39 % pri sistemu s 5 % (m/m) AP.

Potencialni vpliv na višje stabilnosti AP v SMES bi lahko imelo povečanje viskoznosti pri višjih začetnih koncentracijah AP. V okviru predhodnih raziskav na Katedri za farmacevtsko tehnologijo so v sklopu diplomske naloge z naslovom Vrednotenje koloidnih sistemov z lecitinom za dermalno dostavo AP izvedli tudi meritve viskoznosti za SMES (izdelan iz IPM, lecitina, Tween-a 80 in butanola) z višjim deležem AP. Ugotovili so, da 1 % (m/m) AP v SMES nima bistvenega vpliva na viskoznost in posledično na konsistenco nosilnega

41

sistema, medtem ko je maksimalni delež vgrajenega AP (6,9 % (m/m)) bistveno poveča viskoznost sistemov (73).

Pri sistemu z dodanim vitaminom C pa se je stabilnost AP v SMES gibala med TK1 in TK3.

Iz rezultatov študije lahko potrdimo, da je vitamin C znatno izboljšal stabilnost AP v SMES, saj je delež ne razpadlega AP po osmih tednih znašal 29 %. Pri sistemu z 1 % AP brez dodanega AO pa je ta delež znašal 1,2 %. Vpliv stabilizacije z AO je tako bolj izrazit pri SMES, saj so TK že sami po sebi sposobni zaščititi ZU pred razgradnjo.

Odsotnost vode v SMES je prav tako lahko eden izmed dejavnikov, ki zmanjša vpliv oksidativnega razpada AP in doprinese k višji stabilnost in je še toliko bolj izrazit pri stabiliziranih sistemih (Slika 29).

Slika 29: Primerjava stabilnosti AP v sistemih SMES.

Kristl in sodelavci so izvedli stabilnostno študijo, pri kateri so 1 % (m/m) AP vgradili v SLN, ME tipa O/V in V/O ter liposome, vzorce pa so starali pri sobni temperaturi, zaščitene pred svetlobo. Po štirih tednih staranja je delež ne razpadlega AP v V/O ME znašal 19 %, v O/V ME 13 %, v liposomih iz nehidrogeniranega sojinega lecitina 26 %, v liposomih iz hidrogeniranega sojinega lecitina 7 % in v SLN 25 % (65). V okviru naše stabilnostne študije smo do četrtega tedna staranja pri 40 °C in 75 % RV dosegli večjo stabilnost AP v TK (med 39 % in 63 %). V drugem delu študije so Kristl in sodelavci želeli izločiti vpliv kisika in ustvariti inertno atmosfero, kjer so kisik zamenjali z argonom. V sisteme O/V in V/O ME so vgradili 2 % (m/m) AP in primerjali stabilnost v atmosferi s prisotnim kisikom napram

42

argonu. Delež ne razpadlega AP po štirih tednih staranja v inertni atmosferi na sobni temperaturi je v O/V ME znašal približno 53 % (v atmosferi s prisotnim kisikom pa 28 %), v V/O ME 40 % (m/m) (v atmosferi s prisotnim pa kisikom 37 %). Opazimo lahko, da je stabilnost AP v inertni atmosferi znatno izboljšana, saj se zmanjša razgradnja zaradi oksidacije (65).

V nedavni študiji so prav tako poskušali povečati stabilnost AP, zato so slednjega vgradili v NLC in preučevali vpliv lipidov, PAS, pogojev shranjevanja, inertnosti atmosfere, začetne koncentracije AP in dodatek AO na stabilnost AP. Najvišjo stabilnost so dosegli v NLC z vgrajenim pri 6 % (m/m) AP in dodanimi AO (vitamin E, BHT, butilhidroksianizol), ki so bili shranjevani v inertni atmosferi (dušik) pri 4 °C. Delež ne razpadlega AP je po 90ih dneh znašal približno 95 % in več kot 80 % pri tistih, ki so bili shranjevani na sobni temperaturi (69). Inertna atmosfera in trdno agregatno stanje omenjenih sistemov dodatno zmanjšata vpliv kisika, kar privede do manjše razgradnje AP v primerjavi s TK.

Ugodni vpliv na stabilnost AP v NLC in SLN so dokazali tudi Űner in sodelavci. Izvedli so stabilnostno študijo, kjer so v nanoemulzije, SLN in NLC vgradili 1 % (m/m) AP in vzorce starali pri 40 °C znotraj treh mesecev. Po 8 tednih staranja je bila stabilnost AP v sistemih med 58 % in 62 % (75). Če primerjamo rezultate omenjene študije z rezultati naše 8 tedenske študije, kjer je stabilnost AP v stabiliziranih TK1 sistemih znašala med 59 % in 63 %, lahko rečemo, da smo dosegli primerljivo stabilnost AP.

43 5.3 Kinetično ovrednotenje razgradnje AP

Izračunali smo kinetike kemijskih reakcij razgradnje AP in dokazali, da sledi 1. redu, saj je bil R² blizu vrednosti 1 (Preglednica IV).

Za reakcije prvega reda je značilno, da je hitrost sorazmerna koncentraciji reaktanta (AP) in se zato s časom spreminja. Večja kot je konstanta kemijske reakcije, hitrejša je razgradnja ZU. Pri večjih deležih vode opazimo večje konstante reakcijskih hitrosti, kar kaže na nižjo stabilnost AP (Slika 30). Sklepamo lahko na padajočo stabilnost AP v odvisnosti od deleža vode od TK1 do TK8.

Preglednica IV: Konstante reakcijske hitrosti (k1) in R² za 1. red kinetike kemijskih reakcij v sistemih TK in SMES. (vrednost konstante 0,0118 – 0,0334 d^-1) dosegli najvišjo stabilizacijo, glede na sisteme z 1 % (m/m) AP (vrednost konstante 0,0363 – 0,0792 d^-1). Konstante stabiliziranih SMES sistemov so nizke (0,0118 – 0,0221 d^-1), kar nakazuje na visoko stabilnost. V primeru sistemov z 1 % (m/m) AP, pa je stabilnost AP v SMES najslabša (0,0792 d^-1).

44

Pri 1. redu reakcij povišanje začetne koncentracije AP nima vpliva na razpolovni čas, kar tudi opazimo pri sistemih s 5 in 10 % (m/m) AP, ki imajo primerljive vrednosti konstant reakcijskih hitrosti pri različnih deležih vode.

Slika 30: Vrednosti konstant reakcijskih hitrosti 1. reda, glede na delež vode v štirih sistemih TK: TK1 – 20 %, TK3 – 30 %, TK5 – 40 %, TK8 – 55 %.

Naše rezultate referenčnih vzorcev (1 % (m/m) AP) lahko primerjamo z rezultati študije, ki je bila nedavno izvedena na Fakulteti za farmacijo, kjer so prav tako določali kinetiko reakcijske hitrosti TK1 – TK8 z 1 % (m/m) AP. Določili so, da koncentracija AP upada po 1. redu reakcije. Vrednosti konstant so pri 1 % (m/m) AP naraščale od TK1 do TK8 (0,023 – 0,0431 d^-1) z najvišjo vrednostjo konstante za SMES (0,043 d^-1) (12).

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07

0 10 20 30 40 50 60

Konstanta reakcijske hitrosti (d-1)

Delež vode (%)

Konstanta reakcijske hitrosti (1. red) v odvisnosti od deleža vode

1%

vit.C 5%

10%

45