UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
MAJA BADOVINAC MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
MAJA BADOVINAC
STABILIZACIJA ASKORBILPALMITATA V LAMELARNIH TEKOČIH KRISTALIH
STABILIZATION OF ASCORBYL PALMITATE IN LAMELLAR LIQUID CRYSTALS
UNIFORM MASTER'S STUDY PROGRAMME PHARMACY
Ljubljana, 2021
I
Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmaciji, Univerza v Ljubljani pod mentorstvom doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž, mag farm. in somentorstvom prof. dr. Robert Roškar, mag. farm.
Zahvala
Iskreno se zahvaljujem mentorici doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž, mag. farm. in somentorju prof. dr. Robertu Roškarju, mag. farm, za prijaznost, strokovno pomoč, usmeritve in številne koristne nasvete pri raziskovalnem delu in pisanju magistrske naloge.
Zahvaljujem se tudi družini, fantu Davidu in prijateljem za vso podporo, vzpodbudne besede in nepozabne trenutke tekom študija.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelala samostojno pod vodstvom mentorice doc. dr.
Mirjam Gosenca Matjaž, mag farm. in somentorja prof. dr. Roberta Roškarja, mag. farm.
Maja Badovinac
Predsednik komisije: prof. dr. Stanislav Gobec Član komisije: asist. dr. Urška Nabergoj Makovec
Ljubljana, 2021
II
KAZALO VSEBINE
POVZETEK ... VII ABSTRACT ... VIII SEZNAM OKRAJŠAV ... IX
1 UVOD ... 1
1.1 TEKOČI KRISTALI ... 1
1.2 UPORABA TEKOČIH KRISTALOV KOT DOSTAVNIH SISTEMOV V FARMACIJI ... 4
1.2.1 Dermalna in transdermalna dostava ... 6
1.2.2 Peroralna in oralna dostava... 7
1.2.3 Vaginalna dostava... 9
1.2.4 Okularna dostava ... 9
1.2.5 Nazalna dostava ... 9
1.2.6 Parenteralna dostava ... 10
1.2.7 Tarčna terapija raka ... 11
1.3 STABILNOST ... 12
1.4 ANTIOKSIDANTI ZA STABILIZACIJO ZDRAVILNIH UČINKOVIN ... 14
1.5 ASKORBILPALMITAT ... 14
2 NAMEN DELA... 16
3 MATERIALI ... 17
3.1 Materiali za izdelavo lamelarnih tekočih kristalov kot nosilnih sistemov ... 17
3.2 Laboratorijska oprema za pripravo nosilnih sistemov in vrednotenje stabilnosti AP 23 3.3 Ostale snovi: ... 23
4 METODE ... 24
4.1 Priprava vzorcev ... 24
4.2 Vrednotenje stabilnosti askorbilpalmitata ... 26
4.3 Kinetično ovrednotenje razgradnje AP ... 27
4.4 Določanje mikrostrukture tekočih kristalov ... 28
5 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 29
5.1 Askorbilpalmitat kot derivat askorbinske kisline ... 29
5.2 Vrednotenje stabilizacije askorbilpalmitata ... 31
5.2.1 Preliminarna študija ... 31
5.2.2 Vrednotenje stabilnosti AP v dolgotrajni študiji ... 35
III
5.3 Kinetično ovrednotenje razgradnje AP ... 43
5.4 Določanje strukture tekočih kristalov s polarizacijsko mikroskopijo ... 45
6 SKLEP ... 48
7 LITERATURA ... 49
8 PRILOGE ... 55
IV
KAZALO SLIK
Slika 1: Enačba za izračun CPP, pri čemer v predstavlja volumen hidrofobnega lipidnega
repa, a0 površino polarne glave in lc dolžino lipidnega repa hidratirane molekula PAS ... 2
Slika 2: Vpliv vrednosti CPP na nastanek specifičnih mezofaz liotropnih TK ... 2
Slika 3: Lokalizacija hidrofilnih, lipofilnih in amfifilnih ZU v različne mezofaze: (a) kubična faza III in (b) reverzna heksagonalna faza... 4
Slika 4: Načini priprave disperzije nanodelcev s strukturo TK ... 6
Slika 5: In situ fazni prehod lamelarne v kubično mezofazo s hidrofilno učinkovino ... 11
Slika 6: Strukturna formula izopropilmiristat. ... 17
Slika 7: Strukturna formula fosfatidilholina. ... 18
Slika 8: Strukturna formula Tween-a 80. ... 18
Slika 9: Strukturna formula askorbilpalmitata. ... 19
Slika 10: Strukturna formula vitamina E. ... 20
Slika 11: Strukturna formula vitamina C. ... 21
Slika 12: Strukturna formula propilgalata. ... 21
Slika 13: Strukturna formula butilhidroksitoluen. ... 22
Slika 14: Strukturna formula koencima Q10. ... 22
Slika 15: Strukturna formula kvercetina. ... 23
Slika 16: Psevdo-trikomponentni fazni diagram za sistem lecitin/Tween 80/IPM/ voda. Na sliki je označena razrečitvena premica, na kateri se nahajajo izdelani sistemi TK z začetnim razmerjem emulgatorska zmes/lipofilna faza 7/3 ... 24
Slika 17: Makroskopski videz tekočih kristalov (TK1 in TK8) z vgrajenim 1 % AP in 1 % (m/m) AO (od leve: TK1 propilgalat, TK1 BHT, TK1 kvercetin, TK1 1 % (m/m) AP brez AO, TK8 propilgalat, TK8 kvercetin, TK8 BHT, TK8 1 % (m/m) AP brez AO). ... 25
Slika 18: Makroskopski videz tekočih kristalov z različnim deležem vodne faze in vgrajenim 1 % (m/m) AP (od leve: T1, T3, T5, T8, SMES). ... 26
Slika 19: Pretvorba askorbinske kisline (AA) do dehidroaskorbinske kisline (DHA) in do 2,3-diketogulonata ... 29
Slika 20: Tavtomerni obliki AP in struktura formula oksidirane oblike AP, dehidroaskorbilpalmitat ... 30 Slika 21: Primerjava količine ne razpadlega AP (%) v TK1 (levo, obarvano modro) in TK8 (desno, obarvano roza) po dveh tednih pospešenega staranja, prikazano s standardnimi
V
odkloni (AP = askorbilpalmitat, BHT = butilhidroksitoluen, KQ = koencim Q10, KV =
kvercetin, E = vitamin E, C = vitamin C, PG = propilgalat). ... 32
Slika 22: Primerjava relativne stabilnosti po 2. tednu glede na 1 % AP med sistemi TK1 in TK8 (AP = askorbilpalmitat, BHT = butilhidroksitoluen, KQ = koencim Q10, KV = kvercetin, E = vitamin E, C = vitamin C, PG = propilgalat). ... 33
Slika 23: Primerjava stabilnosti AP v sistemih z 1 % AP in 1 % vitaminom C. ... 36
Slika 24: Primerjava stabilnosti AP v sistemih s 5 % AP. ... 36
Slika 25: Primerjava stabilnosti AP v sistemih z 10 % AP. ... 37
Slika 26: Primerjava stabilnosti AP v sistemih z 1 % AP, ki je referenčni sistem. ... 37
Slika 27: Primerjava stabilnosti AP v sistemih TK1. ... 39
Slika 28: Primerjava stabilnosti AP v sistemih TK8. ... 40
Slika 29: Primerjava stabilnosti AP v sistemih SMES. ... 41
Slika 30: Vrednosti konstant reakcijskih hitrosti 1. reda, glede na delež vode v štirih sistemih TK: TK1 – 20 %, TK3 – 30 %, TK5 – 40 %, TK8 – 55 %. ... 44
Slika 31: Mikrostruktura lamelarnih tekočih kristalov pod polarizacijskim mikroskopom pri večji povečavi (400×): TK1 1 % (m/m) AP (levo) in TK8 1 % (m/m) AP (desno) z razvidnimi številnimi malteškimi križi. ... 45
Slika 32: Mikrostruktura lamelarnih tekočih kristalov pod polarizacijskim mikroskopom pri večji povečavi (400×): TK1 1 % (m/m) AP in 1 % (m/m) vitamin C (levo) in TK8 1 % (m/m) AP in 1 % (m/m) vitamin C (desno) z izrazito lamelarno strukturo (vidni malteški križi). 46 Slika 33: Mikrostruktura lamelarnih tekočih kristalov pod polarizacijskim mikroskopom pri večji povečavi (400×): TK1 5 % (m/m) AP (levo) in TK8 5 % (m/m) AP (desno) z vidnimi oljnimi črtami. ... 46
Slika 34: Mikrostruktura lamelarnih tekočih kristalov pod polarizacijskim mikroskopom pri večji povečavi (400×): TK1 10 % (m/m) AP (levo) in TK8 10 % (m/m) AP (desno) z vidnimi oljnimi črtami. ... 47
Slika 35: Mikrostruktura lamelarnih tekočih kristalov pod polarizacijskim mikroskopom pri manjši povečavi (100×): TK8 5 % (m/m) AP (levo), TK1 10 % (m/m) AP (na sredini) in TK8 10 % (m/m) AP (desno). ... 47
VI
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Strukturna formula pogosto uporabljenih snovi, ki tvorijo tekoče kristale .. 3 Preglednica II: Pogoji testiranja ZU, ki se shranjujejo na sobni temperaturi ... 13 Preglednica III: Kvantitativna sestava izdelanih sistemov TK in SMES. ... 26 Preglednica IV: Konstante reakcijske hitrosti (k1) in R2 za 1. red kinetike kemijskih reakcij v sistemih TK in SMES. ... 43
VII
POVZETEK
Askorbilpalmitat (AP) je amfifilni derivat vitamina C, ki izkazuje večjo stabilnost in enostavnejše prodiranje v kožo, vendar je njegova stabilnost zaradi hitre oksidacije, nezadovoljiva. Namen magistrskega dela je izboljšati kemijsko stabilnost AP, vgrajenega v lamelarne tekoče kristale za dermalno uporabo. Ovrednotili smo dva različna pristopa za povečanje stabilnosti AP, in sicer dodatek antioksidantov ali povišanje koncentracije AP.
V prvem delu smo v okviru preliminarne študije (2 tedna) testirali vpliv dodatka antioksidantov (vitamin C in E, koencim Q10, kvercetin, butilhidroksitoluen, propilgalat), različnih koncentracij AP (5 % in 10 % napram 1 % (m/m)) na stabilnost AP v dveh sistemih tekočih kristalov s konstantnim razmerjem med lipofilno fazo in emulgatorsko zmesjo ob različnem deležu vodne faze (T1 z najmanjšim deležem vode ter T8 z največjim deležem vode). V sisteme z dodanim antioksidantom smo vgradili 1 % (m/m) antioksidanta in 1 % (m/m) AP. Preliminarno stabilnostno študijo smo izvedli v klimatski komori pri 40 °C in 75 % RV, kjer so bili vzorci zaščiteni pred svetlobo, ter vrednotili stabilnost AP s pomočjo tekočinske kromatografije ob času 0 in 2 tedna. Ugotovili smo, da je bil AP najstabilnejši pri obeh višjih koncentracijah in sočasni vgradnji vitamina C v primeru 1 % (m/m) AP. Na podlagi preliminarnih rezultatov smo nadalje zasnovali in izvedli stabilnostno študijo pri višjih koncentracijah AP ali ob dodatku vitamina C v tekočih kristalih z različno kvantitativno sestavo, in sicer v tekočih kristalih z naraščajočim deležem vode (TK1, TK3, TK5 in TK8) in primerjalno v SMES (zmes olja in emulgatorjev brez dodane vode). Vzorce smo shranjevali v klimatski komori pri 40 °C in 75 % RV in določali upad vsebnosti AP s tekočinsko kromatografijo znotraj 8 tednov. Ugotovili smo, da stabilnost AP z nižanjem deleža vode narašča. Najbolj optimalno stabilnost smo po osmih tednih dosegli v TK1 in SMES-u pri višjih koncentracijah AP ali ob dodatku antioksidanta vitamina C. Ker lahko večji delež vgrajenega AP ali dodatek antioksidantov vpliva na mikrostrukturo, smo mikrostrukturo tekočih kristalov, vključenih v stabilnostno študijo, dodatno pregledali pod polarizacijskim mikroskopom ter potrdili njihovo lamelarno strukturo.
Zaključimo lahko, da smo z vgradnjo višjih koncentracij AP in dodatkom vitamina C v tekoče kristale z manjšim deležem vode, dosegli uspešno stabilizacijo AP.
Ključne besede: askorbilpalmitat, liotropni tekoči kristali, stabilnost, antioksidanti, vitamin C
VIII
ABSTRACT
Ascorbyl palmitate (AP) is an amphiphilic derivative of vitamin C, which shows greater stability and easier penetration into the skin, but its stability is still insufficient due to rapid oxidation. The aim of master’s thesis is to improve the chemical stability of AP incorporated in lamellar liquid crystals for dermal application. Two different approaches to increase the stability of AP were evaluated, the addition of antioxidants or increasing the AP concentration. Firstly, the effect of antioxidants (vitamins C and E, coenzyme Q10, quercetin, butylhydroxytoluene, propyl gallate) and different concentrations of AP (5% and 10% vs.
1% (w/w)) on the stability of AP in two liquid crystal systems was tested within preliminary study (2 weeks). Liquid crystals had a constant ratio between lipophilic phase and emulsifier mixture at different proportions of aqueous phase (T1 with the lowest and T8 with the highest proportion of water). In the systems with added antioxidant, 1% (w/w) antioxidant and 1%
(w/w) AP had been incorporated. A preliminary stability study was carried out at 40 °C and 75 % relative humidity, where the samples were protected from light, and the stability of AP was evaluated by liquid chromatography at 0 and 2 weeks. AP was most stable at both higher AP concentrations and with the additional incorporation of vitamin C in the case of 1% (w/w) AP. Based on the preliminary results, a stability study was further designed and carried out at either higher concentrations of AP or with the addition of vitamin C in liquid crystals. The tested liquid crystals differ in their quantitative composition, namely the water content was increasing from TK1, TK3, TK5 to TK8, comparatively the stability was evaluated also in SMES (mixture of oil and emulsifiers with no added water). The samples were stored at 40
°C and 75 % relative humidity and the decrease in concentration of AP was determined by liquid chromatography within 8 weeks. As determined, the stability of AP increased with decreasing water content. The most optimal stability was observed after 8 weeks in TK1 and SMES at higher AP concentrations or with the addition of the antioxidant vitamin C. Because the addition of antioxidants or increasing the concentration of AP influence the microstructure, the microstructure of the liquid crystals included in the stability study was examined under a polarized microscope and the lamellar structure was confirmed. It can be concluded that by incorporating higher concentrations of AP and the addition of vitamin C to the liquid crystals with a lower proportion of water, successful stabilization of AP was achieved.
Key words: ascorbyl palmitate, lyotropic liquid crystals, stability, antioxidants, vitamin C
IX
SEZNAM OKRAJŠAV
AA2G askorbil-2-glukozid AK askorbinska kislina
AO antioksidant
AP askorbilpalmitat BHT butilhidroksitoluen
CPP ureditveni parameter (angl. critical packing parameter) EDTA etilendiamintetraocetna kislina
FO farmacevtska oblika IPM izopropilmiristat
LLCN nanodelci s strukturo liotropnih tekočih kristalov (angl. lyotropic liquid crystal nanoparticles)
ME mikroemulzija
NLC nanostrukturirani lipidni nosilci (angl. nanostructured lipid carriers) PAS površinsko aktivna snov
RV relativna vlažnost
SLN trdni lipidni nanodelci (angl. solid lipid nanoparticles) SMES samo-mikroemulgirajoči sistem
TK tekoči kristali
ZU zdravilna učinkovina 3OAA 3-O-etil-askorbat
1
1 UVOD
1.1 TEKOČI KRISTALI
Tekoči kristali (TK) so termodinamsko stabilne snovi, ki predstavljajo vmesno fazo med tekočinami in trdnimi snovmi. Imajo možnost pretoka kot tekočine ter lastnosti trdih snovi, kot so anizotropnost, dvolomnost, urejenost, mehanska stabilnost. Molekule oz. gradniki, ki gradijo to nenavadno vmesno stanje snovi, se imenujejo mezogeni. Glede na temperaturo, konsistenco, koncentracijo ter določene ostale parametre se TK nahajajo v različnih strukturah oziroma fazah (mezofazah), med katerimi lahko pod določenimi pogoji prehajajo v specifičnem zaporedju. Molekule v mezofazah se gibljejo kot molekule tekočine, toda kljub temu ohranjajo orientacijsko urejenost na dolge razdalje, včasih tudi na kratke, nimajo pa pozicijske urejenosti (urejenost molekul v mrežo) na dolge razdalje (1, 2). TK v osnovi ločimo na termotropne in liotropne, in sicer pri termotropnih nastanejo mezofaze s segrevanjem trde snovi, medtem ko pri liotropnih po dodatku topila amfifilni snovi (3).
Liotropni TK
Liotropni TK nastanejo z raztapljanjem površinsko aktivnih snovi (PAS) z značilno amfifilno strukturo (polarna glava in nepolarni rep) oziroma amfifilnih lipidov v ustreznem topilu (3). Tvorijo jih hidrati ali solvati molekul PAS ob prisotnosti vodne in/ali oljne faze (1, 4). PAS se raztapljajo v vodi, dokler ne dosežejo kritične micelarne koncentracije, pri kateri se začnejo spontano urejati v micele (polarne glave so obrnjene navzven in nepolarni repi navznoter). Nasprotno velja v oljni fazi, kjer nastanejo reverzni miceli (polarne glave so obrnjene navznoter in nepolarni repi navzven). Z naraščanjem deleža PAS nad kritično micelarno koncentracijo se v določenem koncentracijskem in temperaturnem območju spontano tvorijo specifično urejene strukture, imenovane TK (1).
Glede na razporeditev molekul razlikujemo več različnih mezofaz, ki nastanejo v odvisnosti od deleža posameznih komponent v sistemu ter od geometrijske urejenosti hidratiranih molekul PAS, ki zavzamejo obliko valja, stožca ali obrnjenega stožca (1). Mehanizme prehodov med naštetimi oblikami in posledično med mezofazami lahko razložimo s pomočjo ureditvenega parametra (CPP, angl. critical packing parameter). CPP predstavlja razmerje med volumnom hidrofobnih lipidnih repov (v) ter produktom med površino polarnih glav (a0) in dolžino lipidnih repov (lc) amfifilnih molekul (Slika 1). Pri CPP>1 se oblikujejo reverzne faze, pri CPP<1 normalne faze in pri CPP=1 lamelarna faza. Osnovni gradniki
2
spontano asociirajo v najbolj ugodno obliko in jo ob spremembi pogojev oz. CPP spremenijo (1, 5).
Slika 1: Enačba za izračun CPP, pri čemer v predstavlja volumen hidrofobnega lipidnega repa, a0 površino polarne glave in lc dolžino lipidnega repa hidratirane molekula PAS,
prirejeno po (6).
Liotropne TK v osnovi delimo na lamelarne, heksagonalne in kubične, v odvisnosti od CPP, kot je predstavljeno na Sliki 2.
Slika 2: Vpliv vrednosti CPP na nastanek specifičnih mezofaz liotropnih TK, prirejeno po (4, 6).
V lamelarni fazi so molekule PAS razporejene v dvosloje, pri katerih so polarne glave obrnjene proti vodi; nepolarni, lipofilni repi pa so združeni skupaj.
V primeru heksagonalne faze strukturno enoto predstavljajo dolgi paličasti agregati PAS, ki so s svojimi dolgimi osmi vzporedne ena na drugo in ustvarjajo heksagonalno obliko.
Viskoznost se v primerjavi z lamelarno fazo močno poveča zaradi dvodimenzionalne ureditve (7).
3
Pri kubični fazi PAS tvorijo specifične tridimenzionalne strukture z orientacijsko urejenostjo, kar se odraža v visoki viskoznosti teh faz. Obstajata dve različni agregaciji, in sicer sferična (diskontinuirana), ki tvori fazo I (normalni micel) in fazo IV (reverzni micel) in nastane med micelarno in heksagonalno fazo ter paličasta (bikontinuirana), ki tvori fazo II (normalni micel) in fazo III (reverzni micel) ter nastane med lamelarno in heksagonalno fazo (4, 7). V teoriji lahko nastane širok spekter različnih mezofaz, ki lahko ob spremembi pogojev prehajajo iz ene v drugo fazo. Ni pa nujno, da se v praksi izrazijo vse mefozafe (5).
V Preglednici I so predstavljene pogosto uporabljene snovi, ki tvorijo različne faze TK.
Znano je, da specifične kombinacije PAS in topila tvorijo značilne mezofaze. Amfifilni lipidi z dolgo verigo (C18) in dvojnimi vezmi navadno oblikujejo stožčaste oblike in s tem heksagonalne ali kubične faze. Lipidi s krajšimi verigami (C14, C15) pa tvorijo valjaste oblike ter s tem lamelarno fazo (8).
Preglednica I: Strukturna formula pogosto uporabljenih snovi, ki tvorijo tekoče kristale, prirejeno po (8, 9).
Pogosto uporabljene snovi za
izdelavo TK Strukturna formula
Gliceril monooleat
Gliceril monolinoleat
Fitantriol
Gliceril dioleat
Fosfatidilholin
Oleilglicerat
Fitanilglicerat
4
V mnogih študijah se za izdelavo TK uporablja gliceril monolinoleat. Slednji lahko tvori različne mezofaze, glede na delež vode, temperaturo in dodane PAS. Oleilglicerat in fitanilglicerat sta PAS, ki omogočata prehod iz lamelarne v kubično mezofazo pri povišani temperaturi (8). Temperaturno odvisen prehod med mezofazami pa je značilen tudi za fitantriol, ki pri nižjih temperaturah tvori bikontinuirane kubične mezofaze ter pri višjih temperaturah in večjem deležu vode pa reverzne heksagonalne faze (9).
1.2 UPORABA TEKOČIH KRISTALOV KOT DOSTAVNIH SISTEMOV V FARMACIJI
TK se v zadnjem času uspešno uporabljajo za subkutano, intravensko, oralno, peroralno, vaginalno, nazalno predvsem pa dermalno in transdermalno dostavo zdravilnih učinkovin (ZU) (8). ZU se v odvisnosti od svojih fizikalno-kemijskih lastnosti in tipa mezofaze ujamejo v strukturo TK, kar omogoča nadzorovano sproščanje ter izboljšano stabilnost ZU. V TK lahko vgradimo širok nabor učinkovin, saj so primeren dostavni sistem tako za hidrofilne, lipofilne ter amfifilne učinkovine. Na Sliki 3 so predstavljene možnosti lokalizacije ZU v heksagonalnih in kubičnih TK, in sicer hidrofilne ZU se vgradijo med polarne glave ali v vodne kanale, lipofilne ZU bodo locirane v lipidni dvosloj ter amfifilne ZU v medfazo (10).
Primer hidrofilne molekule je ZU za zdravljenje pljučne fibroze, pirfenidon, ki je znotraj heksagonalnih in kubičnih struktur locirana v vodne kanale in se sprošča z difuzijo (11).
Primer hidrofobne molekule pa je meloksikam, nesteroidna protivnetna in protirevmatska ZU, ki se znotraj TK nahaja v lipidnem dvosloju (25). Askorbilpalmitat (AP) kot amfifilna ZU se znotraj TK razporeja med molekule PAS in delno znotraj vodnih kanalov (12).
Slika 3: Lokalizacija hidrofilnih, lipofilnih in amfifilnih ZU v različne mezofaze: (a) kubična faza III in (b) reverzna heksagonalna faza, prirejeno po (13).
5
Prednosti TK kot dostavnih sistemov so velika sposobnost solubilizacije ZU v primerjavi s klasičnimi dostavnimi sistemi zaradi hidrofilnih in lipofilnih domen, kar je ključnega pomena v primeru slabo vodotopnih ZU, sposobnost zaščite ZU, občutljivih na encimsko razgradnjo, lahko tudi zmanjšajo potencialno toksičnost vgrajenih ZU ter končno omogočajo večjo biološko uporabnost ZU (8, 10). Zaradi edinstvene strukture in fizikalno-kemijskih lastnosti so liotropni TK primerni dostavni sistem tako za majhne klasične molekule (npr.
aciklovir, aminolevulinska kislina (14)) kot peptide in proteine (8, 10). Za dostavo proteinskih makromolekul je najprimernejša kubična faza III, saj se med lipidnimi dvosloji nahaja mreža vodnih kanalov s premerom, primerljivim z velikostjo proteinov, ki omogoča vgradnjo proteinske ZU v optimalni konfiguraciji ter zaščito ZU pred encimsko razgradnjo.
V eni izmed raziskav so z vgradnjo inzulina v gel s kubičnimi mezofazami preprečili agregacijo in ohranili njegovo nativno obliko za daljši čas v primerjavi s pufrno raztopino (1, 14).
Kot dostavni sistem se TK uporabljajo ali kot poltrdni sistem (ti. »bulk« faza) ali kot disperzije nanodelcev s strukturo TK (LLCN, angl. lyotropic liquid crystal nanoparticles). »Bulk« TK so bistri, viskozni, poltrdni sistemi z makroskopskim videzom hidrogela. Visoka viskoznost omejuje njihovo uporabo in aplikacijo, saj se na mestu aplikacije skoncentrirajo in visoka koncentracija npr. površinsko aktivnih snovi lahko povzroči draženje ter neželene učinke (13), medtem ko ob ustrezni izbiri gradnikov predstavlja prednost za (trans)dermalno dostavo. Njihova izdelava je v primerjavi z LLCN preprosta in hitra, posamezne komponente samo zmešamo skupaj do nastanka homogenega sistema.
Koloidne disperzije nanodelcev s strukturo TK, imenovane heksosomi ali kubosomi, pa predstavljajo inovativen dostavni sistem (15). LLCN lahko pripravimo s pomočjo različnih metod, ki so predstavljene na Sliki 4. Od zgoraj navzdol (top-down) načinu priprave prvi korak vključuje pripravo viskozne »bulk« faze TK, ki jo nato dispergiramo v vodni fazi z dodanim stabilizatorjem. Razprševanje v nanodelce s strukturo TK dosežemo z visokotlačnim homogenizatorjem ali ultrazvočno sondo. Od spodaj navzgor (bottom up):
predstavlja alternativen način priprave, pri katerem zmesi lipidne faze in stabilizatorja dodamo hidrotropno snovi (npr. etanol), ki prepreči takojšnje samoasociiranje. Nastalo zmes nato dispergiramo v vodni faz, pri čemer je za nastanek nanodelcev potreben minimalen vnos energije npr. s pomočjo vorteksa (16). Pri metodi sušenje z razprševanjem najprej pripravimo dispergirano vodno zmes lipidov in stabilizatorja ter zmes sušimo do nastanka
6
suhega prahu. Slednji služi kot prekurzor za LLCN, ki nastanejo ob ponovnem hidriranju suhega prahu. Ta način izdelave nanodelcev se uporablja za pripravo prahov, ki so primerni za oralne in inhalacijske farmacevtske oblike (FO), pri katerih pride do tvorbe LLCN ob stiku FO s telesnimi tekočinami (tkivna tekočina, slina, prebavni sokovi). V primeru prej opisanih metod v disperziji nanodelcev pogosto nastanejo tudi različni vezikli, čemur se lahko izognemo z metodo toplotne obdelave. Slednja sama po sebi ni metoda za pripravo nanodelcev, toda s tem procesom, vključenim v proces izdelave LLCN zmanjšamo število nastalih veziklov. Z višanjem temperature namreč dosežemo manjšo topnost PAS in s tem zmanjšanje stabilnosti vezikov, kar privede do njihove fuzije, kar omogoča nastanek kubične ali heksagonalne strukture ter porazdelitev delcev in večjo termodinamsko stabilnost. Je pa proces toplotne obdelave primeren zgolj v primeru termostabilnih učinkovin (13, 15).
Slika 4: Načini priprave disperzije nanodelcev s strukturo TK, prirejeno po (15).
Večina raziskav zadnjih let je usmerjena v raziskovanje LLCN zaradi številnih prednosti, kot so relativno preprosta izdelava, nižja viskoznost, boljša fluidnost, možnosti dostave večjih količin ZU in drugo (13, 17).
1.2.1 Dermalna in transdermalna dostava
Z dermalno dostavo dosežemo lokalno dostavo ZU, medtem ko transdermalna dostava omogoča absorpcijo ZU preko kože v sistemski krvni obtok ter predstavlja alternativo parenteralni in peroralni dostavi (18). Na absorpcijo ZU prek kože vpliva veliko dejavnikov, in sicer fizikalno-kemijske lastnosti in koncentracija ZU, lastnosti dostavnega sistema, okluzivnost in mesto aplikacije.
V nedavnem preglednem članku so predstavili LLCN kot dostavne sisteme za širok spekter kožnih bolezni, kot so luskavica, atopični dermatitis, akne, glivične okužbe, opekline, kožni rak. Zanimiv pristop predstavljajo tekoče dermalne FO v vsebnikih pod tlakom, ki ob
7
aplikaciji tvorijo aerosol, kar predstavlja neboleč način aplikacije ZU za zdravljenje globokih ran kot posledica opeklin 2. stopnje. Tako so Chen in sodelavci zasnovali sprej na osnovi LLCN s hialuronsko kislino in ZU pirfenidon za profilakso brazgotin ter pospešeno celjenje ran. In vivo aplicirani lamelarni LLCN so ob stiku z rano absorbirali eksudat in oblikovali in situ gel s heksosomi in kubosomi, ki je zaradi svoje specifične strukture
»kletke« omogočili učinek »vzmeti«, ki je mehansko zaščitil kožo ter zmanjšal pritisk na rano. Poleg tega so TK uspešno zaščitili hialuronsko kislino pred encimsko razgradnjo, tako podaljšali njeno protivnetno delovanje ter posledično skrajšali fazo vnetja (11).
S strukturno podobnostjo fiziološkim membranam in lipidnim dvoslojem v roženi plasti kože, tako »bulk« TK kot LLCN dokazano povečajo absorpcijo ZU. PAS, prisotni v TK, vplivajo na propustnost in fluidnost membran, s čimer izboljšajo zadrževanje ZU v različnih plasteh kože in omogočajo postopno sproščanje (8). Disperzije nanodelcev s strukturo TK so se tako izkazale kot superiorna dermalna FO za zdravljenje glivičnih okužb. Mahmood in sodelavci so raziskovali LLCN z vgrajenim antimikotikom, lulikonazolom. In vitro testi so pokazali podaljšano sproščanje v primerjavi s kremami na tržišču ter v nadaljnjih ex vivo raziskavah na koži kozjega ušesa tudi boljšo penetracijo. Na podlagi študije so tako potrdili, da so LLCN omogočajo večjo penetracijo v kožo ter podaljšano sproščanje, s čimer zagotovijo daljši kontaktni čas in boljše zdravljenje glivične infekcije (19).
Poleg podaljšanega sproščanja in boljše penetracije sta za dermalni nanos TK značilni tudi boljša biološka razpoložljivosti in manj neželenih učinkov, ki sta zlasti pomembni pri ZU s slabo biološko uporabnostjo in številnimi neželenimi učinki. Primer takšne učinkovine je kolhicin, ki se uporablja kot prva izbira pri zdravljenju protina. Nasr in sodelavci so poskusili preprečiti neželene učinke ZU, kot so bolečina v trebuhu, slabost, bruhanje, driska, upad kostnega mozga, aritmija in azoospermija, z vgradnjo kolhicina v kubosome za transdermalno dostavo. Ex vivo so na zajčji koži primerjali učinkovitost zdravljenja s peroralnim zdravilom s transdermalim gelom s kubosomi. Izkazalo se je, da je gel izrazito izboljšal absorpcijo in s tem biorazpoložljivost ter zmanjšal sistemske neželene učinke (20).
1.2.2 Peroralna in oralna dostava
Peroralna dostava zdravil je najbolj zaželen in najprimernejši način dostave zdravila zaradi višjega sodelovanja pacientov, stroškovne učinkovitosti, zaradi manj doziranj, prilagodljivosti pri oblikovanju dozirne oblike in enostavnosti proizvodnje. Problematična pa je lahko slaba biološka uporabnost zaradi neustrezne topnosti ali absorpcije ZU, vpliva
8
dejavnikov gastrointestinalnega trakta na stabilnost ZU (pH, encimi, bakterijske kolonizacije) ali metabolizma (13, 21).
Zaradi edinstvene mikrostrukture omogočajo TK vgradnjo slabo topnih učinkovin in s tem izboljšanje biološke razpoložljivosti (13). Trans-resveratrol izkazuje protimikrobno delovanje, hidrofobne lastnosti pa predstavljajo izziv pri oblikovanju farmacevtskih pripravkov. Miyashiro in sodelavci so raziskovali njegovo zmožnost lokalnega zdravljenja oralne kandidoze. Razvili so mikroemulzijo (ME), ki je zaradi nižje viskoznosti in lažje aplikacije služila kot prekurzorski sistem za dostavo trans-resveratrola. Ob stiku s slino pa so nastali TK, ki so se zaradi višje viskoznosti dalj časa zadržali na mestu aplikacije.
Prisotnost natrijevega alginata, kot polimera, je dodatno povečala mukoadhezivno moč formulacije in s tem čas zadrževanja ZU, kar je omogočilo večjo absorpcijo in boljšo učinkovitost zdravljenja, potrjeno v okviru in vitro mikrobioloških testov na sevu Candida albicans (22).
LLCN se uporabljajo tudi za prekrivanje neprijetnega okusa zdravilnih učinkovin oz. zdravil, ki je poglaviten problem pri pediatrični populaciji, saj močno vpliva na sodelovanju otrok pri zdravljenju z zdravili. Fan in sodelavci so poskušali z vgradnjo antibiotika cefpodoksima v kubosome prikriti grenak okus ZU. Izdelali so kubosome in dosegli podaljšano sproščanje do 24 h, termodinamsko stabilnost (z dodatkom poloksamerja 407) in prekrivanje neprijetnega okusa, potrjeno z elektronskim jezikom (23).
Uporaba disperzij kubosomov pa je omejena zaradi slabe termodinamske stabilnosti pri shranjevanju. Z namenom izboljšanja termodinamske stabilnosti koloidne disperzije so kot prekurzorje disperzijam uporabili kubosome v obliki suhega prahu, izdelane z metodo sušenja z razprševanjem. Slednji so v telesu ob stiku s tekočino tvorili TK. S tem so izboljšali stabilnost kubosomov med shranjevanjem in izboljšano dostavo učinkovine (24). Zanimiv način izboljšanja stabilnosti pa je izdelava trdnih kapsul na osnovi TK s fazno transformacijo, ki so jo preučevali Zhang in sodelavci. Izdelali so TK z različnimi dodatki kot je PEG 1000 ali Tween 80 za prilagoditev tališča in profila sproščanja ter zmes vnesli v želatinaste kapsule. In vitro so dokazali, da je vsebina kapsul ob spremembi temperature iz sobne na telesno prešla iz poltrdne v tekočo, kar je omogočilo spontan mezofazni prehod lamelarne v kubično ali heksagonalno fazo. S tem so dosegli stabilnost trdnih kapsul za shranjevanje in povečan učinek zaradi večje viskoznosti nastalih faz ter posledičnega podaljšanega sproščanje do 24 ur (25).
9 1.2.3 Vaginalna dostava
Uporabo TK so ovrednotili tudi na področju vaginalne dostave za zdravljenje infekcij ter rakavih obolenj. Raziskave namreč kažejo, da ima ta način aplikacije velik doprinos k zmanjšanju antibiotične rezistence in tarčni terapiji raka, saj se z lokalno aplikacijo zdravila izognemo sistemskim neželenim učinkom ter povečamo učinkovitost terapije (26, 27).
V večini raziskav so kot dostavni sistem uporabili lamelarne TK, ki so in situ, ob stiku z vaginalno tekočino oblikovali gel TK s kubično strukturo. Zaradi ustrezne viskoznosti, ki je omogočila daljše zadrževanje na mestu nanosa, so dosegli večjo učinkovitost, nizko celično toksičnost, manj draženja, podaljšano sproščanje in s tem daljše delovanje ter manj doziranj.
Naštete prednosti bi lahko pripomogle k večjem sodelovanju pacientk pri zdravljenju ter manjšim stroškom zdravljenja (26, 27).
1.2.4 Okularna dostava
Dostava učinkovin v oko je otežena zaradi različnih dejavnikov, kot so solze, mežikanje, tesni stiki celic ter plastovita sestave roženice, ki otežuje penetracijo ZU. Na splošno lahko rečemo, da na učinkovitost absorpcije vplivata dva glavna dejavnika, in sicer sposobnost penetracije in čas stika učinkovine z roženico (17).
Za zdravljenje neovaskularizacije roženice se uporablja resveratrol, ki zaradi velike hidrofobnosti in fizioloških ovir očesa težko prehaja v roženico. Z namenom optimizacije zdravljenja so Li in sodelavci ZU vgradili v gel z lamelarnimi TK, kjer so kot lipofilno fazo uporabili gliceril monooleat. Slednji je z resveratrolom tvoril vodikove vezi in s tem doprinesel k vgradnji večje količine ZU. S primerno viskoznostjo in počasno erozijo gela pa so dosegli podaljšano sproščanje in s tem manj odmerjanj. Gel z lamelarnimi TK se je tako izkazal kot neinvaziven in varen dostavni sistem, ki je omogočal večjo penetracijo učinkovine (28). Izsledki novejših raziskav predstavljajo kubosome, kot potencialne dostavne sisteme, za različne okularne bolezni, kot so vnetje očesa, keratomikoza in drugo.
V študijah so dokazali nadzorovano sproščanje, boljšo permeabilnost in višjo biološko razpoložljivost ZU (29, 30).
1.2.5 Nazalna dostava
Nazalna dostava omogoča ne zgolj lokalno dostavo, temveč tudi neinvazivno dostavo učinkovin v možgane, s čimer zaobidemo jetrni metabolizem in krvno-možgansko pregrado.
Po drugi strani ima ta način aplikacije nekaj omejitev, kot je omejena količina aplicirane ZU
10
in kratek čas zadrževanja zaradi nosne sluzi, kar privede do slabe absorpcije. Z uporabo kubosomov so zaobšli omenjene omejitve, slednji so se tako izkazali kot potencialni dostavni sistem za dostavo ZU za bolezni centralnega živčnega sistema (31). V eni izmed študij so izdelali kubosome z antidepresivom, duloksetinom, ter toplotno občutljivimi polimeri, ki so omogočili in situ prehod pri telesni temperaturi iz tekoče v gel obliko. Z bolj viskoznim gelom so podaljšali čas zadrževanja učinkovine na nosni sluznici in tako povečali absorpcijo ZU. Študije so pokazale večjo biološko razpoložljivost in povečano dostavo učinkovine v možgane (32).
1.2.6 Parenteralna dostava
Visoka viskoznost »bulk« TK, predvsem kubične in heksagonalne faze, omejuje njihovo uporabo za injiciranje, problematično je iztiskanju formulacije iz brizge ter potencialno draženje zaradi skoncentriranja formulacije na mestu aplikacije. Rešitev predstavlja uporaba lamelarne mezofaze z nižjo viskoznostjo kot prekurzorja, ki po injiciranju ob stiku s telesno tekočino in/ali telesni temperaturi in situ preide v kubične in heksagonalne faze. Na začetku je sproščanje iz lamelarnih faz hitrejše, zato je pomemben čas, ki je potreben za in situ prehod, vezava na mestu injiciranja pa lahko povzroči rahlo bolečino (13). Omenjen fazni prehod so Mei in sodelavci uporabili za aplikacijo hidrofilnega lokalnega anestetika, bupivakainijevega klorida, ki zaradi kratkega razpolovnega časa potrebuje večkratno odmerjanje, kar povzroči slabo sodelovanje pacientov pri zdravljenju in višje stroške.
Zdravilo je bilo zasnovano kot tekočina lamelarnih TK, ki in situ ob stiku s fiziološko tekočino spontano tvori gel v heksagonalni in kubični obliki (Slika 5). Nizka viskoznost lamelarne faze je omogočila enostavno injiciranje, medtem ko je gel z notranjimi vodnimi kanali zagotovili podaljšano sproščanje. In vivo je bila dosežena dolgotrajna analgezija in stabilnejša koncentracija analgetika v plazmi (33).
Novejše raziskave se zaradi omejitev pri uporabi »bulk« TK, usmerjajo v razvoj inovativnih kubosomov in heksosomov, ki so zaradi majhne velikosti delcev, nižje viskoznosti, biokompatibilnosti in stabilnosti primerni za parenteralno dostavo (13). Cervin in sodelavci so ovrednotili LLCN kot potencialni intravenski dostavni sistem peptidnega hormona somatostatina, ki ima visok terapevtski potencial (akutni pankreatitis, akromegalija), toda kratek razpolovni čas (le nekaj minut). In vivo testi na podganah so pokazali značilno podaljšanje razpolovnega časa v primeru vgradnje v LLCN, v katerih je bil zaščiten pred peptidazami (34).
11
Slika 5: In situ fazni prehod lamelarne v kubično mezofazo s hidrofilno učinkovino, prirejeno po (33).
1.2.7 Tarčna terapija raka
V okviru mnogih raziskav na področju protirakavih učinkovin so ovrednotili uporabo TK, s katerimi lahko izboljšamo topnost, neželene učinke ter dosežemo tarčno zdravljenje, kar predstavlja velik pomen pri klinični uporabi (17). V eni izmed raziskav so spremljali sproščanje kemoterapevtika, doksorubicina, iz heksagonalne faze napram bikontinuirani kubični v odvisnosti od pH za tarčno terapijo raka črevesja. Fazni prehod je stimulirala sprememba pH med pH zdravih celic (7,4) v primerjavi s pH izvenceličnega matriksa rakavih celicah (okrog 5,5). In vitro sproščanje doksorubicina iz bikontinuiranih kubičnih faz na humanih črevesnih rakavih celicah je bilo desetkrat hitrejše in trikrat bolj učinkovito pri uničevanju rakavih celic pri pH 5,5 kot pri pH zdravih celic, s čimer so dosegli ciljano terapijo, kar je ključnega pomena v primeru rakavih obolenj (35).
Zanimiv sistem bifunkcionalnih kubosomov, ki vsebujejo kemoterapevtik (doksorubicin) in radionuklidni kompleks za radioterapijo (177Lu (β −)), so prvi raziskovali Cytryniak in sodelavci. Prednost te kombinacije je v sinergističnem učinku kemoterapevtskega sredstva in radionuklida, zaradi česar lahko uporabimo nižje koncentracije kemoterapevtika, kar je pomembno zlasti v primeru kardiotoksičnih učinkovin, kot je doksorubicin. Študije na celicah HaLa so pokazale povečanje citotoksičnost bifunkcionalnih kubosomov v primerjavi s kubosomi z vgrajeno le eno učinkovino in s tem znatno zmanjšanje tveganje za neželene učinke. Ta študija je odprla novo smer uporabe kubosomov, vendar bo potrebno še veliko raziskav na tem področju (36).
12 1.3 STABILNOST
Stabilnost zdravil pomeni zmožnost ohranjanja njihovih fizikalnih, kemijskih, toksikoloških, terapevtskih in mikrobioloških značilnosti od izdelave do roka uporabnosti znotraj predpisanih meja (37). Na stabilnost ZU lahko vplivajo različni zunanji dejavniki, kot so temperatura, pH, pufri, ionska moč, vlažnost, svetloba, kisik, pomožne snovi, mehanska sila na ZU v obliki pritiska ali mletja ter notranji dejavniki, kot je molekulska struktura (predzdravilo, kiralna zgradba, sprememba lakton/kislina, velikost delcev, higroskopnost, kristaliničnost) (37– 39).
Nekatere ZU so občutljive na kemijsko razgradnjo zaradi občutljive molekulske zgradbe, druge na fizikalne pretvorbe, ki lahko privede do fizikalnih sprememb (npr. sprememb topnosti). Te spremembe so lahko reverzibilne (strukturne in konformacijske spremembe, ki se povrnejo v prvotno obliko) ali ireverzibilne (razpad strukture) (38, 39).
Fizikalna stabilnost: Fizikalno stanje ZU se odraža v njenih fizikalnih lastnostih. Zaradi nestabilnosti lahko pride do zmanjšane topnosti, sedimentacije, ločevanja faz, agregacije, neenakomernosti vsebine (40). ZU obstajajo v fazah z različno stopnjo urejenosti molekul, ki lahko s časom prehajajo iz manj v bolj termodinamsko stabilno stanje, kar lahko povzroči upad učinkovitosti. Primeri takšnih sprememb so: kristalizacije amorfnih snovi, prehodi med različnimi kristaliničnimi fazami, nastanek in rast kristalov, izhlapevanje/sublimacija ZU, adsorpcija vlage (38). Kemijska stabilnost: Najpogostejši kemijski reakciji nestabilnosti sta oksidacija, ki je razgradnja ZU ob prisotnosti kisika in solvoliza, ki je razgradnja ZU ob prisotnosti topila. Drugi možni načini kemijske razgradnje so še fotoliza, dehidracija, hidroliza, izomerizacija, racemizacija, eliminacija in drugo. Molekulska struktura vpliva na kemijsko stabilnost, zato lahko že v začetnih stopnjah sintetiziramo ZU v smeri, da je vpliv kemijske razgradnje čim manjši (38, 40).
Zmanjšana stabilnost in razgradnja ZU lahko vodita do manjše terapevtske učinkovitosti, nastanka toksičnih spojin in sprememb v izgledu (barva, vonj), zato je določanje stabilnosti in razpadnih produktov izredno pomembno. Dejstvo je, da je stabilnost ZU v različnih pogojih shranjevanja različna, zato zagotavljanje stabilnosti pri normalnih pogojih shranjevanja ni dovolj (38). Namen testiranja stabilnosti je pridobiti dokaze o tem, kako se kakovost ZU oz. zdravil spreminja s časom ob vplivu različnih dejavnikov (temperatura, vlaga) (41). Smernice ICH (angl. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use) so bile razvite z namenom poenotenja registracije zdravil za področje Evrope, Japonske in ZDA. Znotraj ICH se nahajajo Q
13
smernice, kjer so v poglavjih Q1A-1E navedena točna navodila o testiranju stabilnosti za nove ZU, produkte in FO ter vrednotenju stabilnostnih podatkov (38).
Testiranje stabilnosti za nove ZU po ICH Q1A (R2):
Formalni testi so namenjene dokazovanju obstojnosti ZU pri pogojih shranjevanja. Pogoji in čas teh testiranj so predstavljeni v Preglednici II. Dolgoročno testiranje (angl. real time/long term testing) poteka pod predvidenimi pogoji shranjevanja, da opredelimo rok uporabnosti oziroma rok do ponovnega preskušanja ZU. Pri pospešenem testiranju (angl.
accelerated testing) pogoji odstopajo od predvidenih, da dokažemo odpornost ZU. Slednji se uporabljajo tudi kot del raziskav, ki pospešujejo procese kvarjenja z namenom napovedovanja stabilnosti pri poljubnih pogojih (38).
Stresno testiranje (angl. stress testing) je namenjeno ugotavljanju intrinzične stabilnosti ZU, določanju razgradnih produktov ZU ter osnova za razvoj ustreznih analiznih metod za vrednotenje stabilnosti ZU. Izvaja se pri ostrejših pogojih kot pospešeno testiranje ter vključuje testiranje vpliva temperature (vsaj 10 °C višjo od temperature pospešenega testiranja), vlažnosti (75 % ali višjo), pH, oksidacije in svetlobe.
Preglednica II: Pogoji testiranja ZU, ki se shranjujejo na sobni temperaturi (41).
Pogoji Minimalni čas
Dolgoročno testiranje 25°C ± 2°C/ 60 % RV ± 5 % ali 30°C ± 2°C/65 % RV ± 5 % RV
12 mesecev
Vmesno testiranje 30°C ± 2°C/65 % RV ± 5 % RV 6 mesecev Pospešeno testiranje 40°C ± 2°C/75 % RV ± 5 % 6 mesecev
RV = relativna vlažnost
Pristopi k stabilizaciji ZU v FO
S prilagoditvijo pogojev, kot so temperatura, vlaga (vodotesna embalaža, filmsko oblaganje), svetloba (filmi za zaščito pred svetlobo), pH, ionska moč, dielektrična konstanta topila, lahko dosežemo stabilizacijo ZU. Da bi ZU najdlje ohranila obliko, je potrebno izbrati termodinamiko najugodnejše stanje, saj s tem preprečimo prehod med oblikami (amorfna- kristalinična). ZU lahko vključimo v različne dostavne sisteme, kot so liposomi, miceliji, emulzije, TK in ciklodekstrini, ki zaščitijo ZU pred kemijsko razgradnjo. Z dodatkom antioksidantov (AO) pa zaščitimo ZU pred oksidativno razgradnjo (38).
14
1.4 ANTIOKSIDANTI ZA STABILIZACIJO ZDRAVILNIH UČINKOVIN
Poznamo različne načine delovanja AO, eden izmed njih je odstranjevanje radikalov in s tem zaviranje reakcij oksidacije, s čimer preprečujejo oksidativni stres in s tem oksidativno škodo. V strukturi imajo reaktiven vodikov atom, ki se odcepi, reagira z radikali, jih nevtralizira ter s tem ustavi verižne radikalske reakcije. Glede na topnost jih v osnovi delimo na lipofilne AO, kot so vitamin E, kvercetin, koencim Q10, ter na hidrofilne, kot je npr.
vitamin C (42, 43).
Antioksidativna aktivnost je zmožnost spojine, da zavira oksidativni proces (npr. lipidno peroksidacijo). Ločevati je potrebno med izrazoma antioksidativna kapaciteta in antioksidativna reaktivnost. Kapaciteta daje informacijo o kvantitativni dolžini delovanja in reaktivnost o začetni dinamiki delovanja v povezavi s koncentracijo AO (44).
AO se v farmacevtske izdelke vključujejo z dvema namenoma, in sicer kot spojine za zaščito pred vplivi radikalov, druga pa kot pomožna snov za zaščito ostalih (pomožnih) sestavin pred oksidacijo, s čimer se podaljša rok uporabe izdelka. Izbira AO je odvisno od hidrofilnih oz. lipofilnih lastnosti izdelka. V formulaciji AO ne smejo reagirati z drugimi sestavinami, temveč morajo ohraniti stabilnost za doseganje želene aktivnost (43).
V nedavni študiji so želeli izboljšati kemijsko stabilnost ZU hirsutenon (angl. hirsutenone), ki je imunomodlutor za zdravljenje atopijskega dermatitisa. ZU so vgradili v NLC (nanostrukturirani lipidni nosilci) in jih dodatno stabilizirali z dodatkom različnih koncentracij AO (AP, etilendiamintetraocetna kislina (EDTA), butilhidroksitoluen (BHT), vitamin E). Največjo stabilizacijo in s tem rok uporabnosti so dosegli v NLC z dodanima 1
% AP in 1 % EDTA kot stabilizatorjema. Na podlagi študije sklepamo, da z vgradnjo ZU v NLC in dodatkom AO lahko uspešno zmanjšamo obseg oksidacije in znatno izboljšamo stabilnost (45).
1.5 ASKORBILPALMITAT
Koža ima širok spekter medsebojno povezanih AO obrambnih mehanizmov, da se zaščiti pred poškodbami, ki vodijo v (foto)staranje kože, vnetje ali rakave spremembe. Ker je zmogljivost omenjene AO mreže omejena, je dodatek eksogenih AO koži dobra podpora pri preprečevanju poškodb. V ta namen se pogosto uporablja L-askorbinska kislina (AK) ali vitamin C, ki lahko nevtralizira oksidativni stres s prenosom elektronov, s čimer odstranjuje reaktivne kisikove zvrsti (ROS) ter druge radikale, ki v koži nastanejo pod vplivom eksogenih in endogenih dejavnikov, kot je izpostavitev UV sevanju in cigaretnemu dimu.
15
Zaradi številnih ugodnih učinkov na kožo se že dolgo uporablja v farmacevtskih izdelkih.
Problem pri uporabi vitamina C je njegova nestabilnost, zato se vse pogosteje uporabljajo njegovi derivati (46, 47). Eden izmed lipofilnih derivatov vitamina C je tudi AP, ki je ester AK ter palmitinske kisline. V primerjavi z vitaminom C, zaradi svojega amfifilnega značaja, izkazuje večjo stabilnost in boljšo penetracijo (48).
Amiodaron je antiaritmik, ki ima veliko neželenih učinkov, predvsem na krvno-žilni sistem, poleg tega pa povzroča občutljivost na svetlobo. Je slabo topen v vodi, zato je za izdelavo parenteralne FO potreben dodatek sotopil, ki povzročijo dodatne neželene učinke. Da bi zmanjšali ali preprečili naštete neželene učinke, so razvili in ovrednotili enoslojne liposome izdelane iz dimiristoilfosfatidilholin (angl. dimyristoylphosphatidylcholine) in AP kot AO za dostavo amiodarona, ki predstavljajo biološko združljiv material in ne povzročajo dodatnih neželenih učinkov. Tekom raziskave so izdelali liposome z različno kvantitativno sestavo in jim določali velikost delcev, zeta potencial in stabilnost. Rezultati so pokazali, da so liposomi, sestavljenih iz 10 mol % AP in 10 mol % amiodarona ohranili stabilnost, velikost in zeta potencial znotraj 28 dni. AP je zmanjšal oksidativne procese in s tem razgradnjo ZU in dodatno doprinesel k stabilnosti disperzij liposomov (termodinamsko nestabilni sistemi) s povečanjem negativnega naboja na površini liposomov in s tem odbojnih sil med delci (49).
Uporabnost AP se je izkazala tudi v cepivih. AP je amfifilna molekula, ki lahko ob segrevanju v vodi nad kritično micelarno temperaturo in ponovnem ohlajanju samoasociira in tvori LLCN lamelarne oblike. Vallecillo in sodelavci so raziskovali cepivo s TK AP za podaljšano sproščanje modelnega antigena, ovalbumina. Razvito cepivo so tako in vitro kot in vivo testirali na miših in rezultate primerjali z raztopino antigena v dekstrozi. Rezultati študije so pokazali, da je ta dostavni sistem tvoril depo obliko na mestu injiciranja, kar je omogočalo podaljšano sproščanje antigena. V nadaljnjih raziskavah so ugotovili, da LLCN AP izkazuje ajuvantno aktivnost, ki temelji na proteinu naravne imunosti, MyD88. S tem so pokazali, da se lahko AP uporablja kot dostavni sistem cepiv za povečanje antigen specifičnega imunskega odziva (50).
16
2 NAMEN DELA
Askorbilpalmitat je derivat askorbinske kisline, ki je zaradi svojih fizikalno-kemijskih lastnosti podvržen procesu oksidacije. Namen magistrskega dela je izboljšati kemijsko stabilnost AP, vgrajenega v lamelarne tekoče kristale za dermalno uporabo, ki so bili že predhodno razviti na Fakulteti za farmacijo na Katedri za farmacevtsko tehnologijo. Njihova stabilnost je bila ovrednotena v sklopu magistrske naloge z naslovom Vrednotenje stabilnosti in sproščanja askorbilpalmitata iz lamelarnih tekočih kristalov, kjer so določali stabilnost 1 % (m/m) AP v sistemih tekočih kristalov z naraščajočim deležem vode od TK1 do TK8.
Stabilnost AP je bila najboljša v TK1 ter najslabša v TK8.
Lamelarni tekoči kristali, vključeni v raziskavo, imajo enako razmerje med lipofilnimi snovmi ter PAS ob naraščajočem deležu vode kot hidrofilne komponente. Cilj magistrske naloge bo ovrednotiti dva različna pristopa za povečanje stabilnosti askorbilpalmitata, in sicer dodatek antioksidantov ali povišanje koncentracije askorbilpalmitata.
V prvem delu bomo v okviru kratkotrajne (14 dni) preliminarne študije testirali vpliv različnih koncentracij askorbilpalmitata (5 % in 10 % napram 1 % (m/m)) ter dodatka antioksidantov (vitamin C in E, koencim Q10, kvercetin, butilhidroksitoluen, propilgalat) na stabilnost askorbilpalmitata v dveh sistemih tekočih kristalov (T1 z najmanjšim deležem vode ter T8 z največjim deležem vode). V sisteme z dodanim antioksidantom bomo vgradili 1 % (m/m) antioksidanta in 1 % (m/m) askorbilpalmitata.
Nadalje bomo na podlagi dobljenih rezultatov oziroma najboljše stabilnosti izvedli dolgotrajno stabilnostno študijo askorbilpalmitata. Stabilnostno študijo bomo izvedli pri višjih koncentracijah askorbilpalmitata ali ob dodatku antioksidanta v tekočih kristalih z različno kvantitativno sestavo (naraščajoč delež vode od TK1, TK3, TK5 do TK8) ter primerjalno še v SMES (sistem lipofilne faze in emulgatorjev, brez dodane vode). Stabilnost oziroma delež nespremenjenega askorbilpalmitata bomo vrednotili z metodo tekočinske kromatografije v času 0, 1, 3, 4, 6 in 8 tednov ter na podlagi pridobljenih podatkov, izračunali in ovrednotili kinetiko kemijskih reakcij razgradnje askorbilpalmitata.
Ker lahko večji delež vgrajenega askorbilpalmitata ali dodatek antioksidantov vpliva na mikrostrukturo, bomo dodatno s pomočjo polarizacijskega mikroskopa preverili tudi mikrostrukturo oziroma tip mezofaze za sisteme, vključene v stabilnostno študijo.
17
3 MATERIALI
3.1 Materiali za izdelavo lamelarnih tekočih kristalov kot nosilnih sistemov Hidrofilna faza: prečiščena voda
Prečiščena voda je bila pripravljena na Fakulteti za farmacijo z reverzno osmozo. Prečiščeno vodo smo uporabili kot hidrofilno fazo TK.
Lipofilna faza: izopropilmiristat (C17H34O2) (Sigma-Aldrich, Nemčija)
Izopropilmiristat (IPM) je ester propan-2-ola in miristinske kisline, ki je nasičena maščobna kislina z visoko molekulsko maso (Slika 6). Je bistra tekočina, brez barve in vonja, ki je odporna na oksidacijo in hidrolizo, zaradi česar ne postane žarka. IPM je topen v 95 % etanolu, kloroformu, acetonu, maščobah, maščobnih alkoholih, tekočih ogljikovodikih in toluenu. Netopen pa je v vodi, glikolih in glicerolu. Potrebno ga je shranjevati v zaprti ovojnini, na hladnem mestu, zaščiteno pred svetlobo.
IPM je nemasten emolient, ki je nestrupen in se dobro absorbira v kožo. V dermalnih pripravkih se zato uporablja predvsem kot pospeševalec penetracije. Njegovo uporabnost so raziskovali tudi v nanoformulacijah, kjer je povečal biološko razpoložljivost vgrajenih učinkovin v oralnih, dermalnih in transdermalnih FO (51).
Slika 6: Strukturna formula izopropilmiristat.
Zmes emulgatorjev:
Lipoid S-100 (Lipoid GmbH, Nemčija)
Lipoid S-100 je prečiščena vrsta sojinega lecitina (fosfolipid), ki vsebuje fosfatidilholin (94 % ali več), fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin in fosfaidilinozitol (Slika 7). Poleg tega vsebuje še lizofosfatidilholin, trigliceride, maščobne kisline in vodo. Vsebnost sestavin se razlikuje od vrste lecitina ter stopnje čistote. Je voskaste konsistence, rumene barve, značilnega vonja ter dobro topen v etru in maščobnem olju. Je amfifilna molekula, zato se uporablja kot emulgator za tvorbo emulzij.
Lecitin je nestrupen, biokompatibilen in biorazgradljiv, zato ima širok spekter uporabe (prehrambna industrija, biotehnologija, kozmetika, farmacija). V farmacevtskih izdelkih se
18
uporablja predvsem kot stabilizator, emolient, emulgator in solubilizator v intramuskularnih in intravenskih injekcijah, parenteralni prehrani in dermalnih izdelkih, kot so kreme in mazila (51).
Slika 7: Strukturna formula fosfatidilholina.
Tween 80 (Fluka, Nemčija)
Tween 80 ali polisorbat 80 je rumena, viskozna tekočina z rahlim značilnim vonjem (Slika 8). Kemijsko je zmes delnih estrov oleinske kisline s približno dvajsetimi oksietilenskimi skupinami substituiranega sorbitana (PEG-iliran sorbitan, kjer je skupno število enot 20).
Je hidrofilna, neionska PAS, ki se pogosto uporablja kot emulgator v emulzijah tipa O/V, solubilizator ter močljivec v suspenzijah, saj ne povzroča draženja in velja za nestrupeno snov. Uporablja se tako v kozmetičnih izdelkih kot v parenteralnih, dermalnih in peroralnih FO ter v prehrambni industriji (52).
Slika 8: Strukturna formula Tween-a 80.
Askorbilpalmitat (C22H38O7) (Sigma-Aldrich, Nemčija)
AP je ester AK s palmitinsko kislino z molekulsko maso 414,54 g/mol. Ima hidrofilno glavo (AK) in lipofilen rep (palmitinska kislina) (Slika 9). Je lipofilni derivat vitamina C, ki je kemijsko bolj stabilen. Po videzu je bel ali rumenkasto bel prah, ki nima vonja. Zaradi lipofilnih lastnosti je njegov prehod skozi kožo olajšan. Dobro je topen v organskih topilih
19
(metanol, etanol) in skoraj netopen v vodi (5,6 mg/mL pri 25 ± 0,1 °C). AP je splošno znan kot nestrupena snov. LD50 (miši, peroralno) znaša 25000 mg/kg oz. LD50 (morski prašički, dermalno) znaša >3000 mg/kg (53). Hitro oksidira pod vplivom svetlobe in kovinskih ionov (Cu2+ in Fe3+v raztopini katalizirajo procese oksidacije). Shranjujemo ga v vsebnikih, ki so nepropustni za zrak, na hladnem mestu (8 – 15 °C). Za dosego večje stabilnosti uporabljamo pri rokovanju z AP nerjaveče jeklo ali steklo ter postopke, ki vključujejo vakuum ali inerten plin in zagotavljamo zaščito pred svetlobo. V koncentracijah med 0,05 in 0,1 % (m/m) AP nastopa kot pomožna snov za zaščito pred oksidacijo (predvsem za lipofilne komponente), medtem ko se v koncentracijah med 1 % in 2 % (m/m) uporablja kot učinkovina za zaščito kože pred oksidativnimi spremembami (54). AP ima GRAS status (splošno prepoznano kot varno; angl. generally recognized as safe), zato se uporablja kot aditiv v prehrani z namenom upočasnitve in omejitve procesa oksidacije lipidov. Kot AO za zaščito oksidativno nestabilnih ZU se uporablja v dermalnih in peroralnih FO (51, 55). Kot učinkovina se uporablja za dermalen nanos, saj z reduciranjem radikalov ščiti kožo pred UV-sevanjem. Pripomore tudi k upočasnjenemu fotostaranju kože, s pospeševanjem sinteze kolagena in preprečevanjem njegove razgradnje z zaviranjem metaloproteinaz. Poleg tega zmanjšuje hiperpigmentacije kože z zaviranjem encima tirozinaze. Izkazuje tudi protivnetno delovanje (56).
Pridobivamo ga s kemijsko ali z encimsko sintezo. Pri kemijski sintezi poteče kislinsko katalizirana esterifikacija AK s palmitinsko kislino, kjer se žveplova kislina uporablja kot katalizator. Encimska sinteza pa poteče ob prisotnosti biokatalizatorja lipaze (51, 55).
Slika 9: Strukturna formula askorbilpalmitata.
Antioksidanti, uporabljeni za stabilizacijo askorbilpalmitata:
Vitamin E ali tokoferol (C29H50O2) (Sigma-Aldrich, Nemčija)
Vitamin E je rumena do rumenkasto rjava, viskozna tekočina (Slika 10). Izkazuje izrazito lipofilne lastnosti in se meša z acetonom, diklorometanom, etanolom, etrom ter maščobnimi olji. Z vodo se ne meša. V aerobnih pogojih in ob stiku s solmi z železom ter srebrom hitro
20
oksidira, zato ga je potrebno shranjevati v zaprti posodi na hladnem, suhem mestu, kjer je zaščiten pred svetlobo in zrakom. Je varna snov, saj spada med vitamine in se nahaja v vsakdanji prehrani. Uporablja se v farmaciji, prehrambni industriji ter v kozmetiki.
Največkrat nastopa v vlogi AO (51, 52).
Slika 10: Strukturna formula vitamina E.
L-Askorbinska kislina ali vitamin C (C6H8O6) (Sigma-Aldrich, Nemčija)
AK je kristalni prah, bele do rahlo rumenkaste barve brez vonja in kislega okusa (Slika 11).
Je ne higroskopna snov, topna v alkoholu, glicerinu in vodi; netopna pa je v etru in kloroformu. V odsotnost kisika in drugih oksidantov je toplotno stabilna (tališča pri 190 °C).
Raztopine AK največjo stabilnost izkazujejo pri približno pH 5,4. Proces oksidacije pospešuje svetloba (na svetlobi potemni) in toplota. Nezdružljiva je z bazami, težkimi kovinami (posebno s Cu, Fe), oksidanti, metenaminom, fenilefrinijevim kloridom in salicilamidom. Potrebno jo je hraniti v dobro zaprti nekovinski posodi, zaščiteno pred svetlobo, v hladnem in suhem prostoru (52).
V farmacevtskih in kozmetičnih formulacijah se uporablja za uravnavanje pH raztopin, kot AO in kot stabilizator v micelih. Široko pa se uporablja tudi kot učinkovina. Študije kažejo, da je vitamin C učinkovit pri zdravljenju in zaviranju nastanka pigmentacij ter razgradnje melanina, zaradi česar se uporablja kot sredstvo za beljenje kože (pri melazmah, hiperpigmentacijah in sončnih pegah) (47). Njegova učinkovitost se kaže tudi pri preprečevanju kožnih fotosprememb, diferenciaciji keratinocitov, nenazadnje pa lahko izboljša kohezijo v dermalnem-epidermalnem stiku (46). V okviru in vitro študij so dokazali, da dermalni nanos 10 % (m/m) vitamina C bistveno zmanjšala eritrem, povzročen z UVB sevanjem in sončne opekline (57). Poleg AO delovanja, vitamin C izboljša tudi elastičnost kože in s spodbujanjem sinteze kolagena zmanjša gube (47). Zaradi protivnetnega delovanja je uporaben tudi pri zdravljenju rozacee in aken (57).
Pridobiva se sintetično ali ekstrahira iz različnih rastlinskih virov (šipka, črnega ribeza, soka agrumov). AK je optično aktivna molekula z dvema kiralnima centroma (C4 in C5). Tako
21
se pojavlja v različnih izomernih oblikah. L-AK deluje kot vitamin, D-AK pa ne. V raztopljeni obliki ima dve ionizirajoči skupini z vrednostma pKa 4,75 in 11,8 (51, 58).
Slika 11: Strukturna formula vitamina C.
Propilgalat (C10H12O5) (Fluka, Nemčija)
Propilgalat je ester galne kisline in 1-propanola (Slika 12). Je bel ali skoraj bel kristaliničen prah z rahlim, značilnim vonjem in grenkim, adstringentnim okusom. Dobro je topen v oljih in slabo v etanolu ter etru. Uporablja se kot AO v FO, hrani, parfumih in kozmetičnih izdelkih. Izkazuje tudi šibko protimikrobno delovanje (51, 52).
Slika 12: Strukturna formula propilgalata.
Butilhidroksitoluen (C15H24O) (Sigma-Aldrich, Nemčija)
BHT je fenol, substituiran s sterično velikima lipofilnima terc-butilnima skupinama (Slika 13). Je bel ali rumenkasto bel kristaliničen prah z rahlim, značilnim vonjem. Pri izpostavitvi svetlobi, vlagi in višjim temperaturam postane neaktiven. Pri rokovanju z BHT je potrebno upoštevati običajne previdnostne ukrepe (prezračen prostor, rokavice, zaščitna očala), saj lahko pride do draženja oči in kože. Kot AO se uporablja v hrani, kozmetičnih in farmacevtskih izdelkih (51, 52).
22
Slika 13: Strukturna formula butilhidroksitoluen.
Koencim Q10 ali ubikinon (C59H90O4) (Farmalabor, Italija)
Koencim Q10 je lipidotopen benzokinonski derivat rumeno-oranžne barve (Slika 14). Ima visok redukcijski potencial in kristalizira že pri nižjih temperaturah (40 °C). Obstaja v dveh oblikah, in sicer v oksidirani obliki – ubikinon ali reducirani obliki – ubikinol, ki ima boljše AO delovanje (59). Ubikinon, ki je prejemnik elektronov, prenaša elektrone s prehajanjem iz oksidirane v reducirano obliko. Reducirana oblika, ki je dajalec elektronov, nevtralizira radikale in prepreči oksidativne poškodbe bioloških molekul. V kozmetičnih izdelkih se kot AO pojavlja v relativno nizkih koncentracijah (< 1 % (m/m)) (60).
Slika 14: Strukturna formula koencima Q10.
Kvercetin (C15H10O7) (Molekula group, Velika Britanija)
Kvercetin je polifenolni flavonoid (Slika 15). Je rumen prah, ki je dobro topen v etru, metanolu, etanolu in acetonu ter slabo topen v vodi. Uporablja se kot AO v prehrambni in kozmetični industriji (61).
23
Slika 15: Strukturna formula kvercetina.
3.2 Laboratorijska oprema za pripravo nosilnih sistemov in vrednotenje stabilnosti AP
Analizna tehnica (Mettler Toledo-Delta range, Švica)
Magnetno mešalo (IKA, Nemčija)
HPLC sistem Series 1100/1200 (Agilent Technologies, ZDA); kolona (Phenomenex, ZDA)
Komora ICH260L (Memmert, Nemčija)
Optični polarizacijski mikroskop (Leica Q500 MC Image analyzer system) 3.3 Ostale snovi:
Acetonitril (C2H3N), HPLC grade (Honeywell Riedel-de Haën AG, Nemčija):
mobilna faza za HPLC
Mravljinčna kislina (CH2O2) (Merck, KGaA, Nemčija): pri pripravi mobilne faze za HPLC
Metanol (CH4O) (Merck, KGaA, Nemčija): topilo za AP pri HPLC analizi
Metanol, HPLC grade (Honeywell Riedel-de Haën AG, Nemčija): mobilna faza za HPLC
L-Askorbinska kislina (C6H8O6) (Sigma-Aldrich, Nemčija): za stabilizacijo AP v raztopini metanola (topilo) v okviru HPLC analize stabilnosti
24
4 METODE
4.1 Priprava vzorcev
Vzorce smo izdelali na podlagi predhodno razvitih sistemov TK. Pri pripravi smo upoštevali psevdo-trikomponentni fazni diagram za sistem (lecitin/Tween 80)/izopropilmiristat/voda, ki podaja informacijo o tem, kakšno razmerje komponent je potrebno za nastanek določenih sistemov. Za specifično začetno razmerje PAS/olja po dodatku vode nastane ti. razredčitvena premica. Po vsakem dodatku vode se spremeni razmerje med komponentami sistema, ki jim sledi fazna sprememba. Na Sliki 16 je označena razredčitvena premica, na kateri se nahajajo sistemi TK, uporabljeni kot nosilni sistemi za AP v okviru naloge.
Slika 16: Psevdo-trikomponentni fazni diagram za sistem lecitin/Tween 80/IPM/ voda. Na sliki je označena razrečitvena premica, na kateri se nahajajo izdelani sistemi TK z začetnim
razmerjem emulgatorska zmes/lipofilna faza 7/3 (12).
Pri pripravi vzorcev smo najprej izdelali osnovno zmes, samomikroemulgirajoči sistem (SMES), ki je zmes lecitina, Tween-a 80 in IPM (PAS ter lipofilna faza). Upoštevali smo začetno razmerje zmesi emulgatorjev in lipofilne faze, ki je bilo 7:3. SMES smo izdelali tako, da smo v erlenmajerico najprej natehtali Tween 80 in lecitin v masnem razmerju 1:1 in nato dodali IPM. Zmes smo zaprli s pokrovčkom in pustili mešati na magnetnem mešalu čez noč oziroma do nastanka bistre, rumene homogene zmesi.
25 Preliminarna študija
Za vrednotenje vpliva različnih koncentracij AP (5 % in 10 % napram 1 % (m/m)) ter dodatka AO (vitamin C in E, koencim Q10, kvercetin, BHT, propilgalat) na stabilnost AP smo v okviru kratkotrajnejše preliminarne stabilnostne študije (14 dni) vrednotili stabilnost AP v dveh mejnih nosilnih sistemih, in sicer TK1 z najmanjšim deležem vode (20 % (m/m)) ter TK8 z največjim deležem vode (55 % (m/m)). Kvantitativna sestava je podana v Preglednici III. V sisteme z dodanim AO smo vgradili 1 % (m/m) AO in 1 % (m/m) AP.
Vzorce smo pripravili tako, da smo na sobni temperaturi najprej v vsebnik natehtali SMES, ustrezno količino AP ter mešali na magnetnem mešalu do nastanka homogene zmesi.
Vzorcem, v katere smo vgradili lipofilne AO (vitamin E, propilgalat, BHT, koencim Q10 in kvercetin), smo slednje natehtali neposredno v zmes AP in SMES-a ter ponovno mešali do nastanka homogene zmesi. Pri vzorcih s hidrofilnim AO (vitamin C), pa smo AO najprej raztopili v ustrezni količini vode in ga dodali predhodno pripravljeni zmesi SMES-a in AP.
Na koncu smo vsem sistemom dodali še ustrezno količino vode in ponovno pustili mešati na magnetnem mešalu čez noč do nastanka homogenih TK. Enakemu postopku smo sledili pri vzorcih s 5 % in 10 % (m/m) AP.
Slika 17: Makroskopski videz tekočih kristalov (TK1 in TK8) z vgrajenim 1 % AP in 1 % (m/m) AO (od leve: TK1 propilgalat, TK1 BHT, TK1 kvercetin, TK1 1 % (m/m) AP brez
AO, TK8 propilgalat, TK8 kvercetin, TK8 BHT, TK8 1 % (m/m) AP brez AO).
Stabilnostna študija
Na podlagi dobljenih rezultatov preliminarne študije smo nadalje izvedli stabilnostno študijo pri višjih koncentracijah AP ali ob dodatku AO v TK z različno kvantitativno sestavo. V okviru te študiji smo vrednotili le tiste pristope, ki so se izkazali za najoptimalnejše, in sicer stabilizacija AP v TK z dodanim vitaminom C ter 5 % in 10 % (m/m) delež AP v TK. Kot nosilne sisteme smo uporabili reprezentativne sisteme TK na razredčitveni premici, in sicer
26
TK1, TK3, TK5, TK8 in SMES (Preglednica III). Kot kontrolo, smo izdelali tudi 1 % (m/m) AP v vseh sistemih TK in SMES-u.
Preglednica III: Kvantitativna sestava izdelanih sistemov TK in SMES.
SISTEM LECITIN
% (m/m)
TWEEN 80
% (m/m)
IPM
% (m/m)
PREČIŠČENA VODA
% (m/m)
SMES 35 35 30 /
TK 1 28 28 24 20
TK 3 24,5 24,5 21 30
TK 5 21 21 18 40
TK 8 15,5 15,5 14 55
Slika 18: Makroskopski videz tekočih kristalov z različnim deležem vodne faze in vgrajenim 1 % (m/m) AP (od leve: T1, T3, T5, T8, SMES).
4.2 Vrednotenje stabilnosti askorbilpalmitata
V okviru stabilnostnih študij smo pripravljene vzorce starali v klimatski komori pri 40 °C in 75 % relativne vlažnosti, zaščitene pred svetlobo. Delež ne razpadlega AP smo v okviru preliminarne študije vrednotili v času 0 in 2 tedna ter v drugem delu študije v času 0, 1, 3, 4, 6 in 8 tednov.
V ustreznih časovnih točkah smo raztopine za HPLC analizo pripravili tako, da smo v 25 ml bučke natehtali 100 mg določenega vzorca, ki smo ga predhodno dobro premešali na magnetnem mešalu in dopolnili do oznake s topilom (200 mg/L AK v metanolu). Topilo smo pripravili tako, da smo v 1 L bučko natehtali 200 mg AK in z metanolom dopolnili do oznake. Ob vsaki časovni točki smo pripravili tudi standard AP s koncentracijo 40 mg/L,
