ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Maja ŠIKIĆ
VPLIV BAKTERIJSKEGA STRESA NA ADHEZIVNOST, INVAZIVNOST TER
ZNOTRAJCELIČNO PREŽIVELOST IN RAST BAKTERIJ Campylobacter V CELIČNEM MODELU
MAKROFAGOV J774 IN CELIC Caco-2
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij
Ljubljana, 2007
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Maja Šikić
VPLIV BAKTERIJSKEGA STRESA NA ADHEZIVNOST,
INVAZIVNOST TER ZNOTRAJCELIČNO PREŽIVELOST IN RAST BAKTERIJ Campylobacter V CELIČNEM MODELU MAKROFAGOV
J774 IN CELIC Caco-2
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij
CORRELATION BETWEEN STRESS EXPOSURE, ADHESION, INVASION AND INTRACELLULAR SURVIVAL OF Campylobacter
WITHIN MACROPHAGES J774 AND Caco-2 CELLS GRADUATION THESIS
University studies
Ljubljana, 2007
Diplomsko delo posvečam svoji družini in Dušanu P.
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija živilske tehnologije. Opravljeno je bilo v laboratoriju Katedre za živilsko mikrobiologijo na Oddelku za živilstvo, Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani, v laboratorijih Katedre za biokemijo na Oddelku za biologijo, Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani in v laboratorijih Zavoda za klinično mikrobiologijo Medicinske fakultete na Reki.
Študijska komisija Oddelka za živilstvo je za mentorico diplomskega dela imenovala prof. dr.
Sonjo Smole Možina, za somentorico prof. dr. Majo Abram in za recenzenta prof. dr. Petra Rasporja.
Mentorica: prof. dr. Sonja Smole Možina Somentorica: prof. dr. Maja Abram Recenzent: prof. dr. Peter Raspor
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik:
Član: prof. dr. Sonja SMOLE MOŽINA
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: Prof. dr. Maja ABRAM, dr. med.
Univerza v Reki, Medicinska fakulteta Član: prof. dr. Peter RASPOR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Datum zagovora:
Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Maja Šikić
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dn
DK UDK 579.22+579.26:579.67(043)=863
KG bakterije/Campylobacter jejuni/stres/stradanje/oksidativni stres/toplotni stres/
kultivabilnost/ živost/virulentnost/Caco-2/makrofagi J774 AV ŠIKIĆ, Maja
SA SMOLE MOŽINA, Sonja (mentorica) / ABRAM, Maja (somentorica) / RASPOR, Peter (recenzent)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2007
IN VPLIV BAKTERIJSKEGA STRESA NA ADHEZIVNOST, INVAZIVNOST TER ZNOTRAJCELIČNO PREŽIVELOST IN RAST BAKTERIJ Campylobacter V CELIČNEM MODELU MAKROFAGOV J774 IN CELIC Caco-2
TD Diplomsko delo (univerzitetni študij)
OP XIV, 108 str, 3 pregl., 46 sl., 10 pril., 143 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Campylobacter jejuni je med vodilnimi povzročitelji črevesnih obolenj, vendar so mehanizmi povzročanja bolezni pri človeku še slabo raziskani. Poleg tega je relativno malo znanega o odzivu kampilobakterjev na stresne okoljske razmere, vključno z oksidativnim stresom, in možnimi posledicami. Ker kampilobakterji nimajo razvitih nekaterih znanih mehanizmov stresnega odziva drugih bakterij, prenosljivih s hrano, so bolj občutljivi na stres kot druge patogene bakterije. Kampilobakterji so izpostavljeni takšnim razmeram v njihovem naravnem okolju v gostiteljskem organizmu, še posebej pa v ekstraintestinalnem okolju, vključno z razmerami v živilih in proizvodnji živil. Hitra odzivnost na spremembe v okolju je ključna za njihovo preživetje in infektivnost. V diplomski nalogi smo preučevali vpliv toplotnega in oksidativnega stresa ter stradanja na kultivabilnost in živost kliničnega seva C. jejuni 27835 in živilskega seva C. jejuni K49/4 iz eksponentne faze rasti. V nadaljevanju eksperimenta smo z uporabo dveh celičnih kultur (celic Caco-2 in makrofagov J774) in vitro ugotavljali adhezivnost, invazivnost in znotrajcelično preživetje obeh sevov C.
jejuni, brez ali s predhodno izpostavitvijo stresom: stradanju, toplotnemu in oksidativnemu stresu. Rezultati so pokazali, da je stradanje najbolj zmanjšalo kultivabilnost in živost C. jejuni, pa tudi adhezivnost, invazivnost in znotrajcelično preživetje. Toplotni stres je povzročil začasno inhibicijo rasti, adhezivnosti in invazivnosti kampilobakterjev, vendar so se bakterije po 24-48 urah v kulturi Ca-co 2 celic spet razmnoževale. Oksidativni stres ni zmanjšal virulentnosti sevov, nasprotno, kratka, 5-urna izpostavitev celic atmosferski koncentraciji kisika je povečala adhezivnost, invazivnost in znotrajcelično preživljivost kliničnega in živilskega seva C. jejuni.
KEY WORDS DOCUMENTATION DN Dn
DC UDC 579.22+579.26:579.67(043)=863
CX bacteria/Campylobacter jejuni/stress/starvation/oxidative stress/thermal stress/
cultivability/viability /virulence/ Caco-2/macrophages J774 AU ŠIKIĆ, Maja
AA SMOLE MOŽINA, Sonja (supervisor) / ABRAM, Maja (coadvisor) / RASPOR, Peter (reviewer)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotehnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2007
TI CORRELATION BETWEEN STRESS EXPOSURE, ADHESION, INVASION AND INTRACELLULAR SURVIVAL OF Campylobacter WITHIN
MACROPHAGES J774 AND Caco-2 CELLS DT Graduation thesis (University studies)
NO XIV, 108 p., 3 tab., 46 fig., 10 ann., 143 ref.
LA sl AL sl/en
AB Though Campylobacter jejuni is among the leading cause of human gastroenteritis worldwide, little is known of its virulence determinants. Campylobacter sp. are considered to be very fragile organisms that lack the global stress response mechanism.
Little is known of the response of these organisms to stressful environmental conditions, including aerobic stress. These conditions are especially relevant to their survival in the environment and during food processing. Under such conditions bacterial adaptation in response to changes in their environment plays a crucial role the organism's survival. The aim of this study was to evaluate the effect of starvation, thermal and oxidative stresses on culturability and viability of clinical and poultry- derived Campylobacter jejuni isolates. Further we analysed the effect of stress exposure on the adhesion, invasion and intracellular survival of both, clinical and food isolates of C. jejuni, in an in vitro cell culture model using macrophages J774 and Caco-2 cells. Starvation was the most vigorous stress that significantly affected C.
jejuni culturability and viability, adhesion and invasion properties as well as intracellular survival. The elevation of temperature resulted with a temporary loss of cultivability and viability accompanied by impaired adhesion and invasion efficiency of C. jejuni. Exposure of C. jejuni to atmospheric concentrations of oxygen had little effect on its adhesion and invasion abilities, on contrary, 5 h oxygen exposure increased invasion properties as well as intracellular survival of clinical and food isolates of C. jejuni.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ...V KAZALO PREGLEDNIC ... IX KAZALO SLIK ... X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... XIV
1 UVOD ...1
1.1 CILJI IN DELOVNE HIPOTEZE DIPLOMSKE NALOGE ... 3
1.1.1 Cilji diplomske naloge ... 3
1.1.2 Delovne hipoteze ... 3
2 PREGLED OBJAV... 4
2.1 ZGODOVINA ... 4
2.2 KLASIFIKACIJA ... 5
2.3 ZNAČILNOSTI BAKTERIJ RODU Campylobacter ... 5
2.4 EPIDEMIOLOGIJA IN PATOGENEZA RODU Campylobacter ... 8
2.4.1 Epidemiologija bakterij rodu Campylobacter ... 8
2.4.2 Patogeneza okužb bakterij rodu Campylobacter ... 11
2.4.2.1 Virulentni dejavniki bakterij rodu Campylobacter... 12
2.4.2.1.1 Gibljivost in kemotaksa... 12
2.4.2.1.2 Adhezivnost in invazivnost ... 13
2.4.2.1.3 Toksini... 16
2.5 VPLIV RAZLIČNIH STRESOV NA BAKTERIJSKE CELICE ... 17
2.5.1 Stres... 17
2.5.2 Živost in kultivabilnost bakterij rodu Campylobacter... 18
2.5.3 Stradanje ... 20
2.5.4 Toplotni stres ... 21
2.5.5 Oksidativni stres ... 24
2.6 UPORABA CELIČNIH KULTUR ... 28
2.6.1 Splošne karakteristike celične kulture Caco-2 ... 29
2.6.2 Splošne karakteristike celične kulture makrofagov 774 ... 30
3 MATERIAL IN METODE DELA ... 32
3.1 POTEK DELA ... 32
3.2 MATERIAL ... 33
3.2.1 Mikroorganizmi in kultivacija ... 33
3.2.2 Celični kulturi makrofagov J774 in celic Caco-2 ... 33
3.2.2.1 Celična kultura Caco-2 ... 33
3.2.2.2 Celična kultura makrofagov J774 ... 33
3.2.3 Mikrobiološka gojišča ... 34
3.2.3.1 Trdno gojišče Karmali ... 34
3.2.3.2 Krvni agar Columbia ... 35
3.2.3.3 Bujon BHI ... 36
3.2.4 Raztopine, reagenti ... 36
3.2.5 Laboratorijska oprema ... 37
3.3 METODE DELA... 38
3.3.1 Revitalizacija bakterij C. jejuni ... 38
3.3.2 Trajno shranjevanje izolatov C. jejuni ... 38
3.3.3 Mikroaerofilna kultivacija C. jejuni do eksponentne faze rasti ... 38
3.3.4 Priprava celičnih kultur makrofagov J774 in celic Caco-2 ... 39
3.3.5 Trajno shranjevanje celičnih kultur makrofagov J774 in celic Caco-2 ... 40
3.3.6 Določanje števila bakterij ... 40
3.3.7 Priprava kulture za toplotni stres ... 41
3.3.8 Priprava kulture za oksidativni stres ... 41
3.3.9 Priprava kulture za stradanje ... 41
3.3.10 Spremljanje kultivabilnosti ... 41
3.3.10.1 Štetje kolonij na agar ploščah (CFU/ml) ... 41
3.3.11 Spremljanje živosti ... 43
3.3.11.1 Toplotni stres ... 43
3.3.11.2 Oksidativni stres ... 43
3.3.11.3 Stradana kultura ... 43
3.3.11.4 Kontrola ... 44
3.3.11.5 Opazovanje in štetje celic s fluorescentnim mikroskopom ... 44
3.3.12 Določanje adhezivnosti, invazivnosti in znotrajcelične preživljivosti bakterij C. jejuni ... 46
3.3.13 Statistična obdelava rezultatov ... 47
4 REZULTATI ... 48
4.1 UČINEK STRESA NA KULTIVABILNOST IN ŽIVOST ... 48
4.1.1 Kultivabilnost živilskega seva C. jejuni K49/4 po stresih ... 49
4.1.2 Živost živilskega seva C. jejuni K49/4 po stresih ... 49
4.1.3 Kultivabilnost kliničnega seva C. jejuni 278358 po stresih ... 50
4.1.4 Živost kliničnega seva C. jejuni 27835 po stresih ... 50
4.2 ADHEZIVNOST ŽIVILSKEGA IN KLINIČNEGA SEVA NA CELIČNI KULTURI Caco-2 IN MAKROFAGIH J774 ... 51
4.2.1 Adhezivnost živilskega seva C. jejuni K49/4 na celice Caco-2 ... 51
4.2.2 Adhezivnost živilskega seva C. jejuni K49/4 na celice makrofagov J774 ... 52
4.2.3 Adhezivnost kliničnega seva C. jejuni 27835 na celice Caco-2 ... 53
4.2.4 Adhezivnost kliničnega seva C. jejuni 27835 na celice makrofagov J774 ... 54
4.3 INVAZIVNOST ŽIVILSKEGA IN KLINIČNEGA SEVA V CELIČNI KULTURI Caco-2 IN MAKROFAGIH J774 ... 54
4.3.1 Invazivnost živilskega seva C. jejuni K49/4 v celice Caco-2 ... 55
4.3.2 Invazivnost živilskega seva C. jejuni K49/4 v celice makrofagov J774 ... 56
4.3.3 Invazivnost kliničnega seva C. jejuni 27835 v celice Caco-2 ... 57
4.3.4 Invazivnost kliničnega seva C. jejuni 27835 v celice makrofagov J774 ... 58
4.4 PREŽIVLJIVOST IN RAST ŽIVILSKEGA IN KLINIČNEGA SEVA V CELIČNI KULTURI Caco-2 IN MAKROFAGIH J774 ... 59
4.4.1 Preživljivost in rast živilskega in kliničnega seva v celični kulturi Caco-2 ... 59
4.4.1.1 Preživljivost in rast celic C. jejuni K49/4 znotraj celic Caco-2, glede na predhodno izpostavitev stresu ... 59
4.4.1.2 Preživljivost in rast celic C. jejuni 27835 znotraj celic Caco-2, glede na predhodno izpostavitev stresu ... 62
4.4.2 Preživljivost živilskega in kliničnega seva v celični kulturi makrofagov J774 ... 65
4.4.2.1 Preživljivost celic C. jejuni K49/4 znotraj makrofagov J774, glede na predhodno izpostavitev stresu ... 65
4.4.2.2 Preživljivost celic C. jejuni 27835 znotraj makrofagov J774, glede na predhodno
izpostavitev stresu ... 68
4.5 PRIMERJAVA SPOSOBNOSTI ZNOTRAJCELIČNEGA PREŽIVETJA IN RASTI ŽIVILSKEGA IN KLINIČNEGA SEVA V CELIČNIH KULTURAH Caco-2 IN MAKROFAGIH J774 ... 71
4.5.1 Primerjava sposobnosti znotrajceličnega preživetja in rasti živilskega in kliničnega seva v celični kulturi Caco-2 glede na predhodno izpostavitev stresu ... 71
4.5.2 Primerjava sposobnosti znotrajceličnega preživetja živilskega in kliničnega seva v celični kulturi makrofagov J774 glede na predhodno izpostavitev stresu ... 75
5 RAZPRAVA IN SKLEPI ...79
5.1 UČINEK STRESA NA KULTIVABILNOST IN ŽIVOST ŽIVILSKEGA IN KLINIČNEGA SEVA C. jejuni ... 79
5.2 ADHEZIVNOST IN INVAZIVNOST ŽIVILSKEGA IN KLINIČNEGA SEVA C. jejuni ... 81
5.3 PREŽIVLJIVOST ŽIVILSKEGA IN KLINIČNEGA SEVA V CELIČNIH KULTURAH Caco-2 IN MAKROFAGOV J774 ... 83
5.3.1 Preživljivost živilskega in kliničnega seva v celični kulturi Caco-2 ... 83
5.3.2 Preživljivost živilskega in kliničnega seva v celični kulturi makrofagov J774 ... 84
5.4 SKLEPI ... 86
6 POVZETEK ... 88
6.1 SAŽETAK ... 89
7 VIRI ... 92 ZAHVALA
PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Sestava osnovnega medija za agar Karmali ... 34 Preglednica 2: Sestava osnovnega medija za krvni agar Columbia ... 35 Preglednica 3: Sestava BHI ... 36
KAZALO SLIK
Slika 1: Tipična morfologija C. jejuni pod elektronskim mikroskopom ... 8
Slika 2: Značilne kolonije bakterij C. jejuni na krvnem agarju po 48-urni inkubaciji v optimalnih pogojih rasti ... 8
Slika 3: Ekološki cikel C. jejuni ... 9
Slika 4: Stopnje invazije bakterij C. jejuni v črevesju ... 16
Slika 5: Mehanizem delovanja proteinov toplotnega stresa ... 23
Slika 6a: Shematski prikaz mehanizma oksidativnega stresa ... 27
Slika 6b: Shematski prikaz delovanja reaktivnih kisikovih in dušikovih zvrsti na poškodbo celice znotraj fagocitnih celic ... 27
Slika 7: Invazivnost in translokacija kampilobakterjev v celični kulturi Caco-2 ... 30
Slika 8: Celice Caco-2 pod mikroskopom ... 30
Slika 9a: Prikaz tipične celice makrofagov ... 31
Slika 9b: Shematski prikaz fagocitoze ... 31
Slika 10: Shema poskusa ... 32
Slika 11: Shematski prikaz štetja celic s hemacitometrom ... 39
Slika 12: Štetje kolonij na ploščah enega izmed poskusov ... 42
Slika 13: Kultivabilnost (%) celic C. jejuni K49/4 ... 49
Slika 14: Živost (%) celic C. jejuni K49/4 ... 49
Slika 15: Kultivabilnost (%) celic C. jejuni 27835... 50
Slika 16: Živost (%) celic C. jejuni 27835 ... 50
Slika 17: Povprečna adhezivnost (%) celic C. jejuni K49/4 na celice Caco-2 ... 51
Slika 18: Povprečna adhezivnost (%) celic C. jejuni K49/4 na celice makrofagov J774 ... 52
Slika 19: Povprečna adhezivnost (%) celic C. jejuni 27835 na celice Caco- 2 ... 53
Slika 20: Povprečna adhezivnost (%) celic C. jejuni 27835 na celice makrofagov J774 ... 54
Slika 21: Povprečna invazivnost (%) celic C. jejuni K49/4 v celice Caco-2 ... 55
Slika 22: Povprečna invazivnost (%) celic C. jejuni K49/4 v celice makrofagov J774 ... 56
Slika 23: Povprečna invazivnost (%) celic C. jejuni 27835 v celice Caco-2 ... 57
Slika 24: Povprečna invazivnost (%) celic C. jejuni 27835 v celice makrofagov J774 ... 58
Slika 25: Preživljivost in rast celic C. jejuni K49/4 znotraj celic Caco-2 po izpostavitvi toplotnemu stresu (55 ºC/3 min) ...………... 59
Slika 26: Preživljivost in rast celic C. jejuni K49/4 znotraj celic Caco-2 po 5 h in 15 h stradanja ... 60 Slika 27: Preživljivost in rast celic C. jejuni K49/4 znotraj celic Caco-2 po 5 in 15-urni
predhodni izpostavitvi kisiku ... 61 Slika 28: Preživljivost in rast celic C. jejuni 27835 znotraj celic Caco-2 po izpostavitvi
toplotnemu stresu (55 ºC/3 min) ...…………...…………...62 Slika 29: Preživljivost in rast celic C. jejuni 27835 znotraj celic Caco-2 po 5 h in 15 h
stradanja ...…………...……….……...………... 63 Slika 30: Preživljivost celic C. jejuni 27835 znotraj celic Caco-2 po 5 in 15-urni predhodni izpostavitvi kisiku ...………...………..………... 64 Slika 31: Preživljivost celic C. jejuni K49/4 znotraj makrofagov J774 po izpostavitvi toplotnemu stresu (55 ºC/3 min) ...………... 65 Slika 32: Preživljivost celic C. jejuni K49/4 znotraj makrofagov J774 po 5 h in 15 h
stradanja ... 66 Slika 33: Preživljivost celic C. jejuni K49/4 znotraj makrofagov J774 po 5 in 15-urni
predhodni izpostavitvi kisiku ... 67 Slika 34: Preživljivost celic C. jejuni 27835 znotraj makrofagov J774 po izpostavitvi
toplotnemu stresu (55 ºC/3 min) ... 68 Slika 35: Preživljivost celic C. jejuni 27835 znotraj makrofagov J774 po 5 h in 15 h stradanja ... 69 Slika 36: Preživljivost celic C. jejuni 27835 znotraj makrofagov J774 po 5 in 15-urni
predhodni izpostavitvi kisiku ...…..………. 70
Slika 37: Primerjava znotrajceličnega preživetja kontrolnih kultur C. jejuni K49/4 in C. jejuni 27835, ki nista bili izpostavljeni stresu …...………... 71
Slika 38: Primerjava znotrajceličnega preživetja in rasti sevov C. jejuni K49/4 in C. jejuni 27835 v celicah Caco-2 po izpostavitvi bakterij toplotnemu stresu (55 ºC/ 3min).. 72
Slika 39: Primerjava znotrajceličnega preživetja in rasti predhodno stradanih celic sevov C. jejuni K49/4 in C. jejuni 27835 v celicah Caco-2 ………...… 73
Slika 40: Primerjava znotrajceličnega preživetja in rasti sevov C. jejuni K49/4 in C. jejuni 27835 v celicah Caco-2 po predhodni izpostavitvi bakterij kisiku …... 74
Slika 41: Primerjava znotrajceličnega preživetja kontrolnih kultur C. jejuni K49/4 in C. jejuni 27835, ki nista bili izpostavljeni stresu ……….... 75
Slika 42: Primerjava znotrajceličnega preživetja sevov C. jejuni K49/4 in C. jejuni 27835 v celicah makrofagov J774 po izpostavitvi bakterij toplotnemu stresu (55 ºC/3 min) ... 76 Slika 43: Primerjava znotrajceličnega preživetja predhodno stradanih celic sevov C. jejuni K49/4 in C. jejuni 27835 v makrofagih J774 ... 77 Slika 44: Primerjava znotrajceličnega preživetja sevov C. jejuni K49/4 in C. jejuni 27835 v makrofagih J774 po predhodni izpostavitvi bakterij kisiku ... 78
KAZALO PRILOG
Priloga A1: Kultivabilnost (%) in živost (%) celic C. jejuni K49/4 iz eksponentne faze rasti po izpostavitvi stresu
Priloga A2: Kultivabilnost (%) in živost (%) celic C. jejuni 27835 iz eksponentne faze rasti po izpostavitvi stresu
Priloga B1: Povprečna adhezivnost (%) celic C. jejuni K49/4 iz eksponentne faze rasti po izpostavitvi stresu na celični kulturi Caco-2 in makrofagih J774
Priloga B2: Povprečna adhezivnost (%) celic C. jejuni 27835 iz eksponentne faze rasti po izpostavitvi stresu nacelični kulturi Caco-2 in makrofagih J774
Priloga C1: Povprečna invazivnost (%) celic C. jejuni K49/4 iz eksponentne faze rasti po izpostavitvi stresu v celični kulturi Caco-2 in makrofagih J774
Priloga C2: Povprečna invazivnost (%) celic C. jejuni 27835 iz eksponentne faze rasti po izpostavitvi stresu v celični kulturi Caco-2 in makrofagih J774
Priloga D1: Preživljivost in rast (log 10CFU/ml) C. jejuni K49/4 znotraj celic Caco-2, glede na predhodno izpostavitev stresu
Priloga D2: Preživljivost in rast (log 10CFU/ml) C. jejuni 27835 znotraj celic Caco-2, glede na predhodno izpostavitev stresu
Priloga E1: Preživljivost (log 10CFU/ml) C. jejuni K49/4 v celični kulturi makrofagov J774, glede na predhodno izpostavitev stresu
Priloga E2: Preživljivost (log 10CFU/ml) C. jejuni 27835 4 v celični kulturi makrofagov J774, glede na predhodno izpostavitev stresu
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
A absorbanca BHI bujon Brain Heart Infusion bujon
C. jejuni 27835 Campylobacter jejuni, humani izolat
C. jejuni K49/4 Campylobacter jejuni, izolat iz piščančjega mesa cAMP ciklični adenozin monofosfat
CAT katalaza
CFU število kolonijskih enot (Colony Forming Units)
dH2O destilirana voda
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) DMSO Dimetil sulfoksid
DNK deoksiribonukleinska kislina
EDTA etilendiamin tetraacetat
FBS Fetal bovine serum
FeSOD(SodB) citoplazemska superoksid dismutaza
GBS Guillain-Barrèov sindrom
h ura H2O2 vodikov peroksid
HOCl hipoklorova kislina
HO• hidroksilni radikal
HrcA regulatorni sistem za nastanek proteinov toplotnega stresa HSP proteini toplotnega stresa (Heat-Shock Proteins)
HspR regulatorni sistem za nastanek proteinov toplotnega stresa LPS lipopolisaharidni sloj v zunanji plasti celične stene G- bakterij M mol/l
Mbp mega bazni pari min minuta
MnSOD(SodA) mitohondrijska superoksid dismutaza O2•- superoksidni anion
obr./min obrati na minuto
RacRS dvokomponentni regulatorni sistem za nastanek proteinov toplotnega stresa
RNK ribonukleinska kislina
ROS reaktivne kisikove zvrsti (Reactive Oxygen Species)
RPMI gojišče za celice leukocitov (Roswell Park Memorial Institute) RpoS dejavnik za večjo odpornost celic proti stresu v stacionarni fazi,
imenovan sigma (σ) dejavnik
s standardni odklon relativnih vrednosti
SD standardni odklon
SOD superoksid dismutaza
SoxRS regulatorni dejavnik oksidativnega stresa (Positive regulators of the response to superoxide stress)
T temperatura
t čas
VBNC živo, vendar nekultivabilno stanje celic (Viable But Not Culturable)
1 UVOD
Bakterije rodu Campylobacter so se v zadnjih 10 letih povzpele med glavne povzročitelje črevesnih enteritisov v razvitem svetu in v deželah v razvoju (Ketley, 1997; van Vliet in Ketley, 2001). Najpogostejši vzrok okužbe predstavlja kontaminirana hrana, predvsem nezadostno toplotno obdelano piščančje meso ali navzkrižna kontaminacija druge hrane (Solomon in Hoover, 1999).
Glavni vir bakterij predstavljajo: domača perutnina in divje ptice, govedo, prašiči, konji, ovce, zajci, glodalci ter hišni ljubljenčki, pri katerih so kampilobakterji naravni del črevesne mikrobne združbe (Solomon in Hoover, 1999).
Kakor v gostitelju so tudi pri predelavi živil bakterije C. jejuni izpostavljene različnim stresom. Zaradi tega je njihova sposobnost preživetja odvisna predvsem od sposobnosti prilagajanja in hitrega odzivanja na stresne pogoje v okolju (Solomon in Hoover, 1999).
Pri izpostavitvi subletalnim stresnim razmeram se kampilobakterji lahko prilagodijo stresnim razmeram in postanejo odpornejši na močnejše strese istega ali drugih tipov stresa, kar povečuje njihovo patogenost (Boor, 2006).
Bakterije C. jejuni so termotolerantne bakterije, saj je njihova optimalna temperatura rasti 42 – 43 °C, vendar so občutljive na povišanje temperature nad 50 °C. Toplotnemu stresu so izpostavljene v postopkih predelave in priprave živil, saj je toplotna obdelava najpomembnejša za zagotavljanje varnih živil. Določeno stopnjo zaščite celicam predstavlja sinteza proteinov toplotnega stresa, ki preprečujejo nepravilno zvijanje toplotno občutljivih celičnih proteinov.
Kampilobakterji so mikroaerofilne bakterije, občutljive na koncentracije kisika, višje od 4 - 5 %. Kampilobakterji so občutljivi, ker nimajo mehanizmov odziva na oksidativni stres, ki jih srečamo pri drugih patogenih mikroorganizmih, prenosljivih s hrano (Park, 2002;
Gaynor in sod., 2005). Zato je pri kampilobakterjih oksidativni stres zelo pogost, saj že sama izpostavljenost atmosferski koncentraciji kisika izzove stres v celicah. Bakterije se pred oksidativnim stresom zaščitijo s sintezo encimov, ki popravljajo škodo, narejeno s kisikovimi spojinami in encimov, ki reagirajo s toksičnimi spojinami in jih na ta način
deaktivirajo (Storz in Imlay, 1999). Obramba pred oksidativnim stresom je pomembna tudi pri preživetju C. jejuni znotraj celic makrofagov.
Pomanjkanje hranilnih snovi v okolju predstavlja najpogostejšo obliko stresa bakterij.
Stradanje spremljajo temeljite strukturne in fiziološke spremembe, ki lahko prispevajo k povečani odpornosti proti temperaturnemu, oksidativnemu, ozmotskemu in kislinskemu stresu. Številnim patogenim bakterijam ta prilagoditev omogoča preživetje fizikalno- kemijskih postopkov obdelave med pridelavo, predelavo, skladiščenjem in distribucijo živil (Park, 2001).
Ko kampilobakterji skupaj s hrano ali vodo pridejo v gostitelja in premagajo želodčno barijero ter naselijo črevesje, pride do izražanja številnih virulentnih dejavnikov, kot so gibljivost, kemotaksa, pritrditev na epitelne celice, invazivnost, produkcija toksinov ter znotrajcelično preživetje (Ketley, 1997).
Čeprav je C. jejuni zelo pomemben patogen, so mehanizmi povzročanja bolezni pri človeku slabo raziskani (Solomon in Hoover, 1999). Uporaba celičnih kultur za raziskovanje invazivnosti je standardna in vitro metoda za preučevanje virulentnosti kampilobakterjev, obenem pa se z njihovo uporabo do določene mere izognemo poskusom na živalih (Hu in Kopecko, 1999; Müller in sod., 2006).
Cilj diplomske naloge je bil preučiti vpliv stradanja, oksidativnega in toplotnega stresa na adhezivnost, invazivnost, znotrajcelično preživetje in rast v celičnih kulturah Caco-2 in makrofagov J774. Celice Caco-2 so humane epitelne celice. Predstavljajo najboljši in vitro model preučevanja interakcij gostitelj-patogen, saj v in vitro pogojih spontano diferencirajo in izražajo funkcionalne ter strukturne lastnosti epitelnih celic tankega črevesa (Szymanski in sod., 1995). Celice makrofagov so krvne celice, ki nastajajo v kostnem mozgu in imajo ključno vlogo v imunskem odgovoru organizma. Predstavljajo potencialni način prenosa kampilobakterjev po gostiteljskem organizmu.
1.1 CILJI IN DELOVNE HIPOTEZE DIPLOMSKE NALOGE 1.1.1 Cilj diplomske naloge
Namen eksperimentalnega dela je bil preučevanje vpliva toplotnega in oksidativnega stresa ter stradanja na adhezivnost in invazivnost ter znotrajcelično preživetje bakterij C. jejuni v celičnih kulturah makrofagov J774 in enterocitov Caco-2. Imeli smo že zbrane podatke o vplivu stresa na kultivabilnost in živost živalskega izolata C. jejuni K49/4, dopolniti pa smo jih želeli še za klinični sev C. jejuni 27835.
Cilji naloge:
S diplomsko nalogo smo poskušali potrditi predpostavko, da izpostavitev celic stradanju, toplotnemu ali oksidativnemu stresu značilno poveča ali zmanjša adhezivnost, invazivnost ter znotrajcelično preživetje in rast bakterije C. jejuni v in vitro celičnih modelih.
1.1.2 Delovne hipoteze
Postavili smo naslednje hipoteze:
1. Izpostavitev bakterij toplotnemu stresu, stradanju in oksidativnemu stresu vpliva na kultivabilnost in živost kampilobakterjev.
2. Predvidevamo, da predhodna izpostavitev bakterij toplotnemu stresu, stradanju in oksidativnemu stresu zmanjša ali poveča adhezivnost, invazivnost ter znotrajcelično rast in preživetje sevov C. jejuni K49/4 in C. jejuni 27835 v celičnih kulturah celic Caco-2 in makrofagov J774 v primerjavi z bakterijskimi celicami, ki niso bile izpostavljene stresnim pogojem.
2 PREGLED OBJAV
2.1 ZGODOVINA
Bakterije rodu Campylobacter so edinstveni povzročitelji bolezni, glede na to, da je preteklo skoraj celo stoletje od prve omembe tega mikroorganizma do razvoja rutinskih tehnik kultivacije, ki bi naj omogočale uspešno izolacijo kampilobakterjev iz blata bolnikov. Prvi, ki je opisal kampilobakterjem podobne bakterije, je bil Escherich, ki jih je leta 1886 izoliral iz blata 16 od 17 otrok, ki so trpeli za drisko. Leta 1909 sta veterinarja McFadyean in Stockman povezala ta rod s primeri splavov pri ovcah in govedu zaradi neznane bakterije podobne vibriju. Leta 1938 je Levy izoliral vibrijem podobne organizme iz krvi bolnikov, ki so zaužili kontaminirano mleko (Crushell in sod., 2004.)
Vinzent s sodelavci je leta 1947 izoliral V. fetus iz krvi treh nosečnic, sprejetih v bolnišnico zaradi vročice neznanega izvora. Bolezen je trajala približno 4 tedne, a dve izmed treh nosečnic sta splavili (Butzler, 2004). E. King je leta 1957 opisala te spiralne bakterije kot povzročitelje enteritisov pri dojenčkih ter jih poimenovala vibrijem - podobni (zaradi navidezne podobnosti s bakterijo Vibrio cholera) (Crushell in sod., 2004). V zgodnjih 1960-tih letih so znanstveniki na podlagi seroloških in biokemijskih testov ločili kampilobakterje od ostalih vrst rodu Vibrio.
Sebald in Veron sta l. 1963 predlagala nov rod, imenovan Campylobacter. Vibrio fetus subspecies jejuni so preimenovali v Campylobacter jejuni (Solomon in Hoover, 1999).
V naslednjih treh desetletjih so ta organizem opisovali kot redek, oportunistični in invazivni patogen, ki povzroča bolezen predvsem pri oslabelih osebah (Solomon in sod., 1999). Šele leta 1972 so izolirali kampilobakterje iz blata oseb z akutnim enterokolitisom, skoraj deset let kasneje pa so C. jejuni prepoznali kot najpogostejši vzrok črevesnih enterokolitisov pri ljudeh (Butzler, 2004).
Naraščajoče število kampilobakterioz v zadnjih dvajsetih letih lahko deloma pripišemo povečanemu spremljanju bolezni in izboljšanim tehnikam odkrivanja in identifikacije.
V zadnjih desetih letih se je Campylobacter povzpel na vrh lestvice povzročiteljev črevesnih enteritisov (Ketley, 1997; van Vliet in Ketley, 2001).
Najpomembnejša patogena tega rodu sta C. jejuni in C. coli, saj skupaj povzročata več kot 95 % vseh kampilobakterioz pri ljudeh (Park, 2002). Ostali predstavniki rodu Campylobacter lahko okužijo človeka, vendar je potek infekcije z njimi še slabo raziskan (Ketley, 1997).
2.2 KLASIFIKACIJA
Rod Campylobacter je bil prvič taksonomsko opredeljen leta 1984 v prvi izdaji Bergeyevega priročnika za sistematizacijo bakterij (Solomon in Hoover, 1999). Rod Campylobacter spada skupaj z rodovoma Helicobacter in Arcobacter v družino Campylobacteraceae. Danes rod vsebuje 16 vrst in 6 podvrst, z osmimi potencialno patogenimi za človeka, ki so poznane kot povzročitelji človeških gastroenteritisov (Brenner in sod., 2005).
Trenutno v rod Campylobacter spadajo naslednje vrste: C. jejuni, C. coli, C. lari, C. hyointestinalis, C. upsaliensis, C. fetus, C. gracilis, C. mucosalis, C. rectus, C. showae,
C. sputorum, C. concisus, C. curvus, C. helveticus, C. hominis, C. lanienae (Brenner in sod., 2005).
Potencialno patogene za človeka so vrste C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis, C. fetus (Walker in sod., 1986; Brenner in sod., 2005). V več kot 95 % primerov sta povzročitelja humanih kampilobakterioz C. jejuni ter C. coli (Snelling in sod., 2005).
2.3 ZNAČILNOSTI BAKTERIJ RODU Campylobacter
Campylobacter jejuni je po Gramu negativna, mikroaerofilna, zelo gibljiva in termotolerantna bakterija. Celice imajo značilno spiralno obliko ali obliko podobno črki S (Konkel in sod., 2001). V eksponentni fazi rasti so celice široke od 0,2- 0,4 μm, dolge 1,5 - 3,5 μm (Walker in sod., 1986). Gibljivost in možnost preboja skozi mukozni sloj, ki prekriva črevesne celice, celicam omogoča mono- ali bipolarni biček (Ketley, 1997).
Bakterije vrste C. jejuni so termotolerantne, saj rastejo v temperaturnem območju med 30 - 45 °C, optimalno pri 42 - 43 °C. Visoka optimalna temperatura je verjetno posledica prilagoditve temperaturi njihovega naravnega okolja (črevesju toplokrvnih živali in ptic) (Ketley, 1997). Pri temperaturi pod 30 °C ne rastejo (Park, 2002). Organizmi so zelo občutljivi na zmrzovanje in sušenje ter učinke visokih temperatur, njihova rast je ustavljena pri temperaturi nad 45 °C (Solomon in Hoover, 1999). Kot mikroaerofilni organizem najbolje rastejo pri nizkih koncentracijah kisika oz. v atmosferi, ki vsebuje 5 % kisika, 10 % ogljikovega dioksida in 85 % dušika (Walker in sod., 1986; Murphy in sod., 2003). Pri izpostavljenosti atmosferski koncentraciji kisika bakterije prehajajo v kokoidno obliko (Snelling in sod., 2005).
Kampilobakterji imajo relativno majhen genom (približno 1,6 – 1,7 Mbp) z visokim deležem adenina in timina. Vsebnost gvanina in citozina je okoli 30 % (Ketley, 1997).
Majhen genom kampilobakterjev je verjetno vzrok za njihove velike potrebe po rastnih dejavnikih oz. kompleksnih medijih, ki jim omogočajo rast, ter njihove nezmožnosti fermentacije sladkorjev, lipidov in nezmožnosti rasti pri vrednosti pH nižji od 4,9 (Snelling in sod., 2005).
Ena izmed posebnih značilnosti genoma je prisotnost hipervariabilnih nukleotidnih zaporedij, predvsem v genih, ki kodirajo biosintezne poti in spremembe površinskih struktur, ter v genih, katerih funkcija zaenkrat še ni poznana. Nekateri menijo, da je mogoče prav ta hipervariabilnost genoma pomembna za preživetje tega organizma v okolju (Solomon in Hoover, 1999).
Kampilobakterji ne rastejo pri vrednosti aw, manjši od 0,987. So bolj občutljivi na osmotski
stres kot druge patogene bakterije, saj ne rastejo v okoljih, ki vsebujejo nad 2 % natrijevega klorida. Prav tako kampilobakterji ne kažejo dobre preživelosti na suhih
površinah (Nguyen in sod., 2006; Altekruse in sod., 1999).
Bakterije so občutljive na visoko temperaturo in jih s pravilnimi postopki pasterizacije ali drugo primerno toplotno obdelavo živila uničimo. Bolje preživijo v ohlajenih živilih,
hranjenih pri nizki temperaturi hladilnika, kot na sobni temperaturi ali zmrzovalniku (Park, 2002).
Za razliko od mnogih drugih mikroorganizmov so kampilobakterji bolj občutljivi na okoljske pogoje, saj nimajo nekaterih mehanizmov prilagoditve na stresne pogoje, potrebnih za preživetje v neugodnih pogojih (Nguyen in sod., 2006). Prav tako nimajo
"klasične" stacionarne faze, zaradi pomanjkanja RpoS oz. dejavnika σs, ki omogoča izražanje genov za večjo odpornost celice v stacionarni fazi, in SoxRS, ki vpliva na celično odpornost proti oksidativnemu stresu (Gaynor in sod., 2005). Adaptivni odgovori na stresne razmere, ki jih poznamo pri drugih patogenih mikroorganizmih, ki se prenašajo z živili, so pri kampilobakterjih drugačni in še niso raziskani (Park, 2002). Zaradi teh značilnosti se kampilobakterji težko razmnožujejo izven prebavnega trakta živali in se za razliko od drugih patogenih bakterij ne morejo razmnoževati v živilih med predelavo in shranjevanjem (Park, 2002).
Za bakterije C. jejuni sta značilna dva tipa kolonij: ravne, sivkaste, ploščate z neravnim robom in okrogle, izbočene in lesketajoče se kolonije. Pogosto imajo majhen, temnejši center.
Slika 1: Tipična morfologija C. jejuni Slika 2: Značilne kolonije bakterij C. jejuni pod elektronskim mikroskopom na krvnem agarju po 48-urni
(Gaynor in sod. 2004) inkubaciji v optimalnih pogojih rasti.
2.4 EPIDEMIOLOGIJA IN PATOGENEZA RODU Campylobacter 2.4.1 Epidemiologija bakterij rodu Campylobacter
Kampilobakterioza je zoonoza, infekcijska bolezen, ki jo povzročajo bakterije rodu Campylobacter, za katero je znano več načinov prenosa. Potencialni vir bakterij predstavljajo: domača perutnina in divje ptice, govedo, prašiči, konji, ovce, zajci, glodalci ter hišni ljubljenčki, kjer so kampilobakterji naravni del črevesne mikrobne združbe (Solomon in Hoover, 1999). V 80 % okužb je prenosnik kontaminirana hrana, predvsem nezadostno toplotno obdelano piščančje meso ali navzkrižna kontaminacija toplotno obdelane hrane s surovo (Solomon in Hoover, 1999). Poleg uživanja toplotno premalo obdelane perutnine je možen vzrok okužbe s kampilobakterji tudi uživanje svežega mleka in kontaminirana voda (Crushell in sod. 2004). Prenos z živali na ljudi prevladuje pri ljudeh, ki imajo neposredni stik z živali ali živalskimi izdelki, ter pri otrocih s hišnimi ljubljenčki. Mačke in psi lahko prenašajo kampilobakterje brez opaznih simptomov bolezni (Crushell in sod. 2004). Možna načina prenosa C. jejuni med perutnino sta preko kontaminirane vode ali hrane, lahko pa tudi preko insektov, glodalcev, divjih ptic in
iztrebkov kokoši ter iztrebkov ostalih živali na kmetiji (Pearson in sod., 1996).
Če se kampilobakterji pojavijo v jati, se zelo hitro prenesejo na vse živali in se naselijo v prebavnem traktu kot nepatogeni komenzali (Pearson in sod., 1993; Hendrixson in DiRita, 2004). Meso se večinoma kontaminira med zakolom s črevesno vsebino ali pa preko kontaminirane klavniške opreme (Altekruse in sod., 1999). Čeprav je C. jejuni zelo občutljiv organizem, je sposoben preživeti na piščančjem mesu. Preprečevanje okužb s kampilobakterji se mora začeti že pri vzreji piščancev in se končati z osveščanjem potrošnikov, t.i. pristopom "od vil do vilic" (angl. "from farm to fork ") (Solomon in Hoover, 1999). Pogostost okužb se naglo viša, kar je verjetno posledica sprememb prehranjevalnih navad in vse večje popularnosti perutninskega mesa (Tauxe, 2002). Več kot 90 % primerov je sporadičnih in sezonsko odvisnih, saj večina pojavov bolezni doseže vrh v pomladnih oz. zgodnjih poletnih mesecih (Snelling in sod., 2005).
Slika 3: Ekološki cikel C. jejuni (Konkel in sod., 2001).
Moški obolevajo pogosteje kot ženske. Za infekcije so veliko bolj dovzetne osebe z zmanjšano imunsko odpornostjo (Solomon in Hoover, 1999).
C. jejuni in C. coli sta razširjena povzročitelja bakterijsko povzročenega akutnega gastroenteritisa, tako v razvitih deželah kot v deželah v razvoju, čeprav je incidenca infekcij bistveno drugačna (Day in sod., 2000). Pojav kampilobakterioz v državah v razvoju je posledica slabega higienskega stanja in tesnejšega stika ljudi z domačimi živalmi. Bolezen v teh državah je omejena na otroke in se ne pojavlja sezonsko. Driske se pojavljajo le pri mlajših otrocih, veliko okuženih starejših pa ne kaže znakov bolezni (Ketley, 1997; van Vliet in Ketley, 2001). Najpogostejši vzrok za okužbe je zaužitje kontaminirane hrane ali vode (Crushell, 2004). Medtem ko bolezen v državah v razvoju spremljajo blage in vodene driske, simptomi bolezni v razvitih državah vključujejo akutne bolečine v trebuhu, drisko, vročino, splošno oslabelost in včasih tudi bruhanje. Tako velike razlike v epidemiologiji lahko pripišemo večji izpostavljenosti otrok v zgodnjem obdobju in razvoju odpornosti (Ketley, 1997; van Vliet in Ketley, 2001).
Kampilobakterji so eden izmed vodilnih vzrokov t.i. potovalne driske, predvsem pri potovanjih oseb iz razvitih držav v dežele v razvoju, Latinsko Ameriko, Azijo, Afriko in Bližnji vzhod (Crushell in sod. 2004). Simptomi bolezni so običajno podobni simptomom bolezni v državi, iz katere oseba prihaja, ne pa obiskuje (van Vliet in Ketley, 2001).
Klinični simptomi, ki spremljajo bolezen, so poleg povečanega izločanja blata še slabost, trebušni krči, vročina in drugi. Najpogosteje obolevajo mlajši otroci, mladostniki med 20.
in 29. - im letom in ljudje z zmanjšano odpornostjo organizma, kot so rakavi bolniki, bolniki, okuženi z virusom HIV ter bolniki s kroničnimi gastrointestinalnimi obolenji (Crushell in sod. 2004).
2.4.2 Patogeneza bakterij rodu Campylobacter
Čeprav je C. jejuni zelo pomemben patogen, so mehanizmi povzročanja bolezni pri človeku še nepojasnjeni. Pri nekaterih bolnikih se bolezen lahko razvije brez značilnih simptomov, medtem ko pa pri nekaterih pride do težjih oblik bolezni, katere simptomi se začnejo kazati šele 1.-7. dan po okužbi in vključujejo vročino, krče, drisko, splošno oslabelost ter včasih tudi bruhanje. Pri bolnikih z zmanjšano odpornostjo organizma lahko bolezen traja tudi do tri tedne. Pri teh bolnikih je lahko bolezen kronična in ponavljajoča, možne so tudi črevesne in izvenčrevesne težave (Walker in sod., 1986; Solomon in Hoover, 1999).
Pri bolnikih se pojavljata dva tipa driske. Pri prvem tipu je značilna krvava in pogosto sluzava driska, ki vsebuje levkocite in jo spremlja tudi vročina. Pri drugem tipu pa gre za nevnetno, vodeno drisko brez vročine, krvi in levkocitov v blatu (Wassenaar in Blaser, 1999). Potek bolezni je odvisen tako od gostitelja kot od bakterije. Zdravstveno stanje, starost gostitelja ter specifična imunost organizma proti tem bakterijam zaradi prejšnje izpostavljenosti vplivajo na potek bolezni po okužbi (Altekruse in sod., 1999). Bolezen se običajno pri zdravih ljudeh konča sama od sebe po 2.–7. dneh, brez potrebnega zdravljenja,
vendar pa lahko telo obolelega izloča bakterije še nekaj tednov (Ketley 1997).
Pri večini bolnikov zadošča zdravljenje z nadomeščanjem tekočine in elektrolitov (Altekruse in sod., 1999). Njihova infekcijska doza je nizka in je odvisna od seva. Za človeka lahko znaša le 500 do 800 mikroorganizmov (Walker in sod., 1986; Solomon in Hoover, 1999).
Zapleti, ki lahko sledijo okužbi s kampilobakterji, so bakteremija, Reiterjev sindrom, ki je revmatološko obolenje in Guillain-Barré-jev sindrom (GBS) (Walker in sod., 1986; Yan in sod., 2005). Za Guillain-Barré–jev sindrom je najpomembnejša okužba s C. jejuni in je resna avtoimunska okvara perifernega živčnega sistema ter eden izmed najpogostejših vzrokov za akutno paralizo (Ketley, 1997). Zanj je značilna hitro napredujoča oslabelost okončin in dihalnih mišic. Na vsakih 1000 primerov kampilobakterioze se pojavi približno en primer GBS, 40 % bolnikov s sindromom je bilo predhodno okuženih s kampilobakterji (Butzler, 2004).
V ZDA ocenjujejo, da je Campylobacter vzrok za 1 do 7 milijonov enteritisov letno, od katerih se jih 100 do 500 konča s smrtnim izidom (Solomon in Hoover, 1999).
2.4.2.1 Virulentni dejavniki bakterij rodu Campylobacter
Ko kampilobakterji skupaj s hrano ali vodo pridejo v gostitelja in premagajo želodčno barijero, naselijo črevesje, pride do izražanja številnih virulentnih dejavnikov. To so gibljivost, kemotaksa, pritrditev na epitelne celice, invazivnost, produkcija toksinov ter znotrajcelično preživetje bakterijskih celic (Ketley, 1997).
2.4.2.1.1 Gibljivost in kemotaksa
Da bi se lahko naselili v črevesju in premagali peristaltiko, morajo biti bakterije sposobne preboja skozi mukozni sloj, ki prekriva črevesne celice. To lahko dosežejo s pomočjo flagela in svoje spiralno-vijačne oblike (Ketley, 1997). Gibljivost C. jejuni prispeva k sposobnosti kolonizacije prebavnega trakta in vivo, prav tako pa k invazivnosti celičnega monosloja in vitro (Grant in sod., 1993).
Gibljivost s pomočjo flagela je pomembna ne samo pri iskanju pritrdilnega mesta, ampak tudi pri samem prodiranju v gostiteljsko celico in je najbolje opisani virulenčni dejavnik kampilobakterja (Yan in sod., 2005). Flagel C. jejuni je sestavljen iz bazalnega telesa, kljuke ter filamenta, ki ga sestavljata dva proteina, FlaA in FlaB. Kodirata ju gena flaA in flaB. Gena nimata skupnega promotorja, saj izražanje gena flaA regulira σ28, izražanje gena flaB pa σ54 (Konkel in sod., 2004). Gen flaA se izraža v večji meri kot flaB. Dokazano je, da ima protein FlaA strukturno vlogo, medtem ko je protein FlaB pomemben pri premikanju bakterije (Ketley, 1997).
Kemotaksa je sposobnost odkrivanja kemijskih gradientov in premikanja vzdolž njih, bodisi proti atraktantom ali proč od repelentov. Skupaj z gibljivostjo je kemotaksa bistvena za uspešno kolonizacijo C. jejuni v črevesju. Med številne kemoatraktante, ki privlačijo celice C. jejuni, sodijo mucin, L- serin in L- fukoza (oba pomembna glikopeptida mucina), med kemorepelente pa spadajo žolčne kisline (Walker in sod., 1986; McSweegan in Walker, 1986). Malo je znano o molekularni osnovi kemotakse kampilobakterja (Ketley, 1997). Najpomembnejši med geni, ki so vključeni v kemotaksični sistem, je regulatorni
gen cheY. Predvidevajo, da je ta gen pomemben za celotno regulacijo virulenčnih genov (van Vliet in Ketley, 2001).
2.4.2.1.2 Adhezivnost in invazivnost
Po okužbi C. jejuni preide skozi mukozni sloj, ki prekriva epitelne celice in se pritrdi na njih, kar omogoča bakterijam vstop v epitelne celice. Zaradi tega pride do poškodbe mukoznega sloja in vnetja (Walker in sod., 1986; van Vliet in Ketley, 2001). Citokini so polipeptidi, ki jih producirajo različni tipi celic in imajo pomembno vlogo pri vnetnem odgovorju gostitelja. Delujejo kot atraktanti specifičnih fagocitov, saj se izločajo na mestih, kjer pride do vnetja. CDT toksin bakterije C. jejuni sproži pri epitelnih celicah izločanje interleukina 8 (IL-8), ki je močan kemoatraktant in aktivator nevtrofilcev (Wassenaar in Blaser, 1999; Konkel in sod., 2001; Jones in sod., 2003; Hickey in sod., 2005).
Pripenjanje na epitelne celice omogočajo različni izrastki (adhezini) na površini bakterije, ti vključujejo različne fimbrijske strukture, flagel, polisaharidne kapsule, sloj LPS, lektine, lipooligosaharide ter različne proteine. Sintezo fimbrijskih struktur spodbuja prisotnost žolčnih kislin (Walker in sod., 1986; Snelling in sod., 2004).
Flagel pospešuje in olajšuje pritrditev na epitelne celice, medtem ko so različni adhezini, povezani na številnih mestih z receptorji epitelnih celic, odgovorni za čvrsto povezanost obeh (McSweegan in Walker, 1986).
Nedavno so odkrili, da pri pripenjanju C. jejuni sodelujejo še proteini PEB1 in CadF (ang.
a fibronectin binding protein), lipoprotein JlpA ter večji protein na zunanji membrani (ang.
major outer membrane protein, MOMP), vendar njihov mehanizem še ni pojasnjen.
Nespecifično vezanje bakterije za lipide na membrani epitelnih celic lahko tudi prispeva k adhezivnosti (Jin in sod., 2003).
Posebnost mnogih proteinov C. jejuni, vključno s flagelom, je v njihovi glikoziliranosti.
Biološka pomembnost glikozilacije proteinov ni znana, vendar domnevajo, da določeni
bakterijski glikoproteini medsebojno vplivajo z receptorji evkariontskih celic ter omogočajo pripenjanje bakterijskih celic (Karlyshev in sod., 2004).
In vitro testi so pokazali, da so žive, a nekultivabilne celice kampilobakterjev sposobne vezave na gostiteljsko celico, kar nakazuje, da "de novo" sinteza proteinov ni potrebna za vezavo na evkariontsko celico, medtem ko je invazija C. jejuni odvisna od teh proteinov in signalno transdukcijskega sistema gostiteljskih celic (van Vliet in Ketley, 2001).
Bakterijska invazija povzroča poškodbe epitelnih celic in vivo, izgubo celičnih funkcij ter drisko (Snelling in sod., 2004). C. jejuni je eden izmed peščice invazivnih patogenih bakterij, sposobnih s pomočjo reorganizacije citoskeleta vstopiti v gostiteljsko celico in se premikati znotraj njih.
Mehanizem invazivnosti v celice, ki ga sproži C. jejuni, vključuje povezano delovanje mikrofilamentov in mikrotubulov gostiteljske celice in inducira aktivacijo G proteina ali fosforilacijo tirozina (Ketley, 1997; Hu in Kopecko, 1999; Snelling in sod., 2004; Crushell in sod., 2004; Friis in sod., 2005).
Avtorja van Vliet in Ketley (2001) navajata tudi možnost prodiranja C. jejuni v gostiteljsko celico s pomočjo endocitoze (van Vliet in Ketley, 2001; Snelling in sod., 2004).
Ko je C. jejuni znotraj gostiteljske celice, ne more uiti iz lizosoma. Pri tem mu je za preživetje in obrambo pred oksidativnim stresom zelo pomembna prisotnost katalaze.
Znotraj lizosoma C. jejuni potuje do bazolateralne površine gostiteljske celice, kjer s eksocitozo preide iz celice, pri čemer lahko bakterijske celice preidejo v živo, a nekultivabilno stanje (VBNC) (Snelling in sod., 2004).
Zaradi svoje sposobnosti preživetja znotraj fagocitov in črevesnih epitelnih celic je C.
jejuni fakultativni znotrajcelični parazit (Konkel in Cieplak, 1992; Wassenaar in sod., 1997; Day in sod., 2000). Znotrajcelično preživetje omogoča celicam C. jejuni, da uidejo imunskemu sistemu gostitelja, ter povzročijo ponavljajoče akutno vnetje in dolgotrajno
infekcijo (Lastovica, 1996). Kampilobakterji lahko preživijo v makrofagih, kar omogoči širjenje bakterij v organizmu (Wassenaar in sod., 1997).
Znotraj gostiteljske celice so izpostavljeni stresnim pogojem (npr. stradanju) ter različnim uničujočim mehanizmom. Pri tem sta pomembna gena katA in sodB, ki kodirata encima katalazo in superoksid dismutazo (Day in sod., 2000, Müller in sod., 2006). Geni ali fenotipski dejavniki, ki pomagajo kampilobakterjem preživeti znotraj gostiteljske celice, do danes niso znani (Gaynor in sod., 2005).
V prisotnosti evkariontskih celic C. jejuni sintetizira in izloča proteine Cia (ang.
Campylobacter invasion antigens), ki naj bi pomagali pri invaziji v gostiteljsko celico (Konkel in sod., 2001).
Translokacija je pomemben dejavnik virulence nekaterih patogenih bakterij, saj jim omogoča dostop do spodnjih tkiv pod epitelom ter diseminacijo v organizmu. Način translokacije epitela za kampilobakterje še vedno ni pojasnjen, toda Bras in Ketley (1999) navajata dve možnosti, paracelularno in transcelularno (skozi citoplazmo gostiteljske celice). Transcelularni način potrjuje konstantna transepitelna električna upornost (TER) tekom translokacije kampilobakterja (Bras in Ketley, 1999). Monteville in Konkel sta leta 2001 pokazala, da je C. jejuni sposoben translokacije tudi paracelularno brez spremembe transepitelne električne upornosti (Monteville in Konkel, 2002).
Invazivnost C. jejuni je sevno pogojena in se preučuje in vitro na različnih črevesnih celičnih kulturah, ki naj bi oponašale pogoje in vivo. Največkrat uporabljene so:
diferencirane celice Hep-2, INT 407, HeLa ter Caco-2 (van Vliet in Ketley, 2001; Friis in sod., 2005). Klinični izolati C. jejuni so se pokazali kot bolj invazivni od živalskih, pri čemer s kontinuiranim precepljanjem izgubljajo to lastnost (van Vliet in Ketley, 2001).
Slika 4: Stopnje invazije bakterij C. jejuni v črevesju (van Vliet in Ketley, 2001).
(1) gibljivost; (2) kemotaksa; (3) oksidativni obrambni mehanizem; (4) adhezija; (5) invazija; (6) sinteza toksina; (7) pridobivanje železa; (8) stresni odziv na spremembe temperature; (9) kokoidna oblika.
2.4.2.1.3 Toksini
Poskusi in vitro so pokazali, da le okoli 1 % bakterij, ki pridejo v črevesje, napadejo epitelne celice, kjer pa se jih veliko uniči z znotrajceličnimi dejavniki. Iz tega sledi, da so za citopatološke učinke okužbe z bakterijami rodu Campylobacter poleg invazije epitelnih celic potrebni še drugi dejavniki, med katerimi pomembno vlogo igrajo toksini (Wassenaar, 1997).
Pri bakterijah rodu Campylobacter so odkrili dva tipa toksinov, ki jih odvisno od načina delovanja delimo v dva razreda: enterotoksine (Gubina in sod., 1982) in citotoksine (Walker in sod., 1986; Wassenaar, 1997; Snelling in sod., 2005).
C. jejuni enterotoksin (CJT) je imunološko podoben enterotoksinu bakterije Vibrio cholerae t.i. kolera toksinu (CT) in termolabilnemu toksinu, ki ga izloča Escherichia coli (LT). Enterotoksini se vežejo na celične receptorje in po vstopu v celico dvignejo koncentracijo znotrajceličnega cikličnega AMP (cAMP). Posledica spremembe v pretoku ionov privede do prevelikega izločanja tekočine iz celice, kar se kaže kot vodena driska (Wassenaar, 1997).
Drugi tip toksinov, ki jih izločajo kampilobakterji, so citotoksini (proteini), ki uničujejo tarčno celico. Njihovo sintezo sta prvič opisala Johnson in Lior leta 1988 (Konkel in sod., 2001). Kampilobakterji proizvajajo različne vrste citotoksinov: 70 kDA citotoksin, Vho/HeLa celični citotoksin, toksin CDT, Shiga toksinu podoben toksin, hemolitične citotoksine in hepatotoksin, vendar mehanizmi delovanja za večino od teh še niso poznani (Wassenaar, 1997). Citotoksičnost toksina CDT temelji na blokadi celičnega cikla v G-2 fazi, s preprečevanjem defosforilacije CDC-2 kinaze, ki je povezana z začetkom mitoze (Konkel in sod., 2001). Toksin na ta način povzroči nepravilen razvoj epitelne celice, ki se postopoma raztegne in kot taka nima sposobnosti absorbcije, kar vodi v smrt celice (Pickerett in sod., 1996). Kdaj pride do izločanja toksina CDT, ali pred kontaktom bakterije s gostiteljsko celico, ob pripenjanju ali po invaziji, še ni poznano (Crushell in sod., 2004).
2.5 VPLIV RAZLIČNIH STRESOV NA BAKTERIJSKE CELICE
2.5.1 Stres
Ob zadostni količini hranil, optimalni temperaturi, vrednosti pH in koncentraciji kisika se celice razmnožujejo z maksimalno hitrostjo rasti, značilno za ta mikroorganizem.
Sprememba kateregakoli od teh parametrov vpliva na maksimalno rast celic in na ta način predstavlja stres za mikroorganizme. Sposobnost mikroorganizmov, da zaznajo in (pravilno) odgovorijo na nagle spremembe v okolju, je zelo pomembna za njihovo preživetje. V realnosti in izven laboratorija so le redkokje pogoji za idealno rast mikroorganizmov (Moat in sod., 2002).
Potencijalni načini preživetja C. jejuni v stresnih pogojih so prehod v živo, vendar nekultivabilno stanje, prehod spiralno zavitih celic v kokoidno obliko in velika genetska heterogenost (Murphy in sod., 2003).
Murphy s sod. (2003) navaja, da določeni sevi C. jejuni (predvsem izolirani iz narave), med rastjo v okolje izločajo spojine, ki delujejo zaščitno pri kislinskem in toplotnem stresu. Zanimivo je, da lahko snovi delujejo zaščitno na vse seve, tudi na tiste, ki jih sami ne izločajo. Dodaten mehanizem, ki prispeva k preživetju C. jejuni v neugodnih pogojih, je celično signaliziranje (angl. Quorum sensing, QS). Genom C. jejuni vsebuje gen za protein LuxS, ki je pomemben za tvorbo signalnih molekul (Murphy in sod., 2003).
2.5.2 Živost in kultivabilnost bakterij rodu Campylobacter
Živost celice definira prisotnost celičnih struktur, intaktne membrane, ki ločuje celično vsebino od zunaj celičnih snovi, transkripcije in translacije, proizvajanja energije za vzdrževanje celičnega metabolizma, torej biosinteze proteinov, sinteze nukleinskih kislin, polisaharidov in drugih celičnih komponent ter celično rast in razmnoževanje (Breeuwer in Abee, 2000).
V stresnih okoljskih razmerah se kampilobakterji lahko zaščitijo z vsaj dvema fiziološkima oblikama. Prva oblika so biofilmi, strukturirane združbe mikrobnih celic, ujete v polimerni matriks, ter druga oblika, prehod v živo, vendar nekultivabilno stanje.
Tvorba biofilmov je eden od načinov preživetja v težkih pogojih. Domneva se, da je C. jejuni sposoben tvorbe biofilmov na abiotskih površinah kot je nerjaveče jeklo, steklo in v vodnem okolju. Nastalo mikrookolje znotraj biofilma varuje celice C. jejuni pred oksidativnim stresom. Na ta način so celice C. jejuni sposobne preživeti en teden pri 10 ºC kljub pomanjkanju hranil (Murphy in sod., 2006).
V neugodnih okoljskih razmerah si kampilobakterji skušajo zagotoviti večjo možnost preživetja tudi s prehodom v živo, vendar nekultivabilno stanje VBNC (VBNC: viable but non-culturable). VBNC stanje celic je bilo opisano že pri mnogih patogenih
mikroorganizmih, vključno z bakterijami Listeria monocytogenes, Vibrio cholera, Helicobacter pylori, Salmonella typhi in Escherichia coli.
Stanje VBNC sta pri C. jejuni prvič opisala Rollins in Colwell (1986) in od takrat se pojavljajo številne polemike o tem, če oblika VBNC kampilobakterjev res obstaja. Glede na izredno občutljivo naravo kampilobakterjev lahko povzročimo izgubo kultivabilnosti z izpostavitvijo organizmov kisiku, s spremembo temperature ali pomanjkanjem hranil (Park, 2002). VBNC je fiziološko stanje bakterij, v katerem celice ostanejo infektivne, vendar niso več sposobne celične delitve oz. rasti na standardnih gojiščih, na katerih bi v idealnih pogojih tvorile kolonije (Cappelier in sod., 1999). Nekateri poskusi z živalskimi modeli so pokazali, da nekultivabilne celice preidejo v kultivabilno obliko, potem ko preidejo skozi živalskega gostitelja in v nekaterih primerih ohranijo virulentnost (Cools in sod., 2003; Cappelier in sod., 1999).
Zmanjšanje živosti in izguba kultivabilnosti po izpostavitvi kampilobakterjev določenim stresnim razmeram (pH, oksidativni stres, pomanjkanje hranil, svetloba, starost celic) je velikokrat povezana s spremembo celične morfologije in sicer s prehodom spiralno zavitih celic v kokoidno obliko (Kelly in sod., 2001; Harvey in Leach, 1998; McDougald in sod., 1998). Ta opažanja so privedla do špekulacij, da je kokoidno stanje v bistvu dormantno VBNC stanje, vendar so številne študije pokazale, da je kokoidno stanje degenerativna oblika celice, saj celice zgubijo zmožnost reprodukcije, zmanjša se metabolna aktivnost, vsebnost nukleinskih kislin (DNK in RNK) in peptidov (Park, 2002).
Po stresu so nekatere celice kokoidne oblike obdane samo s citoplazemsko membrano, medtem ko je zunanja ovojnica (celična stena) precej mlahava. Nekatere celice kokoidne oblike imajo tudi citoplazemsko membrano tako poškodovano, da puščajo celično vsebino v okolje (Harvey in Leach, 1998).
2.5.3 Stradanje
Pomanjkanje hranilnih snovi v okolju predstavlja najbolj pogosto obliko stresa za bakterije.
Stradanje nastopi, kadar je bakterijam omejena razpoložljivost hranljivih snovi, ene ali večih aminokislin (zamenjava obogatitvenega gojišča z minimalnim) ali ko izčrpajo primarni vir ogljika. Takrat pride do začasne ustavitve rasti in do hitre prilagoditve metabolizma, zmanjša se metabolna aktivnost, akumulacija RNA in replikacija DNK, prav tako pride do zmanjšanja sinteze biomolekul (Moat in sod., 2002). Stradanje spremljajo temeljite strukturne in fiziološke spremembe, ki prispevajo k povečani odpornosti proti temperaturnemu, oksidativnemu, ozmotskemu in kislinskemu stresu. Številnim patogenim bakterijam ta prilagoditev omogoča preživetje fizikalno-kemijskih postopkov obdelave med pridelavo, predelavo, skladiščenjem in distribucijo živil (Park, 2001). Celice C. jejuni, ki so bile izpostavljene stradanju, kažejo povečano odpornost proti toplotnemu stresu (Cappelier in sod., 2000).
Pri daljšem stradanju se bakterijske celice skušajo prilagoditi z zmanjšanjem celičnega volumna (zaradi česar se jim poveča površina, s katero komunicirajo z okoljem), z razgradnjo celičnih proteinov in maščobnih kislin, zmanjšanjem števila ribosomov, spremembo lipidne sestave citoplazemske membrane, z relativnim povečanjem lipopolisaharidov v zunanji membrani ter s kondenzacijo DNK molekule, s čimer jo zaščitijo. Med stradanjem je znižana tudi sinteza proteinov (Moore, 2001; Moat in sod., 2002). Te spremembe spremlja še akumulacija najmanj dveh celičnih nukleotidov, cikličnega AMP (cAMP) in guanozin 3,5 –difosfata (ppGGpp) (Moat in sod., 2002).
V stradanih bakterijskih celicah so odkrili dve vrsti proteinov stradanja in sicer proteine Cst in proteine Pex. Matin (1992) ter Schultz in sod. (1988) sta pokazala, da proteini Cst sodelujejo pri asimilaciji hranilnih snovi v celici, medtem ko proteini Pex preko proteolitične aktivnosti tvorijo dostopne aminokisline za izgradnjo novih proteinov.
Kot odgovor na stradanje bakterijske celice proizvajajo razgradne encime, ki celici takoj pomagajo metabolizirati nekatera hranila. Celica najprej izkorišča enostavna hranila, zatem začne izkoriščati bolj kompleksne substrate iz okolja. Če preprečimo sintezo proteinov
stradanja, bodisi z mutacijo ali z dodatkom inhibitorjev, se celice ne morejo prilagoditi na pogoje stradanja (Cappelier in sod., 2000).
Nekatere bakterije se pred neugodnimi okoljskimi pogoji zaščitijo s tvorbo spor ali s prehodom v živo, vendar nekultivabilno stanje. Campylobacter jejuni med stradanjem lahko preide v stanje VBNC, v katerem je metabolno aktiven in sposoben povzročiti infekcijo (Cools in sod., 2003).
Regulacija proteinov stradanja pri bakterijah Escherichia coli poteka preko sigma faktorja σs (RpoS), pomembnega za preživetje celic v stacionarni fazi in med izpostavitvijo neugodnim pogojem (Kelly in sod., 2001). Pri C. jejuni ni prisoten homolog RpoS in so zato celice v stacionarni fazi bolj občutljive na stres (Parkhill in sod., 2000).
2.5.4 Toplotni stres
Bakterije so sposobne rasti pri različnih temperaturah. Nekatere termofilne bakterije so sposobne rasti tudi pri temperaturi 90 ºC, psihrofili pri temperaturi pod 0 ºC in mezofili pri temperaturah od 20 do 40 ºC. Optimalna temperatura rasti bakterij Campylobacter pa je 42 – 43 °C, zato jih prištevamo med termotolerantne bakterije (Moat in sod., 2002).
Bakterije vrste C. jejuni so relativno občutljive na visoko temperaturo, saj se njihova vrednost D55 giblje od 0,6 do 2,3 minute (Nguyen in sod., 2006). Odziv celic na zvišano temperaturo je še posebej zanimiv, saj se običajno uporablja visoka temperatura pri postopkih kot je blanširanje, pasterizacija in sterilizacija v proizvodnji mikrobiološko neoporečnih, kakovostnih, varnih in obstojnih živil. Zmanjšanje števila bakterij ali njihova inaktivacija se dosega z uporabo vode, pare, zraka, električne energije, svetlobe, ultrazvoka ali mikrovalov ( Abee in Wounters, 1999).
V celici je veliko tarčnih mest občutljivih na toploto, med katerimi so najpomembnejši ribosomi, citoplazemski in membranski proteini, nukleinske kisline, encimi. Ribosomi lahko zaradi koagulacije beljakovinskih podenot pri povišani temperaturi izgubijo
sekundarno in terciarno strukturo. Toplota prav tako povzroči poškodbe na celični membrani in s tem inaktivira bakterijsko celico, čeprav glavni vzrok celične smrti še vedno ni natančno pojasnjen (Abee in Wounters, 1999).
Bakterije se skušajo prilagoditi povišani temperaturi z indukcijo genov, ki kodirajo proteine toplotnega stresa (angl. Heat Shock Proteins, HSP). Njihova sinteza se spreminja v odvisnosti od temperature, vendar se zelo pospeši pri naglem povišanju temperature (Konkel in sod., 1998). Poleg toplotnega stresa njihovo sintezo inducirajo tudi drugi stresi iz okolja, kot so kislinski in oksidativni stres. Pomembni so pri preživetju znotraj makrofagov, zaradi česar sklepajo, da HSP ne pomagajo celici le pri termotoleranci in drugih stresih, ampak tudi pri preživetju v gostitelju po infekciji (Abee in Wounters, 1999).
Bistvena funkcija HSP med izpostavitvijo stresu je šaperonsko delovanje ali proteazno delovanje (proteoliza nepravilno zvitih proteinov). Šaperoni se vežejo na nepravilno zvite ali nezvite proteine in na ta način preprečujejo nepravilno zvijanje toplotno občutljivih celičnih proteinov. Vezava in sprostitev proteinskih substratov je odvisna od hidrolize ATP. Poškodovane citoplazemske proteine, ki jih z delovanjem šaperonov ni bilo mogoče popraviti, proteazni kompleksi razgradijo ter odstranijo iz celice (Konkel in sod., 1998;
Brøndsted in sod., 2005).
Slika 5: Mehanizem delovanja proteinov toplotnega stresa (Abee in Wouters, 1999).
Neaktivne proteine prepoznajo proteaze (1) ali šaperonski kompleksi (2), ki vodijo v razgradnjo proteinov na manjše peptide (1) ali tvorijo aktivne in toplotno stabilne proteine (2).
Glede na molekulsko maso so HSP proteini razdeljeni v različne družine: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 in nizkomolekularne HSP (Santorno, 2000).
Po izpostavitvi toplotnemu stresu pride pri kampilobakterjih do sinteze najmanj 24 proteinov toplotnega stresa, nekaj od njih je indentificiranih kot GroEL, DnaJ, DnaK in Lon proteaze (Konkel in sod., 1998; Park, 2002). Analiza genoma C. jejuni je omogočila identifikacijo dodatnih proteinov toplotnega stresa, npr. HrcA, GrpE, in HspR (Park, 2002; Parkhill in sod., 2000).
Pri kampilobakterjih so odkrili tri možne regulatorne sisteme, ki kontrolirajo indukcijo odgovora na toplotni stres in nastanek proteinov toplotnega stresa: regulator RacRS – izražanje proteinov pri 37 °C in 42 °C, HrcA in HspR (Parkhill in sod., 2000; Kelly in sod., 2001). Med vsemi proteini toplotnega stresa je edino za protein DnaJ dokazana vloga v patogenezi C. jejuni, saj je bil mutant gena DnaJ nesposoben kolonizacije črevesja piščancev (Konkel in sod., 1998; van Vliet in Ketley, 2001; Stintzi, 2003).
2.5.5 Oksidativni stres
Bakterije rodu Campylobacter so mikroaerofilne bakterije, kar pomeni, da je njihova sposobnost preživetja v aerobnih pogojih odvisna od celičnih mehanizmov odstranjevanja škodljivih reaktivnih kisikovih zvrsti (Purdy in sod., 1999; van Vliet in Ketley, 2001).
Do oksidativnega stresa pride ob izpostavitvi celic reaktivnim kisikovim zvrstem, kot so npr. superoksidni anion (O2•-), vodikov peroksid (H2O2) in hidroksilni radikal (HO•), ki lahko poškodujejo nukleinske kisline, proteine, lipide in celične membrane. Poleg njih lahko nastanejo še druge toksične spojine, kot so hipoklorova kislina (HOCl), reaktivni dušikov oksid (NO·), peroksinitrit (HOONO) in nitrozotioli (RSNO) (Storz in Imlay, 1999).
Reaktivne kisikove zvrsti se tvorijo tudi med normalnim celičnim metabolizmom (respiratorna veriga, številne reakcije, katalizirane z oksidazami, kjer nastaja kot produkt vodikov peroksid) (Day in sod., 2000; van Vliet in Ketley, 2001). Perokside mora celica učinkovito odstraniti, saj v največji meri prispevajo k nastanku toksičnih hidroksilnih radikalov (van Vliet in sod., 2002).
Najbolj toksičen hidroksilni radikal (HO·) nastaja ob prisotnosti železa (Purdy in sod., 1999).
H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + HO· + H2O ... (1) Bakterije se pred oksidativnim stresom poskušajo zaščititi tako, da sintetizirajo encime, ki popravljajo škodo, narejeno s kisikovimi spojinami in encime, ki reagirajo s toksičnimi spojinami in jih na ta način deaktivirajo (Storz in Imlay, 1999).
Primarno obrambo pred oksidativnim stresom predstavljajo encimi: superoksid dismutaza, katalaza, peroksidaza in glutation reduktaza (Purdy in sod., 1999).
Superoksid dismutaza (SOD) je metaloencim, ki katalizira pretvorbo superoksidnega aniona v kisik in vodikov peroksid:
2O2- + 2H+ → H2O2 + O2 ... (2) SOD je prisoten v citoplazmi prokariontskih in evkariontskih organizmov in domneva se, da je prvi, ki sodeluje pri obrambi proti toksičnim ROS. Encim kodira gen sodB in je prisoten pri večini aerobnih mikroorganizmov (Purdy in sod., 1999). Encim je bistvenega pomena ne samo za preživetje kampilobakterja, izpostavljenega oksidativnemu stresu, ampak tudi pri znotrajceličnem preživetju v evkariontskih celicah (Purdy in sod., 1999).
SOD encimi se med seboj razlikujejo po kofaktorju. Kofaktor je lahko baker–cink (Cu/ZnSOD), nikel (NiSOD), mangan (MnSOD) ali železov ion (FeSOD). Bakterije večinoma vsebujejo dva takšna encima; MnSOD (SodA) ali FeSOD (SodB), medtem ko je pri kampilobakterjih prisoten samo FeSOD. Pri kampilobakterjih, ki tega encima nimajo, je zmanjšana sposobnost kolonizacije črevesja pri piščancih (van Vliet in sod., 2002).
Z delovanjem superoksid dismutaze in med normalnim celičnim metabolizmom nastane vodikov peroksid (H2O2), ki ga nato encim katalaza (KatA) odstrani. Katalaza je tudi metaloencim, ki vsebuje železov ion.
Obe bakteriji, tako C. coli kot C. jejuni, imata samo en gen, ki kodira katalazo in sicer je to gen katA. Izražanje gena katA je regulirano s stradanjem, osmotskim in oksidativnim stresom. Katalaza ščiti celice pred oksidativnim stresom s tem, da katalizira razgradnjo vodikovega peroksida do kisika in vode.
2H2O2 → 2H2O +O2 ... (3) Izražanje gena katA regulirata regulator PerR in izpostavljenost bakterijskih celic vodikovem peroksidu (van Vliet in sod., 2002). Čeprav je C. coli zelo občutljiv na H2O2, z mutacijo gena katA nima zmanjšane odpornosti na kisik ali sposobnosti kolonizacije črevesja pri piščancih (van Vliet in Ketley, 2001).
Prav tako se v bakterijskih celicah sintetizira encim glutation peroksidaza, ki je odgovoren za redukcijo oksidiranega glutationa in vzdrževanje razmerja med oksidiranim in reduciranim glutationom v celici (Moat in sod., 2002).
V celici so prisotni tudi encimi, katerih vloga je pomembna predvsem pri popravljanju poškod na DNK, ter nekaj ostalih encimov, katerih delovanje še ni popolnoma pojasnjeno (Purdy in sod, 1999).
Slika 6a: Shematski prikaz mehanizma oksidativnega stresa (Storz in Imlay, 1999).
