UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Špela AHAČIČ
VPLIV RAZLIČNIH NANODELCEV NA PREŽIVETJE, STRESNI ODZIV IN
DIFERENCIACIJO CELIC Caco-2
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2022
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Špela AHAČIČ
VPLIV RAZLIČNIH NANODELCEV NA PREŽIVETJE, STRESNI ODZIV IN DIFERENCIACIJO CELIC Caco-2
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
EFFECT OF DIFFERENT NANOPARTICLES ON VIABILITY, STRESS RESPONSE AND DIFFERENTIATION OF CELL LINE
Caco-2
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2022
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa druge stopnje Biotehnologije na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Delo je bilo opravljeno na Fakulteti za elektrotehniko, Univerza v Ljubljani, pod mentorstvom doc. dr. Mojce Pavlin.
Praktično delo je bilo opravljeno v laboratoriju Skupine za nano in biotehnološke aplikacije.
Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala doc. dr. Mojco Pavlin. Za recenzentko je bila imenovana prof. dr. Damjana Drobne.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: doc. dr. Mojca PAVLIN
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko Član: prof. dr. Damjana DROBNE
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora: 14.02.2022
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 601.2:620.3:606:61(043.2)
KG Biotehnologija, nanodelci, Caco-2, nanoTiO2, nanoSiO2, nanoAg AV AHAČIČ, Špela, dipl. bioteh. (UN)
SA PAVLIN, Mojca (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Magistrski študijski program druge stopnje Biotehnologija
LI 2022
IN VPLIV RAZLIČNIH NANODELCEV NA PREŽIVETJE, STRESNI ODZIV IN DIFERENCIACIJO CELIC CACO-2
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja) OP XIII, 65 str., 8 pregl., 5 sl., 132 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V našem delu smo analizirali vpliv 48-urne izpostavitve nanodelcev (ND) food grade (FG) nano TiO2, nano SiO2 in nano srebra, v zmernih (2 in 10 µg/mL) in višjih koncentracijah (50 in 100 µg/mL) na celično linijo Caco-2. Z metodo diferencialnega barvanja po Hoechstu in s propidijevim jodidom (PI) smo prikazali koncentracijsko odvisen vpliv izbranih ND na preživetje celic. S pomočjo fluorometričnih metod smo analizirali nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) v tretiranih nediferenciranih celicah Caco-2 z reagentom CM-H2DCFDA ter analizirali aktivnost alkalne fosfataze (ALP) v diferenciranih celicah Caco-2 preko zaznavanja signala od MUP (metilumbeliferil fosfat) odcepljenih fosfatnih skupin.
Delež ROS je bil povečan v primeru celic tretiranih s FG TiO2 in SiO2 pri koncentracijah > 50 µg/mL, vendar nikjer ni prišlo do statistično značilnih razlik v primerjavi s kontrolo. Rezultati ne nakazujejo na vpliv izbranih ND na diferenciacijo celic, kaže pa se od koncentracije odvisen vpliv preučevanih nanodelcev na aktivnost membranske ALP, ki se sintetizira v diferenciranih celicah Caco-2. Prikazali smo vpliv izbranih ND na preživetje celic in vpliv višjih koncentracij izbranih ND na nastanek ROS v tretiranih nediferenciranih celicah Caco-2. Za določitev vpliva izbranih ND na aktivnost ALP v diferenciranih celicah Caco-2 bi morali poskus izvesti v večih bioloških ponovitvah.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 601.2:620.3:606:61(043.2)
CX Biotechnology, nanoparticles, Caco-2, nanoTiO2, nanoSiO2, nanoAg AU AHAČIČ, Špela, B. Sc. Biotech.
AA PAVLIN, Mojca (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Biotechnology
PY 2022
TI EFFECT OF DIFFERENT NANOPARTICLES ON VIABILITY, STRESS RESPONSE AND DIFFERENTIATION OF CACO-2 CELL LINE
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO XIII, 65 p., 8 tab., 5 fig., 132 ref.
LA sl AL sl/en
AB In our thesis we have analysed the effect of acute treatment of Caco-2 with three nanoparticles (NP) – food grade (FG) nano TiO2, nano SiO2 and nano silver NP with moderate (2 and 10 µg/mL) and high (50 in 100 µg/mL) concentrations. With colouring by Hoechst and propidium iodide (PI) we observed concentration dependent effect of selected NPs on cell viability. With spectrophotometric methods we have analysed the quantity of reactive oxygen species (ROS) in treated undifferentiated cells Caco-2 with reagent CM-H2DCFDA and also analysed the activity of alkaline phosphatase (ALP) in treated differentiated cells by detecting from methylumbelliferyl phosphate derived phosphate groups. Albeit ROS was elevated in with high concentrations FG TiO2 and SiO2 (> 50 µg/mL) treated undifferentitated cells, no statistically significant differences were observed.
Although results do not indicate concentration dependent effect of selected NPs on cell differentiation, there could be an effect on alkaline phosphatase activity in treated differentiated cells Caco-2. We have shown an effect of selected NPs on cell viability and effect of high concentrations FG TiO2 and SiO2 NPs on ROS generation in treated undifferentiated cells Caco-2. The effect of selected NPs on ALP activity in treated differentiated cells Caco-2 could be established with additional biological repetitions.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC IX KAZALO SLIK X
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XI
SLOVARČEK XIII
1 UVOD 1
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA 2
1.2 CILJI RAZISKOVALNE NALOGE 3
1.3 DELOVNE HIPOTEZE 3
2 PREGLED OBJAV 4
2.1 NANOTEHNOLOGIJA 4
2.1.1 Uporaba nano SiO2 5
2.1.2 Uporaba nano TiO2 6
2.1.3 Uporaba srebrovih nanodelcev 6
2.1.4 Molekulska korona nanodelcev 7
2.2 VPLIV NANODELCEV NA CELICE 8
2.2.1 Vstop nanodelcev v celice 9
2.2.2 Znotrajcelične poti nanodelcev 9
2.2.3 Oksidativni stres 10
2.2.4 Izbrane in vitro metode za analizo vpliva nanodelcev 11
2.2.4.1 Določitev zmanjšanja preživetja celic Caco-2 12
2.2.4.2 Določitev ROS v celicah Caco-2 13
2.2.4.3 Določitev aktivnosti ALP in diferenciacija celic Caco-2 13 2.2.5 In vitro študije o vplivu izbranih ND na celice 14
2.2.5.1 Vpliv nano SiO2 na celice 14
2.2.5.2 Vpliv nano TiO2 na celice 14
2.2.5.3 Vpliv srebrovih nanodelcev na celice 15
2.3 CELIČNA LINIJA CACO-2 16
2.3.1 Diferenciacija 17
2.3.2 Alkalna fosfataza 19
3 MATERIALI IN METODE 20
3.1 MATERIALI 20
3.1.1 Gojišča in kemikalije 20
3.1.2 Droben laboratorijski material 21
3.1.3 Laboratorijska oprema 21
3.1.4 Nanodelci 22
3.1.5 Celična linija 22
3.1.6 Gojišča in raztopine 22
3.2 METODE 23
3.2.1 Karakterizacija nanodelcev 23
3.2.2 Gojenje celičnih kultur 23
3.2.2.1 Določanje števila celic s hemocitometrom 23
3.2.2.2 Protokol diferenciacije 24
3.2.3 Določanje preživetja celic 24
3.2.3.1 Nasajanje celične kulture 24
3.2.3.2 Izpostavitev nanodelcem 25
3.2.3.3 Diferencialno barvanje 25
3.2.3.4 Izračun zmanjšanja preživetja celic 26
3.2.4 Določanje reaktivnih kisikovih spojin 27
3.2.4.1 Nasajanje celične kulture 27
3.2.4.2 Priprava kontrol 27
3.2.4.3 Izpostavitev nanodelcem 28
3.2.4.4 Spiranje in dodatek reagentov 28
3.2.4.5 Analiza relativnega deleža ROS v vzorcih 28
3.2.4.6 Izračun relativnega deleža ROS 29
3.2.5 Določanje aktivnosti alkalne fosfataze 29
3.2.5.1 Nasajanje celične kulture 29
3.2.5.2 Izpostavitev nanodelcem 29
3.2.5.3 Postopek diferenciacije 30
3.2.5.4 Priprava standardne umeritvene krivulje 30
3.2.5.5 Analiza aktivnosti alkalne fosfataze 30
3.2.5.6 Izračun aktivnosti alkalne fosfataze 31
3.2.6 Statistična obdelava podatkov 32
4 REZULTATI 33
4.1 KARAKTERIZACIJA NANODELCEV 33
4.2 VPLIV NANODELCEV NA PREŽIVETJE CELIČNE LINIJE
CACO-2 33
4.3 RELATIVNI DELEŽ REAKTIVNIH KISIKOVIH SPOJIN 35
4.4 REZULTATI AKTIVNOSTI ALKALNE FOSFATAZE 37
5 RAZPRAVA 39
5.1 VPLIV ND NA PREŽIVETJE NEDIFERENCIRANIH CELIC CACO-2 40 5.1.1 Vpliv koncentracije ND na preživetje nediferenciranih celic Caco-2 40 5.1.2 Vpliv topnosti ND na nediferencirane celice Caco-2 41
5.1.3 Vpliv medija 42
5.2 VPLIV ND NA NASTANEK ROS V NEDIFERENCIRANIH CELICAH
CACO-2 42
5.2.1 Količina ROS v nediferenciranih celicah Caco-2 po izpostavitvi Ag ND 43 5.2.2 Količina ROS v nediferenciranih celicah Caco-2 po izpostavitvi nano
SiO2 43
5.2.3 Količina ROS v nediferenciranih celicah Caco-2 po izpostavitvi FG
nano TiO2 43
5.2.4 Povezava med preživetjem tretiranih nediferenciranih celic Caco-2 in
deležem ROS 44
5.3 VPLIV PREDIZPOSTAVITVE NEDIFERENCIRANIH CELIC CACO-2
IZBRANIM ND NA AKTIVNOST ALP 45
5.3.1 Aktivnost ALP v netretiranih diferenciranih celicah Caco-2 45 5.3.2 Aktivnost ALP v tretiranih diferenciranih celicah Caco-2 46 5.3.3 Aktivnost ALP v diferenciranih celicah Caco-2 po izpostavitvi FG
nano TiO2 46
5.3.4 Aktivnost ALP v diferenciranih celicah Caco-2 po predizpostavitvi Ag
ND 47
5.3.5 Aktivnost ALP v diferenciranih celicah Caco-2 po izpostavitvi nano
SiO2 47
6 SKLEPI 49
7 POVZETEK 50
8 VIRI 53
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Pregled primerov materialov na nanometrski ravni, njihov izvor,
značilnosti in proizvodi, v katerih se lahko nahajajo………..5 Preglednica 2: Prikaz uporabljenih gojišč in kemikalij ter proizvajalec in proizvodna država materiala………...………20 Preglednica 3: Prikaz uporabljenega laboratorijskega materiala ter proizvajalec in proizvodna država materiala……….21 Preglednica 4: Prikaz uporabljene laboratorijske opreme ter proizvajalec in proizvodna država opreme………...21 Preglednica 5: Seznam uporabljenih ND………..22 Preglednica 6: Prikazana sestava gojišč in raztopin, ki smo jih uporabili v raziskovalnem delu………22 Preglednica 7: Prikaz standardnih raztopin reagenta MUP za standardno umeritveno krivuljo………..…31 Preglednica 8: Z-povprečna velikost, hidrodinamski premer, vrednosti polidisperzijskega indeksa (PDI) vrednost in zeta potencial Ag ND, SiO2 in FG TiO2 v destilirani vodi in mediju MEM/F12 z 10 %FBS………...………...…33
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Potencialni mehanizmi vpliva vstopajočega nanodelca v celici (Prirejeno po Shukla in sod., 2011)………....11 Slika 2: Prikaz 21-dnevne diferenciacije po konfluenci celične linije Caco-2…………...18 Slika 3: Vpliv nanodelcev na preživetje nediferenciranih celic Caco-2. Prikaz zmanjšanja števila živih celic (preživetja) v odvisnosti od koncentracije nanodelcev………...34 Slika 4: Prikaz relativnega deleža reaktivnih kisikovih spojin v tretiranih nediferenciranih celicah Caco-2 v odvisnosti od koncentracije nanodelcev………...36 Slika 5: Prikaz aktivnosti ALP v diferenciranih celicah Caco-2 po 48-urni preizpostavitvi nediferenciranih celic Caco-2 v odvisnosti od koncentracije izbranih nanodelcev po 14-ih in 21-ih dnevih diferenciacije………...38
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI Kratica/simbol Pomen
A Absorbanca
Ag ND Srebrovi nanodelci
ALP Alkalna fosfataza
ALPI Gen, ki kodira črevesno alkalno fosfatazo ANPEP Gen, ki kodira membransko aminopeptidazo
ATP Adenozin trifosfat
B Količina MUP, ki smo jo izračunali z enačbo premice standardne umeritvene krivulje
Ca2+ Kalcijev ion
CaCl2 Kalcijev diklorid
CM-H2DCFDA Ang. 5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate
ddH2O Dvojno destilirana voda
DLS Dinamično sipanje svetlobe (ang. Dynamic Light Scattering)
DMSO Dimetil sulfoksid
DMEM Dulbeccovo modificirano celično gojišče (ang. Dulbecco's Modified Eagle's Medium)
DNK Deribonukleinska kislina
DPP4 Gen, ki kodira dipeptidil peptidazo 4
EFSA Evropska agencija za varnost hrane (ang. European Food Safety Authority)
EGFR Epidermalni rastni dejavnik (ang. Epidermal Growth Factor Receptor)
ELISA Encimski imunski test (ang. Enzyme-linked Immunosorbent Assay) FBS Goveji serumski albumin (ang. Fetal Bovine Serum)
FDA Ameriška uprava za hrano in zdravila (ang. Food and Drug Administration)
FG Prehranska kvaliteta (ang. Food grade)
H2O2 Vodikov peroksid
IARC Mednarodna agencija za raziskovanje raka (angl. International Agency for Research on Cancer)
Kratica/simbol Pomen
IL Interlevkin
Mg2+ Magnezijev ion
MgCl2 Magnezijev diklorid
MHC Poglavitni histokompatibilnostni kompleks (ang.
Major Histocompatibility Complex)
mRNA Informacijska ribonukleinska kislina (ang. Messenger RNA)
MUP Metilumbeliferil fosfat
N Število celic
NaCl Natrijev klorid
NADPH Nikotinamin adenin dinukleotid fosfat
ND Nanodelec
DAMP S poškodbo povezani molekulski vzorci (ang. Danger Associated Molecular Pattern)
PBS Fosfatni pufer s soljo (ang. Phosphate Buffered Saline)
PDI Polidisperzijski indeks
ROS Reaktivne kisikove spojine (ang. Reactive oxygen species) RT-PCR Polimerazna verižna reakcija v realnem času
(ang. Real-Time Polymerase Chain Reaction)
SAS Sintetična amorfna silika (ang. Synthetic Amorphous Silica)
SiO2 Silicijev dioksid
T Reakcijski čas
TEER Metoda za merjenje prekoepitelijske električne upornosti (ang.
Transepithelial Electrical Resistance)
TiO2 Titanov dioksid
TGF-β1 Dejavnik rasti tumorja beta (ang. Tumor Growth Factor Beta) TNF-α Dejavnik nekroze tumorja alfa (ang. Tumor Necrosis Factor Alpha)
V Volumen vzorca
SLOVARČEK
Pojem Definicija
Aglomeracija Kopičenje snovi.
Apoptoza Celična smrt.
Avtofagija* Kataboličen proces razgradnje celici lastnih snovi ali molekul.
Celična polarizacija Proces reorganizacije citoskeleta in celičnih organelov za doseg pravilne celične oblike.
Diferenciacija Celični proces razvoja manj specializiranih celic v bolj specializirane celice.
Endocitoza* Celični proces, pri katerem celica v svojo notranjost prenese snov preko celične membrane.
Fagocitoza* Celični proces odstranjevanja mrtvih celic in celičnih ostankov ter mehanizem obrambe pred tujki.
Homeostaza Stanje optimalnega poteka fizioloških procesov.
Kaveolin* Dimerni protein, ki omogoča nastanek celičnih membranskih vdolbin.
Klatrin* Protein, ki omogoča nastanek s proteini prevlečenih veziklov pri klatrinski endocitozi.
in vitro Proces ali poskus, ki poteka v nadzorovanem okolju izven živega organizma.
in vivo Proces, ki poteka znotraj živega organizma.
Paracelularni transport Proces prenosa snovi skozi celice preko epitelija.
PDI
Pokazatelj širine porazdelitve velikosti delca, ki lahko zavzame vrednosti v intervalu med 0 in 1; bližje kot je vrednosti 0, bolj so velikosti nanodelcev enakomerne.
Peroksisom** Z dvojno membrano obdan celični organel za tvorbo in odstranitev vodikovega peroksida
Transcelularni transport Proces prenosa snovi med celicami.
Cit. po *Behzadi in sod. (2017); **Valavanidis in sod. (2009)
1 UVOD
Nanotehnologija je znanost, ki se je prvič pojavila v 80. letih 20. stoletja in je predstavljala novo tehniko sinteze, preoblikovanja in vizualizacijo snovi na nanometrski ravni. Prisotna je na praktično vseh področjih človeškega življenja, med drugim se uporablja v elektronski, tekstilni, živilski in kozmetični industriji (Wu in Tang, 2018). V nekaj desetletjih se je spreobrnila v hitro razvijajoče se področje in danes predstavlja izhodišče za razvoj novih naprednih metod diagnosticiranja in zdravljenja tako akutnih kot težjih kroničnih bolezni, med njimi tudi rakavih obolenj, na področju biomedicine (Yao in sod., 2020; Wu in sod., 2019; Schoenmaker in sod., 2021). Za aplikativnost nanodelcev v namene zdravljenja in vsakdanjo uporabo izdelkov z vsebnostjo nanodelcev je potrebna podrobna raziskava njihovih vplivov na človeški biološki sistem (Bahadar in sod., 2016;
Wu in Tang, 2018).
Nanotehnologija izkazuje velik potencial predvsem v živilski industriji, in sicer za preprečitev razvoja bakterij in plesni v živilih ter podaljšanje njihove stabilnosti. Nanodelci se tako lahko nahajajo v živilih kot tudi v njihovi embalaži (Ameta in sod., 2020; Ferdous in Nemmar, 2020). Ob vedno večji rasti panoge in vsestranskosti nanodelcev se le-ti nahajajo v vedno večjem številu potrošniških izdelkov, ki jih dnevno uporabljamo ali uživamo (Carriere in sod., 2020). Problematika nanodelcev je njihov morebiten vpliv na biološki sistem, zato se je poleg nanotehnologije razširila tudi nanotoksikologija.
Nanotoksikologija je naravoslovna veda, ki preučuje škodljivost nanomaterialov na človekovo zdravje in okolje. Analize in raziskave potekajo v in vitro pogojih na modelnih celičnih linijah in in vivo, vendar kljub številnim raziskavam vpliv nekaterih nanomaterialov še ni točno definiran (Oberdöster, 2010; Schrand in sod., 2010; Pietroiusti in sod., 2017; Wolf-Grosse in sod., 2017; Heller in sod., 2018; Milosevic in sod., 2020).
Eno izmed področij nanotoksikologije, ki je zelo pomembno iz stališča trenutne uporabe nanodelcev, je potencialni vpliv nanodelcev na gastrointestinalni trakt (McClements in Xiao, 2017). Za ohranjanje ravnovesja znotraj črevesnega lumna gastrointestinalnega trakta je potrebno sinhrono in harmonično delovanje tako heterogenih črevesnih celic kot mikrobiote, ki naseljuje črevesje. Kakršnokoli porušenje ravnovesja lahko vodi v črevesna vnetja (Khorr in sod., 2011). Interakcija nanodelcev s črevesnim biološkim sistemom je še nepopolnoma raziskano področje predvsem s stališča kompleksnosti organa in oteženega prenosa rezultatov raziskav opravljenih v in vitro pogojih na stanje in vivo (Krüger in Klempt, 2016; Milosevic in sod., 2020; Mittag in sod., 2021).
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA
Ključna problematika je interakcija nanomaterialov v obliki nanodelcev z biološkim okoljem, kjer lahko nastanejo neugodne biokemijske reakcije zaradi spremembe fizikalno- kemijskih lastnosti nanodelcev ob prehajanju skozi biološki sistem (Auría-Soro in sod., 2019). Premalo okarakterizirana je tudi zmožnost in mehanizem prehajanja nanodelcev v celice ter obnašanje nanodelcev v celicah oziroma tkivu (Behzadi in sod., 2017). Vse omenjeno lahko privede do vnetnih odzivov, genotoksičnosti ali celo do apoptoze celic (Dusinska in sod., 2017). Ob vse večji uporabi nanodelcev na vsakdanji ravni je potrebno raziskati tudi področje vpliva kronične izpostavljenosti nanodelcem na fiziologijo celic (Pietroiusti in sod., 2017; Winkler in sod., 2018).
Opredelitev varnosti nanodelcev, ki se nahajajo v potrošniških izdelkih, je ključnega pomena za zagotavljanje zdravja potrošnikov. Zaradi še nedefiniranih nepoenotenih protokolov toksikoloških analiz posameznih nanodelcev, so rezultati raznih študij, ki vključujejo analizo vpliva različnih koncentracij posameznih nanodelcev bodisi na živali ali ljudi, omejeni s stališča njihove točnosti in zanesljivosti. Čeprav so vplivi inhaliranih nanodelcev obsežneje raziskani (Praphawatvet in sod., 2020), vpliv oralnega uživanja nanodelcev na biološki sistem in njegovo fiziologijo ostaja nezadostno raziskan (Winkler in sod., 2018; Berardi in Bombelli, 2019).
Naše delo zajema raziskavo vpliva različnih koncentracij sintetiziranih nanodelcev, s katerimi se potrošniki vsakodnevno srečujemo, in sicer SiO2 (uporabljen kot agens proti strjevanju živil in v čistilnih sredstvih), FG TiO2 (uporabljen predvsem kot aditiv za izboljšanje barve, izgleda in stabilnosti živil ter v kozmetičnih izdelkih) in srebrovih ND (uporabljeni predvsem kot protimikrobno sredstvo v embalaži živilskih izdelkov in v tekstilu) na celično linijo Caco-2, ki so celice človeškega črevesnega adenokarcinoma. V našem delu smo uporabili zmerne (2 in 10 µg/mL) in višje koncentracije (50 in 100 µg/mL) ND, obsegalo pa je analizo vpliva koncentracij posameznih ND na preživetje, nastanek ROS in aktivnost alkalne fosfataze za analizo vpliva ND na potek diferenciacije v diferenciranih in nediferenciranih celicah Caco-2.
1.2 CILJI RAZISKOVALNE NALOGE
Cilji naše magistrske naloge so bili preučevanje vpliva različnih koncentracij treh različnih nanodelcev – food grade (FG) nano titanovega dioksida, industrijskega nano silicijevega dioksida in nano srebra, na celično linijo Caco-2. Nanodelca SiO2 in FG TiO2 smo celicam izpostavili v koncentraciji 2, 10, 50 in 100 µg/mL, srebrove nanodelce pa v koncentraciji 2, 10 in 50 µg/mL. V vseh treh primerih smo preučevali vpliv akutne izpostavitve nanodelcev, in sicer so bile celice nanodelcem izpostavljene 48 ur v nadzorovanih pogojih.
Celice Caco-2 so celice človeškega adenokarcinoma, ki se spontano diferencirajo v enterocitom podobne celice, ki predstavljajo večinski delež celic v črevesju. Želeli smo preučiti vpliv nanodelcev na živost celic, na nastanek reaktivnih kiskovih spojin in na aktivnost encima alkalne fosfataze.
1.3 DELOVNE HIPOTEZE Postavili smo naslednje hipoteze:
1. Izbrani TiO2 (FG), SiO2 in Ag ND bodo koncentracijsko odvisno vplivali na preživetje celic Caco-2.
2. Izbrani TiO2 (FG), SiO2 in Ag ND bodo koncentracijsko odvisno vplivali na nastanek ROS v celicah Caco-2.
3. Izbrani TiO2 (FG), SiO2 in Ag ND bodo ob akutni predizpostavitvi celicam Caco-2 pred pričetkom diferenciacije koncentracijsko odvisno vplivali na aktivnost ALP v diferenciranih celicah Caco-2.
2 PREGLED OBJAV 2.1 NANOTEHNOLOGIJA
Nanotehnologija je znanost, ki temelji na proizvodnji in manipulaciji materiala na nanometrski ravni (Auría-Soro in sod., 2019) in predstavlja tehnologijo za izboljšanje različnih produktov in procesov v agrokulturni, živilski in kozmetični industriji (Pathakoti in sod., 2017; Dréno in sod., 2019; Ameta in sod., 2020). Nanomateriali imajo potencial za uporabo v medicini (nanomedicina), kjer bi lahko preko enkapsulacije zdravilne učinkovine v nanodelec le-to dostavili v tarčni organ s kontroliranim sproščanjem (Jahangirian in sod., 2017) ali kot diagnostična orodja za diagnosticiranje in zdravljenje bolezni, npr. rakavih obolenj (Tietze in sod., 2015; Yao in sod., 2020) in tumorjev (Wu in sod., 2019). V živilski industriji se nanomateriali uporabljajo za izboljšanje stabilnosti živil ter tudi pri metodah za pridelovanje in proizvodnjo živil, kjer bi s pomočjo nanosenzorjev v embalaži lahko zaznavali patogene mikroorganizme, ki se nahajajo v živilih (Pathakoti in sod., 2017; Yang in Duncan, 2021). V zadnjem času se je nanotehnologija prav tako izkazala kot potencialna metoda v bioremediaciji onesnaženega okolja (Núñez-Vázquez in sod., 2020).
Nanomateriali so definirani kot materiali, ki imajo zunanjo velikost ali površino notranjih struktur materiala v rangu nanometrske skale, in segajo od 1 – 100 nm (Wu in Tang, 2018), nanodelec pa je delec nanomateriala različnih oblik, npr. sferične ali porozne, ki ima 0 - 3 zunanje dimenzije > 1 nm (Núñez-Vázquez in sod., 2020). Kakšnih oblik in dimenzij bodo posamezni nanodelci narekuje predvsem metoda sinteze ND, končno učinkovitost in funkcionalnost pa se doseže z dodatnimi spremembami struktur, npr. dodatek nekovine v strukturo TiO2 za zmanjšanje absorpcije svetlobe (Noman in sod., 2019).
Komercialno se uporabljajo tako imenovani sintetizirani nanodelci, ki so pripravljeni bodisi iz kovinskih, nekovinskih ali polimernih materialov ter biokeramike (Bahadar in sod., 2016). Vsi omenjeni imajo svoje določene lastnosti, ki so ključnega pomena za njihovo uporabo na določenem področju, kot npr. protimikrobno delovanje srebrovih nanodelcev (Ferdous in Nemmar, 2020). Nanodelci so namerno ali nenamerno dodani tudi živilskim izdelkom - v splošnem so namerno dodani za izboljšanje kakovosti, stabilnosti, cene in hranilne vrednosti živila, uporabljajo pa se tudi v materialih za pakiranje živil, kjer lahko nehote preidejo v samo živilo iz embalaže (npr. srebrovi nanodelci) ali ob njihovi pridelavi, in sicer prek uporabe pesticidov (Bahadar in sod., 2016).
V grobem nanomateriale delimo na anorganske nanodelce, kamor spadajo kovinski nanodelci, ter organske nanodelce, kateri vsebujejo ogljik (lipidni, proteinski, ipd).
Najpogosteje uporabljeni anorganski nanodelci so srebrovi nanodelci, silicijev dioksid, titanov dioksid ter cinkov in železov oksid - srebrovi nanodelci se uporabljajo predvsem v tekstilni industriji zaradi njihove protimikrobne aktivnosti, silicijev in titanov dioksid se
uporabljata v živilskih izdelkih za izboljšanje stabilnosti in izgleda živil, cinkov in železov oksid pa se uporabljata predvsem v živilski industriji kot prehranski dodatek za povečanje vnosa cinka ali železa (preglednica 1) (McClements in Xiao, 2017).
Preglednica 1: Pregled primerov materialov na nanometrski ravni, njihov izvor, značilnosti in proizvodi, v katerih se lahko nahajajo (Prirejeno po McClements in Xiao, 2017).
Material na nanometrski ravni
Izvor Značilnost Proizvod
Anorganski nanodelci
Železov oksid Inženiran nanodelec
Železovo oksidni nanodelci uporabljeni za povišanje vsebnosti železa
Prehranski dodatki, ovoji mesnih izdelkov Titanov dioksid Inženiran
nanodelec
Uporabljeni kot belilni agensi Bonboni, žvečilni gumiji, pekovski izdelki, mleko v prahu
Silicijev dioksid Inženiran nanodelec
Uporabljeni za nadzor pretočnosti praškov Soli, sladkor v prahu, začimbe, mleko v prahu, suhe mešanice
Srebro Inženiran
nanodelec
Uporabljeni kot protimikrobni elementi v hrani, ovojih in embalaži
Meso in njihova embalaža, premazi Cinkov oksid Inženiran
nanodelec
Uporabljen za povišanje vsebnosti cinka v živilih, protimikrobni agens in absorpcija ultravijolične svetlobe
Produkti z zaščitnim faktorjem, kozmetični izdelki, prehranski dodatki
Ob vse večji uporabi nanodelcev in eksponentni rasti nanotehnologije so se pričela porajati vprašanja o morebitnem vplivu uporabljenih nanodelcev tako na okolje (Kranjc in Drobne, 2019) kot na človeški biološki sistem (Schrand in sod., 2010; Wu in Tang, 2018).
2.1.1 Uporaba nano SiO2
Silicijev dioksid je nekovinski oksid, zgrajen iz silicija in kisika. V naravi se nahaja v mineralni (kristalinični) obliki, ki pa ga zaradi kovinskih nečistoč ni mogoče uporabiti v znanosti in v industrijskih panogah, zato prevladuje sinteza nanomaterialov na osnovi SiO2
v amorfni obliki (prah) (Rahman in Padavettan, 2012). V živilski industriji se uporablja sintetična amorfna silika ali SAS (ang. synthetic amorphous silica), ki kot prah tvori aglomerate v velikosti > 100 nm, kar omogoči preprečitev strjevanja izdelkov v prahu, npr.
mleko v prahu (Fruijtier-Pölloth, 2016).
Zmerno porozni silicijevi nanomateriali predstavljajo potencialne prenašalce bioloških učinkovin in tudi orodja za lociranje in zdravljenje tumorjev zaradi svoje biokompatibilnosti in velike površne (Wu in sod., 2021). Poleg omenjenega se silicijevi ND uporabljajo tudi v bioremediaciji za čiščenje voda in za zmanjšanje sproščanja težkih kovin in radioaktivnih snovi v vodo (Jeelani in sod., 2019).
2.1.2 Uporaba nano TiO2
TiO2 je kovinski oksid, ki se pretežno nahaja v treh polimorfnih oblikah – rutil, anataz in brukit, nanomateriali na osnovi TiO2 pa se lahko uporabljajo v različnih industrijah, predvsem zaradi njihovih fotokatalitičnih lastnosti (Noman in sod., 2019). V največji meri smo nano TiO2 izpostavljeni v kozmetičnih izdelkih (Dréno in sod., 2019), z razmahom vsestranskosti aditiva, bolje znanega kot E 171, pa se je povečala tudi stopnja oralne izpostavljenosti, saj se nano TiO2 v prahu zaradi njegove čiste bele barve uporablja za uravnavanje barve v živilih, kot so bonboni in žvečilni gumiji, in kot barvilo v plastičnih izdelkih (Winkler in sod., 2018). Po ocenah naj bi ljudje na dnevni bazi bili izpostavljeni od 0,2 do 5,5 mg/kg telesne teže nano TiO2 (Carriere in sod., 2020). Na podlagi številnih analiz je EFSA v maju leta 2021 oznanila uporabo E 171 v živilskih izdelkih kot ne varno, prav tako ni varna uporaba aditiva v živalski krmi (EFSA, 2021).
Poleg omenjenega se nano TiO2 prav tako uporablja kot pomožna snov v farmacevtski industriji in za proizvodnjo sončnih krem z UV filtrom, ličil in pudrov v kozmetični industriji (Dréno in sod., 2019). Ob izpostavitvi ultravijolični svetlobi TiO2 producira različne kisikove reaktivne spojine, ki povzročijo celično smrt targiranih celic ali bakterij - omenjena fotokatalitična lasnost nanodelca predstavlja velik potencial nano TiO2 za uporabo v fotodinamičnih terapijah rakavih obolenj in fotodinamični inaktivaciji na antibiotike odpornih bakterij (Ziental in sod., 2020) ter za razgradnjo onesnaževalnih snovi v okolju (Noman in sod., 2019; Weijie in sod., 2020).
2.1.3 Uporaba srebrovih nanodelcev
Srebrovi nanodelci se uporabljajo v živilski industriji za namene daljšega roka uporabnosti živil in preprečitev vdora patogenov (npr. E. Coli, S. typhimurium, itd.), uporabljajo se tudi v biomedicini in kozmetičnih izdelkih zaradi njihovih protimikrobnih lastnosti (Roach in sod., 2019).
V primeru aktivnega pakiranja živilskih izdelkov, srebro neposredno interagira bodisi s pakiranim živilom ali samim materialom zunanjega ovoja. Srebrovi nanodelci tako počasi prehajajo v živilo in preprečujejo razvoj patogenov in tudi plesni - v največji meri poškodujejo membrano organizma s sproščanjem Ag+ ionov, ki tvorijo reaktivne kisikove spojine in povzročijo oksidativni stres, kar vodi v apoptozo mikroorganizma (Ferdous in Nemmar, 2020). Srebrovi nanodelci do 100 nm naj bi se začeli uporabljati v plastičnih
živilskih embalažah (< 0,025 % w/w) v katerih naj, v primeru ustreznega skladiščenja izdelkov, srebrovi delci ne bi pronicali v samo živilo, v primeru prodora nanodelca v živila pa naj količina srebrovih ionov ne bi presegla priporočenega dnevnega vnosa, ki znaša 0,9 µg srebrovih ionov/kg telesne teže (EFSA, 2021).
2.1.4 Molekulska korona nanodelcev
Proteini, proteinski ostanki, ioni in druge molekule v biološki tekočini ali mediju se vežejo na nanodelec in ustvarijo tako imenovano korono, ki jo delimo na trdo in mehko. Prvo predstavljajo molekule, ki so na površino nanodelca vezane močneje kot v tako imenovanem mehkem delu, kjer poteka bolj dinamično izmenjavanje molekul zaradi šibkejših vezi s površino nanodelca (Berardi in Bombelli, 2019). Molekulska korona nanodelcev pomembno vpliva na interakcijo nanodelcev s celicami, čas kroženja nanodelcev v biološkem sistemu, hitrost odstranjevanja iz biološkega sistema in stopnjo aglomeracije (Rampado in sod., 2020).
Kakšna bo vezava med okoliškimi molekulami in nanodelcem narekuje velikost, površinski naboj in material vstopajočega nanodelca in močno vpliva na njegovo nadaljnjo kinetiko v biološkem sistemu. Vezave narekujejo fizikalne lastnosti nanodelca;
- hidrofilnost/hidrofobnost nanodelca: narekuje s kakšnimi proteini se bo nanodelec vezal npr. hidrofilni nanodelci s proteini tvorijo močnejše vezi preko elektrostatskih sil kot hidrofobni nanodelci,
- naboj: napoveduje kateri proteini se vežejo na podlagi proteinske izoelektrične točke, načeloma bolj kot je nabit delec, debelejša je molekulska korona,
- velikost: večja površina nanodelca, več proteinov se lahko veže in obratno - manjši delec, manj površine za vezave proteinov,
- medij: predvsem v smislu in vitro sestava medija in dodan serum, vrsta in izvor biološke tekočine (človek, miš ipd.),
- pH in temperatura: pH vpliva na afiniteto in difuzivnost proteinov in površinski naboj nanodelca, vpliva tudi na zvijanje proteinov in posledično vezavo na nanodelec (Sakhtianchi in sod., 2013).
Poleg lastnosti nanodelca na interakcijo molekul z nanodelci vpliva tudi narava proteina oziroma kako protein funkcionira, npr. imunoglobulini so bolj »lepljivi« in lahko povzročijo aglomeracijo nanodelcev, na katere se vežejo zaradi medsebojnih proteinskih interakcij ali interakcij z drugimi entitetami v mediju, prav tako se zaradi njihove velikosti lahko na en protein prilepi več nanodelcev in se tudi tako lahko tvorijo aglomerati.
Transportni proteini so manjši, imajo funkcijo transporta in se z njihovo strukturo bolj povežejo z nanodelcem in s prekrivanjem zmanjšajo okolju izpostavljeno površino nanodelca (Rampado in sod., 2020).
Pri sintezi nanodelcev za uporabo v živilskih izdelkih je prevladujoč končni cilj izboljšanje hranilne vrednosti, kakovosti in stabilnosti samega izdelka, včasih pa je njihova uporaba namenjena estetskemu izgledu (npr. FG TiO2 za zelo belo barvo) (Winkler in sod., 2018) - pri tem lahko ND tako pozitivno kot negativno vplivajo na biološki sistem (Roach in sod., 2019). Nanodelec po vstopu v biološki sistem interagira z različnimi celičnimi populacijami in tudi potuje preko celičnih membran s transmembranskimi procesi (Pietroiusti in sod., 2017; Foroozandeh in Aziz, 2018). V primeru oralnega uživanja nanodelci potujejo po GIT, ki je sam po sebi zelo kompleksen in heterogen organ - dinamična sestava GIT in njen vpliv na spreminjanje molekulske korone nanodelca ob pomikanju skozi GIT je še nezadostno raziskano področje, predvsem z vidika velikega števila segmentov GIT z različnimi sestavami in karakteristikami kot so pH, prebavni encimi, stranski produkti metabolizma proteinov in lipidov, celične populacije in mukozna tkiva (McClements in Xiao, 2017). Pri tem je potrebno izpostaviti tudi dolgo pot od začetka oralnega vnosa nanodelca do tarčnega GIT, med katero se lahko fizikalno- kemijske lastnosti le-tega že zelo spremenijo (Rampado in sod., 2020; Berardi in Bombelli, 2019).
2.2 VPLIV NANODELCEV NA CELICE
Zaradi interakcij z biološkim okoljem usodo nanodelcev v največji meri narekujejo molekule, ki so adsorbirane na površino nanodelca, kot same fizikalno-kemijske lastnosti izhodiščnega nanodelca (Berardi in Bombelli, 2019). Nanodelci, ki potujejo preko GIT ali respiratornih poti, morajo preiti polarizirane epitelijske ali endotelijske celice bodisi s transcelularno ali paracelularno potjo (Sakhtianchi in sod., 2013). V človeškem črevesju moramo upoštevati tudi njegovo okolje, ki ima kisel pH in tudi visoko koncentracijo ionov (Ca2+ in Mg2+)v celičnih stičiščih, ki lahko povzročijo agregacijo vstopajočih nanodelcev, ki nato oteži prehajanje nanodelcev med epitelijskimi celicami zaradi ozkih celičnih stičišč (Handy in sod., 2008). Nanodelci vplivajo na celični cikel, eksocitozo in imajo potencialen vpliv na delovanje celičnih signalnih poti, kar močno vpliva na sam odziv celice ob celičnem vstopu nanodelca (Sakhtianchi in sod., 2013).
Manj raziskano področje je vpliv nanodelcev na gastrointestinalni trakt, ki je v primeru uporabe nanodelcev v živilih, njim najbolj izpostavljen - razlog je v kompleksnosti organa, ki je sestavljen iz večih različnih celic (Sakhtianchi in sod., 2013; McClements in Xiao, 2017). Pomembno vlogo imajo tudi naravno prisotne bakterije, ki tvorijo črevesno mikrobioto in prav tako interagirajo z nanodelci (Goldberg in sod., 2008). Kot pri ostalih tkivih, je tudi pri črevesnem tkivu glavna problematika obnašanje nanodelcev v črevesni flori, ki zaradi svoje slanosti, specifičnega pH in prebavnih encimov lahko močno spremeni njihove prvotne fizikalno-kemijske lastnosti (Pietroiusti in sod., 2017; Mittag in sod., 2021). Nanodelci se v gastrointestinalnem traktu različno obnašajo, odvisno je od njihove velikosti in sestave (Sharifi in sod., 2012).
2.2.1 Vstop nanodelcev v celice
Nanodelci vstopajo v celice večinoma z endocitozo, odvisno je od velikosti vstopajočih nanodelcev, ob tem dipolarna celična membrana različno interagira z okoliškimi molekulami, interakcije pa so odvisne od naboja in polarnosti vstopajočih molekul (Auría- Soro in sod., 2019). Preko membranske invaginacije se nanodelci (< 200 nm) zapakirajo v s proteini prevlečene vezikle, ki se ločijo od membrane in nato združijo z endosomi.
Endosomi so z membrano obdani vezikli v velikosti do 1 µm ali več, ki jih delimo na zgodnje, reciklirane in zrele endosome, znani tudi kot multivezikularna telesca. Omenjeni tipi endosomov predstavljajo poglavitni del znotrajcelične endocitotske poti. Celica nato s svojimi znotrajceličnimi procesi ločuje in izloča vezikle. Proces vstopanja in izločanja nanodelcev v obliki veziklov je odvisen od tipa celic in okoliških molekul, kot so proteini in lipidi, ki sodelujejo v procesu endocitoze, velikokrat pa se nastali endosomi združijo z vezikli iz Golgijevega aparata (Behzadi in sod., 2017).
Mehanizmi endocitoze so različni, in sicer poznamo fagocitozo, klatrinsko endocitozo, klaveolinsko endocitozo, endocitozo neodvisno od klaveolina in klatrina ter makropinocitozo. Najpomembnejši poti za internalizacijo nanodelcev sta od klatrina in od kaveolina odvisni endocitotski poti, preko katere vstopajo nanodelci < 500 nm. Večji nanodelci ali agregati (> 500 nm) vstopajo v celico preko fagocitoze (Behzadi in sod., 2017; Foroozandeh in Aziz, 2018).
2.2.2 Znotrajcelične poti nanodelcev
Različne celice internalizirajo nanodelce z različnimi endocitotskimi potmi, nastali vezikli pa nato potujejo do različnih celičnih delov. Veziklom pot narekujejo znotrajcelični procesi usmerjanja in ločevanja, ki so nadzorovani preko omrežja celičnih endosomov, Golgijevega aparata, endoplazmatskega retikuluma in lizosomov. Internaliziran delec, ki je vstopil v s proteini prevlečene vezikle, se po vstopu v celico združi z zgodnjim endosomom, ki deluje kot prenašalec vstopnih molekul. Zgodnji endosom se lahko združi z reciklirajočim endosomom, ki del internaliziranega materiala direktno ali indirektno reciklira nazaj v plazmatsko membrano preko manjših veziklov. Zgodnji endosom lahko dozori v zrel endosom, ki se združi s plazmatsko membrano in internalizirane molekule izloči izven celic ali pa se združi z lizosomi v endolizosom, kjer pride do procesa razgradnje internaliziranih molekul preko lizosomalnih hidrolaz. V znotrajcelični citoplazmi se vrši tudi proces avtofagije, ki predstavlja znotrajcelično pot razgradnje določenih citoplazmatskih komponent v lizosomih (Behzadi in sod., 2017). Mononuklearni fagocitni sistem predstavlja makrofage, ki izvršujejo fagocitozo internaliziranih delcev in njihovo izločanje preko jeter in ledvic. Kot kaže nekateri nanodelci lahko sprožijo sam proces avtofagije in lahko tudi povzročijo nepravilno delovanje procesa fagocitoze preko poškodb lizosomalnih struktur in povečanja membranske prepustnosti (Ma in sod., 2011;
Wang in sod., 2017).
Endocitotska pot ND je močno odvisna od okolja, v katerem se nahajajo, saj se v bioloških tekočinah nanje vežejo različne molekule in spremenijo kemijske lastnosti površine nanodelcev (Behzadi in sod., 2017; Berardi in Bombelli, 2019). Pri tem je pomembno izpostaviti potencialno tvorbo aglomeratov in agregatov preko Van der Waalsovih vezi, ki nastanejo po združevanju posameznih nanodelcev. Slednje lahko spremeni dinamiko premikanja nanodelcev po biološkem sistemu v primerjavi s samostojnim nanodelcem (Sakhtianchi in sod., 2013). Prav tako na kemijsko dinamiko površine nanodelca vpliva molekulska korona, ki poleg prej omenjenega tudi vpliva na usodo nanodelca v biološkem sistemu, saj lahko preprečijo nastanek aglomeratov in agregatov (Oh in Park, 2014;
Rampado in sod., 2020).
Anorganski nanodelci lahko ostanejo inertni (npr. titanov dioksid) oziroma se razgradijo na ione (srebrovi nanodelci) (McClements in Xiao, 2017). Kot že omenjeno, se nanodelci tekom prehajanja skozi biološki sistem precej spremenijo zaradi biološkega okolja kar lahko vodi v združevanje nanodelcev preko hidrofobnih, ionskih ali Van der Waalsovih vezi v skupke različnih velikosti in oblik, njihova stabilnost pa je povsem odvisna od pH, ionske moči, sestave in interakcij okolja, v katerem se nanodelci nahajajo (Rampado in sod., 2020). Agregacija in aglomeracija nanodelcev lahko povzroči nastanek veliko večjih delcev, kar onemogoča njihovo premikanje skozi črevesne tekočine, mukozna tkiva in epitelne celice, pri tem se lahko s površine aglomeriranega ND odtapljajo ioni. Omenjeno lahko vodi do nastanka reaktivnih kisikovih spojin ali ROS, ki poškodujejo celične organele in molekule (npr. proteine), posledično onemogočajo izvajanje osnovnih celičnih procesov, kot so produkcija ATP, replikacija DNK in izražanje genov (McClements in Xiao, 2017; Murugadoss in sod., 2020).
2.2.3 Oksidativni stres
Vsi aerobni organizmi smo podvrženi tvorbi visoko reaktivnih prostih radikalov, ki vsebujejo kisikove ione ali perokside. Slednje imenujemo reaktivne kisikove spojine, ki nastanejo endogeno v procesih mitohondrijskega dihanja, vnetnega odziva in v peroksisomih, ter so ključen del znotrajcelične signalne transdukcije (Manke in sod., 2013). ROS predstavljajo molekule, kot so superoksidni anion (O2•-), hidroksilni radikal (OH•), vodikov peroksid (H2O2), peroksid (1O2) in hipoklorova kislina (HOCl). Tvorba reaktivnih kisikovih spojin je tako normalen proces v celičnem metabolizmu in je v normalnih pogojih uravnotežen z delovanjem antioksidativnih molekul in encimov, kot so glutation peroksidaza, glutation reduktaza, superoksid dismutaza in katalaza, ki redoks stanje uravnavajo s pomočjo antioksidantov NADPH in glutationa. Daljše obdobje porušenega redoks ravnovesja lahko privede do oksidativnih poškodb glavnih celičnih molekul, kot so DNK, proteini in lipidi, ter povzroči spremembe celičnega metabolizma in celo apoptozo (Zuberek in Grzelak, 2018).
Poleg omenjenega prosti radikali lahko poškodujejo tudi lipide in proteine preko lipidne peroksidacije, kar lahko vodi v nastanek mutagenih in kancerogenih stranskih produktov (Kawanishi in sod., 2002; Shukla in sod., 2011). Glavni mehanizem povzročanja neugodnih interakcij nanodelcev znotraj celic je sprememba antioksidativnega celičnega sistema, saj lahko reducirajo glavne antioksidativne molekule in vplivajo na antioksidativno funkcijo encimov (Fenoglio in sod., 2008).
Slika 1: Potencialni mehanizmi vpliva vstopajočega nanodelca v celici (Prirejeno po Shukla in sod., 2011).
2.2.4 Izbrane in vitro metode za analizo vpliva nanodelcev
Metode analiziranja vpliva nanodelcev na celice so različne, v največji meri so analize opravljene v in vitro pogojih. Analizira se predvsem preživetje celic, integriteto celične membrane, genotoksičnost, uporablja se tudi metoda detekcije apoptotskih bioloških označevalcev in nenazadnje se celice analizira z elektronskim mikroskopom za lokalizacijo nanodelcev v celicah. Priročna je metoda detekcije vnetnih bioloških označevalcev s pomočjo ELISA testa (ang. Enzyme-linked immunosorbent assay ali ELISA) (Bahadar in sod., 2016).
Prednosti in vitro študij za toksikološke analize nanomaterialov v celičnih modelih je možnost nadzorovanja pogojev in ponovljivost poskusov, katerih ne moremo doseči pri metodah in vivo. Poleg tega so analize izvedene na celičnih modelih cenovno bolj dostopne in posledično lahko naredimo analize večih parametrov v v večih poskusih z manjšimi stroški in tudi spoštujemo pravilo 3R (refine, replace, reduce), kjer se izognemo nepotrebnim študijam izvedenih na živalih (Magdolenova in sod., 2014). Pogosta je tudi
uporaba kokultur, kjer se bolje približamo stanju in vivo zaradi sodelovanja večih celičnih populacij (Kämpfer in sod., 2017). Pri uporabi ND v in vitro testih je pomembno definirati njihovo stabilnost in fizikalno-kemijske lastnosti v uporabljenem sistemu (Dusinska in sod., 2017).
Kljub omenjenim prednostim je ob tem potrebno omeniti tudi omejenosti in vitro toksikoloških študij vpliva nanomaterialov. Čeprav lahko opravljamo visoko zmogljive in ponovljive nanotoksikološke analize, ob tem ne pridobimo podrobnih informacij o interakcijah med nanodelci in organi oziroma tkivi. Prav tako ne dobimo nobene informacije o potencialnem kopičenju ND v določenem tkivu ter času in poti razgradnje ND. Nanodelci lahko tudi nehote interagirajo s komponentami testiranega sistema, kot je stena gojitvene posodice, kamor se lahko adsorbirajo in tako tretiramo izbrane celice z manjšo koncentracijo ND, kot je bilo teoretično načrtovano v zasnovi poskusa, zato je ob tem potrebno uporabiti dodatne metode za merjenje koncentracije ND v in vitro sistemu. V in vitro pogojih nimamo vpliva imunskega sistema, ki ima veliko vlogo pri vplivu ND na biološki sistem. V in vivo sistemu serumski proteini interagirajo z ND (kot npr. sistem komplementa in imunoglobulini), prav tako se z njimi srečajo makrofagi, ki aktivno fagocitirajo nanodelce in s tem zmanjšajo njihov čas zadrževanja v obtoku, po drugi strani pa lahko sami ND vplivajo na delovanje imunskih celic in ga spreminjajo (Dobrovolskaia, 2015). Nenazadnje tudi prehajanje ND skozi biološki sistem (odvisno od načina vnosa) vpliva na molekulsko korono ND, njihove fizikalno-kemijske lastnosti in privzem ND v celice (Dusinska in sod., 2017).
2.2.4.1 Določitev zmanjšanja preživetja celic Caco-2
V našem delu smo za določitev zmanjšanja preživetja celic Caco-2 uporabili metodo barvanja po Hoechstu za določitev celokupnega števila celic. Hoechst je flourescentno barvilo, ki prehaja v celico in obarva celično jedro in DNK. Barvilo lahko zaznavamo s pomočjo flourescenčnega mikroskopiranja, obarva pa vse celice, ki so prisotne v vzorcu (Thermo Fisher, 2021). Celice smo za določitev PI pozitivnih celic obarvali še s propidijevim jodidom, ki je barvilo, ki se veže na celično DNK. V celico prehaja le v primeru poškodovane celične plazmatske membrane. Po barvanju smo celice analizirali s flourescenčnim mikroskopiranjem, jih slikali in določili število Hoechst pozitivnih in PI pozitivnih celic s pomočjo programa Cell Counter 2. Po pridobitvi števila celic smo nato izračunali preživetje celic pod vplivom določene koncentracije nanodelcev, in sicer smo od števila vseh celic, obarvanih z barvilom Hoechst, odšteli PI pozitivne celice ter tako dobili delež zmanjšanja preživetja celic Caco-2 po tretiranju z izbranimi ND.
2.2.4.2 Določitev ROS v celicah Caco-2
Delež kisikovih reaktivnih spojin smo zaznali s pomočjo reagenta CM-H2DCFDA (ang. 5- (and-6)-chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate ali CM-H2DCFDA) in barvanjem z barvilom Hoechst. CM-H2DCFDA je klorometilni derivat spojine H2DCFDA.
Gre za barvilo, ki pasivno prehaja v celice in se uporablja za dokazovanje prisotnosti reaktivnih kisikovih spojin znotraj celice. Molekula vsebuje acetatne skupine, katere vezi ob prehodu v celico prekinejo znotrajcelične esteraze. Poleg acetatnih skupin vsebuje tudi tiolno klorometilno skupino, ki reagira z znotrajceličnim glutationom in pride do procesa oksidacije, ki povzroči nastanek fluorescentnih produktov znotraj celice (Thermo Fisher, 2021). Nastale produkte smo zaznali s pomočjo spektrofotometra.
2.2.4.3 Določitev aktivnosti ALP in diferenciacija celic Caco-2
Za določevanje aktivnosti ALP smo celice Caco-2 diferencirali 3 tedne, saj ob diferenciaciji pričnejo pričnejo izražati določene diferenciacijske markerje (označevalce), ki so tipični za enterocite, hkrati pa so odvisni od števila pasaž same celične linije.
Apikalna stran diferenciranih celic izraža hidrolazne encime, značilne za zrele enterocite, kot so laktaze in peptidaze (Lea, 2015).
Za analizo škodljivosti nanodelcev v celicah se lahko uporablja diferencirano ali nediferencirano celično linijo Caco-2 (Mortensen in sod., 2020). ALP je pomemben membranski encim, ki se sintetizira na mikrovilih diferenciranih celic Caco-2 (Halbleib in sod., 2007). Za analizo aktivnosti ALP smo uporabili fluorometrično metodo, ki je temeljila na zaznavanju signala od MUP (metilumbeliferil fosfat) odcepljenih fosfatnih skupin, katere se odcepijo v primeru aktivnosti ALP. Aktivnost alkalne fosfataze se izraža kot količina encima, ki povzroči hidrolizo 1 µmol MUP na minuto pri pH 10 (Abcam, 2021).
2.2.5 In vitro študije o vplivu izbranih ND na celice
2.2.5.1 Vpliv nano SiO2 na celice
Vpliv različnih koncentracij in časov izpostavitve SiO2 je bil preučen v večih študijah z uporabo različnih metod in celičnih linij iz epitelnih tkiv različnih človeških organov, kot so pljuča (Farcal in sod., 2012; Xu in sod., 2012) in jetra (Lu in sod., 2011; Wang in sod., 2013; Yu in sod., 2014). V večini izvedenih študij so ugotovili vpliv koncentracije izbranih ND SiO2 nad 25 µg/mL na povečano količino označevalcev oksidativnega stresa in aktivacijo od kaspaze odvisno apoptozo celic. Pri koncentracijah ≤ 100 µg/ml SiO2 s hidrodinamskim premerom > 100 nm ob akutni izpostavitvi ni citotoksičnega učinka na nediferencirane in diferencirane celice Caco-2 (Yang in sodelavci 2014; Tada-Oikawa in sod., 2020; Hempt in sod., 2020). SiO2 ob akutni izpostavitvi niso citotoksični, vendar tako ob akutni (24h) kot kronični izpostavitvi ND (5 dni) v nižjih, zmernih in višjih koncentracijah (> 50 µg/mL) povzročijo nastanek ROS kot tudi povišano aktivnost ALP v diferenciranih celicah Caco-2 (Tarantini in sod., 2015; Guo in sod., 2018).
Kononenko in sodelavci (2017) so pri analizi vpliva ne-citotoksičnih koncentracij s SiO2
prevlečenega železovega oksida, ki ima velik potencial za uporabo pri dostavi zdravil, na človeško alveolarno celično kulturo ugotovili potencialen vpliv nanodelcev na homeostazo pljučnih fosfolipidnih surfaktantov preko vpliva na metabolizem surfaktantov in biogenezo lamelarnih telesc ter spremembe v ekspresiji proteinov, udeleženih v lipidnem metabolizmu. IARC (ang. International Agency for Research on Cancer ali IARC) je kristalinično obliko silike klasificirala kot rakotvorno, za klasifikacijo SAS pa je trenutno še nezadostna količina podatkov (Yazdimamaghani in sod., 2018). Kot kaže ne- citotoksične koncentracije SAS lahko vplivajo na regulacijo genov v makrofagih, privzem v makrofage pa je močno odvisen od sestave in velikosti molekulske korone ND (Kodali in sod., 2013; Saikia in sod., 2016).
2.2.5.2 Vpliv nano TiO2 na celice
FG TiO2 (< 200 µg/mL) so se ob akutni (48 ur) izpostavitvi diferenciranim celicam Caco-2 izkazali kot necitotoksični (Dorier in sod., 2019), kot kaže pa neodvisno od koncentracije izbranih ND na citotoksičnost v diferenciranih celich Caco-2 ob akutni izpostavitvi (48 ur) vpliva oblika nanodelca (García-Rodríguez in sod., 2018). Za boljšo analizo vpliva nanodelcev FG TiO2 na diferencirane celice Caco-2 v ko-kulturi, so Bettencourt in sodelavci (2020) simulirali in vitro prebavo izbranih FG TiO2 ND. V obeh primerih ni bilo citotoksičnega vpliva višjih koncentracij ND FG TiO2 (> 140 µg/mL) na celice.
V največji meri naj bi TiO2 povzročali negativne vplive preko sekundarne genotoksičnosti, torej preko nastanka ROS (Magdolenova in sod., 2014; Gonzalez in sod., 2016; Dorier in
sod., 2019), kot kaže pa lahko povzročajo tudi direktno genotoksičnost (García-Rodríguez in sod., 2018). Lojk in sodelavci (2020) so v svoji študiji ugotovili vpliv akutne izpostavitve (72 ur) nižjih koncentracij (< 50 µg/mL) proizvedenih nanodelcev FG TiO2 na preživetje človeških nevronskih celic. Prav tako so ugotovili vpliv na poškodbo membrane, celični cikel in nastanek ROS v isti celični kulturi.
Murugadoss in sodelavci (2020) so ugotovili, da na biološki odziv celic Caco-2 na aglomerirane ND TiO2 ne vpliva velikost aglomerata, saj so tako manjši (17 nm) kot večji nanodelci (117 nm) TiO2, ki so po dispergiranju v mediju agregirali v nekaj 100 nm velike aglomerate, vplivali na integriteto epitelne pregrade, količino vnetnih mediatorjev in poškodbe nukleinskih kislin. Visoke koncentracije FG TiO2 (350 µg/mL) naj bi povzročile tudi izgubo mikrovilijev na apikalni strani diferenciranih celic Caco-2 na račun biološkega odziva ob vstopu aglomeriranih ND (Faust in sod., 2014). V primeru gojenja celic Caco-2 v ko-kulturi je zelo pomembna izbira kokulturne celične linije, saj naj bi količina izločenega mukusa vplivala na genotoksičnost dodanih nanodelcev TiO2 (Dorier in sod., 2019), prav tako je pomembno v katerem mediju so nanodelci raztopljeni, saj naj bi nanodelci raztopljeni v vodi bili manj toksični kot tisti, raztopljeni v mediju (Dorier in sod., 2015, 2019; Vila in sod., 2018b; Proquin in sod., 2016).
V diferenciranih celicah Caco-2, gojenih v kokulturi, akutna izpostavitev (4 h) in kronična izpostavitev (5 dni) nanodelcem FG TiO2 (30 nm) povzroči povečano aktivnost ALP, kar nakazuje na vpliv izbranih ND v zmernih in visokih koncentracijah (> 50 µg/mL) na fiziologijo celic. Aktivnost ALP je bila pri daljši izpostavitvi ND kar 70 % višja v primerjavi z akutno tretiranimi celicami (Guo in sod., 2017).
2.2.5.3 Vpliv srebrovih nanodelcev na celice
Citotoksičnost srebrovih nanodelcev je bila preučevana na večih celičnih linijah, kjer so prišli do različnih zaključkov povzročanja celične apoptoze, in sicer je citotoksičnost lahko odvisna od velikosti Ag ND (večji citotoksični vpliv imajo manjši Ag ND v primerjavi z večjimi delci) (Liu in sod., 2010; Mishra in sod., 2016) ali pa zavisi od vrste celične linije (Park in sod., 2010). Prav tako naj bi velikost Ag ND narekovala količino nastalih ROS (Mishra in sod., 2016; Sriram in sod., 2012), katera nato lahko povzročijo celično apoptozo (Greulich in sod., 2009). Koncentracijsko odvisno naj bi Ag ND tudi povzročili nastanek ROS in poškodbe mitohondrija v tretiranih človeških celičnih linijah (Asharani in sod., 2009).
V in vitro pogojih naj bi bili Ag ND (20 nm) citotoksični za celice Caco-2 že pri nižjih koncentracijah (< 20 µg/mL), kjer citotoksičnost narašča z višjo koncentracijo izbranih ND, vendar v tretiranih celicah ni prišlo do oksidativnega stresa, prav tako se delci niso aglomerirali v večje skupke. V tretiranih celicah je bila zaznana poškodba mitohondrijev, ki bi lahko bila vzrok celične apoptoze (Sahu in sod., 2014). Pri analizi vpliva akutne
izpostavitve Ag ND v višjih koncentracijah (15 - 90 µg/mL) je prišlo do koncentracijsko odvisne citotoksičnosti v diferenciranih celicah Caco-2 v ko-kulturi, prav tako so ND povzročili oksidativni stres in spremembe aktivnosti antioksidativnih encimov (Martirosyan in sod., 2016). Akutna izpostavitev (24 ur) Ag ND različnih velikosti (do 110 nm) v koncentraciji < 25 µg/mL kljub vstopu ND v notranjost celice in znotrajcelični razgradnji, ni imela citotoksičnega učinka na nediferencirane celice Caco-2, vendar naj bi bil zaznan oksidativni stres sprožen zaradi srebrovih ionov, ki so nastali po znotrajcelični razgradnji Ag ND (Van der Zande in sod., 2016).
V drugi študiji je tako akutna (24 ur) kot kronična izpostavitev (21 dni) nižjim koncentracijam (< 2 µg/mL) Ag ND v velikosti 20 – 30 nm povzročila celično apoptozo, nastanek ROS in poškodbo mitohondrijev (Chen in sod., 2016). Vila in sodelavci (2018a) so ugotovili manjši vpliv akutne izpostavitve (24 ur) Ag ND v velikosti < 8 nm (1 – 50 µg/mL) na preživetje diferenciranih celic Caco-2 v primerjavi z nediferenciranimi celicami, kar nakazuje na vpliv diferenciacije celic na zmanjšano občutljivost celic na škodljive agense, ni pa bilo zaznane spremembe pri stopnji izražanja genov, posledično ni bilo zaznanega vpliva na delovanje in zgradbo monosloja diferenciranih celic.
2.3 CELIČNA LINIJA CACO-2
Za toksikološke in farmakološke analize črevesja v in vitro pogojih se že vrsto let kot modelna celična linija uporablja celična linija Caco-2, ki so celice človeškega črevesnega adenokarcinoma. Gre za nesmrtno, pritrjeno celično kulturo, ki raste v enojnem sloju in se ob dosegu konfluentnega stanja spontano diferencira v celice črevesne stene z izraženimi mikrovili na apikalni strani v približno treh tednih kultiviranja, kar predstavlja veliko prednost v primerjavi z ostalimi celičnimi linijami. Uporabna je zaradi dostopnosti in lahkega vzdrževanja (Sambuy in sod., 2005; Kämpfer in sod., 2017). Kljub dobrim karakteristikam je v zadnjem času začela prevladovati metoda ko-kultur, ki omogoča boljše napovedi in prikaze resničnega stanja črevesnega tkiva in vivo v primerjavi z analizo monokultur (Kämpfer in sod., 2017; Ferraretto in sod., 2018).
Caco-2 celična linija predstavlja modelno celično linijo za raziskovanje potencialnih učinkov in privzema nanodelcev in vitro, saj se najbolj približa in vivo črevesni endotelijski pregradi, ki spada med celične pregrade s katerimi se nanodelci srečajo po vstopu v organizem (Bimbo in sod., 2011; Gerloff in sod., 2013; Yang in sod., 2014).
Prednost Caco-2 celic je njihova diferenciacija v polarizirane celice s tesnimi stičišči, ki predstavlja najboljši približek stanja in vivo za analizo interakcij med organizmom in nanodelci, saj izvajajo drugačne celične procese internalizacije in signalizacije kot celice, ki delujejo na ravni samostojnih izoliranih celic, kjer določeni celični procesi ostajajo nerazviti ali pa se sploh ne izvajajo (Rodriguez-Boulan in sod., 2005; Apodaca, 2001).
Celice Caco-2 lažje in v večji količini privzemajo nanodelce s pozitivnim nabojem, kot tiste z negativnim nabojem, preko klatrinske endocitoze in makropinocitoze, medtem ko negativno nabite delce celice privzemajo preko kaveolinske endocitoze (Bannunah in sod., 2014). V črevesnem tkivu je neraziskan mehanizem transcitoze s proteini obdanih nanodelcev, predvsem v endotelijskih in epitelijskih celicah, ki je zelo različen glede na tip nanodelca (Reinholz in sod., 2018). Proces transcitoze nanomaterialov se je v in vivo in in vitro študijah izkazal kot neučinkovit, zato pogosto končajo v celicah ali pa se razgradijo znotraj lizosomov (He in sod., 2013; Ye in sod., 2013). V primeru GIT se majhni nanodelci hitreje in uspešno transcitirajo, prav tako tisti s pozitivnim nabojem (Des Rieux in sod., 2005). Tisti, ki se uspešno transcitirajo, končajo v endosomih, kateri se razvrščajo s pomočjo Golgijevega aparata, v primeru Caco-2 celic tudi preko endoplazmatskega retikuluma (He in sod., 2013).
2.3.1 Diferenciacija
Pomemben dejavnik pri diferenciaciji Caco-2 celične linije je polarizacija, ki jo celice dosežejo v približno treh tednih kultivacije v ustreznih pogojih. Polarizacija pomeni popolni razvoj apikalne in bazalne membranske domene, ki sta različni tako biokemijsko kot funkcionalno. Polarizirane enterocite imajo visoko električno rezistenco in izražajo tipične prebavne encime. Na svoji membrani izražajo receptorje za vitamina B12 in D3, EGFR (ang. epidermal growth factor receptor ali EGFR) in prenašalce sladkorja. Prav tako sintetizirajo citokine, in sicer IL-6, IL-8, TNF-α (ang. tumor necrosis factor ali TNF), TGF-β1 (ang. tumor growth factor ali TGF) in IL-15, ki igrajo pomembno vlogo pri neprepustnosti epitelne črevesne pregrade in posledično preprečujejo pojav črevesnih obolenj (Xavier in Podolsky, 2007; Lea 2015).
Slika 2: Prikaz 21-dnevne diferenciacije po konfluenci celične linije Caco-2; a, b: Ob dosegu konfluence celice zgradijo monosloj in zasnovo mikrovilijev; c, d: 7 dni po konfluenci se izgradi konfluenten monosloj in mikrovili postanejo izrazitejši; e, f: 14 dni po konfluenci celice zrastejo v stolpičasto oblikovan epitelij, mikroviliji postanejo večji in izrazitejši, ustvarijo se tudi tesna stičišča med celicami; g, h: 21 dni po konfluenci se celice izoblikujejo v strukturo, zelo podobno strukturi črevesnih epitelnih celic oziroma enterocitov. Skala slik v zgornji vrstici (a, c, e, g) je 5 µm, skala slik v spodnji vrstici (b, d, f, h) je 1 µm.
Slike so bile zajete z elektronskim mikroskopom (Sinnecker in sod., 2014).
Celična linija Caco-2 je heterogena, torej se tekom kultivacije celice lahko diferencirajo v celične subpopulacije z rahlo drugačnimi lastnostmi, odvisno od kultivacijskih pogojev, predvsem sestavin gojišča in tudi sosednjih celic, če so gojene v ko-kulturi (Lea 2015). Za analizo škodljivosti nanodelcev na celice se lahko uporablja diferencirano ali nediferencirano celično linijo Caco-2. Najboljši približek črevesnega stanja in vivo so diferencirane celice, uporaba nediferenciranih celic pa predstavlja hitrejšo in enostavnejšo pot analize, vendar lahko vodi do lažnih rezultatov (Mortensen in sod., 2020). Halbleib in sodelavci (2007) so analizirali tekom 26 - dnevne diferenciacije izolirano mRNA iz kultiviranih celic Caco-2 s pomočjo tehnike RT-PCR (ang. Real time polymerase chain reaction ali RT-PCR) za določitev genske ekspresije. Med drugim so ugotovili povečano ekspresijo genov DPP4, ANPEP in ALPI, ki kodirajo proteine dipeptidil-peptidazo 4, aminopeptidazo N in črevesno alkalno fosfatazo. Vsi omenjeni proteini so hidrolazni encimi, ki so izraženi na ščetkastem obrobju apikalne domene celic in omogočajo razgradnjo kompleksnih substratov na enostavne molekule. Njihova raven izražanja je bila nizka v nepolariziranih celicah, tekom diferenciacije se je povišala in se ob dosegu polarizacije stabilizirala. Odkrita je bila tudi konstantna raven izražanja od Ca2+ odvisnega proteina e-kadherina, ki je pomemben za nastanek celičnih stičiš, katera omogočajo nastanek celičnega monosloja, polarizacijo celic in paracelularni transport makromolekul (Halbleib in sod., 2007).
2.3.2 Alkalna fosfataza
Alkalna fosfataza (ALP) je homodimerni metaloencim, ki spada v družino encimov s širokimi aktivnostmi, kot so hidrolaze, izomeraze in transferaze (Fawley in Gourlay, 2016). V splošnem je prisotna v večih encimskih izoformah v različnih tkivih, in sicer poznamo tkivno nespecifično, črevesno, placentalno in alkalno fosfatazo v zarodnih celicah. Med vsemi izoformami ima črevesna alkalna fosfataza zelo pomembno vlogo pri črevesnih obolenjih (Tuin in sod., 2009; Lallès, 2010). Gre za endogeno izražen protein v črevesnem epiteliju, ki se izloča v črevesni lumen in krvni obtok. Encim ima ključno vlogo pri ohranjanju homeostatskega ravnovesja v črevesju, natančneje uravnavanju izločanja bikarbonata, uravnavanju pH, absorpciji dolgoverižnih mašobnih kislin ter uravnavanju črevesnega vnetja in mikrobioma, namreč defosforilira iz celic izločene vnetne molekule, kot so lipopolisaharidni ovoj gram negativnih bakterij, flagelin in adenozin trifosfat, v primeru stresnih celičnih dogodkov (Fawley in Gourlay, 2016; Bilski in sod., 2017).
3 MATERIALI IN METODE
Eksperimentalno delo smo izvajali v celičnem laboratoriju in laboratoriju za nano- in biotehnološke aplikacije na Fakulteti za elektrotehniko.
3.1 MATERIALI
3.1.1 Gojišča in kemikalije
Preglednica 2: Prikaz uporabljenih gojišč in kemikalij ter proizvajalec in proizvodna država materiala.
Gojišče / kemikalija Proizvajalec, proizvodna država
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 (DMEM/F-12) Gibco
TrypLE Express Gibco, Danska
Fetal bovine serum FBS Gibco, Danska
antibiotik Pen Strep Gibco, Danska
NaCl 0,9 % Braun, Nemčija
CaCl2 Sigma, ZDA
MgCl2 Sigma, ZDA
Etanol Braun, Nemčija
Destilirana voda Braun, Nemčija
Hoechst 33342 Life technologies, ZDA
Propidijev jodid Sigma-Aldrich ZDA
DMSO Thermo Fisher Scientific, ZDA
CM-H2DCFDA
Invitrogen by Thermo Fisher Scientific, ZDA
ab83371 Alkaline Phosphatase Assay Kit (Fluorometric) Abcam, Velika Britanija
