BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Luka BITEŽNIK
VPLIV REZI NA RAST MATIČNIH RASTLIN NEKATERIH SORT INDUSTRIJSKE KONOPLJE
(Cannabis sativa L.) TER DOLOČANJE
SEKUNDARNIH METABOLITOV V SOCVETJIH NJIHOVIH VEGETATIVNO RAZMNOŽENIH
POTAKNJENCEV
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2021
ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Luka BITEŽNIK
VPLIV REZI NA RAST MATIČNIH RASTLIN NEKATERIH SORT INDUSTRIJSKE KONOPLJE (Cannabis sativa L.) TER DOLOČANJE
SEKUNDARNIH METABOLITOV V SOCVETJIH NJIHOVIH VEGETATIVNO RAZMNOŽENIH POTAKNJENCEV
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
INFLUENCE OF PRUNING ON GROWTH OF SOME INDUSTRIAL HEMP VARIETIES (Cannabis sativa L.) AND DETERMINATION OF
SECONDARY METABOLITES IN INFLORESCENCES OF VEGETATIVELY PROPAGATED CUTTINGS
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa druge stopnje Hortikultura.
Delo je bilo opravljeno na Katedri za fitomedicino, kmetijsko tehniko, poljedelstvo, pašništvo in travništvo in na Znanstveno Raziskovalnem Inštitutu Zdravstvene fakultete v Ljubljani.
Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorja magistrskega dela imenovala doc.
dr. Marka Flajšmana, za somentorja pa asist. razisk. dr. Romana Štuklja.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Darja KOCJAN-AČKO
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Marko FLAJŠMAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: asist. razisk. dr. Roman ŠTUKELJ
Univerza v Ljubljani, Zdravstvena fakulteta, Znanstveno Raziskovalni Inštitut Član: prof. dr. Dea BARIČEVIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum zagovora: 09.09.2021
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 633.522:582.630:631.535:543.61(043.2)
KG Cannabis sativa, industrijska konoplja, matične rastline, potaknjenci, kanabinoidi, terpenoidi
AV BITEŽNIK, Luka
SA FLAJŠMAN, Marko (mentor), ŠTUKELJ, Roman (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Magistrski študijski program druge stopnje Hortikultura
LI 2021
IN VPLIV REZI NA RAST MATIČNIH RASTLIN NEKATERIH SORT INDUSTRIJSKE KONOPLJE (Cannabis sativa L.) TER DOLOČANJE
SEKUNDARNIH METABOLITOV V SOCVETJIH NJIHOVIH VEGETATIVNO RAZMNOŽENIH POTAKNJENCEV
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja) OP XIII, 52, [10] str, 11 pregl., 23 sl., 10 pril., 91 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Navadna konoplja je zelo raznolika vrsta, zato je načrtovana pridelava lahko problematična. Z vegetativnim razmnoževanjem dobimo matični rastlini enake potomce (potaknjence), ki nam zagotovijo enakomernejše in kakovostnejše pridelke v primerjavi z vzgojo iz semena. V raziskavi smo vzgajali matične rastline šestih sort navadne konoplje (Cannabis sativa L.) 'Carmagnola', Tiborszallasi', 'Gorička Simba', Santhica 27', 'Fiona' in 'Finola' skozi časovno obdobje 9-ih mesecev in spremljali njihovo obraščanje ob treh vrstah začetne (prve) rezi, to je nad trejim, nad petim in nad sedmim nodijem. Primerjava zbranih rezultatov genotipov vseh sort nam je pokazala statistično značilne razlike med posameznimi načini rezi. Ker ima navanda konoplja dobro sposobnost razmnoževanja s vegetativnimi potaknjenci, smo poganjke uporabili za ocenitev sposobnost koreninjenja različnih genotipov petih sort konoplje, med katerimi se je za najboljšo izkazala 'Gorička Simba', Sorta 'Finola' se je po pričakovanjih pokazala za neprimerno za vegetativno razmnoževanje. Ukoreninjene vegetativne potaknjence smo izpostavili rastnim razmeram za prehod v generativno fazo. Ob primerni zrelosti socvetij smo socvetja vzorčili in z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) ter plinske kromatografije v povezavi s masno spektrometrijo (GC-MS) določili kanabinoidni in terpenoidni profil genotipov.
Velike razlike v vsebnosti kanabinoidov, predvsem skupnega CBD, THC in CBDV, kažejo na heterogenost navadne konoplje na nivoju sekundarnih metabolitov, kar se kaže tudi v vsebnosti terpenov.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 633.522:582.630:631.535:543.61(043.2)
CX Cannabis sativa, industrial hemp, mother plants, vegetative stem cuttings, cannabinoids, terpenoids
AU BITEŽNIK, Luka
AA FLAJŠMAN, Marko (supervisor); ŠTUKELJ, Roman (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Master Study Programme in Horticulture
PY 2021
TI INFLUENCE OF PRUNING ON GROWTH OF SOME INDUSTRIAL HEMP VARIETIES (Cannabis sativa L.) AND DETERMINATION OF SECONDARY METABOLITES IN INFLORESCENCES OF VEGETATIVELY PROPAGATED CUTTINGS
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes)
NO XIII, 52, [10] p., 11 tab., 23 fig., 10 ann., 91 ref.
LA sl AL sl/en
AB Hemp is one of the most heterogeneous species meaning that planned production can be problematic. Vegetative propagation by stem cuttings is a low-cost method that delivers genetically uniform plants similar to mother plants with consistent rates of growth and cannabinoid production compared with propagation from seed. In this research we tried to maintain mother plants of six hemp varieties (Cannabis sativa L.) 'Carmagnola', Tiborszallasi', ' Gorička Simba ', 'Santhica 27', 'Fiona' and 'Finola' over a period of 9 months and observe influence of pruning on growth. Statistical analysis revealed significant differences between individual pruning types. Since cannabis has great ability for vegetative reproduction by stem cuttings, we used the shoots to evaluate rooting success and quality of five hemp varieties, among which "Gorička Simba" showed the best results. Rooted vegetative stem cuttings were set to blooming phase. Fully mature inflorescences have been sampled and and analysed. Contents of cannabinoids and terpenes in inflorescences were determinated using HPLC and GC- MS. Large variation in content of cannabinoids, especially in total CBD, THC and CBDV as well as terpenoids confirms heterogeneity of secondary metabolites in cannabis.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VIII
KAZALO SLIK X
KAZALO PRILOG XII
1 UVOD 1
1.1 POVOD V RAZISKAVO 1
1.2 CILJ RAZISKAVE 1
1.3 DELOVNA HIPOTEZA 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 NAVADNA KONOPLJA 3
2.1.1 Uporaba 3
2.1.2 Taksonomija 3
2.2 MORFOLOGIJA KONOPLJE 4
2.3 PRIDELAVA KONOPLJE 5
2.3.1 Pridelava za seme in vlakna 5
2.3.2 Pridelava za kanabinoide 6
2.3.3 Razmnoževanje konoplje 6
2.3.3.1 Razmnoževanje s semenom 6
2.3.3.2 Razmnoževanje z vegetativnimi potaknjenci 7
2.3.3.3 In vitro razmnoževanje s tkivnimi kulturami 7
2.3.4 Vegetativna rast in matične rastline 8
2.3.5 Generativni razvoj 8
2.4 SEKUNDARNI METABOLITI V NAVADNI KONOPLJI 9
2.4.1 Terpenoidi 10
2.4.2 Kanabinoidi 10
2.4.2.1 Δ9 -trans-tetrahidrokanabinol (Δ9 -THC) 10
Str.
2.4.2.2 Kanabigerol (CBG) 11
2.4.2.3 Kanabidiol (CBD) 11
2.4.2.4 Kanabikromen (CBC) 12
2.4.3 Terpeni 13
2.4.3.1 β - mircen 13
2.4.3.2 β – kariofilen 14
3 MATERIALI IN METODE 15
3.1 RASTLINSKI MATERIAL 15
3.2 POGOJI RASTI 15
3.3 VZGOJA MATIČNIH RASTLIN 16
3.3.1 Ocena sposobnosti obraščanja matičnih rastlin po rezi 16
3.3.1.1 Prva rez 17
3.3.1.2 Vzdrževalna rez v vegetativni fazi rasti 17
3.4 VEGETATIVNO RAZMNOŽEVANJE NAVADNE KONOPLJE 18
3.4.1 Priprava potaknjencev in ocena sposobnosti njihovega koreninjenja 18 3.5 DOLOČANJE SEKUNDARNIH METABOLITOV V SOCVETJIH
VEGETATIVNO RAZMNOŽENIH POTAKNJENCEV 20
3.5.1 Pogoji rasti in generativni razvoj 20
3.5.2 Vzorčenje socvetij in priprava vzorcev navadne konoplje 21
3.5.2.1 Način vzorčenja 21
3.5.2.2 Način sušenja vzorcev 22
3.6 DOLOČANJE VSEBNOSTI SEKUNDARNIH METABOLITOV V
SOCVETJIH NAVADNE KONOPLJE 22
3.6.1 Uporabljeni reagenti in topila 22
3.6.2 Pripomočki/ Laboratorijski pribor 22
3.6.3 Naprave 22
3.6.4 Uporabljeni kanabinoidni in terpenoidni standardi za umeritveno krivuljo 22
3.6.5 Priprava vzorcev 23
3.6.6 Določanje kanabinoidov s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti –
HPLC 23
3.6.7 Določanje vsebnosti terpenoidov s plinsko kromatografijo v povezavi z
masnim detektorjem - GS/MS 24
3.6.8 Izračun vsebnosti kanabinoidov 26
3.7 STATISTIČNA ANALIZA 26
4 REZULTATI 27
4.1 SPOSOBNOST OBRAŠČANJA MATIČNIH RASTLIN 27
4.2 SPOSOBNOST KORENINJENJA VEGETATIVNIH POTAKNJENCEV 32
4.3 VSEBNOSTI KANABINOIDOV V SOCVETJIH 34
4.3.1 CBD-A 34
4.3.2 THC-A 34
4.3.3 Preostali kanabinoidi 36
4.4 VSEBNOSTI TERPENOIDOV V SOCVETJIH 37
5 RAZPRAVA IN SKLEPI 39
5.1 RAZPRAVA 39
5.1.1 Obraščanje matičnih rastlin 39
5.1.2 Uspešnost koreninjenja vegetativnih potaknjencev 40
5.1.3 Vsebnost kanabinoidov v socvetjih 41
5.1.4 Vsebnost terpenoidov v socvetjih 43
5.2 SKLEPI 44
6 POVZETEK 45
7 VIRI 46
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Pogosto prisotni terpeni in terpenoidi v konoplji s pripadajočimi molekulskimi formulami in masami (Hanuš in Hod, 2020). 13 Preglednica 2: Kromatografski pogoji pri HPLC analizi kanabinoidov. 24 Preglednica 3: Kanabinoidni standardi s specifičnim retencijskim časom (tR). 24
Preglednica 4: Pogoji delovanja GC-MS. 25
Preglednica 5: Relativni retencijski časi (tR) z uporabo GC-MS pri standardni raztopini
Restek terpenoidni standard #1. 25
Preglednica 6: Povprečno število vseh poganjkov na rastlino po obravnavanjih (3N, 5N in 7N) za pet sort konoplje 'Carmagnola', 'Tiborszallasi', 'Gorička Simba', 'Santhica 27' in 'Fiona' s pripadajočimi standardnimi odkloni (SD).
Prikazano je tudi število potencialnih potaknjencev in odstotek potencialnih potaknjencev izmed vseh poganjkov s pripradajočimi standardnimi odkloni
(SD). 28
Preglednica 7: Vsota števila poganjkov in vsota števila potencialnih potaknjencev za posameznmo obravnavanje pri sorti konoplje 'Finola'. Podatki so
predstavljeni glede na posamezno rez. 28
Preglednica 8: Minimalni, maksimalni in povprečni odstotek uspešno ukoreninjenih vegetativnih potaknjencev za pet sort konoplje 'Carmagnola', 'Tiborszallasi', 'Gorička Simba', 'Santhica 27' in 'Fiona'. Predstavljeni rezultati so izračunani na podlagi zbranih podatkov prvih petih rezi (1. do 5. rez) in koreninjenja vegetativnih potaknjencev, opravljenih v razmaku približno 30 dni.
Minimalni odstotek pomeni najnižji določen odstotek uspešno ukoreninjenih vegetativnih potaknjencev za nek genotip znotraj sorte.
Maksimalni odstotek pomeni najvišji določen odstotek uspešno ukoreninjenih vegetativnih potaknjencev za nek genotip znotraj sorte.
Povprečje je povprečni odstotek vseh genotipov znotraj sorte, določen na
podlagi podatkov iz prvih petih rezi. 32
Preglednica 9: Minimalna, maksimalna in povprečna vsebnost kanabinoidov (wt % - masni delež) v socvetjih vegetativno razmnoženih potaknjencev treh dvodomnih sort konoplje. Podatki temeljijo na 27 genotipih sorte 'Carmagnola', 27 genotipih sorte 'Tiborszallasi' in 29 genotipih sorte 'Gorička Simba' in so podani s pripadajočimi standardnimi odkloni (SD). Minimalna vrednost (Min.) predstavlja genotip znotraj sorte z najnižjo detektirano vsebnostjo.
Maksimalna vrednost (Max.) predstavlja genotip znotraj sorte z najvišjo detektirano vsebnostjo. Vsebnosti za posamezni genotip so izračunane na podlagi povprečne vrednosti dveh meritev kanabinoidov (wt %) s pripadajočimi standardnimi odkloni (SD). Prikazane so tudi vsebnosti kanabinoidov v socvetjih dveh enodomnih sort 'Santhica 27' in 'Fiona', pri katerih so podatki izračunani na podlagi združitve petih rastlin posamezne sorte v en vzorec. Prikazane so povprečne vrednosti dveh meritev kanabinoidov (wt %) s pripadajočimi standardnimi odkloni (SD). wt% 0,1
= 1 mg/gsuhe snovi 35
Str.
Preglednica 10: Povprečne celokupne vrednosti Δ-9-THC, CBD, CBG in CBDV s pripadajočimi standardnimi odkloni. Minimalna vsebnost (Min.) predstavlja genotip znotraj sorte z najnižjo detektirano vsebnostjo. Maksimalna vsebnost (Max.) predstavlja genotip znotraj sorte z najvišjo detektirano vsebnostjo. Povprečje je povprečna vsebnost vseh genotipov znotraj sorte.
Prikazane so tudi celokupne vsebnosti kanabinoidov v socvetjih dveh enodomnih sort 'Santhica 27' in 'Fiona', pri katerih so podatki izračunani na podlagi združitve petih rastlin posamezne sorte v en vzorec. wt% 0,1 = 10
mg/gsuhe snovi 36
Preglednica 11: Minimalna, maksimalna in povprečna vsebnost terpenoidov (wt %) v socvetjih vegetativno razmnoženih potaknjencev treh dvodomnih sort konoplje. Podatki temeljijo na 10 genotipih sorte 'Carmagnola', 10 genotipih sorte 'Tiborszallasi' in 10 genotipih sorte 'Gorička Simba' in so podani s pripadajočimi standardnimi odkloni (SD). Minimalna vrednost (Min.) predstavlja genotip znotraj sorte z najnižjo detektirano vsebnostjo.
Maksimalna vrednost (Max.) predstavlja genotip znotraj sorte z najvišjo detektirano vsebnostjo. Povprečje je povprečna vsebnost v vseh genotipih znotraj sorte. Vsebnosti za posamezni genotip so izračunane na podlagi povprečne vrednosti dveh meritev terpenoidov (wt %) s pripadajočimi standardnimi odkloni (SD). wt% 0,1 = 10 mg/gsuhe snovi. 38
KAZALO SLIK
Slika 1: (A) cvetoča moška rastlina, (B) cvetoča ženska rastlina, (C) moško socvetje, (D) seme obdano s cvetnim odevalom, (E) pogled na širok ploski del semena, (F) pogled na ozek del semena, (G) pestič z ovarijem in dvema brazdama, (H) pestič obdan s
cvetnim odevalom (Small, 2015). 4
Slika 2: Trihomi konoplje pod mikroskopom. (A) Trihomi na socvetju; (B) »pecljati glavasti« (angl. capitate-stalked) trihomi; (C) »glavasti sedeči« (angl. capitate- sessile) trihomi; (D) »čebulni« (angl. bulbous) trihomi; (E) trihomi na ovršnih listih;
(F) trihomi na steblu; (G) trihomi na gornji strani lista socvetja; (H) trihomi na spodnji strani lista socvetja (Happyana in sod., 2013). 9 Slika 3: Molekulska struktura Δ9-trans-tetrahidrokanabinola (Δ9-THC) (Thomas in
Elsohly, 2016). 11
Slika 4: Molekulska struktura kanabigerola (CBG) (Thomas in Elsohly, 2016). 11 Slika 5: Molekulska struktura kanabidiola (CBD) (Thomas in Elsohly, 2016). 12 Slika 6: Molekulska struktura kanabikromena (CBC) (Thomas in Elsohly, 2016). 12 Slika 7: Molekulska formula β – mircena (Nuutinen, 2018). 14 Slika 8: Molekulska formula β – kariofilena (Nuutinen, 2018). 14 Slika 9: Gojenje odbranih sejančkov štirih dvodomnih in dveh enodomnih sort navadne
konoplje. 16
Slika 10: Primer razlik v morfologiji matičnih rastlin starosti sedem mesecev glede na položaj prve rezi. Na levi sliki je genotip T68 sorte 'Tiborszallasi', pri kateri je bila 1. rez opravljena nad 3. nodijem (3N). Sredinska slika prikazuje genotip S27-4 sorte 'Santhica 27' s prvo rezjo nad 5. nodijem (5N). Na desni sliki je prikazan genotip S14 sorte 'Gorička Simba', pri kateri smo prvo rez opravili nad 7. nodijem (7N). 17 Slika 11: Potaknjenci postavljeni v kocke kamene volne in pripravljeni na koreninjenje. 19 Slika 12: Ukoreninjeni potaknjenci nekaterih genotipov sort 'Tiborszallasi' (T19) (levo),
'Gorička Simba' (S33) (sredina) in 'Fiona' (M32) (desno), pripravljeni za presaditev.
19 Slika 13: Primer potaknjenca z oceno korenin 1 (levo) in 2 (desno) pri genotipu S21 sorte
'Gorička Simba'. 19
Slika 14: Vegetativno razmnožen potaknjenec (sadika) sorte 'Gorička Simba' genotip S10 en
teden po presaditvi v lonec volumna 5 L. 20
Slika 15: Žensko socvetje z odstranjenimi listi neposredno po vzorčenju, pripravljeno za
sušenje. 21
Slika 16: Tipičen HPLC kromatogram enajstih standardnih raztopin kanabinoidov s koncentracijo 0,045mg/ml. Kromatogam prikazuje retencijske čase (os x) in pa
jakost signala mAU (os y). 24
Slika 17: Povprečno število poganjkov na rastlino v odvisnosti od položaja prve rezi (3N, 5N in 7N) in zaporedne vzdrževalne rezi za tri dvodomne sorte konoplje 'Carmagnola', Str.
'Tiborszallasi' in 'Gorička Simba'. Posamezna zaporedna rez je bila izvedena v
razmaku približno 30 dni. 29
Slika 18: Povprečno število poganjkov na rastlino v odvisnosti od položaja prve rezi (3N, 5N in 7N) in zaporedne vzdrževalne rezi za dve enodomni sorti konoplje 'Santhica 27' in 'Fiona'. Posamezna zaporedna rez je bila izvedena v razmaku približno 30 dni.
29 Slika 19: Povprečno število potencialnih potaknjencev na rastlino v odvisnosti od položaja
prve rezi (3N, 5N in 7N) in zaporedne vzdrževalne rezi. Prikazani so podatki za tri dvodomne sorte konoplje 'Carmagnola', 'Tiborszallasi' in 'Gorička Simba'. 30 Slika 20: Povprečno število potencialnih potaknjencev na rastlino v odvisnosti od položaja
prve rezi (3N, 5N in 7N) in zaporedne vzdrževalne rezi. Prikazani so podatki za dve enodomni sorti konoplje 'Santhica 27' in 'Fiona'. 31 Slika 21: Odstotek potencialnih potaknjencev v primerjavi s celokupnim številom poganjkov
v odvisnosti od položaja prve rezi (3N, 5N in 7N) in zaporedne vzdrževalne rezi.
Prikazani so podatki za tri dvodomne sorte konoplje 'Carmagnola', 'Tiborszallasi' in
'Gorička Simba'. 32
Slika 22: Odstotek potencialnih potaknjencev v primerjavi s celokupnim številom poganjkov v odvisnosti od položaja prve rezi (3N, 5N in 7N) in zaporedne vzdrževalne rezi.
Prikazani so podatki za dve enodomni sorti konoplje 'Santhica 27' in 'Fiona'. 32 Slika 23: Povprečna vrednost ocene bujnosti adventivnih korenin (možni oceni sta bili 1 in
2) s pripadajočimi standardnimi odkloni uspešno ukoreninjenih potaknjencev.
Prikazuje tudi odstotek uspešno ukoreninjenih potaknjencev. Rezultati so zbrani na podlagi podatkov iz 2., 3. in 4. rezi. Število potaknjencev vključenih v poskus = n;
nCarmagnola=472; nFiona=360; nGorička Simba=389; nSanthica27=591; nTiborszallasi=437. 33
KAZALO PRILOG
PRILOGA A - Rezultati HPLC analize kanabinoidov za sorto 'Carmagnola'.
PRILOGA B - Rezultati HPLC analize kanabinoidov za sorto 'Gorička Simba'.
PRILOGA C - Rezultati HPLC analize kanabinoidov za sorto 'Tiborszallasi'.
PRILOGA D - Skupne vsebnosti kanabinoidov v sorti 'Carmagnola'.
PRILOGA E - Skupne vsebnosti kanabinoidov v sorti 'Gorička Simba'.
PRILOGA F - Skupne vsebnosti kanabinoidov v sorti 'Tiborszallasi'.
PRILOGA G - Umeritvena krivulja za kanabinoid CBDA.
PRILOGA H - Tipičen GS-MS kromatogram devetnajstih standardnih raztopin.
PRILOGA I - Tipičen kromatogram kanabinoidnega profila posamezne sorte konoplje za industrijski namen.
PRILOGA J - Tipičen kromatogram terpenoidnega profila posamezne sorte konoplje za industrijski namen.
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
% odstotek
% wt masni delež
°C stopinje Celzija
GERK grafična enota rabe kmetijskega gospodarstva
DLI količina osvetlitve v 24 urah (angl. daily light integral) Δ9-THC delta-9-tetrahidrokanabinol
Δ9-THCA delta-9-tetrahidrokanabinolna kislina Δ8-THC delta-8- tetrahidrokanabinol
CBG kanabigerol
CBGA kanabigerolna kislina
CBD kanabidiol
CBDA kanabidiolna kislina CBDV kanabidivarin
CBDVA kanabidivarinska kislina THCV tertahidrokanabivarin
CBN kanabinol
DNA deoksiribonukleinska kislina (angl. deoxyribonucleic acid) PCR verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction)
SCAR s sekvenco okarakterizirana pomnožena regija (angl. Sequence characterized amplified region)
CTAB angl. cetyl trimethylammonium bromide
pH merilo za koncentracijo hidroksidnih ionov v raztopini ppm angl. parts per milion
1 UVOD
1.1 POVOD V RAZISKAVO
Navadna konoplja je rastlinska vrsta, ki je znana ne samo po vsesplošni uporabnosti, ampak tudi po zapletenem statusu, ki ga ima rastlina v družbi in zakonodaji. Čeprav taksonomija navadne konoplje ni enotna, saj lahko konopljo delimo v eno botanično vrsto z več podvrstami, ali pa celo v več vrst, se konopljo v vsakdanjem življenju deli na dve skupini: v eni skupini so rastline, katerih delež THC presega 0,2 % ali 0,3 % (npr. v Kanadi in nekaterih EU državah) v suhi snovi zgornje tretjine socvetja ženskih rastlin. Takim rastlinam pogovorno rečemo medicinska konoplja, saj se take rastline uporabljajo izključno v medicinske namene. Druga skupina pa so rastline, katerih vrednost THC v suhi snovi ženskih rastlin ne presega 0,2 % (ali 0,3 %) in takim rastlinam pravimo industrijska konoplja (Flajšman, 2019). To ni delitev izključno glede na namen uporabe, kot nakazuje ime, saj se lahko tudi industrijska konoplja uporablja za pridelavo ne psihotropnih kanabinoidov, npr, CBD ali CBG, in tako v medicinske namene (Garcia-Tejero in sod, 2019). Gre za način poimenovanja različnih skupin konoplje in glede na razvrstitev v ti dve skupini veljajo za vsako skupino različna pravila za pridelavo in nekatere druge posebnosti, ki bodo razložene v nadaljevanju. Tej delitvi konoplje (na medicinsko in industrijsko), ki temelji zgolj na vsebnosti THC, bomo sledili v tej nalogi.
Pridelava industrijske konoplje je trenutno v Sloveniji dovoljena samo z vzgojo iz semena.
V prihodnosti je pričakovati spremembo pravilnikov, ki bodo omogočali pridelavo sadik industrijske konoplje in nato nadaljnjo pridelavo s sadikami, saj trenutna zakonodaja omogoča vzgojo navadne konoplje v Sloveniji samo iz semena na njivah. Pridelava konoplje s sadikami je smiselna predvsem v primeru, kadar pridelujemo konopljo z namenom pridobivanja sekundarnih metabolitov kanabinoidov in terpenov, ki se nahajajo predvsem v socvetjih ženskih rastlin. V ta namen bo potrebno poznati lastnosti matičnih rastlin industrijske konoplje ter kako gojenje in agrotehnični ukrepi (npr. rez) vplivajo na njihovo rast. Med rastlinami, ki jih vzgojimo iz semena, lahko na podlagi analize sekundarnih metabolitov, predvsem kanabinoidov in terpenov, odberemo elitno matično rastlino in jo uporabimo za nadaljnjo pridelavo sadik. Vegetativno razmnoženi potaknjenci izbrane matične rastline nam omogočajo lažje načrtovanje pridelave in kakovostnejše pridelke socvetij.
1.2 CILJ RAZISKAVE
Cilj raziskovalnega dela je bil preučiti potencial različnih genotipov šestih sort industrijske konoplje (Cannabis sativa L.) za njihovo nadaljnjo vegetativno razmnoževanje v pridelovalne namene, in sicer:
1. ugotoviti vpliv rezi na rast in razvoj matičnih rastlin šestih sort industrijske konoplje skozi daljše časovno obdobje ter spremljati obraščanje rastlin,
2. oceniti sposobnosti koreninjenja potaknjencev, pridobljenih iz matičnih rastlin,
3. analizirati vsebnost kanabinoidov in terpenov v socvetjih vegetativno razmnoženih potaknjencev, pridobljenih iz matičnih rastlin izbranih sort,
4. odbrati elitne matične rastline na podlagi zbranih podatkov.
1.3 DELOVNA HIPOTEZA
Navadna konoplja velja za zelo heterogeno vrsto, saj so si lahko rastline znotraj iste sorte med sabo zelo morfološko in biokemijsko različne. Naše hipoteze so bile:
1) način rezi bo vplival na sposobnost obraščanja matičnih rastlin. Med posameznimi sortami in med njihovimi vegetativno razmnoženimi potaknjenci bomo ugotovili razlike v sposobnosti regeneracije.
2) tako med sortami kot tudi med posameznimi genotipi znotraj iste sorte se bodo pojavile razlike v sposobnosti koreninjenja vegetativno razmnoženih potaknjencev.
3) največje razlike v vsebnosti kanabinoidov in terpenov se bodo pokazale med sortami, manjše razlike pa bodo opazne med genotipi znotraj iste sorte.
2 PREGLED OBJAV 2.1 NAVADNA KONOPLJA
Navadna konoplja (Cannabis sativa L.) je v njej ustreznih naravnih rastiščih zelo razširjena rastlina. Uspeva na obmorskih kot tudi na višje ležečih legah. Predvideva se, da izvira iz predela centralne in jugovzhodne Azije, od koder se je razširila po vsem svetu (Schultes in sod., 1974). Je hitro rastoča rastlina z visoko vsebnostjo celuloze in lesnih vlaken, zato se jo uporablja za raznovrstne namene. V zadnjem času zaradi visoke vsebnosti bioaktivnih snovi pridobiva pomen tudi v farmacevtski industriji in zdravstvu (Andre in sod., 2016).
2.1.1 Uporaba
Začetki uporabe konoplje segajo v obdobje okoli 10.000 let pred našim štetjem. Sprva so jo uporabljali za izdelovanje vrvi in tkanin, in s tem predstavlja najstarejšo pridelovalno rastlino z namenom proizvodnje vlaken (Cherney in Small, 2016). Z domestikacijo rastline se je začela tudi odbira posameznih rastlin in s tem večanje njene prehranske vrednosti in obseg uporabe (Piluzza in sod., 2013). Prvi zapis medicinske uporabe je v kitajski farmakopeji, kjer jo predpisujejo za boj proti debelosti, revmi in malariji, zato se predvideva, da se je medicinska uporaba konoplje začela že pred 5000 leti (Abel, 1980). Zaradi neželenih psihotropnih in fizičnih učinkov je dandanes podvržena strogim zakonskim omejitvam.
Medicinska in farmakološka uporaba konoplje se v zadnjem desetletju povečuje, predvsem za lajšanje kroničnih in nevropatskih bolečin. Vse širša uporaba rastline spodbuja spremembe regulacije na področjih pridelave, predelave in njenega uživanja (Leung, 2011;
Štukelj in sod., 2018).
2.1.2 Taksonomija
Leta 1976 sta Small in Cronquist izoblikovala uradno botanično nomenklaturo za konopljo.
Uvrščamo jo v družino konopljevk (Cannabaceae). Razvrstitev na podvrste temelji na vsebnosti sekundarnega metabolita delta-9-tetrahidrokanabinola (Δ9-THC) v posušenih ženskih socvetjih. Vsebnost Δ9-THC se določa z analizo posušene, homogenizirane, zgornje tretjine ženske rastline. Nadaljnja delitev na varietete konoplje je v stopnji domestikacije rastlin. Delimo jo na Cannabis sativa subsp. sativa var. sativa, ki predstavlja udomačeno podvrsto konoplje z vsebnostjo Δ9-THC < 0,2 % ali 0,3 %, imenovana tudi konoplja za industrijske namene ali industrijska konoplja. Delež Δ9-THC v teh sortah konoplje ne presega 0,2 %, na nekaterih območjih je dovoljena pridelava sort z vsebnostjo do 0,3 % (npr.
v Kanadi in nekaterih EU državah); Cannabis sativa subsp. sativa var. spontanea, ki je podvrsta divjega tipa konoplje z vsebnostjo Δ9-THC < 0,3%; Cannabis sativa subsp. indica var. indica, konoplja udomačenega tipa z vsebnostjo Δ9-THC > 0,3% imenovana tudi indijska ali medicinska konoplja, pogovorno tudi rekreativna konoplja ali marihuana; in Cannabis sativa subsp. indica var. kafristanica, ki je podvrsta divjega tipa z vsebnostjo Δ9-
THC > 0,3%. Laično se konoplja razvršča na medicinsko in industrijsko konopljo, kar pa ne predstavlja njene uporabe, saj se tudi industrijska konoplja (Δ9-THC < 0,3% ali < 0,2 %) v zadnjem času uporablja za ekstrakcijo kanabinoidov in drugih bioaktivnih snovi z namenom lajšanja bolezenskih stanj. Medicinska konoplja pa se uporablja izključno za medicinske namene (Janatova in sod., 2018).
2.2 MORFOLOGIJA KONOPLJE
Rastlina je visoke pokončne rasti in doseže višino do 6 m. Kalitev v optimalnih pogojih traja do 7 dni. Rast sejančka in vegetativna razvojna faza se začne s tvorbo hipokotila in kotilendonov. Pravi listi pri sejančkih konoplje se formirajo v parih in so nasprotno orientirani od predhodno nastalih. Prvi pravi list je sestavljen iz enega lističa, drugi pravi list iz treh, tretji iz pet do skupno največ enajst lističev na enem listu. V pazduhi vsakega pravega lista (nodiju) je lateralni meristem, ki se ob izpostaviti svetlobi ali prekinitvi apikalne dominance razvije v stranski poganjek. Nodiji so sorazmerno razporejeni po celotni dolžini stebla in poganjkov (Clarke, 1981). Konoplja je enoletnica, kar pomeni, da v naravi opravi vegetativni in generativni cikel v isti rastni sezoni (Bouloc, 2013). Vegetativna rast konoplje in prehod v generativni razvoj sta pogojena z dolžino dnevne osvetlitve (Clarke, 1981).
Obstaja tudi tako imenovana oblika konoplje Cannabis rudelaris, ki izvira iz Rusije in je neobčutljiva na dolžino osvetlitve. To pomeni, da cvetenje ni pogojeno z dolžino dneva, ampak s starostjo rastline (Gloss, 2015).
Slika 1: (A) cvetoča moška rastlina, (B) cvetoča ženska rastlina, (C) moško socvetje, (D) seme obdano s cvetnim odevalom, (E) pogled na širok ploski del semena, (F) pogled na ozek del semena, (G) pestič z ovarijem in dvema brazdama, (H) pestič obdan s cvetnim odevalom (Small, 2015).
Konoplja na posamični rastlini razvije klasaste ženske ali lataste moške cvetove, kar imenujemo dvodomnost (Bouloc, 2013). Spol rastlin je določen s heteromorfnimi kromosomi X in Y. Moški spol je določen s heterogametnimi XY, ženski pa s homogametni XX. Fenotipsko izražanje spola je velikokrat povezano z okoljskimi dejavniki in posledično nastankom hermafroditnih oziroma dvospolnih rastlin, kar imenujemo enodomnost (Moliterni in sod., 2004). Moško latasto socvetje je sestavljeno iz posameznih razvejanih latov z petimi bledo zelenimi dlakavimi čašnimi listi, dolgimi med 2,5 in 4 mm. Čašni listi obdajajo pet pecljatih visečih prašnikov. Klasasto žensko socvetje je sestavljeno iz enodelnega cvetnega odevala, ki vsebuje pestič z dvobrazdno plodnico. Plod pri navadni konoplji je seme in se imenuje orešek (Slika 1) (Clarke, 1981).
2.3 PRIDELAVA KONOPLJE
Udomačeni podvrsti konoplje Cannabis sativa subsp. sativa var. sativa ali konoplja za industrijske namene in Cannabis sativa subsp. indica var. indica ali indijska konoplja sta najbolj razširjeni podvrsti, pri čemer je pridelava slednje zaradi visoke vsebnosti psihoaktivne snovi v večini svetovnih držav prepovedana. Konoplja za industrijske namene ima visoko vsebnost celuloze in jo uporabljamo za bio goriva, tekstil, prehranska dopolnila in številne druge izdelke. Večina sort je odpornih na sušni stres, slanost tal, mraz, vročino, visoko vlažnost, bolezni in škodljivce ter obenem zagotavljajo zadovoljive pridelke (Hartsel in sod., 2016).
Pri konoplji za industrijske namene v Evropski uniji vsebnost THC ne presega 0,2 %, kar je njena glavna razlika od prepovedane indijske konoplje. Sorte navadne konoplje so uvrščene v Katalog dovoljenih sort poljščin EU, ki jih je v Sloveniji dovoljeno gojiti pod nadzorom Ministrstva za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano na njivah z GERK številko na poljedelski način (Tavčar, 2019). Na podlagi 3. člena pravilnika o pogojih za pridobitev dovoljenja za gojenje konoplje in vrtnega maka (Uradni list RS, št. 40/11, 36/15 in 33/18) velja, da je v Republiki Sloveniji pod pogoji, določenimi s tem pravilnikom, dovoljena pridelava industrijske konoplje.
2.3.1 Pridelava za seme in vlakna
Seme konoplje ima bogato hranilno vrednost. Vsebuje 20 do 25 % beljakovin, 20 do 30 % ogljikovih hidratov, 25 do 35 % maščob in 10 do 15 % netopnih vlaknin (Štukelj in sod., 2017). Uživanje semen pozitivno vpliva na raven holesterola in visok krvni tlak (Baldihi in sod., 2018). Iz nepraženih semen konoplje s hladnim stiskanjem dobimo do 35 % olja. Olje vsebuje več kot 55 % dvakrat nenasičene linolne kisline, 15 % trikrat nenasičene alfa- linolenske kisline, 1,5 % trikrat nenasičene gama-linolenske kisline in dvakrat nenasičene omega-3 kisline. Zadnje tri so človeku esencialne maščobne kisline (Andrenšek, 2000). Pri stiskanju olja iz semen je uporaben tudi ostanek, t.i. oljna pogača (briketi), ki se lahko uporabi v prehrani ljudi in živali. Brikete se lahko zmelje v moko, bogato z beljakovinami,
vlakninami, minerali, ogljikovimi hidrati (Štukelj in sod. 2017). Za pridobivanje semena ali vlaken so primerne tako enodomne kot tudi dvodomne sorte, nekatere omogočajo istočasno pridelavo obeh surovin. Ob gosti setvi (50 kg semena na hektar) je pričakovani pridelek semen med 0,7 in 1,8 tone ter 1,2 do 3,0 tone vlaken. V konoplji poznamo dva tipa vlaken, likova vlakna v skorji in kratka lesna vlakna v jedru stebla. Vlakna v skorji so dolga do dveh metrov in predstavljajo 20 do 30 % mase stebla. V skorji sta dva tipa vlaken. Primarna vlakna vsebujejo veliko celuloze in malo lignina in so najmočnejša, uporabljamo jih za izdelavo tekstila in vrvi. Sekundarna vlakna vsebujejo več lignina in jih je več v spodnjem delu stebla in so primerna za paprino industrijo, gradbeništvo in drugo. (Salentijn in sod., 2015).
2.3.2 Pridelava za kanabinoide
Industrijska konoplja vsebuje relativno visoke koncentracije CBD in CBG, zato je pridelovalno zanimiva za namene proizvodnje vršičkov ter njihovih proizvodov. Vsebnost kanabinoidov v rastlinskem tkivu je odvisna od biotičnih in abiotičnih dejavnikov, kot so spol in starost rastline, DLI (angl. Daily Light Integral, količina osvetlitve v 24 urah), temperature okolja, dostopnosti hranil in UV sevanja (Hillig in Mahlberg, 2004).
V zadnjem času smo priča strmi rasti povpraševanja po izdelkih, ki vsebujejo kanabinoida CBD in CBG. Povečuje se potreba po načrtovani proizvodnji kakovostnih rastlinskih delov, ki ustrezajo farmacevtskim standardom. Za proizvodno konopljinih ekstraktov je najprimernejša pridelava izključno ženskih rastlin, saj zagotavlja višji izplen kanabinoidov na enoto površine (Thomas in Elsohly, 2016). V Evropski uniji se lahko prideluje le sorte, pri katerih vsebnost THC v zgornji tretjini rastline ne presega 0,2 %, zato je izbor sort za pridelovanje v medicinske namene omejen. Zaradi omejitev se povečuje pomen pridelave dovoljenih sort v namene proizvodnje sekundarnih metabolitov in s tem potreba po odkrivanju novih tehnologij pridelave (García-Tejero in sod., 2019) in predelave (Štukelj in sod., 2019).
2.3.3 Razmnoževanje konoplje
Razmnožujemo jo lahko s semenom, vegetativnimi potaknjenci in in vitro s tkivnimi kulturami (Caplan in sod., 2018).
2.3.3.1 Razmnoževanje s semenom
Konoplja se v naravi nahaja kot dvodomna rastlina, kar pomeni, da poznamo ženske rastline s samo ženskimi cvetovi in moške rastline s samo moškimi cvetovi. Ženskim rastlinam rečemo tudi črnice, moškim pa belice (Kocjan Ačko, 1999). Vednar pa se v vsaki populaciji dvodomnih rastlin nahaja tudi določen delež enodomnih rastlin (približno ena na tisoč do ena na milijon). To so rastline, ki imajo na isti rastlini prisotne tako ženske kot moške cvetove in jim rečemo tudi hermafroditne (dvospolne) rastline (Berenji in sod., 2013).
Generativno razmnoževanje oziroma razmnoževanje s semenom je naravni potek
razmnoževanja konoplje. Genetsko različne divje rastoče rastline konoplje so nastale pod vplivom naravne selekcije. Človek jih je kasneje z odbiro in načrtno selekcijo spremenil v sorte (Clarke in Merlin, 2017). Rastline konoplje vzgojene iz semena so si med seboj pogosto zelo različne. Znotraj ene sorte najdemo več različnih genotipov, ki se med seboj razlikujejo v morfologiji in vsebnosti bioaktivnih snovi (Ranalli, 2004). Ob vzgoji iz semena se pogosto v četrtem tednu vegetativne rasti pokažejo zgodnji cvetovi, ki determinirajo spol rastline. Ob tem pojavu lahko odberemo rastlino želenega spola (Cervantes, 2006).
2.3.3.2 Razmnoževanje z vegetativnimi potaknjenci
Metode vegetativnega razmnoževanja se uspešno uporabljajo pri številnih hortikulturnih in gozdnih rastlinskih vrstah z namenom ohranjanja genetske stabilnosti in izenačenosti razmnoženega rastlinskega materiala (Coffman in Gentner, 1979). Cilj vegetativnega razmnoževanja s potaknjenci je nastanek adventivnih korenin. Tvorba adventivnih korenin je pogojena s številnimi dejavniki, med katerimi so najpomembnejši listna površina potaknjenca, položaj rezi potaknjenca na matični rastlini, prisotnost hormonov, osvetlitev, medij za koreninjenje, vsebnost vode in pristnost hranil (Ofori in sod., 1996). V praksi se vegetativno razmnoževanje konoplje izvaja na način, kot ga je opisal Cervantes leta 2006.
Na zdravi matični rastlini izberemo poganjek debeline 2 do 3 mm, ki ima vsaj 4 nodije, in ga odrežemo poševno pod kotom 45 stopinj. Odstranimo liste, tako da ostanejo dva do trije pravi listi, ga pomočimo v hormonski pripravek za koreninjenje ter nemudoma postavimo medij za koreninjenje. Če je mogoče, poskrbimo, da je en nodij potaknjenca v mediju. Steblo potaknjenca mora biti v celoti v stiku z medijem. Potaknjencu moramo zagotoviti visoko vlažnost (95 do 100 %) in primerno temperaturo (18 do 27 °C), zato se poslužujemo uporabe propagatorjev. To so komore, ki lahko vzdržujejo potrebne pogoje. Število in površina listov stimulira nastanek adventivnih korenin zaradi delovanja endogenih hormonov avksinov (Haissig, 1974). Istočasno imamo z večjo skupno listno površino večjo evapotranspiracijo in posledično izgubo vode v potaknjencu. Prevelika izguba vode vodi v sušni stres, kar negativno vpliva na uspešnost koreninjenja (Leakey in Coutts, 1989; Ofori in sod., 1996).
Caplan in sod. (2018) so pokazali, da prikrajševanje listov na potaknjencih ni potrebno, v kolikor zagotovimo ustrezne pogoje v fazi koreninjenja. Za uspešno koreninjenje moramo zagotoviti tudi primerno intenziteto svetlobe in čas osvetlitve (18/6 ali 20/4; svetloba/tema).
Po približno treh tednih imamo ukoreninjeni potaknjenec, ki ga lahko presadimo v substrat, namenjen vzgoji sadik (Cervantes, 2006).
2.3.3.3 In vitro razmnoževanje s tkivnimi kulturami
In vitro propagacija je tehnika vegetativnega razmnoževanja, pri kateri je začetna količina rastlinskega materiala zelo majhna. Uporabljamo lahko najrazličnejše dele rastlin, kot so stebelni in listni izsečki, apikalni in aksilarni brsti, nedozorela semena, embriji in kotilendoni. Tehnike gojenja tkivnih kultur se med seboj razlikujejo glede na izbran rastlinski del in rastlinsko vrsto (Ahloowalia, 1997). Najpogostejša tehnika in vitro
razmnoževanja je mikropropagacija, pri kateri uporabimo aksilarni poganjek dolžine 1 do 2 cm in ga vzgajamo na gojišču z dodanimi hranili in hormoni v sterilnih pogojih. In vitro vzgoja konoplje poteka v štirih korakih, in sicer regeneracija (tvorba novih poganjkov), izdolževanje poganjkov in koreninjenje mladih rastlin ter aklimatizacija (Lata in sod., 2016).
Konopljo je mogoče razmnoževati v in vitro pogojih ( Lata in sod., 2016), vendar se je ta rastlinska vrsta pokazala za zahtevno in manj odzivno za gojenje v in vitro razmerah (Mestinšek Mubi in sod., 2020).
2.3.4 Vegetativna rast in matične rastline
Vegetativno razmnoževanje nam omogoča pridobitev potomcev, ki so matični rastlini genetsko identični. Je cenovno ugodna in učinkovita metoda za pridobivanje uniformnih rastlin s konsistentno rastjo in kanabinoidnim profilom (Potter, 2009). Odbira elitne rastline za nadaljnjo vegetativno razmnoževanje temelji na oceni morfologije in kemijskega profila.
Najboljša odbrana rastlina predstavlja matično rastlino, ki se jo uporablja za nadaljnjo vegetativno razmnoževanje s potaknjenci (Chandra in sod., 2010). Za potaknjence je značilna bujna rast nadzemnega in podzemnega dela. Vegetativna rast konoplje je pogojena z minimalno osvetlitvijo 16 ur na dan. S staranjem rastline se korenine razraščajo in prodirajo v globlje talne sloje ter črpajo vodo in hranila. Z večanjem dostopnosti elementov se začne močna rast nadzemnega dela in tvorba številnih nodijev, ki so osnova za lateralno razrast rastline. Za pridelavo kanabinoidov, pridelovalci večinoma odbirajo robustne, zdrave in potentne ženske rastline (Cervantes, 2006).
2.3.5 Generativni razvoj
V naravi konoplja cveti jeseni, ko se dan skrajša, kar je znak za zaključevanje rastne sezone.
Fiziologija in morfologija rastline se spremenita, rast novih listov in poganjkov se zmanjša, začne se rast in razvoj moških ali ženskih socvetij. Za večino sort konoplje je značilno, da se cvetenje začne, ko je dan krajši od 14 ur. Ob prisotnosti obeh spolov ali dvospolne rastline se tvorijo semena, ki dozorijo in odpadejo z rastline (Cervantes, 2006). Razvoj semen je potraten proces, zato oprašene ženske rastline v primerjavi z neoprašenimi tvorijo nižje koncentracije kanabinoidov. V kolikor pridelujemo konopljo z namenom pridobivanja kanabinoidov, se temu izognemo z odstranjevanjem moških rastlin iz obdelovalne površine ali vegetativnim razmnoževanjem odbranih ženskih rastlin (Chandra in sod., 2010). S posebnimi postopki lahko spodbudimo tudi tvorbo feminiziranih semen. S samooprašitvijo ženske rastline dobimo semena, ki dajejo samo ženske potomce (Ram in Sett, 1982).
V obdobju cvetenja imajo rastline konoplje večjo potrebo po hranilih kot v vegetativni fazi.
Odmerek mora biti skrbno načrtovan, saj prevelik vnos hranil negativno vpliva na vsebnost kanabinoidov v socvetjih. S prevelikim vnosom hranil pride do povečane skupne mase rastline in obenem majhnega skupnega pridelka kanabinoidov na rastlino (Caplan in sod., 2017).
2.4 SEKUNDARNI METABOLITI V NAVADNI KONOPLJI
Rastline so razvile prefinjene mehanizme, ki jim omogočajo preživetje v okolju. Poleg mehanske zaščite sintetizirajo tudi številne varovalne spojine, ki spadajo med sekundarne metabolite. Vloga sekundarnih metabolitov je interakcija rastline z okoljem, kot na primer zaščita pred herbivori, patogeni in UV sevanjem. Njihova vsebnost v rastlinskem tkivu je odvisna od vpliva zunanjih dejavnikov. Številni imajo biološki učinek v človeškem telesu, zato jih uporabljamo v medicinske namene (Yazaki, 2004). Konoplja vsebuje veliko različnih sekundarnih metabolitov, med katerimi so najpogostejši kanabinoidi, terpenoidi, flavonoidi in alkaloidi (Andre in sod., 2016). Nekateri metaboliti, predvsem alkaloidi, so lahko toksični tako za prokariontske kot tudi za evkariotske celice, zato jih rastline po sintezi transportirajo v posebne organele, na primer vakuole in smolne kanale, in s tem preprečijo citotoksičnost (Sirikantaramas in sod., 2007).
Slika 2: Trihomi konoplje pod mikroskopom. (A) Trihomi na socvetju; (B) »pecljati glavasti« (angl. capitate- stalked) trihomi; (C) »glavasti sedeči« (angl. capitate-sessile) trihomi; (D) »čebulni« (angl. bulbous) trihomi;
(E) trihomi na ovršnih listih; (F) trihomi na steblu; (G) trihomi na gornji strani lista socvetja; (H) trihomi na spodnji strani lista socvetja (Happyana in sod., 2013).
Na površju rastlinskih delov konoplje lahko na enem mestu najdemo raznolik nabor struktur, med katere spada več vrst žleznih in nežleznih trihomov. Žlezni trihomi so večcelični epidermalni izrastki, v katerih poteka sinteza sekundarnih metabolitov in so visoko skoncentrirani na površini neoprašenih ženskih socvetij. Glavnino sekundarnih metabolitov predstavljajo terpenoidi, vendar so prisotni tudi fenilpropanoidi, flavonoidi in metilketoni.
Njihova sinteza je vrstno in sortno specifična (Conneely in sod., 2021). Nežlezni trihomi večinoma niso povezani z nastankom in akumulacijo terpenoidov.
Na ženskih rastlinah konoplje najdemo tri vrste žlezni trihomov, ki so sestavljeni iz sekretornih in stebelnih celic in jih imenujemo »čebulni« (angl. bulbous), »sedeči« (angl.
capitate-sessile) in »pecljati glavasti« (angl. capitate-stalked) trihomi (Happyana in sod., 2013), prikazani so na Sliki 2. Pri moških rastlinah je prisoten četrti tip trihomov, imenovani
»prašnični« (angl. anther) žlezasti trihomi, ki so prisotni le na prašnikih (Fairbairn, 1972).
Kanabinoidi se sintetizirajo iz enostavnega fenola ali njegovega prekurzorja in terpena ter se
akumulirajo v sekretornih votlinah, zato je njihova vsebnost v teh strukturah največja.
Polnjenje sekretornih celic poteka med cvetenjem, zato se s staranjem rastline vsebnost kanabinoidov zvišuje (Russo, 2011). Za določitev optimalnega časa žetve je potrebno poznati strukturo trihomov in potek sinteze kanabinoidov (Potter, 2009). Poznavanje strukture žlez je velikega pomena, saj nam omogoča razumevanje sinteze kanabinoidov in možnosti za manipulacijo vsebnosti kanabinoidov v socvetjih konoplje (Mahlberg in Kim, 2008).
2.4.1 Terpenoidi
Do nedavnega je skoraj po vsem svetu veljalo prepričanje, da so kanabinoidi edina bioaktivna snov v konoplji. V zadnjih letih se pospešeno raziskuje druge komponente in medsebojne odnose s kanabinoidi. Terpeni in terpenoidi imajo širok spekter biološkega in farmakološkega delovanja, kar zajema antimikrobno, protiglivično, protivirusno, antikancerogeno, protivnetno, protiparazitno, antioksidativno delovanje itd. Trenutno je poudarek na raziskovanju terpenoidov, vendar se odpirajo tudi nove poti v raziskavah flavonoidov, flavonoidnih glikozidov in polifenolov. Do danes je bilo v konoplji odkritih 110 različnih terpenov in 121 terpenoidov (Orser in sod., 2018).
2.4.2 Kanabinoidi
Kanabinoidi oziroma fitokanabinoidi so spojine naravno prisotne v rodu Cannabis (Cannabaceae). Spadajo v skupino terpenofenolnih spojin (Taura in sod., 2007; Brenneisen, 2007). Klasifikacija je določena z nastankom iz C21 prekurzorja (kanabigerolične kisline, CBGA) ali njegovega analoga C19 (kanabigerovarična kislina, CBGVA). Encimatska pretvorba CBGA in CBGVA poda širok nabor C21 terpenofenolnih spojin, ki jim pravimo kanabinoidi (Shoyama in sod., 1975; Shoyama in sod., 1977). Poznamo jih več kot 100 različnih, od katerih je najbolj poznan delta-9-trans-tetrahidrokanabinol (Δ9-THC). Δ9-THC ob zaužitju povzroča psihoaktivne učinke, zato je v večini držav po svetu prepovedan. V rastlini so nakopičeni predvsem v žleznih votlinah trihomov na ženskih socvetjih (Whiting in sod., 2015).
2.4.2.1 Δ9 -trans-tetrahidrokanabinol (Δ9 -THC)
Najvišje vsebnosti Δ9-trans-tetrahidrokanabinola (Δ9-THC) vsebujejo vrste Cannabis sativa ssp. indica var. indica in Cannabis sativa ssp. indica var. kafristanica. V teh dveh skupinah so glavne pridelovalne sorte medicinske konoplje. V rastlinskem tkivu je v večini prisoten njegov prekurzor Δ-9-tetrahidrokanabinolna kislina (Δ9-THCA). Ob izpostavitvi Δ9-THCA visoki temperaturi, osvetlitvi ali alkalnim razmeram, se ta v procesu dekarboksilacije pretvori v Δ9–THC (Yang in sod., 2020). Dekarboksilirana oblika je psihoaktivna snov in se uporablja v medicinske namene za lajšanje bolečin, depresije, psihičnih motenj, težav s spanjem in drugo. Uporablja se v t. i. rekreacijske namene, npr. kajenje (Mechoulam in sod.,
1976). Vsebnost Δ9-THC se med sortami industrijske konoplje močno razlikuje ter je odvisna od časa vzorčenja. V času zorenja in staranja socvetij se njegova vsebnost povečuje, v zadnjih tednih pa sledi rahlo zmanjšanje. Njegova vsebnost je v vseh sortah konoplje, ki so registrirane za industrijsko pridelavo v Evropski uniji, nižja od 0,2%. V Italiji je dovoljeno odstopanje vsebnosti do 0,6 %. V kolikor je vsebnost skupnega Δ9-THC večja, je pridelava strogo prepovedana oz. dovoljena v nekaterih državah pod mnogo strožjimi pogoji (Spano in sod., 2021).
Slika 3: Molekulska struktura Δ9-trans-tetrahidrokanabinola (Δ9-THC) (Thomas in Elsohly, 2016).
2.4.2.2 Kanabigerol (CBG)
Pogosto je v večjih količinah prisoten v sortah industrijske konoplje, zato je pridelava z namenom ekstrakcije CBG kanabinoida omejena na pridelavo le teh. Prisoten je v vseh rastlinah konoplje, le v različnih količinah. V rastlinskem tkivu je prisoten v kislinski obliki in je prekurzor za sintezo Δ9-THCA, kanabidiolne kisline (CBDA) in kanabikromenske kisline (CBCA), zato je njegova vsebnost v rastlinskem tkivu močno odvisna od razvojnega stadija rastline. V večini primerov se med cvetenjem njegova vsebnost povečuje do 4. ali 6.
tedna cvetenja (dosežen 'plato') in potem sledi drastičen padec vsebnosti. To lahko pojasnimo z večjo aktivnostjo THCA in CBDA sintaze (Yang in sod., 2020).
Slika 4: Molekulska struktura kanabigerola (CBG) (Thomas in Elsohly, 2016).
2.4.2.3 Kanabidiol (CBD)
Višje vsebnosti kanabidiola je značilna za vse sorte industrijske konoplje in predstavnike Cannabis sativa ssp. indica var. kafristanica. V rastlinskem tkivu je CBD v večini prisoten v kislinski obliki (CBDA) in se nato, enako kot THCA, pod določenimi pogoji pretvori v
dekarboksilirano obliko CBD. CBDA in CBD nista psihoaktivna kanabinoida.
Dekarboksilirana oblika CBDA je pogosto uporabljena v medicinske namene zaradi protivnetnega in antioksidativnega delovanja, antiepileptičnega delovanja in domnevnega pozitivnega vpliva v primeru akutnih in kroničnih nevrodegeneracij. Vsebnost skupnega CBD se pri sortah konoplje za industrijske namene s staranjem socvetij povečuje. V povprečju največjo vsebnost doseže v šestem tednu po indukciji cvetenja. Po dosegu platoja sledi sortno specifičen padec vsebnosti (Yang in sod., 2020).
Slika 5: Molekulska struktura kanabidiola (CBD) (Thomas in Elsohly, 2016).
2.4.2.4 Kanabikromen (CBC)
Skupaj z zgoraj naštetimi kanabinoidi CBC tvori skupino 4 glavnih kanabinoidov v konoplji.
Koncentracija CBC je v realnosti veliko manjša od ostalih glavnih kanabinoidov. V novejših sortah konoplje, ki se uporabljajo v medicinske in rekreacijske namene, glavni trije kanabinoidi predstavljajo do 35 % suhe mase, kar je za vsebnost sekundarnih metabolitov zelo visoka vrednost. CBC pa v redkih primerih presega vrednost 0,2 do 0,3 % (Hanuš in sod., 2016).
Slika 6: Molekulska struktura kanabikromena (CBC) (Thomas in Elsohly, 2016).
Na podlagi razmerja kanabinoidov THC in CBD delimo konopljo v pet kemotipov. Kemotip I vsebuje velike vsebnosti kanabinoida THC (> 0,3 %) in majhne vsebnosti CBD (< 0,5%);
kemotip II vsebuje veliko THC (> 0,3 %) in veliko CBD (> 0,5 %); kemotip III vsebuje veliko CBD (> 0,5 %) in malo THC (< 0,3 %) (Small and Beckstead, 1973). Analiza geografskega izvora rastlin potrjuje, da so kemotipi konoplje lokacijsko značilni (Hillig in
Mahlberg, 2004). Naknadno so Fournier in sod. leta 1987 determinirali še dva kemotipa, in sicer kemotip IV, ki vsebuje CBG nad 0,3 % in kemotip V, pri katerem ni zaznati vsebnosti kanabinoidov.
Spano in sod. so leta 2021 izvedli analizo ženskih socvetij več sort konoplje za industrijsko pridelavo. Pokazali so, da imata sorta in čas žetve močan vpliv na kemijski profil socvetij.
Na podlagi vsebnosti bioaktivnih snovi lahko odbiramo sorte, ki so bolj primerne za pridelavo v medicinske, prehranske ali aromaterapijske namene. Variabilnost v vsebnosti bioaktivnih snovi se razlikuje tudi med posameznimi deli rastline. Največjo vsebnost kanabinoidov vsebujejo ovršni listi, medtem ko se vsebnost kanabinoidov v socvetjih glede na položaj socvetja ne razlikuje. Ovršni listi vsebujejo do štirikrat več kanabinoidov v primerjavi s preostalim delom socvetja (Glivar in sod., 2020).
2.4.3 Terpeni
Medtem ko so kanabinoidi primarne psihoaktivne in medicinsko uporabne molekule v konopljini smoli, hlapni terpeni (monoterpeni in seskviterpeni) doprinesejo dišave vršičkom in izdelkom iz konoplje. Arome so velikokrat unikatne in sortno značilne. Zaradi raznolikosti rastlin med sortami in znotraj sort se srečujemo s problemi v ponovljivosti terpenskega in kanabinoidnega profila pri pridelavi (Booth in Bohlmann, 2019). V posušenem cvetu je vsebnost skupnih terpenov med 0,5 in 3 %. V splošnem lahko rečemo, da imajo terpeni v konoplji sedativen in anksiolitičen učinek. Vendar pa imajo posamezni terpeni različne farmakološke učinke, kot ima na primer pinen antibiotično aktivnost, β-kariofilen vlogo v zaščiti želodčnih celic in β-mircen antiepileptično delovanje (Orser in sod., 2018). V Preglednici 1 je nekaj primerov skupin terpenov in terpenoidov (Hanuš in Hod, 2020).
Preglednica 1: Pogosto prisotni terpeni in terpenoidi v konoplji s pripadajočimi molekulskimi formulami in masami (Hanuš in Hod, 2020).
Monoterpeni - C10H16, mw 136 Monoterpenoidi
Aciklični (β-mircen) Aciklični (linalool - C10H18O, mw 154)
Monociklični (α-felandren) Monociklični (cis-linalool oksid - C10H18O2, mw 170) Biciklični (α-pinen) Biciklični (cis-sabinen hidrat - C10H18O, mw 154) Triciklični (tricilen)
Seskviterpeni - C15H24, mw 204 Seskviterpenoidi
Aciklični (cis-β-farnezen) Aciklični (cis-nerolidol - C15H26O, mw 222) Monociklični (α-humulen)
Monociklični (humulen epoksid II - C15H24O, mw 220)
Biciklični (β-kariofilen) Biciklični (seskvicineol - C15H26O, mw 222) Triciklični (α-kubeben) Triciklični (epi-kubebol - C15H26O, mw 222)
Diterpeni Diterpenoidi
Monociklični (m-camforen C20H32, mw 272) Aciklični (fitol - C20H40O, mw 296)
Študije so pokazale, da lahko na podlagi analize terpenov med seboj ločujemo sorte, ki imajo zelo podobno koncentracijo kanabinoidov. Zaradi zmede v nomenklaturi sort medicinske konoplje so se na podlagi povezovanja terpenskih profilov posameznih sort začeli oblikovati terpenski kemotipi, ki bi jih v prihodnosti lahko uporabljeni za lažje poimenovanje
(Fischedick, 2017). Najpogosteje zastopani terpeni v konoplji so monoterpeni. So lahko hlapni, zato so v večini odgovorni za raznolike arome rastlin. Druga glavna skupina terpenov so seskviterpeni. Prisotni so v bistveno nižjih koncentracijah, so manj hlapni ter jih lahko zaznamo samo, ko so vezani na alkohol ali ketone, zato so za človeško zaznavanje arom postranskega pomena.
2.4.3.1 β - mircen
Je monoterpen, pogosto zastopan v najvišji koncentraciji v primerjavi z ostalimi terpeni v konoplji. Njegova vsebnost lahko predstavlja tudi do 78 % vseh terpenov v rastlinskem tkivu. Prisoten je tudi v drugih rastlinskih vrstah, kot so limonska trava, timijan, peteršilj, bazilika in druge. Deluje antioksidativno in protivnetno, predvideva se, da ima tudi sedativne učinke na človeško telo (Nuutinen, 2018; Orser in sod., 2018).
Slika 7: Molekulska formula β – mircena (Nuutinen, 2018).
2.4.3.2 β – kariofilen
Je najpogostejši seskviterpen, velikokrat zastopa več kot polovico vseh terpenov v konoplji, čeprav ga v nekaterih kemotipih lahko sploh ni. Prisoten je tudi v sivki, črnem popru in rožmarinu. Zanimivost β – kariofilena je njegova afiniteta do kanabinoidnega receptorja 2 (CB2), in s tem predstavlja edini fitokanabinoid, ki je prisoten tudi v drugih rastlinskih rodovih, razen Cannabis-u. CB2 agonizem je najverjetneje glavni razlog za njegovo močno protivnetno delovanje. Pozitivno vpliva tudi na zmanjševanje rasti in proliferacije tumorskih celic (Nuutinen, 2018).
Slika 8: Molekulska formula β – kariofilena (Nuutinen, 2018).
3 MATERIALI IN METODE
Raziskava je potekala v letih 2020 in 2021 v prostorih Katedre za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin na Oddelku za agronomijo, Biotehniške fakultete na Univerzi v Ljubljani ter na Znanstveno Raziskovalnem Inštitutut (ZRI) Zdravstvene fakultete na Univerzi v Ljubljani. Vzgoja rastlin je potekala v rastlinjaku in rastni komori Biotehniške fakultete, Oddelka za agronomijo. Namen poskusa v rastlinjaku je bil preučevanje sposobnosti obraščanja in regeneracije matičnih rastlin ob izvajanju redne rezi. Analizo sekundarnih metabolitov smo opravili v kemijskem laboratoriju na Zdravstveni fakulteti.
Analize smo opravili z namenom pregleda kanabinoidnega in terpenoidnega profila konoplje ter medsebojne primerjave sort in genotipov znotraj posamezne sorte.
3.1 RASTLINSKI MATERIAL
V poskus so bile vključene 4 dvodomne in 2 enodomni sorti industrijske konoplje (Cannabis sativa L.). Dvodomne sorte so bile 'Gorička Simba' (gre za domačo populacijo, ki jo ohranjajo v Prekmurju in v Posavju, vendar jo bomo zaradi enotnega poimenovanja v nadaljevanju poimenovali sorta), 'Carmagnola', 'Tiborszallasi' in 'Finola' ter enodomni sorti 'Santhica 27' in 'Fiona'. Dne 18.6.2020 smo posejali semena sort 'Gorička Simba', 'Tiborszallasi', 'Finola', 'Santhica 27' in 'Fiona'. Dne 22.6.2020 je sledila setev sorte 'Carmagnola'. Vse sorte smo posejali v gojitvene plošče s 84 luknjami, napolnjene s šotnim substratom Tonsubstrat (Klasmann, Nemčija). V posamezno luknjo gojitvene plošče smo posejali 3 semena za vsako sorto, s čimer smo si zagotovili zadostno število sadik kljub morebitni slabi kalitvi. Gojitvene plošče smo postavili na temperaturo 24 do 28 °C in pod LED osvetlitev (PHILIPS Green Power LED) s fotoperiodo 16/8 (svetloba/tema), kar je pogoj za vegetativno rast navadne konoplje. Tri dni po kalitvi smo izpulili odvečne rastline in pustili en sejanček na posamezno luknjo gojitvene plošče. Po enem tednu rasti smo iz sejančkov dvodomnih sort izolirali DNA po modificirani CTAB metodi in molekularno določili spol z uporabo markerjev SCAR119 in MADC2 (Slapnik, 2018). Za izolacijo DNA smo uporabili klična lista in polovico prvega pravega lista. Za posamezen marker smo izvedli ločeno PCR reakcijo. Na podlagi združenih rezultatov dveh PCR reakcij za vsako rastlino smo določili spol.
3.2 POGOJI RASTI
Skupno smo iz nabora sejančkov odbrali 30 ženskih rastlin za vsako dvodomno sorto in 30 rastlin za vsako enodomno sorto. Dne 2.7.2020 smo rastline presadili v 1 L lonce in jih gojili v rastni komori Katedre za aplikativno botaniko, ekologijo, fiziologijo rastlin in informatiko na Oddelku za agronomijo, z dodatnim osvetljevanjem s CFL (Pure Light) svetilkami (4 x 125W, 6400K) in fotoperiodo 16/8 (svetloba/tema) (Slika 9).
Slika 9: Gojenje odbranih sejančkov štirih dvodomnih in dveh enodomnih sort navadne konoplje.
3.3 VZGOJA MATIČNIH RASTLIN
Nadaljnja vzgoja matičnih rastlin je potekala v substratu Kekkila (Kekkilä Oy Professional, Finska) v loncih prostornine 5 L. Po presajanju v končne lonce smo rastline prestavili v rastno komoro Katedre za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin na Oddelku za agronomijo, opremljeno z dosvetljevanjem s pomočjo CFL (Pure Light) svetilk (6 x 125 W, 6400 K). V zimskem času smo zaradi pomanjkanja osvetlitve dodatno osvetljevali tudi s štirimi 600 W HPS lučmi. Temperatura se je čez celotni cikel rasti gibala med 19 in 29 °C ob relativni zračni vlagi 60 do 80 %. V fazi vegetativne rasti smo rastlinam dodajali hranila v obliki tekočih mineralnih gnojil s hranilno raztopino pH vrednosti 6,5 in koncentracijo 500 ppm. Dognojevanje je potekalo dvakrat tedensko. Vsako tretje zalivanje smo aplicirali čisto vodo s pH vrednostjo 6,5. S tem smo zagotovili izpiranje odvečnih hranil iz substrata in omogočili lažje uravnavanje pH vrednosti substrata ter lažji sprejem hranil.
Vzgoja in vzdrževanje matičnih rastlin je potekala 9 mesecev. Med tem smo izvajali rez in spremljali obraščanje posameznih genotipov in sort. Odrezane poganjke smo uporabili za pridobitev potaknjencev in oceno koreninjenja posameznih genotipov.
3.3.1 Ocena sposobnosti obraščanja matičnih rastlin po rezi
Prvo rez matičnih rastlin smo izvedli na 3 različne načine, kar je razloženo v naslednjem poglavju. Nato smo opazovali vpliv načina rezi na sposobnost obraščanja. V oceno sposobnosti obraščanja je bilo vključenih 30 rastlin za vsako od 6 izbranih sort. Rastline vsake sorte smo razporedili v tri obravnavanja (zaradi treh različnih načinov rezi) po 10 rastlin. Pri sortah 'Gorička Simba', 'Carmagnola', 'Tiborszallasi', 'Santhica 27' in 'Fiona' smo skupine poimenovali 3N, 5N in 7N. Sorto 'Finola' smo razdelili v skupine imenovane 2N, 4N in 6N. Med seboj so se razlikovale v položaju prve rezi terminalnega poganjka. Na podlagi tega je prišlo do spremenjene morfologije in razrasti posameznih rastlin, kar nam je
omogočilo primerjave med posameznimi rastlinami znotraj sorte in med sortami. Do četrte rezi smo rastline vzgajali pri gostoti 11,1 rastlin na m2, od četrte rezi dalje pri gostoti 9,30 rastlin na m2.
3.3.1.1 Prva rez
Pri prvi rezi smo rastlinam (5 sort) odrezali terminalni poganjek na tretjem (3N), petem (5N) ali sedmem (7N) nodiju (Slika 10) oziroma drugem (2N), četrtem (4N) in šestem (6N) nodiju pri sorti 'Finola' ter s tem oblikovali obravnavanja. Zaradi hitrejše rasti je bila prva rez sort 'Santhica 27' in 'Finola' izvedena 32 dni po setvi, pri preostalih sortah pa 42. in 43. dan po setvi.
3.3.1.2 Vzdrževalna rez v vegetativni fazi rasti
Vzdrževalna rez je potekala čez celotno obdobje rasti na enak način. Rez smo izvajali približno enkrat mesečno, pri kateri smo novo nastale poganjke prikrajšali na en nodij, iz katerega sta praviloma pognala dva nova poganjka. Enakovredna rez vseh rastlin nam je omogočila spremljanje in beleženje sposobnosti obraščanja vsakega genotipa. Pred vsako rezjo smo prešteli število novih poganjkov, ki so izraščali iz posameznega stebelnega nodija.
Poganjek smo zabeležili kot poganjek, v kolikor je bil dolg vsaj 2 cm in je imel razvit minimalno en nodij. Poganjek smo prikrajšali, če je imel vsaj 3 dobro razvite nodije in ni bil krajši od 5 cm. Prav tako smo zabeležili tudi število poganjkov, ki so bili primerni za vegetativno razmnoževanje s potaknjenci (v nadaljevanju jih imenujemo potencialni potaknjenci). Poganjek smo zabeležili kot potencialni potaknjenec, če je meril vsaj 13 cm in imel najmanj tri dobro razvite liste ter štiri nodije.
Slika 10: Primer razlik v morfologiji matičnih rastlin starosti sedem mesecev glede na položaj prve rezi. Na levi sliki je genotip T68 sorte 'Tiborszallasi', pri kateri je bila 1. rez opravljena nad 3. nodijem (3N). Sredinska slika prikazuje genotip S27-4 sorte 'Santhica 27' s prvo rezjo nad 5. nodijem (5N). Na desni sliki je prikazan genotip S14 sorte 'Gorička Simba', pri kateri smo prvo rez opravili nad 7. nodijem (7N).
3.4 VEGETATIVNO RAZMNOŽEVANJE NAVADNE KONOPLJE
Redna rez spodbuja obraščanje rastlin. Odrezane poganjke smo uporabili za pripravo potaknjencev in s tem preučevanje potenciala vegetativnega razmnoževanja sort navadne konoplje. Teoretično lahko z rezjo število novih poganjkov eksponentno narašča, saj iz vsakega nodija izraščata dva nova poganjka. Vegetativne potaknjence lahko uporabimo za nadaljnjo koreninjenje in pridobivanje vegetativno razmnoženih sadik. Potaknjence smo koreninili in spremljali uspešnost vegetativnega razmnoževanja prvih pet rezi, od druge do četrte rezi smo beležili tudi oceno bujnosti korenin.
3.4.1 Priprava potaknjencev in ocena sposobnosti njihovega koreninjenja
Vegetativno razmnožene potaknjence smo pripravili iz stranskih poganjkov vseh šestih sort.
Poganjek dolžine 13 do 16 cm smo odrezali pod kotom 45 stopinj, ranjeni del pomočili v hormonski gel Clonex (Growth Technology) in pravokotno postavili v kocko kamene volne (Cultilene) namenjene vegetativnem razmnoževanju rastlin. Kocke kamene volne velikosti 37 mm x 37 mm so se pred uporabo namakale 24 ur v vodi s pH 6,5 z namenom popolnega nasičenja in vzpostavitve stabilne pH vrednosti. Rezna rana na poganjku se je popolnoma stikala s kameno volno. Na posameznem poganjku smo pustili dva do tri cele prave liste. V kolikor je bila dolžina lističev v listu večja od 10 cm, smo listne ploskve prikrajšali na primerno dolžino, to je približno za polovico. Potaknjence smo prvi teden vzdrževali v propagatorju (Slika 11) pri konstantni temperaturi 25 °C in 95 do 100 % relativni zračni vlagi in fotoperiodi 18/6 (svetloba/tema). Gostota potaknjencev je bila 462 na m2. Po enem tednu smo relativno zračno vlago znižali na 85 do 90 % ob ohranitvi ostalih pogojev. Tretji teden koreninjenja je sledilo znižanje relativne zračne vlage na 75 do 80 % in začetek aklimatizacije. Enaindvajset dni po rezi (Slika 12) smo potaknjence presadili v 1 L lončke, napolnjene s Kekkila substratom in jih prestavili v vegetativno komoro poleg matičnih rastlin. Zapisovali smo število uspešno aklimatiziranih in neuspelih potaknjencev. Pred presajanjem smo ocenili bujnost korenin posameznega uspešno ukoreninjenega potaknjenca.
Oceno bujnosti korenin smo podali z vrednostmi 0, 1 in 2, pri čemer število 0 predstavlja propadli potaknjenec, 1 predstavlja potaknjenec, ki je tvoril malo vidnih adventivnih korenin. Potaknjenci z vrednostjo 2 so tvorili veliko novih korenin in popolnoma prerasli kocko kamene volne (Slika 13).
Slika 11: Potaknjenci postavljeni v kocke kamene volne in pripravljeni na koreninjenje.
Slika 12: Ukoreninjeni potaknjenci nekaterih genotipov sort 'Tiborszallasi' (T19) (levo), 'Gorička Simba' (S33) (sredina) in 'Fiona' (M32) (desno), pripravljeni za presaditev.
Slika 13: Primer potaknjenca z oceno korenin 1 (levo) in 2 (desno) pri genotipu S21 sorte 'Gorička Simba'.
3.5 DOLOČANJE SEKUNDARNIH METABOLITOV V SOCVETJIH VEGETATIVNO RAZMNOŽENIH POTAKNJENCEV
Drugi del poskusa je predstavljal indukcijo cvetenja in analizo socvetij vegetativno razmnoženih potaknjencev navadne konoplje. Za vsako matično rastlino sort 'Gorička Simba', 'Carmagnola', 'Tiborszallasi', 'Santhica 27' in 'Fiona' smo iz četrte ali pete rezi odbrali najboljši vegetativno razmnožen potaknjenec. Potaknjence smo po aklimatizaciji presadili v 5 L lonce (Slika 14) napolnjene s Kekkila substratom in jih prestavili v dva ločena prostora, namenjena cvetenju konoplje.
Slika 14: Vegetativno razmnožen potaknjenec (sadika) sorte 'Gorička Simba' genotip S10 en teden po presaditvi v lonec volumna 5 L.
3.5.1 Pogoji rasti in generativni razvoj
Potaknjence sorte 'Gorička Simba' (29, en potaknjenec ni preživel), 27 potaknjencev sorte 'Carmagnola' (trije potaknjenci niso preživeli) in 27 potaknjencev sorte 'Tiborszallasi' (trije potaknjenci niso preživeli) smo prestavili v rastno komoro za cvetenje. Rastna komora je bila opremljena z umetno osvetlitvijo (8 x 600 W HPS svetilke; Sylvania SHP-TS 600W HPS; Lumatek 600W NXE). Temperatura v komori se je gibala med 18 in 28 °C.
Vegetativno razmnoženi potaknjenci enodomnih sort so rasli ločeno od dvodomnih sort, da smo preprečili možnost oprašitve ženskih socvetij dvodomnih sort. Cvetenje enodomnih sort je potekalo v steklenjaku z dodatnim osvetljevanjem z uporabo dveh 600 W HPS luči.
Število rastlin, ki smo jih izpostavili pogojem za cvetenje sort 'Santhica 27' in 'Fiona', je bilo 28 ter 29. Temperatura v steklenjaku se je gibala med 18 in 30 °C. Prvi teden po presajanju
