LOKALIZACIJA ENCIMA ACC-OKSIDAZE V PLODOVIH PARADIŽNIKA (SOLANUM LYCOPERSICUM)

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA

NEJA LAVRIČ

LOKALIZACIJA ENCIMA ACC-OKSIDAZE V PLODOVIH PARADIŽNIKA (SOLANUM LYCOPERSICUM)

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2018

(2)

DVOPREDMETNI UČITELJ: BIOLOGIJA- GOSPODINJSTVO

NEJA LAVRIČ

Mentor: doc. dr. SIMONA STRGULC KRAJŠEK Somentor: dr. ALEŠ KLADNIK

LOKALIZACIJA ENCIMA ACC-OKSIDAZE V PLODOVIH PARADIŽNIKA (SOLANUM LYCOPERSICUM)

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2018

(3)

Lavrič, N. Lokalizacija encima ACC-oksidaze v plodovih paradižnika (Solanum lycopersicum). Diplomsko delo.

Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2018.

i

Diplomsko delo je zaključek prvostopenjskega študijskega programa Dvopredmetni učitelj:

biologija in gospodinjstvo. Opravljeno je bilo na Katedri za botaniko in fiziologijo rastlin na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Komisija za zagovor in oceno:

Predsednica: doc. dr. Jasna Dolenc Koce

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Član: doc. dr. Matevž Likar

Mentor: doc. dr. Simona Strgulc Krajšek

Somentor: dr. Aleš Kladnik

Datum zagovora:

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.

Neja Lavrič

(4)

ii

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK

KG ACC-oksidaza/ etilen/ zorenje plodov/ paradižnik/ Solanum lycopersicum/

imunolokalizacija AV LAVRIČ, Neja

SA STRGULC KRAJŠEK, Simona (mentorica), KLADNIK, Aleš (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta LI 2018

IN LOKALIZACIJA ENCIMA ACC-OKSIDAZE V PLODOVIH PARADIŽNIKA (SOLANUM LYCOPERSICUM)

TD Diplomsko delo

OP VIII, 23 str., 7 sl., 24 vir.

IJ sl JI sl/en

(5)

iii

KEY WORDS DOCUMENTATION

ŠD Dn

DC

CX ACC-oxidase/ ethylene/ fruit ripening/ tomato/ Solanum lycopersicum/

immunolocalization AU LAVRIČ, Neja

AA STRGULC KRAJŠEK, Simona (supervisor), KLADNIK, Aleš (co-supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

PB University of Ljubljana, Faculty of Education PY 2018

IN LOCALIZATION OF THE ACC-OXIDASE ENZYME IN THE TOMATO (SOLANUM LYCOPERSICUM) FRUIT

DT Graduation Thesis NO VIII, 23 p., 7 fig., 24 ref.

LA sl AL sl/en

(6)

iv

ZAHVALA

Zahvaljujem se moji mentorici doc.dr. Simoni Strgulc Krajšek za sodelovanje in pomoč.

Iskreno se zahvaljujem svojemu somentorju dr. Alešu Kladniku za vso strokovno pomoč pri izdelavi diplomske naloge in za čas, ki mi ga je namenil.

Zahvalila bi se tudi sestri Katji, Gregorju in Ani za pomoč pri urejanju diplomskega dela.

Posebno pa bi se rada zahvalila svojemu fantu Gašperju, družini in prijateljem, ki so me tekom celotnega študija podpirali, spodbujali in mi vedno stali ob strani.

(7)

v

POVZETEK

Etilen je majhna plinska molekula, ki so jo raziskovalci odkrili v 19. stoletju in jo kasneje prepoznali kot prvi rastlinski hormon. Njena vloga je najbolj prepoznavna v biologiji rastlin, saj sodeluje v različnih procesih tekom celotnega življenjskega cikla rastline. Ti procesi vključujejo kalitev rastline, razvoj korenin in cvetov, zorenje plodov, senescenco, abscizijo in odgovore rastline tako na biotske (patogeni) kot na abiotske dejavnike (poškodba rastline, pomanjkanje kisika, mraz, poplave in suše). Sintetizira se iz prekurzorja 1-aminociklopropan- 1-karboksilne kisline (ACC), njegovo pretvorbo pa katalizira encim ACC-oksidaza. ACC- oksidazo najdemo tako v vegetativnih, kakor v reproduktivnih tkivih rastline. Z raziskavo smo želeli ugotoviti, katera so specifična mesta, kjer se nahaja ACC-oksidaza v plodovih paradižnika. Encim smo lokalizirali z metodo imunolokalizacije z uporabo specifičnih primarnih protiteles proti ACC-oksidazi in raziskali, kako vpliva uporaba različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov. Z imunolokalizacijo se obarvajo specifična mesta, kjer se nahaja ACC-oksidaza, predvsem na bazi ploda in v predelu žil v plodu ter v peclju ploda. Z uporabo različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov smo opazili razlike v jakosti specifičnega obarvanja in količini nespecifičnega barvanja ozadja. Najmočnejši specifičen signal in hkrati najmanj nespecifično barvanje ozadja smo dobili z uporabo citratnega pufra pH 6 v postopku povrnitve antigenov. Kontrolne preparate smo barvali z uporabo neimunega seruma namesto z specifičnimi primarnimi protitelesi. V kontrolnih preparatih nismo zaznali specifičnega obarvanja.

(8)

vi

ABSTRACT

Ethylene is a small gaseous molecule that was discovered in the 19th century and was later recognized as the first plant hormone. It plays an important role in plant biology because it is involved in many aspects of the plant life cycle, including seed germination, root and flower development, fruit ripening, senescence, abscission and responses to biotic ( pathogen attack) and abiotic (wounding, hypoxia, chilling, floods and droughts) stresses. Ethylene is synthesized from 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) where the reaction is catalyzed by the enzyme ACC oxidase. ACC oxidase is expressed in all vegetative and reproductive plant tissues. The aim of the study was to find out the location of ACC oxidase in the developing fruit of tomato. To localize the enzyme, we used immunolocalization with specific primary antibodies against ACC oxidase and examined the effect of different buffers in antigen retrieval. Using immunolocalization we detected ACC oxidase specifically inside the fruit and in the vascular region of the fruit and fruit pedicel. In the step of antigen retrieval during the immunolocalization process we used three different buffers that resulted in differences in the intensity of specific staining and the amount of nonspecific background staining. The strongest specific staining with the lowest background was achieved by using citrate buffer pH 6 in the step of antigen retrieval. Negative controls were stained using the nonimmune serum instead of specific primary antibodies. No specific staining was observed in the control sections.

(9)

vii

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ... 1

2 TEORETIČNI DEL ... 2

2.1 PARADIŽNIK (SOLANUM LYCOPERSICUM) ... 2

2.2 ETILEN ... 3

2.2.1 BIOSINTEZA ETILENA ... 4

2.2.2 VLOGA ETILENA PRI ZORENJU PLODOV ... 5

2.3 ACC-OKSIDAZA ... 6

2.4 IMUNOLOKALIZACIJA ... 8

3 NAMEN DELA IN RAZISKOVALNA VPRAŠANJA ... 10

4 MATERIALI IN METODE ... 11

4.1 IMUNOLOKALIZACIJA ... 11

4.1.1 Odstranitev voska in rehidracija preparatov ... 11

4.1.2 Povrnitev antigenov v vreli kopeli ... 11

4.1.3 Blokiranje nespecifičnih vezavnih mest za protitelesa ... 11

4.1.4 Inkubacija s primarnimi protitelesi proti ACC- oksidazi ... 12

4.1.5 Spiranje ... 12

4.1.6 Inkubacija s sekundarnimi protitelesi, označenimi z alkalno fosfatazo ... 12

4.1.7 Spiranje ... 12

4.1.8 Detekcija ... 12

4.1.9 Dehidracija ... 13

4.1.10 Priprava trajnega preparata s smolo Permount ... 13

4.2 PREGLED PREPARATOV IN IZDELAVA SLIK ... 13

5 REZULTATI Z RAZPRAVO ... 14

6 SKLEPI ... 19

7 ZAKLJUČEK ... 20

8 LITERATURA ... 21

(10)

viii

KAZALO SLIK

Slika 1: Ena izmed prvih ilustracij paradižnika (Solanum lycopersicum) v Evropi (Knapp in Peralta, 2016). ... 2 Slika 2: Postopek biosinteze etilena (Štraus, 2016). ... 4 Slika 3: Aktivnost ACC- oksidaze (■) tekom zorenja plodov kakija (Zheng, Nakatsuka, Taira in Itamura, 2005). ... 7 Slika 4: Imunolokalizacija ACC-oksidaze v plodu paradižnika z uporabo različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov: s citratnim pufrom pH 6 (A), Tris-EDTA pH 9 (B) in brez povrnitve antigenov v pufru PBS (C). S črno puščico so označena specifična mesta nahajanja ACC-oksidaze, z belo puščico pa mesta nespecifičnega barvanja. ... 15 Slika 5: Imunolokalizacija ACC-oksidaze v plodu paradižnika z uporabo citratnega pufra pH 6 v postopku povrnitve antigenov (A) in kontrola imunolokalizacije z uporabo neimunega kozjega seruma (B). ... 16 Slika 6: Imunolokalizacija ACC-oksidaze v plodu paradižnika z uporabo Tris-EDTA pufra pH 9 v postopku povrnitve antigenov (A) in kontrola imunolokalizacije z uporabo neimunega kozjega seruma (B). ... 17 Slika 7: Imunolokalizacija ACC-oksidaze v plodu paradižnika brez postopka povrnitve antigenov, samo z inkubacijo v PBS pufru na sobni temperaturi (A) in kontrola

imunolokalizacije z uporabo neimunega kozjega seruma (B). ... 18

(11)

Lavrič, N. Lokalizacija encima ACC-oksidaze v plodovih paradižnika (solanum lycopersicum). Diplomsko delo.

1

1 UVOD

Dandanes je paradižnik ena izmed najpogostejših vrst kulturnih rastlin, ki jo gojijo povsod po svetu. Uporabljamo jo tako v prehranske kakor v raziskovalne namene. S prehranskega vidika je paradižnik pomemben predvsem zaradi vsebnosti antioksidantov in likopena, ki naj bi preprečeval nastanek rakastih obolenj. V zadnjih letih ga veliko uporabljajo v raziskovalne namene, predvsem v raziskavah o vlogi etilena pri zorenju plodov z namenom ohranjanja svežih pridelkov v prehranski industriji.

Etilen je majhna plinska molekula, ki ima pomembno vlogo v življenjskem ciklu rastline, saj sodeluje pri rasti, razvoju in preživetju rastline. Pri klimakteričnih plodovih, kot je paradižnik, je etilen tisti, ki sproži proces zorenja, to pa hkrati povzroči povečano biosintezo etilena. V biosintezi etilena sodeluje več encimov, med katerimi je tudi ACC-oksidaza. Ta je tako eden izmed ključnih encimov, ki uravnavajo proizvodnjo etilena. Najdemo jo lahko tako v vegetativnih, kakor tudi v reproduktivnih tkivih rastline, vendar pa njena regulacija in specifična mesta še vedno niso dobro raziskana.

(12)

2

2 TEORETIČNI DEL

2.1 PARADIŽNIK (SOLANUM LYCOPERSICUM)

Paradižnik (Solanum lycopersicum L.) originalno izvira iz Andov, od koder so ga v 16. stoletju uvozili v Evropo in je danes eden izmed najbolj razširjenih vrst kulturnih rastlin na svetu. S prehranskega vidika velja za zaščitno zelenjavo, predvsem zaradi njegove posebne hranilne vrednosti, saj vsebuje likopen, beta-karoten, flavonoide in vitamin C. V zadnjih letih je njegova uporaba še bolj narasla, saj so odkrili, da je likopen antioksidant in preprečuje nastanek rakastih obolenj (Gerszberg, Hnatuszko- Konka, Kowalczyk in Kononowicz, 2015).

Slika 1: Ena izmed prvih ilustracij paradižnika (Solanum lycopersicum) v Evropi (Knapp in Peralta,

2016).

Spada v družino razhudnikovk (Solanaceae), kamor uvrščamo preko 3000 vrst, med drugimi tudi nekatere ekonomsko pomembne vrste kot so krompir, jajčevec, tobak in paprika. V zadnjih letih ga veliko znanstvenikov uporablja v raziskovalne namene, predvsem zaradi odkritja njegovega celotnega genoma pa tudi zaradi njegove sposobnosti, da raste v različnih okoljih, ima relativno kratek življenjski cikel in zaradi obstoja velikega števila mutant, ki so nastale bodisi spontano ali nadzorovano v laboratoriju (Gerszberg, Hnatuszko-Konka, Kowalczyk in Kononowicz, 2015). Zaradi navedenih razlogov bo v tej diplomski nalogi predmet preučevanja ravno paradižnik.

(13)

3 2.2 ETILEN

V 19. stoletju so za osvetlitev v uličnih svetilkah uporabljali premogovni plin, ki je povzročil, da so listi na drevesih v bližini uličnih svetilk začeli prej odpadati kot sicer. Dimitry Neljubov je takrat v svojem laboratoriju odkril nenavadno rast svojih sadik (krajše z bolj odebeljenim steblom) zaradi uhajajočega plina svoje svetilke in tako zaključil, da je etilen tista komponenta premogovnega plina, ki povzroča spremenjeno rast in razvoj rastlin. Tako so raziskovalci začeli z raziskavami o vlogi etilena, kar je privedlo do tega, da je leta 1934 Richard Gane odkril, da rastline tudi same proizvajajo etilen. Povezava biosinteze etilena z njegovo biološko aktivnostjo je bila tako velik korak, da je prepričala raziskovalce, da so odkrili prvi rastlinski hormon (Chang, 2016).

Etilen je majhna plinska molekula, ki jo največkrat uporabljajo za proizvodnjo produktov, kot so plastični izdelki, detergenti in drugi izdelki iz polietilena. Igra pa tudi veliko vlogo v biologiji rastlin. Nadzoruje različne procese v rasti, razvoju in preživetju rastline tekom njenega celotnega življenjskega cikla. Sodeluje pri kalitvi rastline, razvoju korenin in cvetov, zorenju plodov, senescenci in odgovorih rastline tako na biotske dejavnike, kot so patogeni, kakor tudi na abiotske dejavnike, kot so poškodba rastline, pomanjkanje kisika, mraz, poplave in suše. Tekom poplav etilen sproži nastanek aerenhimskih tkiv v rastlini, da se lažje oskrbuje s kisikom. Vendar pa lahko povečana raven etilena v nekaterih primerih rastlini tudi škoduje.

Če je rastlina izpostavljena stresu, kot so suše, poplave, mraz, vročina, pomanjkanje nutrientov ali pa je poškodovana, lahko visoke ravni etilena zavirajo rast in zdravje rastlin (Chang, 2016; Lin, Zhong in Grierson, 2009; Rudus, Sasiak in Kepczynski, 2013).

Etilen vpliva tudi na abscizijo, ki je proces, kjer se listi, cvetovi in plodovi ločijo od matične rastline. Abscizija se odvija v posebnem območju imenovanem abscizijska plast, ki se običajno nahaja na bazi organa, ki bo odpadel, v primeru paradižnika pa je lahko tudi na sredini peclja (Chersicola, Kladnik, Tušek Žnidarič, Lers in Dermastia, 2018; Tucker in Kim, 2015).

Njegova vloga je najbolj prepoznavna pri zorenju klimakteričnih plodov kot so paradižniki, banane, breskve in jabolka. Če dozorelo banano postavimo v vrečko z nedozorelim avokadom, bo avokado zaradi etilena, ki se sprošča iz banane, hitreje dozorel. Etilen pa se danes vedno več uporablja tudi v komercialne namene. Z povečanjem ali zmanjšanjem

(14)

4

biosinteze etilena poskušajo ustvariti rastline, ki so bolj odporne in imajo bolj privlačne značilnosti (Chang, 2016; Lin, Zhong in Grierson, 2009; Rudus, Sasiak in Kepczynski, 2013).

2.2.1 BIOSINTEZA ETILENA

Uporaba etilena pri zorenju plodov je spodbudila znanstvenike, da so se bolj poglobili v samo biosintezo etilena. Rastline sintetizirajo etilen preko treh korakov. Metionin se s pomočjo encima S-adenozil metionin (S-AdoMet)-sintaze pretvori v S-AdoMet, ki je prekurzor za biosintezo etilena. Encim aminociklopropankarboksilat (ACC)-sintaza nato pretvori S- AdoMet v ACC. V tej reakciji kot odpadni produkt nastane tudi 5'-metiltioadenozin (MTA), ki se reciklira in ponovno uporabi za proizvodnjo metionina. To omogoča kontinuirano proizvodnjo etilena brez povečane potrebe po metioninu. ACC se nato oksidira s pomočjo encima ACC oksidaze v etilen, nastane pa tudi CO2 in cianid. Zaradi visokih vrednosti tekom biosinteze etilena se toksičen cianid nato pretvori v β-cianoalanin (Wang, Li in Ecker, 2002;

Rudus, Sasiak in Kepczynski, 2013).

Slika 2: Postopek biosinteze etilena (Štraus, 2016).

V rastlinah so določili dva sistema biosinteze etilena. Tako imenovan sistem 1 deluje tekom normalne rasti in med razvojem ter med odgovori rastline na zunanje dejavnike. Sistem 2 pa med staranjem cvetov in zorenjem plodov (Barry in Giovannoni, 2007).

(15)

5

Sistem 1 je odgovoren za produkcijo minimalnih ravni etilena in ga lahko odkrijemo v tkivih tako v klimakteričnih, kakor tudi v neklimakteričnih plodov. Sistem 1 je avtoinhibitoren in naj bi deloval tekom rasti plodov, medtem ko je sistem 2 avtokatalitičen in deluje med zorenjem klimakteričnih plodov. Sistem 1 se zanaša na dva gena ACC-sintaze, ki sta oba negativno regulirana s strani etilena, sistem 2 pa se aktivira s pomočjo drugih dveh genov ACC-sintaze.

V sistemu 1 sta gena ACO1 in ACO4 izražena v nizkih vrednostih v nezrelem zelenem paradižniku, vendar pa se tekom klimakteričnega zorenja njuno izražanje viša in tako pripomore k prehodu na sistem 2 (Liu, Pirello, Chervin, Roustan in Bouzayen, 2015).

2.2.2 VLOGA ETILENA PRI ZORENJU PLODOV

Zorenje plodov je kompleksen in genetsko programiran proces, ki plodu spremeni barvo, teksturo, okus in aromo. Prav zaradi tega je vloga etilena pri zorenju plodov še posebej raziskovana tako na biokemijskem, kakor na genetskem področju. Njegovo vlogo so poznali že stari Egipčani, ki so namerno poškodovali plodove fige, da so prej dozorele in prav tako stari Kitajci, ki so za zorenje hrušk uporabljali dim, ki vsebuje etilen (Bakshi, 2015;

Aleksander in Grierson, 2002).

Plodove lahko glede na mehanizem zorenja razvrstimo v dve kategoriji in sicer v klimakterične in neklimakterične plodove. Klimakterični plodovi, kot so paradižnik, jabolko, breskev in banana za svoje zorenje potrebujejo etilen, medtem ko neklimakterični plodovi, kot so citrusi, grozdje in jagoda, za zorenje ne potrebujejo etilena. Vendar pa tako kot pri vsaki razvrstitvi tudi pri tej obstajajo izjeme, kot je na primer melona, ki jo lahko uvrstimo tako med klimakterične kakor tudi med neklimakterične plodove (Aleksander in Grierson, 2002;

Barry in Giovannoni, 2007).

Nezreli plodovi so po navadi kisli, trdi in zelene barve, kar uporabljajo kot zaščito pred rastlinojedci. Po zorenju je glavni namen plodov, da privabljajo živali, ki jim pomagajo pri razširjanju semen. V veliko primerih je etilen tisti, ki sproži proces zorenja. Encimski razpad celične stene plodove zmehča, pretvorba škroba in aminokislin v sladkor pa naredi plodove sladke. Razvitje novih arom in barv tako bolj privablja živali, da plodove zaužijejo in pripomorejo k razširjanju semen (Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky, Jackson, 2011).

Tekom zorenja klimakteričnih plodov pride do verižne reakcije in sicer etilen sproži zorenje, to pa povzroči povečano biosintezo etilena. Ker je etilen plinski hormon, se tako prosto

(16)

6

razširja med ostalimi plodovi in tudi pri ostalih sproži proces zorenja. Če poberemo ali kupimo še nedozorelo sadje, ga lahko damo v papirnato vrečko, kar bo zaradi kopičenja etilena pospešilo proces zorenja. V industriji veliko plodov naberejo še preden so dozoreli in jih nato skladiščijo v velikih kontejnerjih, kjer je koncentracija etilena višja kot sicer. V drugih primerih pa proizvajalci poskušajo upočasniti proces zorenja plodov in jih tako skladiščijo v prostorih s povišano koncentracijo ogljikovega dioksida. Kroženje zraka prepreči, da bi raven etilena naraščala, ogljikov dioksid pa prepreči biosintezo etilena. Tako na primer skladiščijo jabolka, ki jih poberejo v jeseni in jih prodajajo naslednje poletje (Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky, Jackson, 2011).

Zaradi velike pomembnosti fizičnega izgleda pobranih plodov v prehrambni industriji so znanstveniki začeli genetsko spreminjati signalno pot etilena. Z zaviranjem prevajanja nekaterih genov, odgovornih za biosintezo etilena, so molekularni biologi spremenili plodove paradižnika, da zorijo na ukaz. Plodove poberejo še zelene in takšni ostanejo, dokler jim ne dodajo etilena. Takšna inovacija tako zmanjša količino pokvarjene hrane, s katero se vsakodnevno soočamo (Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky, Jackson, 2011).

2.3 ACC-OKSIDAZA

ACC-oksidaza (ACO) je eden izmed ključnih encimov, ki je potreben za zadnji korak biosinteze etilena, saj katalizira oksidacijo ACC v etilen. Njegovo aktivnost velikokrat dokazujejo in vivo z dovajanjem ACC v tarčna tkiva, vendar njegove prave vloge in vitro niso poznali vse do odkritja paradižnikove cDNA gena pTOM13, ki je zavirala prevajanje tega encima, kar se je pokazalo kot močno upadla biosinteza etilena. Na podlagi tega odkritja so ugotovili, da ACO za svoje delovanje potrebuje kofaktorja askorbat in Fe²⁺ ter CO2 (Charng, Chou, Jiaang, Chen in Yang, 2001; Kende in Zeevaart, 1997).

V višjih rastlinah je produkcija etilena regulirana preko razvojnih in zunanjih signalov.

Tekom razvoja rastline lahko v vegetativnih in reproduktivnih tkivih, v katerih poteka ločitev celic, opazimo povečano koncentracijo etilena. Tekom elongacije se raven etilena zniža in se nato v fazi zorenja plodov ter senescenci listov in cvetov zopet zviša. ACO geni so tako prisotni v vseh vegetativnih (listi, korenina in epikotil) kot tudi v reproduktivnih tkivih (v cvetovih in plodovih). Vendar pa imajo ACO geni drugačno vlogo tekom različnih razvojnih faz rastline. V krompirju sta gena ACO1 in ACO2 izražena predvsem v listih, medtem ko je njuna izraženost v koreninah zelo majhna. V jabolku so ACO geni različno izraženi v

(17)

7

plodovih in listih. ACO1 je dobro izražen tekom zorenja plodov, medtem ko je ACO2 izražen predvsem v mladih plodovih. ACO3 se izrazi v tkivih mladih in starih listov in manj tekom zorenja plodov (Rudus, Sasiak in Kepczynski, 2013).

Encim ACO v paradižniku kodira majhna genska družina, v kateri je 7 ACO genov.

Ekspresija teh genov je tesno povezana s količino etilena, ki ga proizvede rastlina. Čeprav je struktura encima ACO dobro raziskana, pa je mnogo manj znanega o njegovi regulaciji po prevajanju. Med sedmimi ACO geni se v tkivu cvetov in listov najbolj izražata ACO1 in ACO4. Raziskave so pokazale, da se v pecljih cvetov paradižnika gen ACO1 izraža predvsem v citoplazmi celic spremljevalk floema. V plodovih se najbolj izražajo geni ACO1, ACO2 in ACO4. Dva izmed teh (ACO1 in ACO2) najbolj sodelujeta pri regulaciji zorenja plodov, medtem ko se ACO4 vedno bolj izraža tekom celotnega zorenja plodov. Ostali geni ACC- oksidaze se tekom zorenja zelo malo izražajo, kar nakazuje na to, da je njihova vloga pri tem zanemarljiva (Chersiola, Kladnik, Tušek Žnidaršič, Mrak, Gruden in Dermastia, 2017; Liu in sodelavci, 2015).

Aktivnost ACC-oksidaze so prikazali v raziskavi na kakiju (Slika 3), kjer so jo v pobranih plodovih zaznali že po enem dnevu, njena koncentracija pa je bila najvišja po treh dneh.

Koncentracija je po štirih dneh hitro upadla, za tem pa tudi koncentracija etilena. V raziskavo so vključili tudi, kako se v plodovih izražata gena ACO1 in ACO2. V prvih dveh dneh je bila koncentracija izraženega ACO1 zelo nizka. V drugem dnevu je njegova koncentracija močno narasla in taka ostala do konca eksperimenta. Koncentracija ACO2 je malo narasla v drugem in tretjem dnevu, zatem njegove koncentracije ni bilo moč zaznati. Rezultati so pokazali neskladje med močno izraženostjo ACO genov in nizko aktivnostjo encima ACO, kar naj bi potrdilo domnevo o vključenosti tega encima v regulacijo po prevajanju (Zheng, Nakatsuka, Taira in Itamura, 2005).

Slika 3: Aktivnost ACC- oksidaze (■) tekom zorenja plodov kakija (Zheng, Nakatsuka, Taira in Itamura, 2005).

(18)

8 2.4 IMUNOLOKALIZACIJA

Imunolokalizacija je metoda, ki jo uporabljamo za lokalizacijo specifičnih antigenov v tkivih ali celicah. Izkorišča specifično vezavo protitelesa na antigen, da lahko z mikroskopijo odkrijemo mesto vezave. Ta tehnika ima že več kot 70-letno zgodovino. Profesor Albert H.

Coons je bil eden izmed prvih znanstvenikov, ki je uporabil imunofluorescenčno tehniko za odkrivanje bakterij Streptococcus pneumoniae s protitelesi, ki so bila vidna pod UV svetlobo.

Kasneje pa je Nakane s fluorescentnimi markerji označena protitelesa zamenjal z encimi, kar je bilo ključnega pomena za nadaljnji razvoj mnogih imunolokalizacijskih metod, ki jih danes uporablja veliko raziskovalcev in patologov (Taylor in Shi, 2014; Luongo de Matos, Trufelli, Luongo de Matos, Aparecida da Silva Pinhal, 2010).

Glavni cilj fiksacije tkivnih rezin je zamrzniti celice in tkiva v določeni točki v času, tako da vsaka molekula v celici ali v tkivu ostane na svojem originalnem mestu. Sicer metoda kriofiksacije najbolje ohrani vse antigenske lastnosti, vendar za to potrebujemo drago in zelo specifično opremo. Zato se večinoma uporablja kemična fiksacija celic ali tkiv z uporabo aldehidov, saj je enostavna in zanjo ne potrebujemo posebne opreme. Vendar moramo pri tem paziti, da uporabljamo formaldehid ali paraformaldehid, saj lahko glutaraldehid povzroči avtofluorescenco. Priporočljivo je, da se uporablja velika količina raztopine fiksativa glede na količino tkiva, saj bomo le tako najbolje ohranili zmogljivost pufra in se tako izognili nekontroliranemu redčenju fiksativa s celičnim materialom (Hause, Frugier, Crespi, 2006).

Eden izmed glavnih pogojev za uspešno imunolokalizacijo je izbira specifičnih protiteles, ki se dobro vežejo na specifičen antigen. Protitelesa so lahko monoklonska ali poliklonska.

Monoklonska protitelesa prepoznajo le en epitop, ki je sestavljen iz kratke verige aminokislin ali molekul sladkorja, poliklonska telesa pa prepoznajo več epitopov na antigenu. Prednost uporabe poliklonskih protiteles je, da jih naredijo relativno hitro in so cenejša, vendar se lahko vežejo na epitop za nas nepomembnega proteina. Lokalizacija antigena je mogoča le, ko je na primarna protitelesa vezan označevalec. Glede na vezavo označevalca poznamo dve metodi imunolokalizacije, direktno in indirektno. Pri direktni imunolokaliziciji se mora na vsako vrsto primarnih protiteles vezati fluorokrom ali encim. Pri indirektni se na neoznačeno primarno protitelo, ki je vezano na antigen, veže več sekundarnih protiteles, ki imajo vezan označevalec. Indirektne metode so bolj občutljive in lažje za uporabo, saj lahko sekundarna

(19)

9

protitelesa uporabljamo za vezavo na različna primarna protitelesa iz iste vrste živali (Kladnik, 1999, Hoppert in Wrede, 2011).

V imunolokalizaciji se uporabljajo označevalci, ki so fluorescentni ali nefluorescentni. Za fluorescentne markerje se uporablja različne fluorokrome, ki so vezani na protitelesa, za nefluorescentne označevalce pa se namesto fluorokromov uporablja predvsem encime in koloidno zlato. Prednost nefluorokromskih označevalcev je, da so preparati trajni in primerni za shranjevanje, medtem ko fluorescentni označevalci niso. So pa zato metode s fluorescentnimi označevalci hitrejše in bolj občutljive (Kladnik, 1999, Hoppert in Werde, 2011).

Za imunolokalizacijske metode moramo poleg preučevanih preparatov imeti tudi kontrolne.

Pri kontrolnih preparatih namesto primarnih protiteles uporabimo neimun serum iz iste vrste živali, iz katere smo pridobili primarna protitelesa (Kladnik, 1999).

(20)

10

3 NAMEN DELA IN RAZISKOVALNA VPRAŠANJA

Namen diplomskega dela je, da s pomočjo postopka imunolokalizacije ugotovimo, kje se v plodovih paradižnika (Solanum lycopersicum) nahaja encim ACC-oksidaza in kako na detekcijo z imunolokalizacijo vplivajo različni pufri, uporabljeni v postopku povrnitve antigenov.

Pri tem smo si postavili tri raziskovalna vprašanja:

1. Ali encim ACC-oksidazo najdemo le na določenih mestih v plodovih paradižnika z uporabo specifičnih protiteles proti ACC-oksidazi?

2. Ali uporaba različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov vpliva na detekcijo specifičnih mest ACC-oksidaze?

3. Ali se preparati z uporabo neimunega seruma ne barvajo oz. je barvanje nespecifično?

(21)

11

4 MATERIALI IN METODE

V raziskavi smo uporabili 18 tkivnih rezin razvijajočih plodov paradižnika (Solanum lycopersicum). Od tega je bilo 9 rezin kontrolnih, 9 pa preučevanih. Preučevane rezine so bile razdeljene v 3 skupine z različnimi pogoji povrnitve antigenov.

Plodovi paradižnika so bili fiksirani v FAA (formalin, etanol, ocetna kislina) in vklopljeni v vosek. Rezine so bile narezane na mikrotomu in fiksirane na objektnih stekelcih v dveh skupinah na enem stekelcu.

4.1 IMUNOLOKALIZACIJA

Za raziskavo smo uporabili postopek imunolokalizacije, ki je potekal v spodaj opisanih korakih.

4.1.1 ODSTRANITEV VOSKA IN REHIDRACIJA PREPARATOV

Rezinam je bilo potrebno najprej odstraniti vosek. Preparate smo za dvakrat po 5 minut vstavili v Coplinov kozarec s ksilenom, ki raztopi vosek. Po odstranitvi voska je sledila rehidracija preparata. Preparate smo po vrsti prenesli najprej v absolutni etanol, nato v 96%

etanol, 70% etanol in na koncu še v vodo.

4.1.2 POVRNITEV ANTIGENOV V VRELI KOPELI

Po rehidraciji preparatov je sledil postopek povrnitve antigenov v vreli kopeli. Eno skupino preparatov smo inkubirali za 15 minut v vreli kopeli s citratnim pufrom (10 mM natrijev citrat, pH 6), drugo s Tris- EDTA pufrom (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9), tretjo skupino rezin smo inkubirali v PBS pufru (10 mM PBS, pH 7,4) na sobni temperaturi.

4.1.3 BLOKIRANJE NESPECIFIČNIH VEZAVNIH MEST ZA PROTITELESA

Rezine smo obkrožili s PAP pisalom (Liquid Blocker), ki okoli rezin naredi hidrofobno mejo, saj so bile raziskovane in kontrolne rezine na istem stekelcu. Preparate smo nato prekrili z raztopino za blokiranje iz 5% neimunega oslovega seruma v pufru TBST (Tris buffered saline z 0,2% Tween-20) za 30 minut na sobni temperaturi. Inkubacija rezin v neimunem serumu iz iste vrste, kot so sekundarna protitelesa, blokira nespecifična vezavna mesta za protitelesa.

(22)

12

4.1.4 INKUBACIJA S PRIMARNIMI PROTITELESI PROTI ACC- OKSIDAZI

V epruvetko za kontrolne preparate smo zmešali skupaj 3 μL neimunega kozjega seruma in 297 μL raztopine za blokiranje, v epruvetko za preučevane preparate pa 3 μL primarnih kozjih protiteles proti ACC-oksidazi (Anti-ACO) in 297 μL raztopine za blokiranje. Preparatom smo tako dodali raztopini primarnega protitelesa (razredčina 1:100) in jih inkubirali v pripravljenih raztopinah 60 minut na sobni temperaturi. Postavljeni so bili v vlažno komoro, v petrijevko s spodaj navlaženim filtrom, da se med mirovanjem ne izsušijo.

4.1.5 SPIRANJE

Preparate smo sprali v Coplinovem kozarcu s pufrom PBS in nato v zmesi vode in detergenta Tween-20 (dd H2O + 0,2% Tween-20) trikrat po 5 minut na stresalniku.

4.1.6 INKUBACIJA S SEKUNDARNIMI PROTITELESI, OZNAČENIMI Z ALKALNO FOSFATAZO

V epruvetki smo zmešali 600 μL raztopine za blokiranje in 0,6 μL oslovskega anti-kozjega seruma in jo dali na vorteks mešalnik, da se raztopina dobro premeša. Rezinam smo tako dodali raztopino sekundarnih protiteles, označenih z alkalno fosfatazo (razredčina 1:1000) in jih inkubirali v vlažni komori za 30 minut.

4.1.7 SPIRANJE

Preparate smo spirali v Coplinovem kozarcu v zmesi vode in detergenta Tween-20 (dd H2O + 0,2% Tween-20) trikrat po 5 minut na stresalniku.

4.1.8 DETEKCIJA

Preparate smo 5 minut inkubirali v AP-substratnem pufru (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl in 50 mM MgCl₂) in nato odstranili odvečno tekočino. V epruvetko smo zmešali 12 μL substrata NBT/BCIP in 588 μL AP-substratnega pufra. Preparatom smo dodali nastalo raztopino (razredčina 1:50) in jih za 30 minut inkubirali v petrijevki, pokriti z aluminijasto folijo, saj je NTB/BCIP občutljiv na svetlobo. Po pretečenih 15 minutah smo preverili uspešnost barvanja. Po končani inkubaciji smo preparate za 5 minut spirali pod tekočo vodovodno vodo.

(23)

13 4.1.9 DEHIDRACIJA

Rezine smo dehidrirali v 96% in 100% etanolu in jih na koncu za 5 minut postavili v Coplinov kozarec s ksilenom.

4.1.10 PRIPRAVA TRAJNEGA PREPARATA S SMOLO PERMOUNT

Na preparate smo kanili 3 kapljice smole Permount, čimbolj pri robu in nanj zelo počasi spuščali krovno stekelce, da je smola čisto prekrila preparate in da med stekelci ni bilo zračnih mehurčkov. Preparate smo nato pustili v digestoriju čez noč, da so se posušili.

4.2 PREGLED PREPARATOV IN IZDELAVA SLIK

Pregled trajnih preparatov je potekal s svetlobnim mikroskopom Axioskop 2 MOT (Carl Zeiss), na katerem je bila nameščena kamera za zajem slike Axiocam MRc (Carl Zeiss Vision). Po pregledu preparatov smo izbrali najustreznejšo rezino za zajem slike. Zaradi velikosti slike smo vsako rezino slikali v štirih delih, te smo nato s pomočjo vtičnika

»Grid/Collection stitching« v programu Fiji sestavili skupaj v celotno mikrografijo. Kot navajajo Schindelin idr. (2012) je Fiji različica priljubljene programske opreme ImageJ, ki se osredotoča predvsem na analizo bioloških slik oziroma mikrografij. Mikrografije smo nato opremili z merilom.

(24)

14

5 REZULTATI Z RAZPRAVO

V diplomskem delu smo raziskovali, kje se v plodu paradižnika (Solanum lycopersicum) nahaja ACC-oksidaza in kako na njeno detekcijo vpliva uporaba različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov. Pri določitvi lokacije smo uporabili postopek imunolokalizacije s tremi različnimi pufri in sicer s citratnim, Tris-EDTA in PBS pufrom.

ACC-oksidaza je eden izmed najpomembnejših encimov pri biosintezi etilena, saj katalizira oksidacijo ACC v etilen (Charng, Chou, Jiaang, Chen in Yang, 2001). Kot navajajo Rudus, Sasiak in Kepczynski (2013) etilen najdemo tako v vegetativnih kakor v reproduktivnih tkivih rastline in ravno tako velja za ACC-oksidazo.

V plodu paradižnika smo opazili značilen vzorec porazdelitve encima ACC-oksidaza. V pecljih cvetov paradižnika se ACC-oksidaza izraža predvsem v citoplazmi celic spremljevalk floema (Chersicola idr., 2017). Na podlagi slike 4 lahko opazimo, da je do takšne izraženosti prišlo tudi v peclju ploda paradižnika. Izraženost je podobna na sliki A in B, pri katerih smo uporabili citratni in Tris-EDTA pufer v postopku povrnitve antigenov v vreli kopeli. Brez povrnitve antigenov v pufru PBS na sobni temperaturi (C) je bilo obarvanje šibkejše in manj specifično. Z uporabo pufra Tris-EDTA (B) bilo obarvanje bolj intenzivno, kar je lahko posledica tega, da je prišlo do obarvanja drugih proteinov. Predvidevamo, da se je to zgodilo zaradi uporabe poliklonskih protiteles, saj kot navaja Kladnik (1999), je slabost uporabe poliklonskih protiteles ravno ta, da se veže na različne epitope, ki se nahajajo na za nas nepomembnem proteinu. Kot lahko opazimo na sliki 4, se je obarvanost pojavila tudi na bazi ploda paradižnika, kjer se nahaja abscizijska plast. To je območje, kjer se plod loči od matične rastline (Chersicola idr., 2018).

Do obarvanja je prišlo tudi v osemenju ploda paradižnika v predelu žil, kakor lahko opazimo na Sliki 4. To lahko pojasnimo z vlogo etilena pri zorenju plodov. Etilen sproži zorenje in to povzroči povečano biosintezo etilena, pri kateri sodeluje tudi ACC-oksidaza (Reece idr., 2011). Vendar je bilo obarvanje pri uporabi različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov različno. Najbolj specifično barvanje z najmanj ozadja smo opazili pri uporabi citratnega pufra (Slika 4A), najmočnejše obarvanje je bilo pri uporabi Tris-EDTA pufra (Slika 4B), najšibkejše specifično barvanje z največ nespecifičnega barvanja ozadja smo opazili pri uporabi PBS pufra brez postopka povrnitve antigenov.

(25)

15

Na Slikah 5, 6 in 7 so prikazani rezultati imunolokalizacije ACC-oksidaze v plodu paradižnika z uporabo treh različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov in njihovimi kontrolami z uporabo neimunega seruma. Kot vidimo, do obarvanja na kontrolnih rezinah ni prišlo, saj smo primarna kozja protitelesa proti ACC-oksidazi nadomestili z neimunim serumom iz iste vrste živali, kar priporoča tudi Kladnik (1999).

Slika 4: Imunolokalizacija ACC-oksidaze v plodu paradižnika z uporabo različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov: s citratnim pufrom pH 6 (A), Tris-EDTA pH 9 (B) in brez povrnitve antigenov v pufru PBS (C). S črno puščico so označena specifična mesta nahajanja ACC-oksidaze, z belo puščico pa mesta nespecifičnega barvanja.

A) A)

C) A) B)

A)

(26)

16

Slika 5: Imunolokalizacija ACC-oksidaze v plodu paradižnika z uporabo citratnega pufra pH 6 v postopku povrnitve antigenov (A) in kontrola imunolokalizacije z uporabo neimunega kozjega seruma (B).

A) A)

B)

(27)

17

Slika 6: Imunolokalizacija ACC-oksidaze v plodu paradižnika z uporabo Tris-EDTA pufra pH 9 v postopku povrnitve antigenov (A) in kontrola imunolokalizacije z uporabo neimunega kozjega seruma (B).

A) A)

B) A)

(28)

18

Slika 7: Imunolokalizacija ACC-oksidaze v plodu paradižnika brez postopka povrnitve antigenov, samo z inkubacijo v PBS pufru na sobni temperaturi (A) in kontrola imunolokalizacije z uporabo neimunega kozjega seruma (B).

A) A)

B) A)

(29)

19

6 SKLEPI

Na začetku raziskovalnega dela smo si postavili tri raziskovalna vprašanja, na katera smo tekom raziskave in pregledane literature poskušali odgovoriti. Na prvo vprašanje, ali encim ACC-oksidazo najdemo le na določenih mestih v plodovih paradižnika z uporabo specifičnih protiteles proti ACC-oksidazi je odgovor pritrdilen. Kakor navajajo predhodne raziskave, naj bi encim ACC- oksidazo našli v citoplazmi celic spremljevalk floema v žilah, na bazi organa in v abscizijski plasti na sredini peclja ploda, kadar poteka proces abscizije, na katero vpliva rastlinski hormon etilen. V našem primeru smo ugotovili, da se encim ACC-oksidaza nahaja v žilah peclja ploda, na bazi ploda v bližini abscizijske plasti, poleg tega smo jo našli tudi v žilah osemenja ploda.

Na drugo vprašanje, ali uporaba različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov vpliva na detekcijo specifičnih mest ACC-oksidaze je odgovor prav tako pritrdilen. Pri uporabi različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov je prišlo do razlik v obarvanosti preparatov, vendar pa so bila specifična mesta (v predelu žil v peclju in osemenju ploda) na vseh preparatih obarvana. Do razlik je prišlo predvsem v obarvanju nespecifičnih mest (v osemenju). Na rezini, pri kateri smo uporabili citratni pufer v vreli kopeli, je bilo nespecifično obarvanje v predelu osemenja najmanjše. Na rezini, kjer smo uporabili PBS pufer na sobni temperaturi, je bilo obarvanje največje. Z uporabo Tris-EDTA pufra v vreli kopeli je bilo specifično barvanje najmočnejše, vendar je bilo vidno tudi več nespecifičnega barvanja ozadja kot pri uporabi citratnega pufra. Na podlagi literature bi lahko sklepali, da so se nespecifična mesta obarvala zaradi uporabe poliklonskih protiteles, katerih slabost je ravno ta, da se lahko vežejo na epitope različnih proteinov, tudi tistih, ki niso predmet naše raziskave.

Na tretje vprašanje, ali se preparati z uporabo neimunega seruma ne barvajo oz. je barvanje nespecifično, je odgovor nikalen. Na kontrolnih preparatih do obarvanja ni prišlo oziroma je bilo barvanje nespecifično, saj smo na le-teh uporabili neimun kozji serum, na preučevanih preparatih pa kozja primarna protitelesa proti ACC-oksidazi.

(30)

20

7 ZAKLJUČEK

Paradižnik je ena izmed najpogostejših kulturnih rastlin, ki jo lahko najdemo povsod po svetu in ga zato množično uporabljamo tako v prehranske namene kakor tudi v raziskovalne. Za znanstvenike je predmet raziskav tudi zaradi odkritja njegovega celotnega genoma. Plodove paradižnika uvrščamo med klimakterične, saj za zorenje potrebujejo etilen. Etilen je rastlinski hormon, ki sodeluje pri različnih procesih v življenju rastline. Sintetizira se iz metionina, pri sintezi pa sodeluje veliko encimov, med katerimi je tudi ACC-oksidaza. Ta je encim, ki katalizira pretvorbo ACC v etilen, vendar njegova lokacija in regulacija ni popolnoma poznana.

Cilj diplomske naloge je bilo ugotoviti lokacijo encima ACC-oksidaze v razvijajočih se plodovih paradižnika in kako na detekcijo vpliva uporaba različnih pufrov v postopku povrnitve antigenov. Prav tako nas je zanimalo, kako uporaba neimunega seruma vpliva na obarvanje kontrolnih preparatov. Iz raziskave smo ugotovili, da ACC-oksidazo najdemo v predelu žil v plodu paradižnika. Na detekcijo vpliva postopek povrnitve antigenov z uporabo različnih pufrov. Na vseh rezinah so bila obarvana specifična mesta, kjer smo pričakovali ACC-oksidazo, vendar so se pokazale razlike v obarvanju v osemenju paradižnika. Kontrolne rezine, tretirane z neimunim serumom, se niso obarvale, ali pa le rahlo in nespecifično.

(31)

21

8 LITERATURA

Aleksander L. in Grierson D. (2002). Ethylene biosynthesis and action in tomato: a model for climacteric fruit ripening. Journal of Experimental Botany, 53( 377), 2039-2055.

Bakshi, A., Shemansky, J.M., Chang, C., Binder, B.M. (2015). History of Research on the Plant Hormone Ethylene. Journal of Plant Growth Regulation, 34(4), 809-827.

Barry C. in Giovannoni J. (2007). Ethylene and Fruit Ripening. Journal of Plant Growth Regulation, 26(2), 143-159.

Chersicola, M., Kladnik, A., Tušek Žnidarič, M., Lers, A. in Dermastia, M. (2018). The pattern of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase induction in the tomato leaf petiole abscission zone is independent of expression of the ribonuclease-LX-encoding LeLX gene.

Plant Biology, 20(4), 722-728. doi: 10.1111/plb.12730

Chersicola M., Kladnik A., Tušek-Žnidarič M., Mrak T., Gruden K. in Dermastia M. (2017).

1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase induction in tomato flower pedicel phloem and abscission related processes are differentially sensitive to ethylene. Frontiers in plant science, doi: 10.3389/fpls.2017.00464.

Charng Y., Chou S., Jiaang W., Chen S. in Yang S. (2001). The Catalytic Mechanism of 1- Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid Oxidase. Archives of Biochemistry and Biophysics, 385(1), 179-185.

Chang, C. (2016). Q&A: How do plants respond to ethylene and what is its importance?.

BMC Biology, 14 (7).

Gerszberg, A., Hnatuszko-Konka, K., Kowalczyk, T. in Kononowicz A.K. (2015). Tomato (Solanum lycopersicum L.) in the service of biotechnology. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 120(3), 881-902.

Hause, B., Frugier F. in Crespi, M. (2006). Immunolocalization. Medicago truncatula handbook, 1-11. Pridobljeno s: https://www.noble.org/globalassets/docs/medicago- handbook/immunolocalization.pdf

Hoppert, M., Wrede, C. (2011). Immunolocalization. V Encyclopedia of Geobiology.

doi: 10.1007/978-1-4020-9212-1_116

(32)

22

Kende, H. in Zeevaart J. (1997). The Five “Classical” Plant Hormones. The Plant Cell, 9(7), 1197-1210.

Kladnik, A. (1999). Lokalizacija genske ekspresije nekaterih encimov sladkornega metabolizma v tkivih koruze (Zea mays L.) (Diplomsko delo). Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Ljubljana.

Knapp, S. in Peralta I.E. (2016). The Tomato (Solanum lycopersicum L., Solanaceae) and Its Botanical Relatives. V M., Causse, J., Giovannoni, M., Bouzayen, M. Zouine. The Tomato Genome (str. 7-21). Berlin: Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

Lin Z., Zhong S. in Grierson D. (2009). Recent advances in ethylene research. Journal of Experimental Botany, 60(12), 3311-3336.

Liu M., Pirello, J., Chervin C., Roustan, J. in Bouzayen M. (2015). Ethylene Control of Fruit Ripening: Revisiting the Complex Network of Transcriptional Regulation. Plant Physiology, 169(4), 2380-2390.

Luongo de Matos, L., Trufelli, D.C., Luongo de Matos, M. G. in Silva Pinhal, M. A. (2010).

Immunohistochemistry as an important tool in Biomarkers Detection and Clinical Practice.

Biomarker Insights, 5, 9-20.

Reece, J.B, Urry, L.A., Cain, M.L., Wasserman, S.A., Minorsky, P.V., Jackson, R.B. (2011).

Campbell Biology: Global Edition. United States of America: Pearson Benjamin Cummings.

Rudus, I., Sasiak, M. in Kepzynski, J. (2013). Regulation of ethylene biosynthesis at the level of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) gene. Acta Physiol Plant, 35(2), 295- 307.

Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J., White, D.J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. in Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological- image analysis. Nature Methods, 9(6), 676-682. doi: https://doi.org/10.1038/nmeth.2019.

Štraus, D. (2016). Vpliv hormonov na aktivnost encimov, vključenih v ločevanje celic med abscizijo rastlinskih organov (Diplomsko delo). Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Ljubljana.

(33)

23

Taylor, C.R. in Shi, S. (2014). Techniques of Immunohistochemistry: Principles, Pitfalls and Standardizations.V D.J. Dabbs (ur.),Diagnostic immunohistochemistry: theranostic and genomic applications (str. 1-38). United States of America: Elsevier Saunders.

Tucker, M. in Kim, J. (2015). Abscission research: what we know and what we still need to study. Stewart Postharvest Review, 11(2), 1–7.

Wang, K., Li, H. in Ecker, J.R. (2002). Ethylene Biosynthesis and Signaling Networks. The Plant Cell, 14(suppl 1), 131-151.

Zheng Q., Nakatsuka A., Taira S. in Itamura H. (2005). Enzymatic activities and gene expression of1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) synthase and ACC oxidase in persimmon fruit. Postharvest Biology and Technology, 37(3), 286-290.