UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
DIPLOMSKO DELO
Veronika Škrjanc
Ljubljana, 2022
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJA
Profiliranje O-glikanov v biološko podobnih zdravilih
DIPLOMSKO DELO
Veronika Škrjanc
MENTOR: prof. dr. Matevž Pompe
Ljubljana, 2022
IZJAVA O AVTORSTVU DIPLOMSKEGA DELA
Spodaj podpisana Veronika Škrjanc sem avtorica diplomskega dela z naslovom Profiliranje O-glikanov v biološko podobnih zdravilih.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof. dr.
Matevža Pompeta;
• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana skladno z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007));
• sem poskrbela za jezikovno in oblikovno ustreznost diplomskega dela;
• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.
V Ljubljani, 22. 1. 2022 Podpis avtorice:
Profiliranje O-glikanov v biološko podobnih zdravilih
Povzetek: Cilj diplomskega dela je bil izvesti literaturni pregled profiliranja O-glikanov v biološko podobnih zdravilih. Glikani predstavljajo enega izmed ključnih elementov pri načrtovanju novih bioloških zdravil in cepiv z uporabo protiteles in so zato pomemben del farmacevtske industrije. Velik problem pri določevanju O-glikanov je pomanjkanje
analitičnih orodij za selektivno sprostitev O-glikanov. Odkritje univerzalne O-glikozidaze ali zanesljive metode sprostitve O-vezanih oligosaharidov bi imelo veliko prednosti. Trenutno je najpogostejša kemijska sprostitev O-glikanov pod alkalnimi pogoji, ki daje zadovoljive rezultate, vendar metoda ni selektivna, saj se pri tem odcepijo tudi N-vezani glikani.
Sproščene O-glikane lahko označimo, derivatiziramo ali analiziramo z metodami HPLC, MS ali LC – MS, O-glikopeptide pa z metodo MS ali LC – MS, ki pa nam še vedno predstavlja velik tehnološki izziv. Dobro poznavanje glikanov in njihova analiza sta ključnega pomena za zdravstvo pa tudi za farmacevtsko industrijo za namene razvoja in zagotavljanja kakovosti ter varnosti novih zdravil.
Ključne besede: O-glikani, biološko podobna zdravila, profiliranje, MS
Profiling of O-glycans in biosimilars
Abstract: The aim of the diploma thesis is a literature review of O-glycan profiling in biosimilars. Glycans represent one of the main elements in planning new biosimilars and vaccines using antibodies, that is why they play an important role in the pharmaceutical industry. The shortage of analytical tools for selective release of O-glycans represents a big problem in Glycan profiling. The discovery of an universal O-glycosidase or a reliable method for the release of O-attached oligosaccharides would have a lot of advantages.
Currently, the most common method is the chemical release of O-glycans under alkaline conditions, which gives satisfactory results, but the method itself is not selective, as N-bound glycans are also released. The released O-glycans can be tagged, derivatized or analysed with HPLC, MS or LC-MS methods and the O-glycopeptides can be analysed with MS or LC-MS methods, but these still represent a technological challange for us. Good knowledge about glycans and their analysis are crucial for both healthcare and the pharmaceutical industry, in order to develop and ensure the quality and safety of new drugs.
Keywords: O-glycans, biosimilars, profiling, MS
Kazalo
1 Uvod ... 1
2 Pregled literature ... 3
2.1 Glikani ... 3
2.1.1 Pomen O-manozilacije ... 5
2.1.2 Glikoterapija ... 6
2.2 Biološko podobna zdravila ... 8
2.2.1 Razvoj in odobritev biološko podobnih zdravil v EU ... 10
2.2.2 Imunogenost ... 11
2.2.3 Določanje o-glikanov za razvoj in proizvodnjo bioframacevtikov... 12
2.3 Metode določevanja O-glikanov ... 13
2.3.1 Sprostitev O-glikanov ... 13
2.3.2 Strukturna analiza O-glikanov ... 14
2.4 Potencialne možnosti nadaljnjega razvoja ... 18
2.5 Rekombinantni človeški eritropoetin ... 19
3 Namen dela ... 21
4 Načrt eksperimenta ... 23
4.1 Materiali in reagenti ... 23
4.2 Potek dela ... 23
4.2.1 β-eliminacija terapevtskih glikoproteinov ... 23
4.2.2 Odstranjevanje interferenc ... 23
4.2.3 Skoncentriranje glikopeptidov s pomočjo SPE... 24
4.2.4 Analiza LC – MS in LC – MS/MS ... 24
4.2.5 Procesiranje podatkov LC – MS in identifikacija O-glikopeptidov ... 24
4.3 Rezultati in razprava... 24
4.3.1 Nedestruktivno profiliranje O-glikanov z glikoproteomskim pristopom ... 24
4.3.2 Strukturna karakterizacija O-glikolizacije na rhEPO ... 26
4.3.3 Variacije O-glikozilacije na NESP v različnih serijah ... 26 5 Zaključek ... 27 6 Literatura ... 29
Kazalo slik
Slika 1. Mucin – družina gosto glikoliziranih proteinov. V proteinskem jedru so bogati s treoninom, serinom in s hidroksiprolinom, kar omogoča posttranslacijsko O-glikozilacijo [8].
... 5
Slika 2. Normalna mišica in mišica z mišično distrofijo [9]... 6
Slika 3. Primeri vrst beljakovin v bioloških zdravilih, odobrenih v EU [4] ... 9
Slika 4. Potek karakterizacije in identifikacije O-glikanov z MS-metodo [17] ... 16
Slika 5. Potek določanja mesta O-glikozilacije z MS [17] ... 18
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
GalNAc N-acetilgalaktozamin
Sia Salicilna kislina
Ser Serin
Thr Treonin
GDP-Fuc Gvanozin 5’-difosfo-β-L-fukoza
O-Fuc O-fukoza
ER Endoplazmatski retikulum
Glc Glukoza
O-Glc O-glukoza
Xyl Ksiloza
Man Manoza
O-Man O-manoza
DG O-Man Distroglikan O-manoza
GlcA Glukoronska kislina
UDP-GalNAc Uridin difosfat N-acetilgalaktozamin
α-DG α-distroglikana
Ig Imunoglobulin
MS Masna spektroskopija
LC – MS Tekočinska kromatografija, sklopljena z masno spektroskopijo
MS/MS Tandemska masna spektroskopija
NaBH4 Natrijev borohidrid
O-glikozidaza Endo-α-N-acetilgalaktozaminidaza
HILIC Tekočinska kromatografija na osnovi
hidrofilnih interakcij
PGC Porozni grafitni karbon
CE Kapilarna elektroforeza
HPLC Tekočinska kromatografija visoke
zmogljivosti
IMS Ionsko-mobilna spektrometrija
SPE Ekstrakcija na trdni fazi
ACN Acetonitril
2-AA 2-aminobenzojska kislina
2-AB 2-aminobenzamid
CID Disociacija zaradi trkov (angl. Collision
induced dissociation)
HCD Disociacija zaradi trkov pri višji energiji
(angl. Higher energy collisional dissociation)
ETD Disociacija na podlagi prenosa elektrona
rhEPO Rekombinantni človeški eritropoetin
NESP Hiperglikoziliran analog rhEPO
1
1 Uvod
Glikozilacija je posttranslacijska modifikacija, pri kateri pride do dodajanja sladkornih enot na proteine in lipide, kar povzroči nastanek glikoproteinov in glikolipidov. Nastali
glikoproteini imajo pomembno vlogo pri bioloških procesih v našem telesu; potrebni so za pravilno urejanje na novo sintetiziranih polipeptidov, stabilnost, topnost in za prenos končnih glikoproteinov. Glikani sodelujejo pri medcelični komunikaciji in identifikaciji ter imajo pomembno vlogo pri imunskem odzivu telesa. Pri invaziji patogenega organizma imunski sistem na njem prepozna telesu tuje glikane in zato sproži odziv. Protitelesa nato uporabijo glikane za vezavo na patogene in jih nevtralizirajo ali označijo za uničenje z belimi
krvničkami. Nekatere glikanske strukture so dobri indikatorji napredovanja tumorja, saj pride pri transformaciji celic iz normalnih v maligne do spremembe glikozilacije površinskih proteinov. Spremembe glikanske strukture se v medicini uporablja kot biomarker za nadzor razvoja rakavih celic [1, 2, 3].
Kot zdravilne učinkovine za biološka zdravila so največkrat v uporabi beljakovine. Biološko podobno zdravilo in referenčno zdravilo morata vsebovati enako beljakovino, torej enako zaporedje aminokislin; enaka mora biti tudi tridimenzionalna struktura. Pravilna glikozilacija je ključnega pomena za njihovo stabilnosti in biološko aktivnost. V namene razvoja,
zagotavljanja kakovosti in varnosti novih zdravil sta razumevanje delovanja glikanov in njihova analiza ključnega pomena za farmacevtsko industrijo [4].
Pri analizi glikanov moramo mešanico najprej ločiti na različne frakcije. Najpogosteje uporabljeni tehniki za separacijo glikanov sta kapilarna elektroforeza in tekočinska
kromatografija, sami ločbi pa nato sledi detekcija z fluorescenčnim detektorjem ali masno spektrometrijo [5].
V svojem delu sem se osredinila na vlogo O-glikanov v biološko podobnih zdravilih, njihovo separacijo in v detekcijo ter se posvetila ugotavljanju pomanjkljivosti metod, ki so trenutno v uporabi pri analizi.
2
3
2 Pregled literature
2.1 Glikani
Glikani so ene najpomembnejših biomolekul v naravi. Lahko nastopajo kot enostavni monosaharidi, lahko pa tvorijo tudi kompleksnejše strukture, kot so naravno prisotni
glikokonjugati, pri čemer so sladkorni deli pritrjeni na beljakovine ali lipide. Ogljikovi hidrati so najpogostejše molekule v živih organizmih, zato imajo tudi veliko pomembnih bioloških vlog, kot so gradnja celičnih sten in vir energije skozi presnovo glukoze. Biološke vloge glikanov pa segajo še nekoliko dlje. Kompleksni glikani so potrebni za pravilno urejanje na novo sintetiziranih polipeptidov ter za stabilnost, topnost in za prenos končnih glikoproteinov [1].
Glikani, ki so znani tudi kot oligosaharidi ali polisaharidi, so kompleksne, razvejane ogljikohidratne strukture, sestavljene iz sladkorjev, kot so: fukoza, galaktoza in manoza.
Običajno so monosaharidne enote vezane na beljakovine ali lipide, kar pripelje do nastanka glikoproteinov ali glikolipidov. Postopek dodajanja sladkornih enot imenujemo glikozilacija.
Poznamo dve glavni vrsti glikanov, ki se razlikujeta v načinu vezave na aminokislinsko verigo, tj. N-vezane glikane, ki so vezani prek dušika na aminokislinah asparagin in arginin, ter O-vezane glikane, ki so vezani prek hidroksilnega kisika na aminokislinah serin ali treonin [2].
Modifikacija ostankov serina ali treonina na beljakovinah z adicijo ostanka N-
acetilgalaktozamin povzroči nastanek O-vezanega oligosaharida ali O-glikana. Večina O- glikanov je podaljšana v verige s spremenljivimi konci, ki so lahko podobni tistim na N- glikanih, vendar so O-glikani manj razvejani kot večina N-glikanov [5].
O-glikolizacija zajema številne modifikacije reducirajočega konca monosaharida. Lahko povzroči nastanek molekul mucinskega tipa, ki jih prepoznamo kot celično površino ali izločene glikoproteine z velikim številom gručastih O-glikanov [5].
Pri mucinskem tipu O-glikozilacije je reducirajoči končni sladkor N-acetilgalaktozamin, ki ga lahko nadalje modificirajo molekule, kot so: galaktoza, N-glukozamin, fukoza, N-
acetilgalaktozamin in salicilna kislina [5].
Poznamo O-fukozilacijo, ki je proces modifikacije koncev Ser ali Thr s fukozil glikanom.
Reakcija poteka na endoplazmatskem retikulumu in jo katalizirajo O-fukozil transferaze.
4
Raziskani sta bili dve poti za prenos GDP-Fuc na hidroksilno skupino Ser ali Thr, temu pa sledijo še nadaljnje modifikacije O-Fuc, s katerimi dobimo različne tetra- in disaharide [5].
O-glukozilacija je redek tip modifikacije, ki poteka na ER, pri čemer se na konce Ser in Thr pripne Glc, kar katalizira protein O-glukoziltransferaza. O-Glc se lahko podaljšuje z
dodatkom dveh ksiloznih koncev in tako tvori trisaharid [5].
Prav tako je redka O-manozilacija, ki poteka na ER, kjer se na Ser ali Thr pripne Man, kar katalizira O-manoziltransferaza 1 ali 2. O-Man se nadalje podaljšuje v Golgijevem aparatu z N-acetilglukozaminiltransferazami, galaktoziltransferazami in s sialiltransferazami. O-Man glikani predstavljajo širok spekter različnih heterogenih struktur. Strukturna analiza je pokazala, da lahko α-DG O-Man substituiramo na mestu 6 reducirajočega konca Man s fosfoestrom, ki je povezan z neznano sladkorno enoto, to pa lahko podaljšujemo s ponavljajočimi se enotami Xyl in GlcA [5].
O-glikolizacija mucinskega tipa je najpogostejša posttranslacijska modifikacija pri vretenčarjih in poteka na Golgijevem aparatu. Reakcija je katalizirana s transferazami GalNAc, ki GalNAc iz UDP-GalNAc povezujejo s Ser ali Thr prek hidroksilne skupine.
GalNAc transferaze so transmembranski proteini tipa 2, ki imajo kratek N-terminalni citoplazmatski rep, hidrofobno regijo, ki je zasidrana v membrano Golgijevega aparata, in katalitsko regijo, ki je v notranjosti Golgijevega aparata. Biokemijske študije so dokazale hierarhijo v družini teh encimov. Nekateri encimi katalizirajo prvotno adicijo GalNAc na nemodificiran substrat, to so inicijaroče transferaze, drugi pa glikolizirajo substrate, ki že vsebujejo GalAc, to so glikopeptidne transferaze, ki dodajo GalNAc vicialno na že obstoječe mesto GalNAc. Neznano je, na kak način reakcija dejansko poteče, predlaganih pa je bilo več modelov. O-vezani GalNAc lahko nadalje modificirata Gal in GlcNAc; pri tem nastanejo strukture, ki so primerne za nadaljnje podaljševanje in substitucijo. S podaljševanjem se tako spremeni struktura mucina iz globularne v nekakšno razvejano paličasto. O-glikolizacija je pomembna, saj daje proteinskemu jedru zaščito pred proteolizo in nekatere edinstvene reološke lastnosti. O-glikani mucinskega tipa modulirajo prepoznavanje in komuniciranje med celicami in okoljem [5, 6, 7].
5
Slika 1. Mucin – družina gosto glikoliziranih proteinov. V proteinskem jedru so bogati s treoninom, serinom in s hidroksiprolinom, kar omogoča posttranslacijsko O-glikozilacijo [8].
2.1.1 Pomen O-manozilacije
O-manozilacija je pomembna v povezavi s pojavom mišične distrofije. Veliko različnih proteinov Golgijevega aparata je vključenih v postopek pravilne O-manozilacije; to vključuje tudi Fuktin in protein LARGE. Mutacije O-manozilacijsko povezanih glikoziltransferaz lahko pripeljejo do nepravilne glikozilacije α-distroglikana, kar pomeni, da se nanj ne more vezati laminin, kar vodi v mišično distrofijo. Distroglikanski kompleks v skeletnih mišicah deluje kot transmembranska povezava med ekstracelularnim matriksom in citoskeletom.
Glikoliziran α-DG je ključen za vezavo agrina, neureksina in laminina v ekstracelularnem matriksu. Če do glikozilacije ne pride, se te vezave ne morejo tvoriti, kar poruši strukturno celovitost mišičnega tkiva. Substitucija s fosfoestrom ter podaljševanje z Xyl in GlcA sta se izkazala za ključno pri delovanju proteina LARGE in vezavi α-DG na laminin. Poznavanje α- DG glikozilacije in O-manozilacije je torej ključno za razvoj terapevtikov proti prirojeni mišični distrofiji [9].
6
Slika 2. Normalna mišica in mišica z mišično distrofijo [9] 2.1.2 Glikoterapija
Glikani so pomembni dejavniki imunskega sistema; nahajajo se na površini celic in imajo vlogo prepoznavanja bioloških molekul. So bistvenega pomena za interakcije in
komunikacijo med celicami ter kontrolo obnašanja in odzivov imunskega sistema. Če v telo vstopi patogeni organizem, ki ima na svoji površini glikane, ki imunskemu sistemu še niso znani, to sproži imunski odziv. Da se imunski sistem lahko odzove na invazijo patogenega organizma, ga mora najprej prepoznati kot sebi drugačnega. Glikani nam povedo, ali celice ali proteini pripadajo telesu. Tuje glikanske strukture in vzorce imunski sistem prepozna kot sebi drugačne in tako sproži imunski odziv. Če prepozna sebi znane oz. enake glikane, to preprečuje odziv. Glikani predstavljajo del protiteles, ki se vežejo na patogene organizme ali okužene celice in jih uničijo oz. nevtralizirajo ali označijo za odstranitev z belimi krvničkami.
Razlike v strukturi glikanov lahko spremenijo tarčo, sposobnost vezave in aktivnost protiteles. V človeškem imunskem sistemu je prisotnih pet vrst imunoglobulinov oz.
protiteles: IgG, IgM, IgA, IgE in IgD; ločimo jih po obliki, velikosti in po učinku. Ig imajo fragment za prepoznavanje antigenov, ki ga imenujemo odsek Fab, in fragment Fc, ki intereagira z receptorji Fc imunskih celic. Glikanske modifikacije Ig so pomembne za njihovo delovanje, torej prepoznavanje različnih antigenov. Tvorba napačnih glikanskih struktur ali vzorcev lahko povzroči avtoimunske bolezni, kar pomeni, da imunski sistem glikane na celicah lastnega organizma prepozna kot antigen [10, 11].
7
Bakterije in virusi uporabljajo glikane za prepoznavanje in napad celic gostitelja; s tem omogočijo razmnoževanje. Eden nam najbolj znanih primerov je virus gripe, ki se s svojimi površinskimi glikoproteini pritrdi na glikane, ki se nahajajo na površini celic v nosni sluznici, grlu in v pljučih ter tako vstopa v naše telo. Po razmnoževanju v notranjosti celic novi virusi izstopijo iz celice in so tako sposobni okužbe novih celic. Nekaterih virusov imunski sistem ne prepozna kot tujek, saj imajo na virionu glikane, ki so enaki gostitelju. Primer virusa HIV:
ta lahko preprosto vstopi v celico in se nemoteno razmnožuje, saj ima na površini N-glikane enake gostiteljskim. Kot terapija proti HIV so bili sintetizirani glikopeptidi, ki posnemajo naravne glikoproteine na ovojnici virusa. Glikoproteini na ovojnici so tarča za nevtralizacijo virusov. Ti proteini, kot je Gp120 na virusu HIV, imajo v strukturi veliko glikanov, bogatih z manozo, in te so prve v stiku z gostiteljskim imunskim sistemom. Medtem ko so ti N-glikani prepoznani kot lastni antigeni in s tem preprečujejo nevtralizacijo, je mogoče dobiti močnejše antigenske odzive z napadom notranjih glikanov in beljakovin na površini. Posnemanje glikopeptidov je tako mogoče uporabiti kot terapevtsko strategijo, ki sproži širok odziv in proizvodnjo protiteles [1, 10, 12].
Glikani imajo pomembno vlogo pri pripravi cepiv. Ogljikovi hidrati z različnimi vzorci glikozilacije patogenih ali malignih gostiteljskih celic so lahko uporabljeni kot antigeni za razvoj cepiv. Glikani sami po sebi niso sposobni izzvati odziva T-limfocitov, z izjemo
polisaharidov z menjajočim se pozitivnim in negativnim nabojem na površini nekaterih Gram pozitivnih bakterij. Razvoj zdravila po navadi dosežemo s konjugacijo glikanskih antigenov na primerne nosilce, ki so lahko proteini, peptidi ali nanodelci. Tako z vnosom
modificiranega patogena spodbudimo odziv imunskega sistema, izražanje protiteles ter zapis v spomin v T- in B-celicah [1].
Uporaba proteinov kot terapevtikov na farmacevtskem področju se je v zadnjih letih zelo razširila. Veliko teh proteinov običajno kaže posttranslacijske modifikacije in vezava glikana je ena najpogostejših. Več kot polovico komercialno dostopnih terapevtskih proteinov
predstavljajo glikoproteini, ki jih pridobivamo iz živih celičnih sistemov z molekularno biologijo. Postopki in aplikacije profiliranja komercialnih in potencialno terapevtskih glikanov so še vedno v razvoju. Zanima nas, kako različne glikoforme vplivajo na kakovost produkta v smislu stabilnosti, toksičnosti in učinkovitosti [1].
Glikozilacija je univerzalna značilnost rakavih celic; nekatere glikanske strukture so dobri indikatorji napredovanja tumorja. Tako kot navadne celice se tudi tumorske med
8
embriogenezo aktivirajo in hitro rastejo ter napadajo druga tkiva. Pri embrionalnem razvoju in celični aktivaciji vretenčarjev običajno pride do spremembe celičnih glikanskih profilov.
Zato ni presenetljivo, da so spremembe glikanske strukture pokazatelj napredovanja tumorja.
Za preživetje rakava celica potrebuje spremenjene rastne faktorje, ki omogočajo nenormalno rast celice. V celici pride do povečane razvejanosti N-glikanov, in sicer zaradi povečanja fukozilacije jedra glikana. To se v medicini uporablja kot biomarker za nadzor razvoja rakavih celic. V malignih celicah lahko pride do različnih glikanskih sprememb, kot so prenehanje izražanja ali prekomerno izražanje določenih struktur, obstojnost nepopolnih ali okrnjenih struktur in kopičenje prekurzorjev. Spremembe v zgodnjih fazah biosinteze lahko izrazito vplivajo na relativno količino enega razreda struktur in omogočijo dominanco drugih.
Presenetljivo je, da je od vseh mogočih biosintetskih sprememb glikanov le omejena podskupina sprememb pogosto povezana z maligno transformacijo in napredovanjem tumorja. Glede na to, da je rak »mikroevolucijski« proces, v katerem preživijo le najprimernejše celice v gensko heterogeni populaciji, je smiselno, da se te specifične glikanske spremembe izberejo med napredovanjem tumorja [3].
Aminoglikozidi so razred aminov, ki vsebujejo malomolekulske glikane, ki jih sintetizirajo grampozitivne bakterije Streptomyces in Micromonospora. Prvi aminoglikozid, streptomicin, je bil odkrit leta 1943 in klinično uporabljen kot prvi antibiotik za uspešno zdravljenje
tuberkuloze. Drugi predstavniki tega široko uporabljenega razreda antibiotikov so gentamicin, kanamicin in neomicin. Večina jih deluje kot zaviralci sinteze proteinov, a
natančen mehanizem še ni popolnoma znan. Na žalost je hiter pojav bakterijske odpornosti na aminoglikozide pripeljal do upada njihove uporabe, vendar je povečanje števila sevov,
odpornih proti več zdravilom, vzpodbudilo zanimanje za oblikovanje novih ciljnih spojin [1, 11, 13].
2.2 Biološko podobna zdravila
Biološka zdravila vsebujejo zdravilne učinkovine biološkega izvora, kot so na primer žive celice ali organizmi. So dobro uveljavljena v klinični praksi in v veliko primerih nepogrešljiv dejavnik za zdravljenje hudih in kroničnih bolezni, kot so na primer rak, sladkorna bolezen in avtoimunske bolezni. Zdravilne učinkovine v večini bioloških zdravil, ki so v uporabi, so beljakovine. Te se med seboj lahko razlikujejo po velikosti in strukturni kompleksnosti.
Lahko imamo enostavne beljakovine, kot sta inzulin in rastni hormon, ali kompleksnejše, kot so koagulacijski faktorji ali monoklonska telesa [4].
9
Slika 3. Primeri vrst beljakovin v bioloških zdravilih, odobrenih v EU [4]
Biološko podobno zdravilo je zdravilo, ki je zelo podobno drugemu biološkemu zdravilu, ki je že odobreno in v prometu v EU; temu rečemo tudi referenčno zdravilo. Odobrena podobna biološka zdravila lahko proizvajalci dajo na trg šele po izteku obdobja tržne zaščite
referenčnega zdravila. Biološko podobno zdravilo ima fizikalne, kemijske in biološke
lastnosti, ki so zelo podobne lastnostim referenčnega zdravila. Med referenčnim zdravilom in njim lahko obstajajo majhne razlike, ki pa niso signifikantne v smislu varnosti in
učinkovitosti; to morajo potrditi klinične študije, ki so podlaga za odobritev podobnega biološkega zdravila. Zato tudi ne pričakujemo razlik v kliničnih izidih. Odobrena so na podlagi enako strogih standardov kakovosti, varnosti in učinkovitosti, ki se uporabljajo za katero koli drugo zdravilo. Kadar znanstveni dokazi izkazujejo odsotnost vpliva na varnost in učinkovitost, je dovoljena manjša variabilnost. Njen dopustni razpon je enak razponu, ki je dovoljen med serijami referenčnega zdravila [4].
Kot zdravilna učinkovina so največkrat v uporabi beljakovine. Biološko podobno zdravilo in referenčno zdravilo morata vsebovati enako beljakovino, torej enako zaporedje aminokislin;
imeti mora tudi enako tridimenzionalno strukturo oz. zvitje. To sta glavna dejavnika, ki določata biološko aktivnost. Podobno biološko zdravilo in referenčno zdravilo morata imeti v svoji končni obliki enako odmerjanje in pot uporabe. Dopustne so nekatere razlike, ki pa ne smejo vplivati na učinkovitost in varnost. To so na primer razlike v oblikovanju zdravila, torej sestavi pomožnih snovi, v predstavitvi farmacevtske oblike, npr. prašek, v primerjavi z raztopino za injiciranje, in v pripomočku za aplikacijo zdravila [4].
Biološko podobnih zdravil ne obravnavamo kot generična zdravila. To je predvsem zaradi tega, ker naravna variabilnost in zapletena proizvodnja bioloških zdravil ne omogočata natančne ponovitve molekularne mikroheterogenosti. Za njihovo odobritev je zato potrebnih več študij kot za generična zdravila, da se zagotovi, da manjše razlike ne vplivajo na varnost
10
in učinkovitost zdravila. Sam razvoj temelji na dokazovanju biološke podobnosti z uporabo primerjalnih študij. Potrebna je celovita neposredna primerjava podobnega biološkega zdravila z referenčnim zdravilom, da se dokaže visoka podobnost v kemijski strukturi, biološkem delovanju, učinkovitosti, varnosti in v imunogenosti. Običajno niso potrebna potrditvena klinična preskušanja biološko podobnega zdravila za vsako indikacijo, ki je bila potrjena za referenčno zdravilo. Po dokazu biološke podobnosti je mogoča ekstrapolacija podatkov na druge indikacije, če razpoložljivi dokazi obravnavajo vse posebne vidike teh indikacij [4].
2.2.1 Razvoj in odobritev biološko podobnih zdravil v EU
Večina podobnih bioloških zdravil je bila odobrena za uporabo v EU s centraliziranim postopkom prek Evropske agencije za zdravila. Ko poslovni subjekt zaprosi za dovoljenje za promet nekega zdravila, pridobljene podatke ocenijo odbor za zdravila za uporabo v humani medicini in odbor za varnost pa tudi strokovnjaki EU za biološka zdravila in strokovnjaki za biološko podobna zdravila. Znanstveno mnenje se na koncu pošlje Evropski komisiji, ta pa izda dovoljenje za promet, veljavno v celotnem EU [4].
Uporaba zdravil je odobrena, če študije o njihovi farmacevtski kakovosti, varnosti in o učinkovitosti prepričljivo dokazujejo, da so koristi zdravila večje od tveganj. Pri biološko podobnih zdravilih pozitivno razmerje med koristmi in tveganji temelji na dokazovanju biološke podobnosti, torej dokazovanju visoke podobnosti referenčnemu zdravilu. Za odobritev biološko podobnega zdravila potrebujemo neklinične in klinične podatke, ki se razlikujejo od tistih, potrebnih za odobritev biološkega zdravila z novo zdravilno učinkovino.
Ob ugotovljeni biološki podobnosti se namreč lahko zanesemo na izkušnje o varnosti in učinkovitosti, pridobljene z referenčnim zdravilom [4].
Razvoj biološko podobnih zdravil temelji na tako imenovanih »primerjalnih študijah« za določitev podobnosti z referenčnim zdravilom. Te študije vključujejo celovito in neposredno primerjavo biološko podobnega zdravila in referenčnega zdravila. Primerljivost je stopenjski proces oziroma dobro uveljavljeno znanstveno načelo v regulativni znanosti in je prilagojeno posameznemu zdravilu [4].
Prvi korak so primerjalne študije kakovosti. V študijah in vitro primerjamo strukturo
beljakovine in biološko delovanje z uporabo občutljivih tehnik, s katerimi je mogoče odkriti manjše klinično pomembne razlike med podobnim biološkim zdravilom in njegovim
referenčnim zdravilom. Med ljudmi, ki sodelujejo v tovrstnih študijah oz. preskušanjih, je
11
pogosto prisotna variabilnost, zato so te študije v primerjavi s kliničnimi preskušanji veliko občutljivejše za odkrivanje prisotnih razlik [4].
Drugi korak so primerjalne neklinične študije, ki vključujejo farmakodinamske študije in vitro, s katerimi preučujejo vezavo in aktivacijo ali inhibicijo fizioloških tarč ter takojšne fiziološke učinke v celicah. Včasih je potrebna tudi izvedba toksikoloških študij, a le v primerih, ko je biološko podobno zdravilo proizvedeno v novi vrsti organizma ali če
farmacevtska oblika vključuje nove pomožne snovi, ki predhodno še niso bile v uporabi [4].
Tretji korak so primerjalne klinične študije; njihov cilj je potrditev biološke podobnosti in pojasnjevanje vprašanj, ki so se mogoče pojavila v predhodnih analitičnih ali funkcionalnih študijah [4].
Celotnega programa kliničnega razvoja referenčnega zdravila z znanstvenega in
regulativnega vidika ni treba ponoviti. Varnost in učinkovitost pri pacientih sta bili dokazani že za referenčno zdravilo, zato se na pacientih in zdravih prostovoljcih ne bodo izvajala nepotrebna klinična preskušanja [4].
2.2.2 Imunogenost
Odziv imunskega sistema na učinkovino je najpogostejši neželeni učinek, povezan z
aplikacijo bioloških zdravil. Pomembno je, da se vedno preuči imunogenost bioloških zdravil.
Intrinzična sposobnost beljakovin in drugih bioloških zdravil je, da lahko vzbudijo neželen imunski odziv, ki lahko povzroči resne neželene učinke ali manjšo učinkovitost. Težko je napovedati klinične posledice, saj so te zelo raznolike – od nezaznavnih do življenje ogrožajočih. Številne dejavnike, ki vplivajo na imunogenost, slabo poznamo, a nanjo lahko vplivajo značilnosti zdravila, npr. sprememba strukture beljakovine, dejavniki, povezani z zdravljenjem, npr. različna tveganja glede na to, kako se zdravilo aplicira, in dejavniki, povezani s pacientom ali z boleznijo, npr. starost. A pomembneje je, da pozornost posvečamo kakovosti zdravila. Gotovo lahko z optimizacijo proizvodnje na vseh korakih, torej od izbire genske informacije do ekspresijskega sistema ter učinkovitejšega čiščenja učinkovine, močno omejimo imunogenost, ne moremo pa je odpraviti v celoti. Pomembno je spremljanje
imunogenosti po prehodu biološkega zdravila na trg, saj tako lahko ugotovimo redke imunske reakcije, ki se lahko odkrijejo šele po daljšem obdobju spremljanja večjega števila pacientov.
Kot učinkovit pristop za omejevanje imunskega odziva sta se v nekaterih primerih izkazala modulacija terapevtskega režima in koterapija z imunosupresivi. Učinkovita strategija zniževanja imunogenega potenciala je konjugacija proteinske učinkovine s hidrofilno verigo
12
polietilenglikola oz. pegilacija. Ta izboljša topnost proteinov in s tem posredno omejuje agregacijo, ovira procesiranje proteina v antigen predstavitvenih celicah, maskira epitope in s tem preprečuje dostop protiteles do učinkovine ter upočasni eliminacijo iz organizma.
Minimalne fizikalno-kemijske ali strukturne spremembe proteina so lahko vzrok za spremembo imunogenega potenciala rekombinantne učinkovine, do katere lahko pride pri spremembi proizvodnega procesa [4, 14].
Pri spremembah proizvodnega procesa je treba zagotoviti, da sta incidenca protiteles proti učinkovini ter njihov potencialen vpliv na varnost in učinkovitost pri pacientih, zdravljenih z novim produktom, primerljiva s tisto pri bolnikih, zdravljenih z zdravilom, pripravljenim po referenčnem postopku. Sam razvoj biološko podobnih zdravil se zanaša na izkušnje z referenčnim biološkim zdravilom. Proizvodni procesi so drugačni kot tisti, s katerimi
izdelamo referenčno zdravilo, kar pomeni, da lahko pričakujemo razlike v imunogenosti obeh zdravil. Pri celovitem vrednotenju biološko podobnih zdravil je treba dokazati tudi podobno imunogenost, a obstaja možnost, da morebitnih manjših razlik v imunogenosti ne bomo zaznali. Zaradi interindividualnih razlik v dovzetnosti za odziv imunskega sistema na učinkovino avtomatična zamenljivost, kakršna velja za generična zdravila, za podobna biološka zdravila ni priporočljiva. Klinične raziskave učinkovitosti in varnosti, vključno z imunogenostjo, niso zaznale značilnih razlik pri pacientih, ki so jim referenčna zdravila zamenjali za podobna biološka zdravila, in tistih, ki so obdržali prvotno terapijo [14].
2.2.3 Določanje o-glikanov za razvoj in proizvodnjo bioframacevtikov
Fukcionalni vpliv glikolizacije na učinkovitost in varnostne profile zdravil je bil dokazan v širokem spektru biofarmacevtskih izdelkov. Razumevanje N-glikozilacijske poti in pojav analitskih tehnologij sta omogočila podrobno in hitro karakterizacijo N-glikanov in dober nadzor za spremljanje skladnosti s predpisi. V primerjavi z N-glikolizacijo O-glikozilacija zajema več vrst beljakovinskih modifikacij in zato je njeno razumevanje težje in še ne dobro raziskano [5].
Znaten del proteinsko osnovanih zdravil na trgu so glikoproteini. Pri analitičnih raziskavah O-glikanov obstaja več omejitev, ki vplivajo na razvoj zdravil. Različne glikanske strukture lahko vplivajo na fizikalno-kemijske lastnosti proteinov, njihovo in vivo stabilnost, njihov terapevtski učinek in na varnostni profil teh zdravil. Pri analizi glikoproteinov je pomembna določitev vsebnosti glikanov, njihove strukture in informacije o mestu vezave. Ne glede na
13
pomembnost analize glikanov nam univerzalen kriterij meril za sprejemljivost glikanskega profila še ni znan, saj so merila odvisna od posameznih proteinskih terapevtikov [5].
V praksi biokemijsko testiranje biofarmacevtskih izdelkov po navadi poteka na dveh ravneh:
»lot release« in karakterizacija. V okviru profiliranja O-glikanov se »lot release« izvaja za vsako serijo posebej, za preverjanje, ali je glikolizacija podobna tisti iz prejšnjih serij; s tem se zagotovi doslednost proizvodnje. Karakterizacija pa predstavlja temeljitejše delo in se izvaja samo na izbranih serijah pred licenciranjem ali velikimi spremembami v procesu, da natančno določimo oglikohidratne strukture glikoproteina [5].
2.3 Metode določevanja O-glikanov
Poznamo dva načina analize O-glikanov. Prvi pristop je odcep O-glikanov od glikoproteinov in njihova derivatizacija z naslednjo analizo s separacijskimi ali z MS-metodami. Pri drugem pristopu pa se odcepijo peptidi, ki imajo vezane O-glikane, torej O-glikopeptidi, stran od proteinov, in temu sledi analiza s sistemom LC – MS, nato pa so ti podvrženi še fragmentaciji za določitev zaporedja peptida in pritrjenega O-glikana z MS/MS [5].
2.3.1 Sprostitev O-glikanov
Kljub prizadevanjem za identifikacijo univerzalne O-glikozidaze za odcep O-glikanov ta še ni bila odkrita [5].
Kemijska sprostitev O-glikanov se izvaja pod alkalnimi pogoji. Pri povišanem pH so sproščeni O-glikani dovzetni za degradacijo; pride do izgube sladkorjev na reducirajočem koncu, to pa vpliva na celovitost strukture. Za nadzor tega problema se uporabljajo reducenti, kot je NaBH4, ki reducirajo sproščene O-glikane s pretvorbo reducirajočega konca GalNAc v GalNActitol. Takšna metoda je najzanesljivejša v ohranjanju strukture O-glikanov. Ena večjih pomanjkljivosti je, da reducirani sladkorji preprečujejo nadaljnje določanje glikanov zaradi hidroksilne skupine na reducirajočem koncu; to onemogoča možnost uporabe metode na osnovi fluorescence za detekcijo in kvantizacijo. Testirane so bile šibke baze, kot sta amonijak in dimetilamin, ki dokazano zavirajo učinek redukcije sladkorjev, vendar se mu ne izognejo. Še ena nereduktivna metoda je hidrazinoliza, katere slabost je uporaba škodljivega hidrazina. Vse kemijske metode sprostitve imajo pomanjkljivost v specifiki za selektivno sprostitev O-glikanov namesto N-glikanov [5].
Specifični encimi za sprostitev O-glikanov niso komercialno dostopni. O-glikani se sprostijo s pomočjo O-glikozidaze, ki lahko odcepi nesubstituirane glikane tipa 1, kar nam poda delno informacijo o strukturi. Za zdaj se za sprostitev O-glikanov uporabljajo kemijske metode, kot
14
sta hidrazinoliza in β-eliminacija, vendar so te omejene na naravne O-glikane, brez modifikacij, kot je na primer O-acetilacija. Pri uporabi kemijskih metod je neizogibna interferenca N-glikanov, saj se O- in N-glikani sprostijo simultano [15].
Odkritje univerzalne O-glikozidaze ali zanesljive metode sprostitve O-vezanih oligosaharidov ima veliko prednosti. Dve najpomembnejši sta ohranitev osnovnega proteina oz. peptida in s tem možnost identifikacije mesta O-glikolizacije in funkcionalne analize ter možnost
sprostitve točno določene vrste O-glikana, kar omogoča specifično strukturno analizo [5].
2.3.2 Strukturna analiza O-glikanov
Zaradi širokega področja uporabe glikanov je veliko napora namenjenega raziskavi njihove analize in določevanju strukture. Za potrebe nadaljnje analize je glikan treba modificirati, da se izboljša občutljivost detekcije. Glikane lahko modificiramo z derivatizacijo v fluorofore ali pa z uporabo reduktivne aminacije in permetilacije [5].
Podobno kot N-glikani so lahko sproščeni O-glikani analizirani s kromatografskimi
metodami na osnovi elucijskega profila, z metodami MS ali s kombinacijo obeh LC – MS.
Pomembno merilo pri izbiri ustrezne analitske metode so predhodne obdelave O-glikana, saj fizikalno-kemijske lastnosti O-glikanov po obdelavi vplivajo na njihovo interakcijo s
stacionarno fazo [5].
2.3.2.1 Analiza O-glikanov z MS
Masna spektrometrija je znana kot ena najboljših metod za strukturno določevanje glikanov zaradi občutljivosti, potrebe po majhni količini vzorca in z možnostjo analize kompleksih glikanskih mešanic. Poleg določitve glikanske sekvence lahko z MS določimo tudi vzorce razvejanja, mesta substituentov in pridobimo kvantitativne podatke [17].
2.3.2.1.1 Identifikacija in karakterizacija O-glikanov
Zaradi šibke kislosti ali bazičnosti večine glikanov je ionizacija prostih glikanov zelo slaba.
Pred MS-analizo je zato potrebna derivatizacija. Samo derivatizacijo lahko razdelimo v dve kategoriji: označevanje reducirajočih koncev in zaščita funkcionalnih skupin. Za označevanje reducirajočih koncev se uporablja reduktivna aminacija, pri kateri je najpogosteje uporabljen označevalec 2-aminobenzamid, zaščita vseh ali večine funkcionalnih skupin pa se izvede s permetilacijo [17].
Reduktivno aminirani glikani so tako primerni za separacijo s tekočinsko kromatografijo na osnovi hidrofilnih interakcij pred MS-analizo. Separacijska metoda HILIC ločuje glikane po
15
njihovi velikosti in strukturi; tako ločimo med seboj tudi strukturne izomere. Prav tako pa HILIC ločuje tudi nativne glikane. Kolona Thermo Scientific™ GlycanPac™ AXH-1 loči označene in neoznačene glikane z uporabo retencijskih mehanizmov WAX in HILIC.
Funkcija WAX omogoča retencijo in selektivnost za negativno nabite glikane, medtem ko funkcija HILIC omogoča separacijo glikanov enakega naboja glede na njihovo velikost in polarnost. Analiza na osnovi metode HILIC daje neposredne rezultate in omogoča rešitve nekaterih izomernih glikanskih struktur. Elucijski čas je mogoče navajati v enotah glukoze, kar nam daje pomembne strukturne informacije. Pojav ultrazmogljive tekočinske
kromatografije je drastično zmanjšal čas analize in izboljšal njeno ločljivost. Pri določevanju O-glikanov je v uporabi stacionarna faza iz poroznega grafita (PGC), ki lahko ločuje med nativnimi in reduktivnoaminiranimi glikani. Kolona PGC ima širše območje delovanja pH in dobro ločuje med različnimi strukturnimi izomeri. Pred separacijo PGC so O- in N-glikani reducirani; s tem preprečimo α- in β-izomerizacijo hidroksilne skupine na reducirajočem koncu in tako poenostavimo analizo. Za reduktivno aminirane glikane se pri separaciji s PGC po navadi kot označevalec uporablja 2-aminopiridin. Za analizo z MS je prednost uporabe označevalcev na reducirajočih koncih ta, da lokalizirajo naboj na reducirajočih koncih glikana, kar povzroči večinski nastanek fragmentacijskih ionov x, y in z, ki nastanejo, ko pri fragmentaciji CID ali HCD naboj ostane na C-terminalnem koncu peptida, to pa poenostavi strukturno analizo neznanih spojin. Kot sorazmerno nova metoda se PGC manj uporablja pri analizi glikanov biofarmacevtikov, saj ima slabo ponovljivost in robustnost [17, 5].
Alternativno se kot metoda derivatizacije uporablja zaščita vseh ali večine prisotnih
funkcionalnih skupin. Najpogostejša med zaščitami, permetilacija, izboljša MS-ionizacijski odziv vseh prostih glikanov enako, kar omogoča simultano analizo nevtralnih in kislih glikanov. Prav tako permetilacija poveča pojav navzkrižnih in dvojnih glikozidnih razcepov med fragmentacijo, kar pripomore k informaciji o razvejanju in mestu vezave. Razvit je bil mehanizem uporabe kombinacije permetilacije in MS, kar omogoča določevanje vezavnega mesta in razvejanosti; s tem lahko ločujemo med strukturnimi izomeri. Permetilirane glikane lahko pred analizo ločimo z MS [17].
Analiza pridobljenih podatkov je ključen del MS-glikanske analize; za to se uporablja program SimGlycan® software, ki omogoča interpretacijo podatkov MS/MS in MS, pridobljenih na masnem spektrometru Thermo Scientific [17].
16
Slika 4. Potek karakterizacije in identifikacije O-glikanov z MS-metodo [17]
2.3.2.1.2 Kvantifikacija O-glikanov
Detekcija in kvantifikacija separiranih O-glikanskih struktur pri kromatografiji po navadi poteka optično ali elektrokemijsko. Čeprav lahko nativne glikane zaznavamo z absorpcijo pri valovni dolžini 210 nm, jih raje označimo s fluorescenčno oznako in s tem znižamo mejo zaznave. Najbolj razširjena je uporaba 2-aminobenzamida, lahko pa uporabimo tudi 2- aminopiridin, p-aminobenzojsko kislinski etil ester ali 8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfonsko kislino [5].
V zadnjih letih je prišlo na področju kvantifikacije glikanov do razvoja veliko metod; najbolj je v uporabi metoda, ki izkorišča prednosti reduktivne aminacije. Predhodna derivatizacija z uporabo reduktivne aminacije nam omogoča poznejši vnos stabilnih izotopskih oznak na glikane. Podobno kot pri uporabi oznake 2-AB za glikansko karakterizacijo 2-
aminobenzojska kislina, ki je komercialno dostopna v stabilni izotopsko označeni obliki, omogoča večino enakih koristi za analizo LC – MS in jo lahko uporabimo za relativno kvantifikacijo [17].
Pri eksperimentih, izvedenih s stabilno izotopsko oznako 2-AA glikane odcepimo stran od proteinov z encimatsko reakcijo in označimo z izotopsko obliko fluorescenčne oznake 2-
12[C6]-AA ali 2-13[C6]-AA. Po označevanju so vzorci združeni za to, da so poznejši procesni koraki lahko izvedeni na združenih vzorcih, kar nam omogoči natančnejšo kvantifikacijo.
Ekvimolaren, označen in združen vzorec je nato podvržen analizi LC – MS. Sklopitev LC – MS ima veliko prednosti, kot so: separacija določenih strukturnih izomerov, koncentriranje O-glikanov in s tem povečana občutljivost detekcije ter lažja detekcija manjših O-glikanskih specij [5, 17].
17
Označevanje z oznako 2-AA ima veliko prednosti za analizo MS, kot sta na primer
označevanje pod vodnimi pogoji brez predhodne obdelave vzorca in fragmentacija označenih glikanov po predvidljivi poti do ionov, ki jih lahko nedvoumno določimo. Po navadi se eksperimenti 2-AA izvajajo s sistemom LC – MS. Glikani so derivatizirani z izotopskimi oznakami in zato se obnašajo podobno v fazi separacije, kar pomeni, da koeluirajo; med njimi lahko ločujemo z uporabo masnega spektrometra zaradi razlik v masah obeh izotopskih oznak. V primeru 2-AA je med izotopoma z 2-12[C6]-AA ali 2-13[C6]-AA 6 Da razlike.
Relativne intenzitete vrhov izotopsko različnih glikanov so uporabljene za določitev povprečne spremembe v kvantiteti (številčnosti) glikana v obdelanem vzorcu. Ločljivost in masna točnost tehnologije Thermo Scientific™ Orbitrap™ omogočata ločevanje med koeluiranimi izobarnimi ioni, kar je ključno za pravilno kvantifikacijo 2-AA [17].
Analiza glikanov, označenih z oznako 2-AA, zahteva kvantifikacijo in pojasnitev strukture.
Kvantifikacija obsega MS in primerjavo intenzitet prekurzorskih ionov, označenih z obema izotopoma [17].
2.3.2.1.3 Določevanje mesta glikozilacije z MS
Kot je bilo omenjeno, lahko glikane profiliramo tudi na ravni peptidov; s tem dosežemo tudi kvantifikacijo specifičnih mest glikozilacije. Koncentriranje vzorca je glavni dejavnik za učinkovitost tega postopka; lahko ga izvajamo na proteinski ali peptidni ravni, lahko pa tudi na obeh. Koncentriranje je lahko tarčno ali univerzalno, odvisno od informacije, ki jo želimo pridobiti. Tarčno koncentriranje lahko izvajamo za selektivno izolacijo določenih podvrst glikopeptidov ali glikoproteinov na osnovi specifičnih glikanskih struktur [17].
Za ta postopek je potrebnih veliko fragmentacijskih mehanizmov; uporabljajo se različne kombinacije HCD ali CID z ETD. ETD naredi fragmentacijo vzdolž glavne peptidne verige in s tem omogoči sekvencioniranje peptidov in hkrati ohranitev pripetih glikanskih struktur, kar nam poda informacijo o mestu glikozilacije. CID ali HCD pa nam podajata informacijo o glikanski strukturi [17].
18
Slika 5. Potek določanja mesta O-glikozilacije z MS [17]
2.4 Potencialne možnosti nadaljnjega razvoja
Zaradi velikega vpliva glikozilacije na učinkovitost in varnost biofarmacevtskih proteinov mora biti proces glikozilacije nadzorovan in ohranjen na konstantni in optimalni ravni. Tip posttranslacijske modifikacije ni neposredno zapisan na genomu gostitelja, zato kontrola vzorca glikozilacije zahteva podrobno razumevanje biologije in zanesljiv analizni sistem za strukturno karakterizacijo in rutinski nadzor. Obstoječe metode, kot so: CE, HPLC in MS, nam omogočajo podrobno analizo in informacije o N-glikozilaciji biofarmacevtikov. Te metode so del glikoanaliznih platform za regulativno odobritev biofarmacevtskih
glikoproteinov, njihovo celostno analizo in nadzor med serijami njihove proizvodnje. Še vedno smo v iskanju natančnejših metod za določevanje vzorcev glikozilacije v procesu proizvodnje zdravil, prav zaradi ugotovitve, da lahko že majhna sprememba v procesu
povzroči veliko spremembo v lastnostih proteinov, ki nam lahko spremenijo kakovost. Očitno je, da je potrebno nadaljnje raziskovanje v smeri hitre, kvantitativne analize O-glikanov, njihove strukture in mesta pritrditve [5].
Sproščanje O-glikanov ostaja ozko grlo pri njihovi strukturni karakterizaciji. Čeprav smo daleč od odkritja univerzalne O-glikanaze, bi lahko odkrili metodo sproščanja O-glikanov, ki omogoča fluorescenčno označevanje in ne podre same strukture glikana na podlagi že
odkritih metod za analizo N-glikanov [5].
Analiza specifičnega mesta glikozilacije pri O-glikozilaciji predstavlja večji izziv kot pri N- glikozilaciji. Pojav LC – MS in PGC – LC – MS ima potencial za revolucijo
glikoanalitičnega področja zaradi odlične ločljivosti in zmožnosti avtomatizacije postopka dela. Karakterizacija IgG N-glikana je bila popolnoma avtomatizirana na sistemu LC – MS,
19
vendar želimo pridobiti več aplikacij za avtomatizirano pripravo in analizo O-glikopeptidov – od čiščenja, cepitve proteinov, koncentriranja in separacije glikopeptidov ter sekvenciranja peptidov MS/MS in O-glikanov [5].
Pomemben del analize glikolizacije je tudi analiza gostiteljskih celic. Glikolizacija
rekombinantnega produkta je v veliki meri kontrolirana prek metabolizma gostiteljske celice.
Vzorec glikozilacije gostitelja lahko v različnih pogledih predvidi vzorec rekombinantnega produkta. Glikomska analiza na MS-sistemu še ni bila narejena na ravni gostiteljske celice;
velik problem predstavlja heterogenost glikanskega oz. glikopeptidnega vzorca
derivatiziranega iz lizatov celic, ki so zelo raznoliki in lahko vsebujejo veliko interferenc, ki višajo ozadje pri meritvah. V tem pogledu lahko IMS predstavlja zanimivo tehnologijo za ločevanje pomembnega signala od ozadja. Harvey et al. so odkrili, da sklopitev IMS pred MS drastično izboljša razmerje signal – šum in s tem omogoča dobro detekcijo N-glikanov.
Zanimiva bi bila aplikacija te metode za analizo O-glikozilacije v kompleksnih matricah, kot so lizati celih celic za hitro identifikacijo celic z želenimi O-glikanskimi profili [5].
2.5 Rekombinantni človeški eritropoetin
Eritropoetin je glikoproteinski hormon, ki nastaja v ledvicah in jetrih; dokazana je bila tudi sinteza v možganih, maternici, modih in v vranici. Po kemični sestavi je glikoprotein in je najpomembnejši rastni dejavnik. Filogenetsko ga uvrščamo med citokine. EPO deluje neposredno na prekurzorje eritrocitov v kostnem mozgu ter nadzira poliferacijo, zorenje in diferenciacijo. Hemoglobin, na katerega se veže v pljučih kisik in se z eritrociti prenaša v vsa tkiva v telesu, je ključna sestavina eritrocitov. Posledica pomanjkanja eritropoetina povzroči pomanjkanje eritrocitov in znižanje koncentracije hemoglobina v krvi, kar imenujemo slabokrvnost. Poznamo tudi rekombinantne eritropoetine, rEPO, ki se med seboj razlikujejo po sladkornih komponentah, različni vsebnosti sialične kisline ter farmakokinetičnih in farmakodinamičnih lastnostih. Uporaba rEPO v zdravstvu je pomenila napredek pri zdravljenju anemije, ki nastane zaradi kronične odpovedi ledvic [16].
rhEPO je glikoliziran proteinski hormon, ki se uporablja kot del zdravljenja anemije in kronične odpovedi ledvic. Razpolovni čas in biološka aktivnost rhEPO sta v veliki meri določena z glikolizacijo. Za separacijo in detekcijo derivatiziranih glikanov, označenih s fluorescenčno oznako, kot sta na primer antrilna kislina in 2-aminobenzamid, se v veliki meri uporablja HPLC, sklopljen s fluorescenčnim detektorjem. Glikane identificiramo samo z rentencijskim časom v korespondenci z enoto glukoze na koloni. Problem te metode sta težka
20
dostopnost standardov glikanov za določitev retencijskih časov in potreba po velikih količinah vzorca. Čeprav so bile kromatografske metode pogosto dovolj za pretekle regulativne raziskave o naravi bioloških proizvodov v biofarmacevtski industriji, obstaja velika ovira pri njihovi uporabi za raziskovanje novih terapevtskih glikoproteinov, ki so močno N- in O-glikozilirani. V zadnjem času se je pojavil MS kot osrednje orodje za analizo glikanov zaradi svoje ločitvene moči in občutljivosti. Zagotavlja hitro informacijo o glikanski sestavi in strukturi, kar posledično pomeni celovito glikomično karakterizacijo terapevtskih glikoproteinov. Na osnovi MS je bilo razvitih veliko tehnik za analizo glikolizacije na bioterapevtskih glikoproteinih. Metodi HPLC – MS in CE – MS sta bili uspešno uporabljeni za detekcijo kompleksnih terapevtskih glikoproteinov, kot sta rhEPO in monoklonska protitelesa [15].
21
3 Namen dela
Namen dela je pregled literature o O-glikanih, njihovi separaciji, detekciji in o analizi.
Pomemben del je tudi identifikacija pomanjkljivosti trenutnih analitičnih metod in iskanje novih potencialnih možnosti za analizo O-glikolizacije za podporo razvoja in proizvodnje O- glikoziliranih biofarmacevtikov. Trenutno je v ospredju analiza N-glikanov zaradi
pomanjkanja analitičnih orodij za selektivno sprostitev O-glikanov. Univerzalna metoda za njihovo sprostitev in detekcijo še ni bila odkrita, zato sem se osredinila na že opravljene poizkuse karakterizacije O-glikolizacije na eritropoetinu. Zanimalo me je, kakšne so regulacije in zahteve pri odobravanju biološko podobnih zdravil, katere metode in postopki so bili do zdaj že uporabljeni za določevanje oligosaharidov ter kje so pomanjkljivosti teh procesov in kako bi jih lahko izboljšali.
22
23
4 Načrt eksperimenta
Eksperiment zaradi sprejetih ukrepov za zajezitev širjenja okužb z virusom SARS-CoV-2 na UL FKKT ni bil izveden.
4.1 Materiali in reagenti
Za analizo vzorca rhEPO bi potrebovali nespecifično proteazo, pronazo E, tri ločene serije derbepoetina alfa (NESP) in izvedli bi separacijo na trdni fazi s kolono PGC. Vsa topila bi morala biti čistosti HPLC in vsi drugi materiali na analitski ali višji ravni [15].
• 50 µg vzorca terapevtskih glikoproteinov
• 1,0 M NaBH4
• 0,1 M NaOH
• 1,0 M HCl
• Pronaza E
• 100 µL 50 mM fosfatnega pufra s pH 7,5
• 90 % in 40 % vodna raztopina acetonitrila
• 0,1 % in 0,05 % vodna raztopina trifluoroocetne kisline
• Topilo A: 3,0 % vodne raztopine ACN in 0,5 % vodne raztopine metanojske kisline
• Topilo B: 90 % vodne raztopine ACN in 0,5 % vodne raztopine metanojske kisline
• SPE s PGC-koncentracijsko in analitsko kolono; 9 x 0,075 mm ID, 5 µm 4.2 Potek dela
4.2.1 β-eliminacija terapevtskih glikoproteinov
O-glikane bi sprostili z β-eliminacijo. 50 µg terapevtskih glikoproteinov bi raztopili v alkalni raztopini reducenta, tj. mešanici 1,0 M NaBH4 in 0,1 M NaOH. Reakcijo bi izvajali na vodni kopeli pri 43 °C 16 ur, nato bi jo prekinili z dodajanjem 1,0 M raztopine HCl v ledeni kopeli, dokler pH-raztopine ne bi dosegel vrednosti 5,0 [15].
4.2.2 Odstranjevanje interferenc
Po potrebi bi terapevtski glikoprotein skoncentrirali in očistili z uporabo ultrafiltracijske membrane; s tem bi odstranili snovi, ki bi lahko interferirale pri analizi. 50 µg terapevtskega glikoproteina bi združili z enako količino pronaze E v 100 µL 50mM fosfatnega pufra s pH 7,5. Celotno mešanico bi nato inkubirali pri 37 °C šest ur. Reakcijske mešanice bi očistili neposredno z uporabo ekstrakcije na trdno fazo s PGC-kolono [15].
24 4.2.3 Skoncentriranje glikopeptidov s pomočjo SPE
Sproščene O-glikane in glikopeptide bi skoncentrirali z uporabo ekstrakcije na trdno fazo s PGC-kolono. PGC-kolone bi predhodno obdelali z 80-odstotnim ACN, 0,1-odstotno
raztopino trifluoroocetne kisline v vodi in vodno raztopino vzorca; soli bi izprali s pomočjo vode. Nato bi uporabili 40-odstotno raztopino ACN in 0,05-odstotno raztopino
trifluoroocetne kisline v vodi in eluirali vzorce O-glikanov ali O-glikopeptidov. Pod vakuumom bi nato vzorce posušili [15].
4.2.4 Analiza LC – MS in LC – MS/MS
Kromatografsko separacijo bi naredili po predhodno optimiziranih postopkih z modifikacijo mobilne faze. Očiščene raztopine glikopeptidov bi injicirali v sistem nano-LC-chip-Q/TOF.
O-glikopeptidi bi šli skozi PGC s koncentracijsko kolono (9 x 0,075 mm ID, 5 µm) in analitsko kolono (9 x 0,075 mm ID, 5 µm). Mobilna faza bi bila sestavljena iz topila A in topila B. Naraščajoč gradient bi šel od 5 do 35 % B v 16,5 min. Stacionarno fazo bi spirali z 100 % topila B 10 minut pred vrnitvijo na 5 % B [15].
Očiščene raztopine glikopeptidov bi injicirali v sistem nano-LC-chip-Q/TOF; MS-spektre bi pridobili v območju od m/z 500–2.000 v pozitivnem načinu ionizacije [15].
4.2.5 Procesiranje podatkov LC – MS in identifikacija O-glikopeptidov
Po pridobitvi podatkov bi te sprocesirali s pomočjo algoritma vključenega v t. i. MassHunter Qualitative Analysis software, ki upošteva podatke o naboju, izotopski razporeditvi in o retencijskem času. Tako bi pridobili seznam vseh vrhov spojin z njihovimi osnovnimi masami in količino, prisotno v vzorcu [15].
Identifikacijo O-glikopeptidov bi izvedli z uporabo algoritma Gly-coX/GPFinder; s tem bi pridobili seznam potencialnih O-glikopeptidov z upoštevanjem njihove molekulske mase, aminokislinskega zaporedja, primarno in sekundarno generiranega rhEPO, O-glikanske strukture in tolerance mase. Rezultate bi nato ovrednotili glede na predhodno znane glikobiosintetske motive in poti [15].
4.3 Rezultati in razprava
4.3.1 Nedestruktivno profiliranje O-glikanov z glikoproteomskim pristopom
Analit rhEPO bi bil očiščen in skoncentriran z uporabo ultrafiltracije; s tem bi odstranili aditive in detergente. Očiščen rhEPO bi bil obdelan z nespecifično proteazo in preostali O- glikopeptidi bi bili skoncentrirani s pomočjo ekstrakcije na trdni fazi in uporabo PGC-kolone.
25
Nato bi identificirali, profilirali in strukturno določili O-glikopeptide z analizo nanoLC-PGC chip-Q/TOF MS in MS [15].
Slika 6. Proces profiliranja O-glikopeptidov [15]
V rhEPO bi bilo identificiranih kar nekaj O-glikopeptidov, ki bi bili ločeni glede na njihovo strukturo in polarnost na PGC-stacionarni fazi. O-glikopeptidi, ki bi vsebovali nevtralne O- glikane, bi se eluirali prej, medtem ko bi se preostali, ki bi vsebovali sialično kislino, eluirali pozneje. Retencijski čas O-glikopeptidov bi bil odvisen tudi od O-acetilacije, zato bi bili tisti z večjo stopnjo O-acetilacije eluirani pozneje kot nemodificirane spojine [15].
Iz meritev bi pridobili podatke o sestavi, masi in o količini prisotnih O-glikanov, ki jih identificiramo iz glikopeptidov rhEPO [15].
Vzporedno bi sprostili O-glikane iz rhEPO z uporabo metode β-eliminacije in te primerjali z O-glikani, analiziranimi z nespecifično proteolizo. Verjetno je, da s to metodo ne bi
detektirali O-acetiliranih spojin, saj bi močno alkalni pogoji, ki jih uporabimo za odcepljanje O-glikanov, lahko uničili kemijsko labilne, a bioaktivne glikane, kot je O-acetilacija. V tem
26
primeru predvidevamo, da je potrebna nova analitska metoda za analizo nativnih O-glikanov, še posebej terapevtskih glikoproteinov z bioaktivnimi modifikacijami [15].
4.3.2 Strukturna karakterizacija O-glikolizacije na rhEPO
Za razlago strukture O-glikopeptidov bi uporabili analizo CID-MS/MS. Informacijo o O- glikozilaciji, vključno z glikansko strukturo in mestom glikozilacije, bi pridobili iz fragmentacije ionov pri analizi MS [15].
4.3.3 Variacije O-glikozilacije na NESP v različnih serijah
Glikolizacija na terapevtskih glikoproteinih se signifikantno razlikuje glede na pogoje pri sintezi; to lahko vpliva na biološko aktivnost in farmakinetične lastnosti biofarmacevtikov.
Da bi zagotovili kakovost in učinkovitost NESP, bi pri proizvodnji vsake serije izvajali hitre in natančne analize produkta. Pred tem bi ocenili reproducibilnost z analizo treh posameznih vzorcev; če bi ti kazali med seboj veliko podobnost in bi bil Pearsonov korelacijski faktor R blizu 1.00, bi to pomenilo, da ima glikoproteomski pristop z uporabo nespecifične proteolize dobro analitsko ponovljivost. Za analizo ponovljivosti med posameznimi serijami glede na O- glikozilacijo na NESP bi analizirali tri serije. Vsako izmed njih bi analizirali trikrat,
izračunali absolutne intenzitete vrhov za vsako O-glikansko strukturo v posamezni seriji in izračunali povprečje meritev intenzitete vrhov v vseh treh serijah skupaj za posamezno O- glikansko strukturo. Da bi preučili podobnosti in razlike O-glikanov med serijami, bi izračunali vrednosti R za vsak par serij s primerjavo vsakega O-glikana v eni seriji z istim v drugi [15].
27
5 Zaključek
V sklopu diplomskega dela sem raziskovala področje profiliranja O-glikanov v biološko podobnih zdravilih. Profiliranje je kompleksen proces, ki pripomore h karakterizaciji terapevtskih proteinov in biosimilarjev. Ker je glikolizacija ena najpomembnejših
posttranslacijskih modifikacij, do katerih pride med proizvodnjo, mora biti nadzorovana oz.
moramo te spremembe nadzirati eksperimentalno in jih ne moremo predvideti glede na lastnosti proteina. Informacije analize glikanov so uporabne v vseh stopnjah razvoja zdravil za določevanje identitete in kvantitete različnih monosaharidov oz. glikanov, ki so prisotni, tipa glikozilacije, tj. O-glikozilacija ali N-glikozilacija, za preverjanje soslednosti serij med proizvodnim procesom, primerjavo glikoproteinov, proizvedenih s pomočjo različnih celic, ter nadzor stabilnosti in sprostitve glikanov.
Glikolizacija ima velik vpliv na varnost in učinkovitost biofarmacevtikov. Zahtevana je stalna rutinska analiza glikanskega profila. Trenutno je v ospredju analiza N-glikanov zaradi
pomanjkanja analitičnih orodij za selektivno sprostitev O-glikanov in pomanjkanja razumevanja biologije O-glikozilacije. Sama O-glikozilacija pripelje do večje strukturne heterogenosti, saj poteka na različne načine. Univerzalna metoda za njihovo sprostitev in detekcijo še ni bila odkrita. Vse kemijske metode sprostitve imajo pomanjkljivost v specifiki za selektivno sprostitev O-glikanov namesto N-glikanov. Pri uporabi kemijskih metod je neizogibna interferenca N-glikanov, saj se O- in N-glikani sprostijo simultano. Prav tako ne poznamo učinkovite encimatske metode za sprostitev O-glikanov. Odkritje univerzalne O- glikozidaze ali zanesljive metode sprostitve O-vezanih oligosaharidov bi imelo veliko prednosti. Dve najpomembnejši sta ohranitev osnovnega proteina oz. peptida in s tem možnost identifikacije mesta O-glikolizacije in funkcionalne analize ter možnost sprostitve točno določene vrste O-glikana, kar omogoča specifično strukturno analizo. Sproščene O- glikane lahko označimo, derivatiziramo ali analiziramo nativno z metodami HPLC, MS ali LC-MS, ki imajo različne prednosti in slabosti. Analiza O-glikopeptidov z metodo MS ali LC - MS prinese veliko pomembnih informacij, a predstavlja velik tehnološki izziv.
Z napredki v analizi O-glikozilacije in boljšim razumevanjem njene vloge v zdravstvu in farmaciji se stalno daljša seznam O-glikoziliranih proteinskih zdravil in potencialnih kandidatov za zdravila. Uspešnost pridobivanja terapevtikov se v veliki meri nanaša na konsistenco v kakovosti, vključno z O-glikozilacijskim vzorcem in zmožnostjo njegovega ohranjanja skozi različne stopnje bioprodukcije. Razvoj strukturne O-glikomije bo šel
28
verjetno v dveh komplementarnih smereh: podrobna analiza O-glikanov oz. O-glikopeptidov za pridobivanje podatkov fine strukture, kar vključuje informacije o glikanski kompoziciji, vezavi in o pritrjenih peptiddnih sekvencah, in pa O-glikanska oz. O-glikoproteomska karakterizacija za analizo gostiteljske celice in produkta. S tem bomo pridobili informacije o elucijskem profilu, glikanskem odtisu, vzorcu fragmentacije in še več. Želimo si tudi ustvariti strukturne baze podatkov, ki bi vključevale O-glikanske standarde in bi bile lahko dostopne ter vključene v analizo za avtomatsko kromatogram/spekter interpretacijo. Integracija O- glikomije z drugimi oblikami, kot so: genomika, transkriptomika in metabolomika,
predstavlja zanimivo področje za razumevanje regulacije O-glikolizacije na sistemski ravni in nam lahko pripomore pri efektivnem zdravljenju O-glikozilacijsko povezanih bolezni in produkciji O-glikozilacijsko optimiziranih glikoproteinskih zdravil.
Enak eksperiment kot bi ga naredila sama, je bil izveden že prej, zato lahko komentiramo že pridobljene ugotovitve. Čeprav so N- in O-glikani močno prisotni na rhEPO, je bila
karakterizacija O-glikanov veliko slabša glede na N-glikane zaradi pomanjkanja analitičnih metod in orodij za sprostitev O-glikanov v neokrnjeni obliki stran od rhEPO. V našem primeru bi celovito karakterizacijo O-glikanov na rhEPO dosegli z glikoproteomskim pristopom z nespecifično proteolizo. Uporaba proetaz za pripravo O-glikopeptidov presega trenutne metode za sprostitev O-glikanov, ki se zanašajo na alkalno β-eliminacijo ali druge kemijske obdelave, ki so močno destruktivne za O-acetilne in druge modifikacije. Pri že izvedenem eksperimentu so z analizo nanoLC-MS/MS O-glikopeptidov pridobili podrobne strukturne podatke o biološko aktivnih motivih, kot je O-acetilacija na rhEPO. Kvantizacija glikanov in glikopeptidov je zahtevna zaradi strukturne kompleksnosti glikanske
heterogenosti in pomanjkanja čistih standardov. Prav tako lahko pride do izgube bioaktivnih motivov, kot je O-acetilacija na rhEPO, zaradi ostrih pogojev derivatizacije ali označevanja za UV- ali fluorescenčno detekcijo, kar lahko povzroči napačno kvantizacijo.
Rezultati že narejenega eksperimenta so pokazali, da je mogoča karakterizacija O-
glikozilacije na rhEPO, vključno z O-acetilacijo na sialični kislini. Podatki o O-glikanski strukturi in O-acetil modificiranih mestih so bili pridobljeni s tandemsko MS. To metodo lahko uporabimo za analizo tudi drugih bioterapevtikov z več O-glikozilacijskimi mesti.
29 6
Literatura
[1] P. Valverde, A. Ardá, N.-C. Reichardt, J. Jiménez - Barbero in A. Gimeno: Glycans in drug discovery. MedChemComm, 2019, 10, 1678–1691.
https://doi.org/10.1039/C9MD00292H (pridobljeno 20. jul. 2021).
[2] Glycans: A critical quality attribute for biopharmaceutical products. BioPharma Services.
https://www.eurofins.com/biopharma-services/media/pharma-newsletters/eurofins- biopharma-services-newsletter-15-october-
2016/glycans/?fbclid=IwAR3eDwJnfYmkm0PdLLnvkTXiH0l9tM5IFUCrap2S0UVvpRZpP KQQxH64Xn (pridobljeno 20. jul. 2021).
[3] A. Varki, R. Kannagi in B. P. Toole: Glycosylation Changes in Cancer, 2009.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1963/ (pridobljeno 20. jul. 2021).
[4] Podobna biološka zdravila v EU. Evropska agencija za zdravila in Evropska komisija.
https://www.ema.europa.eu/en/documents/leaflet/biosimilars-eu-information-guide- healthcare-
professionals_sl.pdf?fbclid=IwAR2d6QPG4BTykxQAS06CZzSvy4TapJsNiho2FXdn9RtHi9 _SLoeHn0Bkr-4 (pridobljeno 20. jul. 2021).
[5] P. Zhang, M. Bardor, Z. Zhiwei Song in T. Wang: Pharmaceutical future science group.
2013. https://doi.org/10.4155/PBP.13.7 (pridobljeno 23. jul. 2021).
[6] A. Varki, R. Cummings, J. Esko, H. Freeze, G. Hart in J. Marth: O-Glycans. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20721/
(pridobljeno 23. jul. 2021).
[7] D. T. Tran in K. G. Ten Hagen: Mucin-type O-Glycosylation during Development. The Journal of Biological Chemistry. 2013, 288, 6921–6929.
https://doi.org/10.1074/jbc.R112.418558 (pridobljeno 23. jul. 2021).
[8] Mucin. Merck KGaA. https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/technical-
documents/technical-article/protein-biology/enzyme-activity-assays/mucin (pridobljeno 20.
jul. 2021).
[9] U. Conti Reed: Glycosylation of alpha-DG in normal muscle: glycans attached.
https://www.researchgate.net/figure/A-Glycosylation-of-alpha-DG-in-normal-muscle- glycans-attached-to-alpha-DG-link-the_fig2_26312334 (pridobljeno 20. jul. 2021).
[10] Glycans and Disease. GlyTech, Inc. https://www.glytech-inc.com/glycan/glycans-and- disease/#:~:text=Glycans%20are%20involved%20in%20disease (pridobljeno 20. jul. 2021).
30
[11] E. Maverakis, K. Kim, M. Shimoda, M. E. Gershwin, F. Patel, R. Wilken, … C. B.
Lebrilla. Glycans in the immune system and The Altered Glycan Theory of Autoimmunity: A critical review. Journal of Autoimmunity, 2015, 57, 1–13.
https://doi.org/10.1016/j.jaut.2014.12.002 (pridobljeno 30. avg. 2021).
[12] C. St-Pierre, H. Manya, M. Ouellet, G. F. Clark, T. Endo, M. J. Tremblay in S. Sato:
Host-Soluble Galectin-1 Promotes HIV-1 Replication through a Direct Interaction with Glycans of Viral gp120 and Host CD4, 2020. Pridobljeno 23. 7. 2021.
https://jvi.asm.org/content/85/22/11742 (pridobljeno 23. jul. 2021).
[13] J. E. Hudak in C. R. Bertozzi: Glycotherapy: New Advances Inspire a Reemergence of Glycans in Medicine. Chemistry & Biology, 2014, 21, 16–37.
https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2013.09.010 (pridobljeno 30. avg. 2021).
[14] T. Bratkovič: Imunogenost bioloških zdravil, 2017.
https://www.dlib.si/stream/URN:NBN:SI:DOC-KO4S4RSN/93217d54-df43-4dbf-9bf4- 2c85e07889c2/PDF (pridobljeno 23. jul. 2021).
[15] U. Kim, M. J. Oh, Y. Seo, Y. Jeon, J.-H. Eom, in H. J. An: Sensitive and comprehensive analysis of O-glycosylation in biotherapeutics: a case study of novel erythropoiesis
stimulating protein. Bioanalysis, 2017, 9, 1373–1383. https://doi.org/10.4155/bio-2017-0085 (pridobljeno 23. jul. 2021).
[16] Eritropoetin. Wiki FKKT. http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Eritropoetin (pridobljeno 30. avg. 2021).
[17] Thermo Scientific: Thermo Scientific Guide to Glycan Analysis, 2013.
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/BR63722_Glycans_0713S_medium.pdf (pridobljeno 30. avg. 2021).
