UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Tilen PAJK
BIOINFORMACIJSKA ANALIZA V DIAGNOSTIKI Z UPORABO TEHNOLOGIJE NANOPORE
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Tilen PAJK
BIOINFORMACIJSKA ANALIZA V DIAGNOSTIKI Z UPORABO TEHNOLOGIJE NANOPORE
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
BIOINFORMATIC ANALYSIS IN DIAGNOSTICS USING NANOPORE TECHNOLOGY
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Jerneja Jakšeta.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: prof. dr. Jernej JAKŠE
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: prof. dr. Jernej OGOREVC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum predstavitve: 26.8. 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 601.4:577.21:575.112(043.2)
KG nanopore, MinION, diagnostika, sekvenciranje, bioinformatika AV PAJK, Tilen
SA JAKŠE, Jernej (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN BIOINFORMACIJSKA ANALIZA V DIAGNOSTIKI Z UPORABO TEHNOLOGIJE NANOPORE
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 19 str., 3 sl., 17 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Nanopore sekvenciranje je perspektivna nova tehnologija z začetki uporabe v prejšnjem tisočletju. Deluje na podlagi zaznavanja sprememb v toku, ki teče skozi poro v membrani. Spremembe toka povzroča prehajanje molekule skozi nanoporo, ki je vezana v membrano. Oxford Nanopore Technologies je podjetje, ki je odgovorno za mnogo napredkov na tem področju in je leta 2014 izdalo napravo MinION, ki ponuja mnoge prednosti pred ostalimi metodami sekvenciranja nove generacije. Čeprav so imele začetne različice težave z doseganjem visoke natančnosti, so izboljšave naprave to dvignile do standardov, ki so postavljene pri ostalih tehnologijah nove generacije.
Zahteve moderne diagnostike se pomikajo stran od tradicionalnih metod proti hitrejšim tehnologijam, ki lahko rezultate podajo v krajšem ali celo realnem času. Nanopore tehnologija se je dokazala kot nepogrešljiva pri spremljanju in ukrepanju v mnogih izbruhih ebole in drugih tropskih bolezni, kjer so fizične lastnosti in zmogljivosti MinION-a ekipam omogočile sekvenciranje na prej nedostopnih lokacijah in s tem izboljšale nadzor situacije ter omogočile natančnejši vpogled v spreminjanje patogenov skozi potek izbruhov. Hitrost sekvenciranja, zmogljivost podajanja rezultatov v realnem času, lahka uporaba in prenosljivost, so razlogi, da se MinION naprava vedno več uporablja v diagnostične namene za živali, rastline in druge vrste povsod po svetu.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 601.4:577.21:575.112(043.2)
CX nanopore, MinION, diagnostics, sequencing, bioinformatics AU PAJK, Tilen
AA JAKŠE, Jernej (supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI BIOINFORMATIC ANALYSIS IN DIAGNOSTICS USING NANOPORE
TECHNOLOGY
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 19 p., 3 fig., 17 ref.
LA sl AL sl/en
AB Nanopore sequencing is a promising new technology with beginnings in the previous millennium. It works by detecting changes in the electrical current flowing through a nanopore embedded in the membrane. The changes are caused by the passage of a charged molecule through a nanopore bound to the membrane. Oxford Nanopore Technologies is the company responsible for many advances in this field. In 2014, they released the MinION device, which offers many advantages over other next-generation sequencing methods. Although the first versions struggled to achieve high accuracy, improvements have raised the device to the standard of other next-generation technologies. The demands of modern diagnostics are moving away from traditional methods to faster technologies that can deliver results faster or even in real time.
Nanopore technology has proven essential in monitoring and responding to many outbreaks of Ebola and other tropical diseases. The physical properties and capabilities of the MinION have allowed teams to sequence in previously inaccessible locations, improving situational control and providing more accurate insights into how pathogens change over the course of outbreaks. Sequencing speed, real-time result delivery, ease of use and portability are the reasons why the MinION instrument is increasingly used for diagnostic purposes in animals, plants and other species around the world
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO SLIK VI
1 UVOD 1
1.1 PROBLEMATIKA SEKVENCIRANJA NOVE GENERACIJE V
DIAGNOSTIKI 1
2 KAJ JE NANOPORE SEKVENCIRANJE 2
2.1 KONCEPT DELOVANJA 2
2.2 OXFORD NANOPORE MINION 3
3 PREDNOSTI NANOPORE SEKVENCIRANJA IN
TEHNOLOGIJE MINION 5
3.1 PROGRAMSKA OPREMA IN OBDELAVA PODATKOV 5
3.2 PRENOSLJIVOST IN ZMOŽNOST DELOVNJA V EKSTREMNIH
POGOJIH 6
3.3 SPREMLJANJE REZULTATOV V REALNEM ČASU IN
HITROST SEKVENCIRANJA 7
3.4 ZMOŽNOST BRANJA DALJŠIH MOLEKUL 7
4 MODERNA DIAGNOSTIKA IN EPIDEMIOLOGIJA 8 4.1 PROBLEMATIKA DIAGNOSTIKE S SEKVENCIRANJEM V
TERENSKIH LABORATORIJIH 9
5 PRIMERI UPORABE 10
5.1 EBOLA 10
5.2 RUMEN MRZLICA 13
5.3 ČIKUNGUNJA VIRUS 14
5.4 RAZVOJ MULTIPLEKSNEGA TESTA ZA VIRUSE HEMORAGIČNE
MRZLICE 15
6 ZAKLJUČEK 17
7 VIRI 18
VI KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Graf odvisnosti toka od časa med prehajanjem molekule skozi poro. 3 Slika 2: Prikaz prehoda molekule skozi poro pri 2D branju. 4
Slika 3: Terenski laboratorij v Gvineji. 11
1 1 UVOD
Zgodovina nanopor v sekvenciranju se je začela že v prejšnjem tisočletju. Razvoj se je začel v devetdesetih letih prešnjega stoletja. Leta 1995 je bil prijavljen prvi patent za sekvenciranje z nanoporo. Izbrana molekula za prve raziskve v to področje je bila α-hemolizin vstavljena v lipidni dvosloj, ki je ločeval cis in trans predel. Kmalu potem so tudi potrdili hipotezo, da ta pora omogoča prehod le enoverižne DNA zaradi omejenega notranjega premera nanoporne molekule. Ko je bilo prehajanje molekule skozi poro uspešno dokazano, je bil naslednji korak uspešna identifikacija posameznih nukleotidov v verigi. Problem je predstavljalo prehitro prehajanje molekule skozi poro, kar je preprečevalo zaznavanje natančnih sprememb v toku čez membrano. Prehajanje so upočasnili z vezavo DNA polimeraze (kasneje se uporabijo drugi motorični proteini) pred α-hemolizin, ki je premikala verigo naprej v korakih. Kljub bolj zmernim hitrostim prepuščanja meritve niso bile dovolj natančne za razločevanje posameznih nukleotidov, saj je bilo zaznavno mesto pore predolgo (Deamer in sod., 2016). Naslednja uporabljena molekula je bila Mycobacterium smegmatis porin A (MspA), koničaste oblike z enojnim in ostrim prepoznavnim mestom. Z gensko spremenjenimi nanoporami MspA so lahko trinukleotide uspešno razločili pri testiranju s ssDNA (Huang, 2014).
Na podlagi teh odkritji se je ustanovilo podjetje Oxford Nanopore Technologies (ONT), ki je leta 2014 v omejeno uporabo izdalo produkt MinION. S tehnologijo ONT so mnogi laboratoriji dosegli presenetljive rezultate. Naj omenim 99,4 % natančnost 4,6 Mb dolgega kontiga genoma E. coli s precejšnjo globino branja in 99 % natančnost sekvence genoma bakteriofaga M13 in de novo sestavljena sekvenca genoma E. coli. To so le nekateri izmed zanimivih dosežkov različnih laboratorijev, ki so uporabili ONT MinION (Deamer in sod., 2016).
MinION je od svoje javne predstavitve leta 2015 dobil številne posodobitve. MinION analizni in referenčni konzorcij (MiniION Analysis and Reference Consortium) je skozi leta opravil več poskusnih faz, v katerih so preverjali delovanje s sekvenciranjem istega vzorca E. coli K-12 na več napravah in več laboratorijih. Čeprav so začetne verzije pretočnih celic v testih leta 2015 imele zelo različne rezultate v številu branj in le 89 % natančnost, naj bi novejše različice celic serije R9 z modificiranimi CsgG porami dosegale 95 % natančnost z branjem obeh verig DNA molekule in občutno večje število branj na celico (Leggett in Clark, 2017).
1.1 PROBLEMATIKA SEKVENCIRANJA NOVE GENERACIJE V DIAGNOSTIKI NGS tehnologije določanja nukleotidnih zaporedij so omogočile velik napredek v pridobivanju natančnosti in hitrosti sekvenciranja bolj in bolj presenetljivih količin genetskih zapisov. Kot začetek vsake tehnologije je bila njihova uporaba zahtevna ter je zahtevala znaten vložek, a se je stanje izboljšalo s še hitrejšim delovanjem in nižjo operativno ceno za nekaj velikostnih razredov. Kljub temu je te tehnologije kot so Ilumina in podobne, ki sekvencirajo s sintezo oziroma označevanjem, omejevalo nekaj lastnosti: fizične lastnosti naprav, zahtevnost priprave
2
knjižnic in (kljub hitrosti) prepočasno zajemanje podatkov ter previsoka cena za uporabo v diagnostiki. V primerjavi z metodami NGS, ki zahtevajo fluorescentno označene nukleotide DNA in dolg čas cikla (dodajanje nukleotidov, fluorescenčno slikanje nukleotidov in izpiranje), je nanoporni sekvenator hiter, brez zelo dragih reagentov z nizko ceno same aparature. Poleg tega ima še sprejemljivo natančnost, odlikuje pa ga zmožnost dolgih bralnih dolžin, kar omogoča lažje določanje regij z veliko ponovitvami, ki so težavne za ostale NGS podatkovne sete (Jain in sod., 2016).
V tem delu bom predstavil delovanje Nanopore tehnologije in številne prednosti, ki jih prinaša uporaba novih naprav, ki temeljijo na njej. Ovrednotil bom te prednosti na primerih uporabe in preveril ali je to primerna tehnologija za uporabo v diagnostiki na terenu in laboratoriju.
2 KAJ JE NANOPORE SEKVENCIRANJE 2.1 KONCEPT DELOVANJA
Nanopora je na splošno lahko protein z ionskim kanalom (biološka nanopora) v električno neprepustni lipidni membrani ali umetno izvrtana odprtina (solid-state nanopora) v trdni material. Ta dva glavna pristopa raziskav nanopor poleg razlike v porah materialov uporabljata isti koncept za meritve. Pri tipičnem merjenju nanopor je nanopora edini prehod za prenos ionov med obema komorama, ki vsebujeta elektrolitske raztopine. Par elektrod je nameščen čez nanoporo, da tvori zaprti električni krog. Migracija ionov skozi nanopore nastane z uporabo potenciala čez membrano in elektrokemična reakcija se zgodi na elektrodah. Na kratko pridobitev elektrona na katodni elektrodi povzroči sproščanje aniona v raztopino, kar ustvari neravnovesje naboja in gradient koncentracije ionov. Na drugi strani zajem aniona na anodni elektrodi povzroči sprostitev elektrona v električni tokokrog in tako ustvari vzdržen tok skozi membrano. Neprekinjena molekularna translokacija blokira pore in ustvari niz uporovnih impulzov v toku, zabeleženem z ojačevalnikom. Amplituda in čas trajanja blokade zagotavljata analitične informacije za molekularne identifikacije trinukleotidov, iz katerih se nato lahko določijo posamezne baze (Huang, 2014).
Idealna tarča za zaznavanje z nanoporami mora imeti majhno površino prereza, ki komaj ustreza velikosti pore, in mora biti ustrezno nabita za zadostno zajemanje v poro. Nukleinske kisline, ki so negativno nabiti polimeri s fosfatno hrbtenico, so zelo primerne in so najbolj pogoste v preiskavah glede zaznavanja sestave molekule s pomočjo nanopor (Huang, 2014). Spremembe v izmerjenem toku pred, med in po translokaciji nabite molekule skozi nanoporo prikazuje slika 1.
3
Slika 1: Graf odvisnosti toka od časa med prehajanjem molekule skozi poro. (i) Ko se pora veže v membrano, tok steče čeznjo (dvig na grafu). (ii) Pora zajame nabito molekulo. (iii) Ko molekula prehaja skozi poro, povzroča spremembe v toku, ki teče čez membrano (padec na grafu). (iv) Molekula zapusti membrano in tok se normalizira (dvig na grafu) (Huang, 2014).
Nanopore sekvenciranje na ta način identificira bazo v DNA neposredno po njenih fizičnih lastnostih in ne zahteva kemijskega označevanja ali modifikacije. V primerjavi z metodami NGS, ki zahtevajo fluorescentno označene DNA nukleotide in dolg čas za vsak cikel dodajanja nukleotidov (dodajanje, fluorescenčno slikanje nukleotidov in izpiranje), je nanoporni sekvenator hiter, brez oznak in stroškovno učinkovit, omogoča razločevanje in določanje ene molekule ter daljše bralne dolžine (Huang, 2014).
2.2 OXFORD NANOPORE MINION
Nanopore tehnologija ONT MinION, ki so jo javno ponudili 2014, je majhna naprava, velikosti pametnega telefona, lahka, prenosljiva, z 2048 nanoporami nameščenimi vsaka v svojem membranskem obroču kot del ene pretočne celice (flow cell). MinION je 90 gramska prenosna naprava. V njenem jedru je pretočna celica, ki nosi do 2048 individualno naslovljivih nanopor, ki jih je mogoče nadzorovati v skupinah po 4 z integriranim vezjem, specifičnim za aplikacijo (ASIC) (Jain in sod., 2016).
Postopek gradnje knjižnice je sestavljen iz več korakov, ki se izvajajo v naslednjem vrstnem redu: razrez genomske DNA z uporabo Covaris g-TUBE, neobvezen korak prePCR za popravilo poškodovane DNA, popravilo koncev, da se ustvarijo topi konci v fragmentirani DNA in neobvezen korak PCR, dodajanje adenina na 3' konec fragmenta, vezava adapterja in končno čiščenje z magnetnimi kroglicami za odstranitev nukleotidov in encimov. Knjižnica običajno vsebuje dva adapterja, vodilni adapter in adapter za lasnice, ki sta ligirana na konce dsDNA. Vodilni adapter je označen kot "Y adapter", saj ima strukturo v obliki črke "Y", medtem ko se adapter s strukturo lasnice imenuje "HP adapter". Zaporedje se začne brati na enojnem 5′ koncu Y adapterja, čemur sledi primarna veriga, nato HP adapter in
(i) (ii) (iii) (iv)
Čas
Tok
4
komplementarna veriga. Nadomestna metoda priprave knjižnice ne uporablja HP adapterja za povezavo obeh verig DNK molekule. Namesto tega nanopora bere samo primarno verigo. To omogoča večjo prepustnost pretočne celice, vendar je natančnost teh 1D branj nekoliko nižja kot pri prej omenjenemu 2D branju, ki zaporedno sekvencira tudi komplementarno verigo in tako dvigne število branj na nukleotid in tako izboljša odstotek pravilne določitve nukleotidov (Lu in sod., 2016).
Ti adapterji olajšajo zajemanje in nalaganje procesnega encima na 5′ koncu ene verige.
Adapterji koncentrirajo tudi substrate DNA na membranski površini, ki je blizu nanopore, kar poveča hitrost zajema DNA za nekaj tisočkrat (Jain in sod., 2016).
Slika 2 prikazuje potovanje DNA molekule skozi poro pri 2D branju, ki poteka sledeče. Motorni protein zajame Y adapter in se pomika proti 3′ koncu, kar poriva verigo skozi nanoporo. Protein začne odvijati dsDNA, ko se približuje prelomnici komplementarne regije Y adapterja. Na tej točki se prva veriga prenese v nanoporo s hitrostjo, ki jo določa motorični protein. Ko je dosežen HP adapter, se v motorični protein vstavi še komplementarna veriga DNA, ki se na enak način prenaša skozi nanoporo. Nato lahko izvedemo osnovno določanje (basecalling) baznega zaporedja (Lu in sod., 2016).
Slika 2: Prikaz prehoda molekule skozi poro pri 2D branju. (i) prazna pora na membrani, (ii) zajetje Y adapterja (modra) v poro, (iii) prehod Y adapterja skozi poro, (iv) prehod primarne verige (rumena), (v) prehod HP adapterja (rdeča), (vi) prehod komplementarne verige (vijolična), (vii) prehod adeninskeda repa (rjava) (Jain in sod., 2016).
Ko DNA prehaja skozi pore, senzor zazna spremembe v ionskem toku, ki jih povzročajo razlike v premikajočih se nukleotidnih zaporedjih, ki trenutno zasedajo poro. Te spremembe ionskega toka so segmentirane kot ločeni dogodki s povezanim trajanjem, srednjo amplitudo in varianco.
To zaporedje dogodkov se nato računsko interpretira kot zaporedje 3–6 nukleotidov dolgih k- merov (tako imenovanih besed) z uporabo grafičnih modelov. Informacije iz primarnih in
5
komplementarnih odčitkov se kombinirajo, da se ustvari visokokakovostno 2D branje z uporabo poravnave zaporedij dogodkov v parih ali preprostejše 1D branje samostojnih dogodkov (Jain in sod., 2016).
Optimalno pot program išče preko implementacije skritega Markovega modela (HMM) zaporednih besed z uporabo Viterbi algoritma. MinION naredi eno datoteko FAST5 na branje.
Format datoteke FAST5 temelji na hierarhičnem podatkovnem standardu 5 (HDF5). Datoteke FAST5 imajo torej hierarhično strukturo, kar pomeni, da lahko skupaj z dogodki shranijo tako metapodatke, povezane z branjem, vključno z beleženjem dogodkov (podatki o spremembah v toku) (Lu in sod., 2016).
3 PREDNOSTI NANOPORE SEKVENCIRANJA IN TEHNOLOGIJE MinION Sekvenciranje na MinION platformi zahteva minimalni vložek v primerjavi s tehnologijami, ki jih ponujajo Illunima, Thermo Fisher in druga vodilna podjetja na tem področju. Uporablja se lahko tako v laboratoriju kot na terenu, zahvaljujoč velikosti primerljivi pametnemu telefonu ter možnosti povezave na MinIT, dodatni računalniški modul, ali pa računalnik preko USB povezave, kar omogoča analizo DNA in RNA molekul v realnem času za številne aplikacije vse od agronomije do osebne medicine (Petersen in sod., 2019). Največja slabost od predstavite te tehnologije javnosti je bila le 90 % natančnost branja posameznih baz v zaporedju, kar se bistveno popravi z 2D načinom branja, ONT pa je prav tako od takrat tudi izboljšal pretočne celice z novimi nanoporami, ki dosegajo tudi do 99 % natančnost, kar pa je že primerljivo z nekaterimi NGS tehnologijami (Petersen in sod., 2019).
Prednosti te tehnologije so številne. Ne le, da je mogoče opravljati dolga sekvenciranja do 2Mb dolžine v enem branju, ampak tudi spremljati rezultate v realnem času, kar je v diagnostiki pomembno za čimprejšnje rezultate in uporabo le teh v postopku diagnoze. Ena pretočna celica lahko hkrati pregleduje vzorce več pacientov, pri čemer generira med 4 in 8 GB podatkov.
Pretočno celico se lahko ponovno uporabi do desetkrat oz. za do 72 ur delovanja, kar še dodatno zniža stroške. Še ena prednost ONT inovacije je kratka predpriprava vzorcev za sekvenciranje.
Če je gostota genetskega materiala v vzorcu zadostna je na voljo komplet za hitro označevanje, ki omogoča le 10 minutno inkubacijo pred nalaganjem na pretočno celico. Na voljo je več kompletov za različne aplikacije z različnimi časovnimi okvirji (Petersen in sod., 2019).
V nadaljevanju se bom osredotočil na določene prednosti, ki imajo vpliv na delo z MinION napravo.
3.1 PROGRAMSKA OPREMA IN OBDELAVA PODATKOV
Za zajem podatkov in nastavitve za parametre postopka se največ uporablja osnovni program MinKNOW. Omogoča izvoz podatkov v različnih oblikah, ki se jih lahko nato dodatno obdeluje
6
v drugih programih. Za uporabnike z naprednim bioinformacijskim znanjem so na voljo tudi lokalna orodja kot je program za določanje zaporedij Guppy, ki omogočajo več možnosti za analizo podatkov, ki lahko pomagajo pri povečevanju natančnosti ter omogočajo avtomatsko odstranjevanje adapterskih sekvenc, poravnavo zaporedji, identifikacijo spremenjenih nukleotidov itd (Petersen in sod., 2019).
ONT je kasneje izdal samostojni program za določanje nukleotidov Albacore, ki ga je mogoče zagnati lokalno ali v grozdu visoko zmogljivih računalnikov (HPC). To je dodalo zmožnost izvedbe določanja nukleotidov 2D podatkov in z MinKNOW 1.5.5, izdan marca 2017, saj je bil MinKNOW dodelan z Albacore 0.8.4. (Leggett in Clark, 2017).
ONT je za manj napredne uporabnike razvil skupek aplikacij EPI2ME, ki omogoča uporabniku analizo rezultatov na bolj prijazen predvsem grafični način, namesto preko ukazne vrstice.
Nekatere izmed funkcij, ki so na voljo so različne analize, razvrščanje po barkodah, obrezovanje adapterskih sekvenc in primerjanje z referenčnimi genomi. Za mikrobne vzorce je na voljo tud i taksonomsko uvrščanje. ONT prav tako razvija nove adapterje in izboljšave, ki bi še bolj znižali stroške in pripomogli pri hitrejši identifikaciji in detekciji patogenov ter karakterizaciji odpornostnih genov (Petersen in sod., 2019).
3.2 PRENOSLJIVOST IN ZMOŽNOST DELOVNJA V EKSTREMNIH POGOJIH Način sekvenciranja, ki ga uporablja MinION omgoča, da je naprava bolj mobilna in robustna v primerjavi z drugimi NGS tehnologijami. Številni biološki viri in nevarnosti planeta so zaprti v državah, nedostopnih za moderno laboratorijsko opremo. Namesto časovno zamudnega in logistično napornega dela prevažanja vzorcev v laboratorij, MinION omogoča sekvenciranje kar v najbolj odročnih lokacijah. Skupina raziskovalcev je tako uspela identificirati različne vrste mikroorganizmov v permafrostu Arktike s sekvenciranjem rRNA 16s (Goordial in sod., 2017).
Kontrastno je skupina, s sekvenciranjem DNA barkod, v toplih podnebjih Ekvadorja, identificirala vrsto žabe in 3 vrste kač, 2 od tega novi, ki so jih sekvencirali kar v improviziranem laboratoriju v deževnem gozdu (Pomerantz in sod., 2018).
Presenetljivo so raziskovalci uspeli sekvencirati DNA z MinION-om na Med narodni vesoljski postaji. Rezultati sekvenciranja vzorcev E. coli K-12, bakteriofaga in miši BALB niso kazali opaznih razlik, kar kaže na impresivne zmožnosti MinION naprave za delovanje v ekstremnih pogojih (Castro-Wallace in sod., 2017).
7
3.3 SPREMLJANJE REZULTATOV V REALNEM ČASU IN HITROST SEKVENCIRANJA
Kljub napredkom ostalih NGS tehnologij MinION ostaja med hitrejšimi metodami sekvenciranja za različne diagnostične in raziskovalne postopke.
Natančna molekularna identifikacija iz zbranih vzorcev z ekstrakcijo DNA, koncentracijo, pripravo knjižnice, sekvenciranjem, bioinformatiko in taksonomsko interpretacijo lahko traja le nekaj ur. Brez posebnega koraka za ekstrakcijo DNA je lahko identifikacija bakterijskih človeških patogenov iz urina opravljena v 4 urah. Več študij poroča o izvajanju celotnega poteka analize v enem dnevu. Ko upoštevamo ves tehnološki napredek v molekularnih in bioinformatičnih analizah, lahko postopek nanopor sekvenciranja za rastlinska in živalska tkiva potencialno zmanjšamo na manj kot 2 uri za metagenome in okoli 3 ure za amplikone. To vseeno zahteva, da se DNA vzorec pridobi v visoki količini in čistosti ter pomnoževanje izvaja z metodami, hitrejšimi kot z običajnimi počasnimi DNA polimerazami. Prav tako se mora knjižnice pripraviti s hitrimi kompleti in čas sekvenciranja omejiti na približno 15 minut po doseganju kritičnega števila odčitkov. Teh naštetih ekspresnih diagnostičnih stopenj MinION naprave ni mogoče premagati z instrumenti drugih platform NGS, ki zahtevajo več ur za pripravo knjižnice in vsaj 1 dan za sekvenciranje. Čeprav pride zaradi krajših postopkov do slabše natančnosti, so pridobljeni rezultati zadostni za uporabo pri identifikaciji znanih patogenov in primerni za diagnostiko rastlin, živali in človeka (Loit in sod., 2019).
Raziskovalci so celo dobili rezultate o prisotnosti begomovirusov, ki povzročajo mozaično bolezen kasave, v 11 sekundah po začetku sekvenciranja, ko so MinION uporabljali za nadzor hrane in zniževanje izgub v Tanzaniji, Ugandi in Keniji (Runtuwene in sod., 2019).
3.4 ZMOŽNOST BRANJA DALJŠIH MOLEKUL
Načini sekvenciranja, ki berejo krajše fragmente, imajo visoko natančnost in so bili standard za mapiranje genetsko raznolikih regij genomov, a imajo določene težave, ki jih lahko razrešimo z sekvenciranjem fragmentov dolžine več tisoč baz ali še daljše. Tovrstni načini sekvenciranja imajo manj težav pri ločljivosti v kompleksnih delih genomov, lažje pravilno določijo sekvenco ponavljajočih regij, kjer kratka branja ne bodo pravilno sestavljena, lažje detekcije strukturne variacije, velikih podvojenih segmentov in paralognih regij genoma ter sekvenci dodajo več konteksta v genomu. Bolje omogočajo tudi de novo sestavljanje iz dolgih odčitkov, ki zajema nizko zapletene in ponavljajoče se regije, za ustvarjanje natančnih sklopov, ciljno sekvenciranje kompleksnih genomskih in paralognih regij in ločitev faze za klinične aplikacije. Tehnologija je uporabna tudi v transkriptomiki, ki omogoča sekvenciranje celotnih izoform in pregledovanje spajanja ter posameznih molekul, kar omogoča pregled klonske heterogenosti patogenov in imunogenih celic (Pollard in sod., 2018).
8
Nedavne izboljšave beljakovinske pore, tehnike priprave knjižnic, hitrost sekvenciranja (450 baz/s) in nadzorna programska oprema so povečali pretočnost, kar je vodilo do sekvenciranja ultra dolgih fragmentov človeškega genoma, tudi do 882 kb dolžine, kjer je raziskovalcem uspelo določiti 12 prej neznanih regij v genomu (Jain in sod., 2018). Trenutni rekord najdaljše prebranega DNA fragmenta pa je 4.2 Mb (Oxford Nanopore Technologies, 2021).
Podobne rezultate so dosegli raziskovalci, ki so sekvencirali 9 bakterijskih genomov z različnimi vsebnostmi GC baz, in uspešno pridobili rezultate z daljšimi branji z MinION-om v težavnih regijah (Goldstein in sod., 2019).
4 MODERNA DIAGNOSTIKA IN EPIDEMIOLOGIJA
Za nadzor potencialno smrtonosnih patogenov so potrebni pravočasni, celoviti nadzorni sistemi. V moderni diagnostiki in posredno tudi epidemiologiji se pojavlja nujnost po hitrejših načinih pridobivanja podatkov, kot jih uspejo zagotoviti tradicionalni postopki. Ti starejši sistemi se trenutno opirajo na štetje primerov in simptomov ter preproste tehnike genotipiziranja, vendar bi bilo mogoče nadzor z genomiko znatno izboljšati (Gardy in sod., 2015).
V zadnjem času se sekvenciranje genoma kaže kot ključno orodje našega sprotnega odziva na izbruhe nalezljivih bolezni, zato se medicina in znanost pomikata v to smer razvoja. Številni patogeni, ki povzročajo akutno bolezen, se hitro razvijajo in spreminjajo, pri čemer genomi iz celo tesno povezanih primerov pogosto kažejo opazne razlike v nukleotidih v časovnih razmikih od tednov do mesecev. Te razlike se lahko uporabijo za informativne epidemiološke zaključke. Začetno genetsko zaporedje novo nastajajočega virusa lahko s primerjavo z obstoječimi zaporedji, kar zagotovi znatno količino informacij o naravi patogena. Z več sekvenciranimi primeri v izbruhu, lahko analiza genetske raznovrstnosti med prebivalstvom zagotovi ocene, kako hitro se bolezen širi, in pomaga napovedati njen nadaljnji potek. V zgodnjih fazah pandemije gripe A H1N1 leta 2009, se je izkazalo, da je ocena prenosnega potenciala na podlagi genetskega zaporedja primerljiva s tradicionalno epidemiološko oceno, ki daje prvo ovrednotenje nastajajoče se epidemije novega patogena (Gardy in sod., 2015).
Trenutni trend kaže, da se iz genomike patogenov, ki zagotavljajo statične "posnetke" epidemij, pogosto generirane mesece po pojavu primerov, premaknejo v situacijo, kjer uspemo podatke pridobivati sproti in zagotavimo podrobno sliko epidemije, ki je stara le nekaj dni.
Napredovanje visoko zmogljivega sekvenciranja z rezultati v realnem času omogoča v nekaj dneh pridobiti zaporedja celotnega genoma povzročitelja iz kliničnih vzorcev. Genomski epidemiologi si prizadevajo določiti zaporedja patogenov čim hitreje kar na kraju izbruha, brez posredovanja in pošiljanja vzorcev v referenčni laboratorij, kjer pa lahko vstopijo nove tehnologije kot je MinION. Hitri rezultati so ključnega pomena, če želimo poseči v izbruh, ne pa le dokumentirati posledice okužb. Za zelo rizične situacije in izbruhe je uporabni čas
9
pridobljenih genetskih informacij, za vpliv na nadzorne in zdravstvene prakse, izmerjen v dnevih ali tednih. Stroka se zaradi tega oddaljuje od počasnejših tradicionalnih metod diagnosticiranja in spremljanja epidemij proti hitrejšim metodam, ki poskušajo rezultate predstaviti v realnem času (Gardy in sod., 2015).
Z veliko dostopnostjo internetnih povezav skoraj povsod po svetu, so le-te, z integracijo bioinformacijskih tehnologij v to stroko, začele dobro služiti tudi pri hitrosti povezovanja rezultatov med izbruhi, kar tudi postaja standard za boljši nadzor nad rekombinacijami sevov, potrjevanjem okužb med žarišči, boljšo pripravljenost za nadaljnje širjenje in hitrejši odziv oblasti, kjer je to najbolj potrebno (Gardy in sod., 2015).
4.1 PROBLEMATIKA DIAGNOSTIKE S SEKVENCIRANJEM NA TERENU
Hitro pridobivanje zaporedij genoma med izbruhi bolezni je ključnega pomena za razjasnitev vzorcev razvoja virusa, spremljanje veljavnosti diagnostičnih testov in preiskovanje prenosnih verig. Poleg tega lahko hitri rezultati pomagajo določiti učinkovitost protiukrepov, odvisnih od zaporedja, kot so tehnologija malih interferenčnih RNA (siRNA) ali zdravljenje s protitelesi. V preteklosti je bilo pravočasno pridobivanje zaporedij genoma težko zaradi političnih, logističnih in geografskih ovir, ki so omejevale izvoz vzorcev v laboratorije, ki so sposobni izvajati te analize. Na primer, v prvem letu izbruha ebole, ki se je začel leta 2014 v Zahodni Afriki, sta bili objavljeni le dve poročili o zaporedjih genoma povzročiteljev. Podobno je vzpostavitev običajnih Sangerjevih tehnologij ali NGS v prizadetih državah logistično zahtevna zaradi velikosti, teže (≈40 do ≈100 kg) in posebnih priključkov (žlahtni plini, električni vodniki večje moči) potrebne opreme, zaradi česar je veliko možnosti za transportno škodo, povezano z občutljivo optiko, omejitvami podporne infrastrukture in zapletenih postopkov obdelave vzorcev. Dodaten izziv je zahtevana namestitev ali kalibracija naprav za sekvenciranje, kar morajo pogosto opraviti terenski inženirji, zaposleni pri proizvajalcih, ki svoje zaposlene neradi pošiljajo na območja izbruha bolezni. Vendar so znani tudi primeri uspešnih namestitev običajnih platform za zaporedje naslednje generacije, npr. Illumina MiSeq naprave (Illumina, San Diego, CA, ZDA) v zahodni Afriki; ena taka platforma je začela delovati februarja 2015 (Hoenen in sod., 2016).
Genomski nadzor v realnem času je pomembno orodje v našem arzenalu za pomoč pri težavnih epidemioloških preiskavah in za zagotavljanje mednarodnega in okoljskega okvira za nastajajoče nalezljive bolezni, predvsem v regijah, kjer bo odziv na nevarnost počasnejši ali otežen. To lahko izboljša učinkovitost dodeljevanja virov in pravočasnost epidemioloških preiskav z gensko utemeljenimi preiskavami prenosnih verig. Genomski nadzor v realnem času povečuje tudi možnost prepoznavanja prej neznanih verig in vektorjev prenosa. Problem je v sami tehnologiji in opremi, ki je potrebna za izvajanje postopkov sekvenciranja. Na težko dostopnih območjih z slabo razvito infrastrukturo je malo možnosti, da bo NGS oprema uspešno in pravočasno postavljena v smiselno bližino izbruha. Na tem področju MinION kaže
10
veliko potenciala, sploh zaradi boljših zmogljivosti delovanja na odročnih lokacijah, kjer se ti izbruhi pogosteje pojavljajo (Quick in sod., 2016).
5 PRIMERI UPORABE
MinION se je od 2015 že uporabljal po celem svetu in na različnih področjih. V tem poglavju se bom osredotočil na njegovo uporabo v diagnostiki in spremljanju izbruhov, kjer naj bi prednosti, ki jih ima, izboljšale rezultate in delo v določeni situaciji. Mnogi so okoli MinION- a razvili svoje postopke, da se lahko opremo, za svoje namene, izkoristi čim bolj učinkovito.
Dotaknil se bom njegove uporabe pri potrjevanju prisotnosti mnogih patogenov in se nato poglobil v nekatere, ki so bolj zanimivi.
5.1 EBOLA
Ekipa raziskovalcev je sestavila sistem za nadzor genoma ebola virusa, ki so ga lahko prepeljali v Zahodno Afriko v Gvinejo in uporabljali od marca do oktobra 2015. Sistem so sestavljali trije instrumenti MinION, štirje prenosni računalniki in ostala potrebna oprema za izvajanje PCR reakcij ter laboratorijsko delo. Prevoz opreme je bil izveden kar v manj kot 50 kg standardne letalske potniške prtljage. Najprej je bil nadzorni sitem nameščen v Evropski mobilni laboratorij v bolnišnici Donka v Conakryju v Gvineji. Kasneje je bila oprema preseljena v poseben laboratorij, ki se je nahajal v enoti za zdravljenje ebole Coyah (Quick in sod., 2016). Na sliki 3 je prikazan transport opreme in celotna postavitev laboratorija. Sekvenciranje genoma se je lahko začelo v dveh dneh po prihodu v Gvinejo. Skladna zaporedja so primerjali s tistimi pridobljenimi s tehnologijo Illumina v validaciji metode, izvedeni v Združenem Kraljestvu pred odpravo, in ugotovili, da je bil pristop zelo skladen, brez lažno pozitivnih rezultatov. V nekaj primerih ni bilo mogoče določiti različic, ker so spadale bodisi v območje vezave primerja bodisi so bile zunaj regij genoma EBOV, ki jih je zajemal komplet amplikonov. Ti položaji so predstavljeni kot dvoumni nukleotidi v končnih zaporedjih soglasja (konsenzna zaporedja), uporabljenih za analizo. Kljub tem zamaskiranim položajem je filogenetsko sklepanje pokazalo, da so se vzorci združili enako. Ugotovili so, da kljub visoki stopnji napak instrumenta uporaba informacij o električnem toku pomeni, da 25-kratna pokritost branja položajev genoma zadostuje za določitev natančnih genotipov (Quick in sod., 2016).
11
Slika 3: Terenski laboratorij v Gvineji. (a) Transport opreme. (b) Prenosniki s povezanimi MinION napravami. (c) Zgradba laboratorija. (d) Celotna postavitev laboratorija (Quick in sod., 2016).
Po uvedbi sistema za nadzor genomov je lahko ekipa v sodelovanju z diagnostičnimi laboratoriji v Gvineji zagotavljali rezultate zaporedja v realnem času Nacionalni koordinaciji v Gvineji in Svetovni zdravstveni organizaciji (WHO). Postopek sekvenciranja zaporedja genoma, ki so ga razvili, vključno z amplifikacijo, pripravo knjižnice zaporedij in zaporedjem, je mogoče izvesti v delovnem dnevu. V enem primeru, vključno z bioinformatsko analizo na daljavo, je bil najhitrejši čas od vzorca pacienta do odgovora dosežen v manj kot 24 urah, čeprav je bil protokol običajno opravljen v dveh delovnih dneh. V polovici primerov je MinION uspel ustvariti zadostno količino odčitkov sekvence (med približno 5000 in 10.000) v manj kot eni uri. V 6-mesečnem obdobju je bilo v 148 poskusih z MinION-om sekvencirano 142 vzorcev, kar je podalo obsežne informacije za prijavljene primere izbruha. Rezultati so uspešno pripomogli do identifikacije dveh sevov, zaznanih prej ločeno v Gvineji in Sierra Leone, kar je kazalo na prenos čez državne meje (Quick in sod., 2016).
To delo dokazuje znatno spremembo sposobnosti za izvajanje genomskega nadzora med izbruhi pod pogoji, omejenimi z viri. Še vedno pa obstajajo številne ovire, preden so takšne genomsko preiskave rutinske, čeprav MinION občutno olajša postopek vzpostavitve delovnega okolja in delo samo. Predvsem so v ospredju logistične težave, na primer odsotnost zanesljive
12
neprekinjene električne energije. Na MinION niso vplivali izpadi in sunki električne energije.
Pogoste so bile tudi težave z internetno povezljivostjo (Quick in sod., 2016).
V času objave je bil edini način za določanje baz (basecalling) iz surovih podatkov MinION-a le Metrichor, internetna storitev v oblaku, kamor so se naložili podatki ustvarjeni med sekvenciranjem, ki so se nato obdelali na strežniku. Raziskovalci so nazaj prejeli obdelano datoteko, ki je vsebovala sekvence. ONT te storitve trenutno ne ponuja več, a je izdal samostojni program za določanje baz iz surovih podatkov MinKNOW, zmožen lokalnega delovanja na računalniku, ki napaja MinION, in upravljati njegovo delovanje. Kasneje je bil program še izboljšan s funkcionalnostjo programa Albacore (Leggett in Clark, 2017).
Ključnega pomena je, da so lahko raziskovalci v tem projektu v rednih časovnih presledkih lahko objavljali podatke, ki so rezultate povezovali z rezultati drugih, ki so bili interaktivno prikazani in dostopni na internetu drugim raziskovalcem.
Po lastni validaciji naprave je druga ekipa MinION odpeljala v terenski laboratorij Centra za nadzor in preprečevanje bolezni (CDC), ki je od avgusta 2014 do maja 2015 zagotavljal diagnostično podporo v Monroviji v Liberiji. Vsa oprema in reagenti, potrebni za sekvenciranje, niso predstavljali transportnih težav in so se preprosto prevažali kot osebna prtljaga. V Liberiji so se temperature v laboratorijskem območju, ki so ga uporabljali za analize, gibale med 28 in 32 ° C, zato je bila za naprave MinION potrebna improvizirana hladilna naprava, ki je bila sestavljena iz kovinske plošče ≈30 × 30 cm (Hoenen in sod., 2016).
Težave v postopku so predstavljale PCR reakcije zaradi povišanih temperatur okolja v terenskem laboratoriju, a so z dodatnim korakom reakcijo uspešno modificirali postopek za take pogoje. V vzorcih z nižjo koncentracijo virusa so lahko dobili le nepopolna zaporedja genoma.
Vendar so tudi v tistih vzorcih regije, za katere so bile na voljo informacije o zaporedju, na splošno pokazale velike globine branja, kar kaže, da bi lahko nadaljnja optimizacija PCR pomnoževanja omogočila tudi popolno pokritost teh vzorcev. Poleg tega lahko celo nepopolna zaporedja genoma med izbruhom zagotovijo dragocene informacije, ki omogočajo analizo posamezni h genov in sledenje prenosnih verig virusa (Hoenen in sod., 2016). S tem posodobljenim protokolom je ekipa dosegla zmogljivost 4 genomov v polni dolžini na dan na eno osebo, ki izvaja laboratorijska dela z uporabo 2 naprav MinION. Analiza bioinformatike med to misijo je bila, z izjemo prvih dveh zaporednih sekvenc, v glavnem zaključena po vrnitvi iz terena, da bi čim bolj povečali čas za pridobivanje surovih podatkov (Hoenen in sod., 2016).
Filogenetska analiza celotnih genomov, ustvarjenih v Monroviji v Liberiji, je pokazala, da se jasno razlikujejo od Sierra Leone ali zgodnjih gvinejskih sekvenc EBOV-Makona, vendar se dobro združujejo z vsemi drugimi zaporedji, ki jih najdemo v vzorcih iz Liberije. Ti rezultati kažejo, da je EBOV v Liberiji izhajal iz enega samega vnosa ali omejenega števila vnosov z genetsko podobnimi virusi. Analiza pridobljenih celotnih zaporedji in primerjava s konsenznim
13
zaporedjem izbruha, je pokazala nekaj mutacij, največ v nekodirajočih regijah ali sinonimnih mutacijah; nobena ni vplivala na ciljna zaporedja siRNA ali diagnostična območja, uporabljena v laboratoriju CDC (Hoenen in sod., 2016).
Ti rezultati so bili velikega pomena za spremljanje sprememb genoma sevov in posledično preverjanje potrebe prilagajanja načinov zdravljenja in taktik cepljenja.
Leta 2017 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) priporočila uporabo cepiva kandidata za rekombinantni vezikularni stomatitis - virus zairske ebole (rVSV-ZEBOV) kot dodaten ukrep za preprečevanje in nadzor v primeru novih izbruhov seva EBOV. To cepivo se je izkazalo za učinkovito in varno ter se uporabljalo med upadanjem epidemije EBOV v Gvineji leta 2015 in med porastom bolezni na podeželju Gvineje leta 2016. Vendar pa so v Afriki dokumentirane 4 vrste virusov ebole: Zaire (EBOV), Sudan (SUDV), Bundibugyo (BDBV) in Tai Forest. Medtem ko je sedem od osmih prejšnjih epidemij v Demokratični republiki Kongo posledica EBOV seva, je bil za izbruh bolezni v Isiru leta 2012 odgovoren BDBV sev, prejšnji izbruhi v Južnem Sudanu pa so bili blizu meje z Demokratično republiko Kongo in ga je povzročil SUDV sev (Mbala-Kingebeni in sod., 2019).
V Kongu so 8. maja 2018 razglasil nov izbruh bolezni virusa ebole v provinci Ekvatur, kjer je ekipi uspelo z MinION-om potrditi EBOV sev v enem dnevu. Zato je potrjevanje virusnih sevov katerega koli novega izbruha toliko bolj pomembno, da zagotovimo koristnost cepljenja proti ebola EBOV sevu. Uporaba in uspešna pomoč pri sanaciji z MinION-om poudarja pomen lokalnih programov za krepitev zmogljivosti za hitro potrditev patogenov in ustrezne intervencije na področju javnega zdravja (Wawina-Bokalanga in sod., 2019).
5.2 RUMEN MRZLICA
Kljub obstoju učinkovitega cepiva proti rumeni mrzlici (YFV) je še vedno vsako leto skoraj 80.000 smrtnih žrtev zaradi te okužbe. Od leta 2016 se v Afriki in Južni Ameriki ponovno pojavljajo primeri - in to v času, ko cepiva primanjkuje. Obstaja skrb, da se bo rumena mrzlica razširila iz gozdov v mesta, ker je njen prenašalec Aedes spp. komarji, so prisotni po vsem s vetu. Med izbruhom leta 2016 se je pojavila nujnost, da bi ocenili vzorce geografskega širjenja, tveganja za izpostavljenost virusom in prispevke prenosa s podeželja v mesto (Faria in sod., 2018).
MinION je bil uporabljen za genomski nadzor izbruha rumene mrzlice v Braziliji. Sedemdeset odstotkov novih zaporedij je bilo ustvarjenih z uporabo MinION-a, kar dodatno dokazuje sposobnost, da dopolnjuje in potencialno nadomešča uveljavljene tehnike. Med izbruhom je pomembno izvesti virološki nadzor, da se izsledi epidemični izvor in žarišča prenosa, opredeli gensko raznolikost za pomoč pri molekularni diagnostiki, odkrije virusne mutacije, povezane z resnostjo bolezni in izključi možnost, da človeške primere povzroči reverzija cepiva (Faria in sod., 2018).
14
V Amerikah se prenos YFV dogaja predvsem prek silvatičnega cikla, v katerem nečloveške primate (NHP) okužijo drevesni vektorji komarjev, kot je Haemagogus spp. in Sabethes spp.
Prenos YFV se lahko zgodi tudi po urbanem ciklu, v katerem so ljudje okuženi z Aedes spp.
komarji, ki se večinoma prehranjujejo s človeško krvjo. Ustvarjenih je bilo 62 popolnih genomov YFV od okuženih ljudi (33 primerov) in NHP (29 primerov) iz najbolj prizadetih brazilskih držav. Genomi so bili posekvencirani v Braziliji, polovica od njih je bila pridobljena z uporabo prenosnega protokola sekvenciranja z MinION napravo, ki je bil prilagojen za ta primer. Ta protokol je bil javno dostopen maja 2017 po zaključku pilotnih preiskav izvedenih na gojenem sevu, ki se je uporabljal za pripravo cepiva. Mediana pokritosti genoma je bila podobna za vzorce, pridobljene iz NHP in iz primerov pri ljudeh (99 %) (Faria in sod., 2018).Da bi novo zaporedje genov YFV postavili v globalni kontekst, so bili genomi dodani skupini 61 javno dostopnih genomov. Razvito in uporabljeno je bilo avtomatizirano spletno filogenetsko orodje z a prepoznavanje in razvrščanje zaporedij genov YFV. Filogenije, ocenjene s tem orodjem, seve brazilskih izbruhov dosledno postavljajo v eno klado znotraj genotipa Južne Amerike I (SA1) z največjo statistično podporo (Faria in sod., 2018).
Genetske informacije pridobljene iz teh postopkov so pomagale pri potrditvi prenosa okužbe s primata, v kombinacij z epidemiološkimi informacijami in izračuni. Okvir za oceno poti prenosa YFV med izbruhom je preverjal rizične značilnosti okuženih posameznikov. Na primer, tveganje posameznika za pridobitev YFV prek silvatičnega cikla je odvisna od njegove verjetnosti, da potujejo na gozdnata območja, kar je običajno največ pri odraslih moških.
Nasprotno pa je v urbanem ciklu pričakovana bolj enakomerna izpostavljenost med starostnimi in spolnimi razredi. Z ovrednotenjem pogostejšega spola in starostne skupine okuženih glede na vektor okužbe, so s statistično zanesljivostjo ovrgli urbani cikel prenosa in predvidevali okužbo preko vektorjev, ki se primarno prehranjujejo z primati. To je bil pomemben podatek za bolj natančno karakterizacijo izvora izbruha, ki je najverjetneje izviral iz endemične skupine primatov, kar dodatno potrdi, da ni prišlo do novih vnosov drugih sevov (Faria in sod., 2018).
Vsaj sedem ljudi s PCR potrjeno YFV je prejelo cepivo YF pred pojavom simptomov. Za potrditev, da je te pojave povzročila naravna okužba in ne ponovna aktivacija cepiva, se je za 3 primere sekvenciral genom YFV. Filogenetska analiza je pokazala, da predstavljajo naravne okužbe, ki jih povzroča trenutni izbruh, in zagotovo ne izvirajo iz seva cepiva 17DD (ki spada v genotip zahodnoafriške YFV) (Faria in sod., 2018).
5.3 ČIKUNGUNJA VIRUS
Chikungunya je vročinska bolezen, ki se prenaša s komarji in jo povzroča virus Chikungunya (CHIKV), ki je virus RNA s pozitivnimi verigami iz rodu Alphavirus. V zadnjem desetletju so po vsem svetu poročali o resnih izbruhih čikungunje. CHIKV so filogenetsko razvrščeni v tri
15
glavne genotipe, Zahodno Afriko, Azijo in Vzhodno-Srednjo Južno Afriko (ECSA). Azijski genotip je bil vzrok nedavnih izbruhov na Karibih in v ZDA.
V Braziliji sta že bila zabeležena azijski in ECSA sev, izbruh v Riu de Janeiru leta 2014, pa naj bi povzročil prav ECSA. Poročali so, da sta filogenetska raznolikost in razlike v infektivnosti med CHIKV lahko korelirane, razvoj CHIKV pa je lahko povezan z virusno prilagoditvijo v prenašalcih komarjih in sesalskih gostiteljih (Hayashida in sod., 2019). Ker so klinične značilnosti chikungunye podobne drugim vročinskim boleznim, ki se prenašajo s komarji, vključno z mrzlico denga, vročino Zika in malarijo, je diferencialna diagnoza teh bolezni na podlagi kliničnih znakov v endemičnih regijah težavna. Dokončna diagnoza temelji na serologiji, izolaciji virusa ali odkrivanju genoma s PCR z reverzno transkripcijo (RT-PCR) iz vzorcev, pridobljenih iz pacientov (Hayashida in sod., 2019).
Metoda z zanko posredovanega izotermalnega pomnoževanja (LAMP) je časovno učinkovita metoda pomnoževanja nukleinskih kislin. Metodo lahko uporabimo za odkrivanje genov virusov RNA, če je v reakcijo vključena reverzna transkriptaza (reverzna transkripcija LAMP;
RT-LAMP). Z uporabo metod LAMP in RT-LAMP lahko amplifikacijsko reakcijo nukleinskih kislin preprosto izvedemo v izotermičnih pogojih v npr. vodni kopeli brez drage opreme. Na podlagi teh lastnosti je skupina raziskovalcev poskusila razviti enostopenjski, enostavni in
"uporabniku prijazen" test pomnoževanja genov na osnovi LAMP v kombinaciji s sekvenciranjem z MinION napravo za hitro odkrivanje CHIKV. Amplifikacijska občutljivost postopka je bila nekoliko nižja od standardnih postopkov detekcije s kvantitativnim PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR). Uporabljeni so bili že uveljavljeni sklopi primerjev, ki so ciljali na regijo E1 genoma CHIKV. Za diagnozo okužbe s CHIKV so priporočljive metode odkrivanja prisotnosti virusne RNA pred 6 dnevom po pojavu simptomov. Virusni titer se razlikuje glede na posameznike ali virusne genotipe, kar lahko povzroča težave za MinION. Po 5 dneh po pojavu simptoma se priporočajo dodatni serološki testi, saj naj bi bila količina virusnega genoma premajhna za uporabne rezultate. Negativne rezultate postopka pri nekaterih bolnikih, okuženih s CHIKV, ki so imeli razmeroma majhno virusno obremenitev, lahko povzroči zapozneli pojav simptomov po okužbi s CHIKV. Postopek lahko okužbo zazna v zgodnjih fazah le pri visokih titrih virusnih delcev. Kljub temu bi novo razviti postopek lahko šteli za boljšega od metode qRT-PCR glede izvedljivosti, saj ni potrebe po pomembnih tehničnih veščinah ali dragi opremi. Kljub temu je postopek uspešno določi prisotnost CHIKV tudi v kasnejših validacijskih testih. Poleg tega pa ima prednosti enostavnosti transportiranja in nizkih stroškov zahvaljujoč MinION-u (Hayashida in sod., 2019).
5.4 RAZVOJ MULTIPLEKSNEGA TESTA ZA VIRUSE HEMORAGIČNE MRZLICE Virusna hemoragična mrzlica je huda in potencialno smrtonosna bolezen, za katero so značilni zvišana telesna temperatura, slabo počutje, bruhanje, krvavitev iz sluznice in prebavil ter hipotenzija, pri kateri je prizadetih več organskih sistemov. Zaradi mednarodnega prevoza in
16
svetovne trgovine se lahko izbruhi virusne hemoragične vročine hitro širijo in prizadenejo veliko število dovzetnih posameznikov. Tako je nujna zanesljiva diagnostika za identifikacijo povzročitelja virusa. Vendar to otežuje število in raznolikost virusov, povezanih s hemoragično mrzlico. Več virusov, razvrščenih v družine Arenaviridae, Filoviridae, Flaviviridae in Bunyavirales, lahko povzroči simptome vročinske bolezni s hemoragičnimi simptomi (Brinkmann in sod., 2017).
Raziskovalci so za namen olajšane diagnoze sestavili hkratni test (multiplex) z dvema kompletoma z 285 in 256 pari začetnih oligonukleotidov za identifikacijo 46 vrst virusov, ki povzročajo hemoragično vročino, in zajemata 6130 genetskih različic sevov. Ciljna amplifikacija je zagotovila odkrivanje virusnega odčitka v vzorcih z najnižjo koncentracijo virusa (1–10 ekvivalentov genoma) in omogočila znatno povečanje specifičnih odčitkov v ozadju za vse preiskane viruse. Za sekvenciranje so izbrali MinION, ki omogoča dodatno znižanje stroškov in pohitritev postopka sekvenciranja (Brinkmann in sod., 2017).
Naslednja generacija sekvenciranja je zagotovila nove možnosti za identifikacijo virusov, vključno s hkratnim in nepristranskimi presejalnimi testi različnih patogenov ter hkratni analizi velikega števila različnih vzorcev v enem zaporednem poteku analize, kar znatno zniža stroške takšnega testa.. Poleg tega je razvoj platform za sekvenciranje v realnem času omogočil obdelavo in analizo posameznih osebkov v sprejemljivem času (Brinkmann in sod., 2017).
Test je bil preverjen z vzorci seruma, pridobljenimi med akutno fazo bolezni, ki jo povzroča CCHFV, sekvenciran na napravi MinION. Ta pristop je omogočil odkrivanje in karakterizacijo virusov v 10 minutah po zagonu sekvenciranja in ga je mogoče zaključiti v manj kot 3,5 urah.
Čas obdelave vzorcev se bo verjetno še skrajšal z nedavno razvitimi možnostmi hitre priprave knjižnice. Medtem ko je trajanje poteka dela daljše, so ostale NGS platforme zelo primerne za vzporedno preiskovanje večjih števil vzorcev. Med preiskavami izbruhov bolezni, kjer je s PCR nepraktično in drago testirati več posameznih povzročiteljev, lahko ta pristop zlahka zagotovi informacije o povzročitelju. To dodatno olajša pravočasno izvajanje ukrepov za zadrževanje in nadzor, hiter potek pa omogoča pravočasno implementacijo teh ukrepov in bolj učinkovito spremljanje izbruha (Brinkmann in sod., 2017).
Glavna slabost testa je ta, da ta potrebuje redno posodabljanje z novimi pari začetnih oligonukleotidov za na novo odkrite viruse za učinkovito uporabo. Kljub temu to ne predstavlja hudih težav z današnjimi hitro dostopnimi sekvencami in zasnovo testa. Le-ta je razmeroma prilagodljiva in je možno glede na nedavno objavljene genome virusov mogoče dodati pare začetnih oligonukleotidov v obstoječi komplet. Preliminarni testi pa so pokazali, da povečano število primerjev ne vpliva bistveno na potek sekvenciranja. Poleg tega bi lahko posodobljeni test zajemal tudi morebitne nevirusne patogene, pomembne za diferencialno diagnozo (Brinkmann in sod., 2017).
17 6 ZAKLJUČEK
Kljub nekaterim zadržkom stroke proti MinION sekvencerju v njegovih začetkih zaradi slabše natančnosti, se je naprava pokazala kot zelo uporabna in mogoče celo nujna za uporabno na odročnih lokacijah, kjer je hitro določevanje povzročitelja izbruha še toliko bolj pomembno.
Uspešne diagnoze so raziskovalci dosegali v težkih pogojih s slabo podporno infrastrukturo, v različnih podnebjih, kamor bi bilo ostale NGS tehnologije težko prepeljali ali vzpostaviti dovolj hitre delovne protokole. Z nadgradnjami programske opreme in pretočnim celicam se zmogljivost naprave povečuje in dosega zadostne natančnosti za de novo sestavljanja virusnih in bakterijskih genomov, celo dopolnjevanje človeškega genoma z ultra dolgimi branji, a je uspešno delovanje odvisno od zadostne količine dednega materiala. Hitrost, fizične karakteristike, preprosta uporaba in sam način sekvenciranja dajejo MinION-u prednost pred ostalimi za hitro diagnostično in epidemiološko delo na terenu ter ga validirajo za uporabo tudi v laboratorijskih preiskavah zgolj raziskovalne narave. Kljub težavam pri določenih aplikacijah in težavah pri nizkih koncentracijah dednega materiala, zagotovo pričakujem vedno bolj pogosto uporabo te naprave, ne samo v znanstvenih strokah, ampak tudi na bolj civilni ravni.
7 VIRI
Brinkmann A., Ergünay K., Radonić A., Tufan Z. K., Domingo C., Nitsche A. 2017.
Development and preliminary evaluation of a multiplexed amplification and next generation sequencing method for viral hemorrhagic fever diagnostics. PLOS Neglected Tropical Diseases, 11(11), e0006075, doi:10.1371/journal.pntd.0006075: 13 str.
Castro-Wallace S. L., Chiu C. Y., John K. K., Stahl S. E., Rubins K. H., McIntyre A. B. R., Dworkin J. P., Lupisella M. L., Smith D. J., Botkin D. J., Stephenson T. A., Juul S., Turner D. J., Izquierdo F., Federman S., Stryke D., Somasekar S., Alexander N., Yu G., Burton A.
S. 2017. Nanopore DNA Sequencing and Genome Assembly on the International Space Station. Scientific Reports, 7(1), 18022, doi:10.1038/s41598-017-18364-0: 12 str.
Deamer D., Akeson M., Branton D. 2016. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology, 34, 5: 518–524
Faria N. R., Kraemer M. U. G., Hill S. C., de Jesus J. G., Aguiar R. S., Iani F. C. M., Xavier J., Quick J., Carvalho R. D. O., Baele G., Pereira M. A., Pereira G. C., Lourenço J., Obolski U., Abade L., Vasylyeva T. I., Giovanetti M., Yi D., Weiss D. J., Mendonça M. C. L. 2018.
Genomic and epidemiological monitoring of yellow fever virus transmission potential.
Science, 361, 6405: 894-899
Gardy J., Loman N. J., Rambaut A. 2015. Real-time digital pathogen surveillance—The time is now. Genome Biology, 16(1), 155, doi:10.1186/s13059-015-0726-x: 3 str.
18
Goldstein S., Beka L., Graf J., Klassen J. L. 2019. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics, 20(1), 23, doi:10.1186/s12864-018-5381-7: 17 str.
Goordial J., Altshuler I., Hindson K., Chan-Yam K., Marcolefas E., Whyte L. G. 2017. In Situ Field Sequencing and Life Detection in Remote (79°26′N) Canadian high Arctic permafrost ice wedge microbial communities. Frontiers in Microbiology, 8, doi:10.3389/fmicb.2017.02594: 14 str.
Hayashida K., Orba Y., Sequeira P. C., Sugimoto C., Hall W. W., Eshita Y., Suzuki Y., Runtuwene L., Brasil P., Calvet G., Rodrigues C. D. S., Santos C. C. dos, Mares-Guia M.
A. M., Yamagishi J., Filippis A. M. B. de, Sawa H. 2019. Field diagnosis and genotyping of chikungunya virus using a dried reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay and MinION sequencing. PLOS Neglected Tropical Diseases, 13(6), e0007480, doi:10.1371/journal.pntd.0007480: 15 str.
Hoenen T., Groseth A., Rosenke K., Fischer R. J., Hoenen A., Judson S. D., Martellaro C., Falzarano D., Marzi A., Squires R. B., Wollenberg K. R., de Wit E., Prescott J., Safronetz D., van Doremalen N., Bushmaker T., Feldmann F., McNally K., Bolay F. K., Feldmann H. 2016. Nanopore sequencing as a rapidly deployable ebola outbreak tool. Emerging Infectious Diseases, 22, 2: 331–334
Huang S. 2014. Nanopore-based sensing devices and applications to genome sequencing: A brief history and the missing pieces. Chinese Science Bulletin, 59, 35: 4918–4928
Jain M., Koren S., Miga K. H., Quick J., Rand A. C., Sasani T. A., Tyson J. R., Beggs A. D., Dilthey A. T., Fiddes I. T., Malla S., Marriott H., Nieto T., O’Grady J., Olsen H. E., Pedersen B. S., Rhie A., Richardson H., Quinlan A. R., Loose M. 2018. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology, 36, 4: 338–345
Jain M., Olsen H. E., Paten B., Akeson M. 2016. The Oxford Nanopore MinION: Delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology, 17(1), 239, doi:10.1186/s13059-016-1103-0: 11 str.
Leggett R. M., Clark M. D. 2017. A world of opportunities with nanopore sequencing. Journal of Experimental Botany, 68, 20: 5419–5429
Loit K., Adamson K., Bahram M., Puusepp R., Anslan S., Kiiker R., Drenkhan R., Tedersoo L.
(2019). Relative Performance of MinION (Oxford Nanopore Technologies) versus Sequel (Pacific Biosciences) Third-Generation Sequencing Instruments in Identification of Agricultural and Forest Fungal Pathogens. Applied and Environmental Microbiology, 85(21), doi:10.1128/AEM.01368-19: 20 str.
Lu H., Giordano F., Ning Z. 2016. Oxford Nanopore MinION sequencing and genome assembly. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 14, 5: 265–279
19
Mbala-Kingebeni P., Villabona-Arenas C.-J., Vidal N., Likofata J., Nsio-Mbeta J., Makiala- Mandanda S., Mukadi D., Mukadi P., Kumakamba C., Djokolo B., Ayouba A., Delaporte E., Peeters M., Muyembe Tamfum J.-J., Ahuka-Mundeke S. 2019. Rapid confirmation of the Zaire Ebola virus in the outbreak of the Equateur province in the Democratic Republic of Congo: Implications for public health interventions. Clinical Infectious Diseases, 68, 2:
330–333
Oxford Nanopore Technologies. Nanoporetech.com. NCM. 2021.
http://nanoporetech.com/about-us/news/ncm-announcements-include-single-read- accuracy-991-new-chemistry-and-sequencing (14. jun. 2021)
Petersen L. M., Martin I. W., Moschetti W. E., Kershaw C. M., Tsongalis G. J. 2019. Third- generation sequencing in the clinical laboratory: Exploring the advantages and challenges of nanopore sequencing. Journal of Clinical Microbiology, 58(1), doi:10.1128/JCM.01315-19: 10 str.
Pollard M. O., Gurdasani D., Mentzer A. J., Porter T., Sandhu M. S. 2018. Long reads: Their purpose and place. Human Molecular Genetics, 27, R2: 234–241
Pomerantz A., Peñafiel N., Arteaga A., Bustamante L., Pichardo F., Coloma L. A., Barrio- Amorós C. L., Salazar-Valenzuela D., Prost S. 2018. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: Opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience, 7(giy033), doi:10.1093/gigascience/giy033: 14 str.
Quick J., Loman N. J., Duraffour S., Simpson J. T., Severi E., Cowley L., Bore J. A., Koundouno R., Dudas G., Mikhail A., Ouédraogo N., Afrough B., Bah A., Baum J. H. J., Becker-Ziaja B., Boettcher J. P., Cabeza-Cabrerizo M., Camino-Sánchez Á., Carter L. L., Carroll M. W. 2016. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.
Nature, 530, 7589: 228–232
Runtuwene L. R., Tuda J. S. B., Mongan A. E., Suzuki Y. 2019. On-Site MinION Sequencing.
V: Single Molecule and Single Cell Sequencing. Y. Suzuki (ur.). Springer: 143–150 Wawina-Bokalanga T., Vanmechelen B., Martí-Carreras J., Vergote V., Vermeire K.,
Muyembe-Tamfum J.-J., Ahuka-Mundeke S., Maes P. 2019. Complete genome sequence of a new Ebola virus strain isolated during the 2017 Likati outbreak in the Democratic Republic of the Congo. Microbiology Resource Announcements, 8(20), doi:10.1128/MRA.00360-19: 3 str.
