DIPLOMSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Sonja Mavri

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJA

Določanje kinurenske kisline v medu s tekočinsko kromatografijo z UV in fluorescenčno detekcijo

DIPLOMSKO DELO

Sonja Mavri

M

ENTOR

: izr. prof. dr. Drago Kočar

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Sonja Mavri sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Določanje kinurenske kisline v medu s tekočinsko kromatografijo z UV in fluorescenčno detekcijo.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom izr.

prof. dr. Draga Kočarja;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

 je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki dela.

V Ljubljani, 14. 08. 2021 Podpis avtorice:

(6)

(7)

Zahvaljujem se svojemu mentorju, izr. prof. dr. Dragu Kočarju, ter raziskovalcu na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo Anžetu Pavlinu, mag. kem., za pomoč in usmeritve pri izdelavi te diplomske naloge.

(8)

(9)

Določanje kinurenske kisline v medu s tekočinsko kromatografijo z UV in fluorescenčno detekcijo

Povzetek: Kinurenska kislina je biološko pomembna organska spojina, ki jo med drugim najdemo tudi v medu. Na podlagi pregledane literature sem razvila metodo za določanje kinurenske kisline v medu s tekočinsko kromatografijo z UV in fluorescenčno detekcijo.

Kot topilo za vzorce sem izbrala 0,1% vodno raztopino amonijaka, kot mobilno fazo pri kromatografiji pa mešanico acetonitrila in vodne raztopine mravljične kisline. Valovne dolžine svetlobe za detekcijo kinurenske kisline sem določila na podlagi posnetih absorpcijskih in emisijskih spektrov: valovna dolžina absorpcije in vzbujanja pri 240 nm, valovna dolžina emisije pri 410 nm. Analizno metodo sem validirala s določitvijo linearnosti, ponovljivosti, LOD in LOQ. Z metodo umeritvene krivulje sem določila koncentracijo kinurenske kisline v 12 vzorcih medu proizvajalca Medex. Najvišja koncentracija kinurenske kisline je bila v kostanjevem medu, najmanjša pa v akacijevem medu.

Ključne besede: kinurenska kislina, med, tekočinska kromatografija

Analysis of kynurenic acid in honey by high-performance liquid chromatography method with UV and fluorescence detection

Abstract: Kynurenic acid is a biologically important organic compound that can be found in honey. Based on the reviewed literature, a method was developed for determining kynurenic acid content in honey by liquid chromatography with UV and fluorescence detection. 0.1% solution of ammonia in water was selected as the solvent for the samples, and a mixture of acetonitrile and water solution of formic acid as the mobile phase for chromatography. Wavelengths of light for the detection of kynurenic acid were determined on the basis of recorded absorption and emission spectra: absorption and excitation wavelength at 240 nm and emission wavelength at 410 nm. The analytical method was validated by determining linearity, repeatability, limit of detection, and limit of quantitation. Using the calibration curve method, content of kynurenic acid was analysed in 12 samples of Medex honey. The highest concentration was found in chestnut honey and the lowest in acacia honey.

Keywords: kynurenic acid, honey, liquid chromatography

(10)

(11)

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Med: lastnosti in sestava ... 1

1.1.1 Naravna stabilnost medu ... 1

1.1.2 Fizikalne in kemijske lastnosti ... 1

1.2 Kinurenska kislina ... 2

1.2.1 Prisotnost kinurenske kisline v organizmih in živilih ... 2

1.2.2 Vplivi kinurenske kisline na organizem ... 2

1.2.3 Struktura in določanje kinurenske kisline ... 4

1.3 Tekočinska kromatografija z UV in FL detekcijo ... 4

1.3.1 Princip določanja s tekočinsko kromatografijo ... 4

1.3.2 UV detekcija ... 5

1.3.3 Fluorescenčna detekcija ... 6

1.4 Parametri za validacijo analizne metode ... 6

1.4.1 Linearnost ... 6

1.4.2 Meja zaznave (LOD) in meja določitve (LOQ)... 7

1.4.3 Ponovljivost ... 7

2 Namen dela ... 9

3 Eksperimentalni del ... 11

3.1 Topilo ... 11

3.2 Vzorci ... 11

3.3 Standardi ... 11

3.3.1 Osnovna standardna raztopina ... 11

3.3.2 Standardne raztopine za umeritveno krivuljo ... 11

3.3.3 Raztopine za določitev ponovljivosti, LOD in LOQ ... 11

3.4 Pogoji HPLC analize ... 11

3.5 Spektrofotometrična določitev valovnih dolžin za FL detektor ... 12

4 Rezultati in razprava ... 15

(12)

4.1 Umeritvena krivulja in validacija analizne metode ... 15

4.1.1 Umeritvena krivulja in linearnost ... 15

4.1.2 Ponovljivost pri pripravi raztopin ... 16

4.1.3 Meja zaznave in meja določitve ... 16

4.2 Določitev kinurenske kisline v vzorcih ... 17

4.2.1 Primeri kromatogramov vzorcev ... 17

4.2.2 Vsebnost kinurenske kisline v vzorcih ... 18

5 Zaključek ... 21

5.1 Povzetek ugotovitev ... 21

5.2 Možnosti za izboljšavo metode in nadaljnje raziskovanje ... 21

6 Literatura ... 23

Kazalo slik

Slika 1: Struktura molekule kinurenske kisline v enolni obliki ... 4

Slika 2: Spreminjanje sestave mobilne faze med ločbo ... 12

Slika 3: Prikaz deprotonacije molekule kinurenske kisline ... 13

Slika 4: Spekter vzbujanja v kislem in bazičnem ... 13

Slika 5: Emisijski spekter v kislem in bazičnem ... 14

Slika 6: Umeritvena krivulja ... 15

Slika 7: Kromatogram A043 (akacijev med, nizka vsebnost kinurenske kisline) ... 17

Slika 8: Kromatogram L061 (lipov med, srednja vsebnost kinurenske kisline) ... 17

Slika 9: Kromatogram K4 (kostanjev med, visoka vsebnost kinurenske kisline)... 18

Kazalo tabel

Tabela 1: Meritve za izris umeritvene krivulje... 15

Tabela 2: Podatki za oceno ponovljivosti ... 16

Tabela 3: Vsebnost kinurenske kisline v vzorcih ... 18

(13)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

HPLC-UV tekočinska kromatografija z ultravijolično detekcijo HPLC-FL tekočinska kromatografija s fluorescenčno detekcijo

HPLC-MS tekočinska kromatografija z detekcijo z masnim spektrometrom RSD relativni standardni odklon

LOD meja zaznave (angl. limit of detection) LOQ¸ meja določitve (angl. limit of quantitation) r korelacijski koeficient

R² koeficient determinacije

γ masna koncentracija

w masni delež

λ valovna dolžina

A ploščina kromatografskega vrha

MQ voda posebej čista, prefiltrirana voda (Milli-Q)

(14)

(15)

Določanje kinurenske kisline v medu s tekočinsko kromatografijo z UV detekcijo Sonja Mavri

1

1 Uvod

1.1 Med: lastnosti in sestava

Med je sladka snov, ki jo proizvajajo medonosne čebele in nekatere druge žuželke. Služi jim kot zaloga hrane za obdobja pomanjkanja, pridobijo pa ga iz zbranega rastlinskega nektarja in medičine. Hranijo ga v satovju iz čebeljega voska. Zaradi svojega sladkega okusa in nepokvarljivosti je med kot živilo postal privlačen ljudem že v času prazgodovine, kasneje pa so ga začeli uporabljati tudi v medicini za lajšanje kašlja, želodčnih težav in za zdravljenje ran [1].

1.1.1 Naravna stabilnost medu

Med je bogat vir energije, hkrati pa je naravno odporen proti mikrobiološkim vplivom in se zato praktično ne pokvari. Glavni vzrok za to je odstranitev večine vsebovane vode pri pretvorbi nektarja. Čebele poskrbijo za izhlapevanje vode tako, da nektar razporejajo po čim večji površini v panju, druge pa medtem z mahanjem kril poskrbijo za stalen tok toplega zraka. Tako nastane prenasičena raztopina sladkorjev (predvsem glukoze in fruktoze) z zelo visokim osmotskim potencialom: bakterije in glive kvasovke v njej dehidrirajo in se zato ne morejo namnožiti. Drugi mehanizem, ki poskrbi, da se med ne pokvari v času, ko je še razredčen, pa je reakcija glukoza oksidaze: to je encim, ki ga čebele same proizvajajo in dodajajo sladki raztopini. V razredčeni raztopini medu glukoza oksidaza cepi glukozo v glukonsko kislino in vodikov peroksid, za slednjega pa je značilno močno protimikrobno delovanje. Glukonska kislina medu zniža pH, kar dodatno pripomore k nepokvarljivosti, pa tudi h končnemu okusu. Večina vodikovega peroksida med procesom koncentriranja izhlapi [1].

1.1.2 Fizikalne in kemijske lastnosti

Med je rumene do rjave barve in sladkega okusa, njegove fizikalne in kemijske lastnosti pa se razlikujejo od vrste do vrste. Je rahlo kisel: njegova pH vrednost je približno 4. Pri 20°C njegova gostota znaša med 1386 in 1403 kg/m³, viskoznost pa okrog 15 Pa s.

Viskoznost izrazito pada z višanjem temperature [2].

Med je higroskopen in lahko ob dovolj visoki relativni vlažnosti zraka (nad 60%) iz njega absorbira vodo. Značilen pojav je tudi spontana kristalizacija, pri kateri se iz prenasičene raztopine izloči glukoza monohidrat v obliki kristalov. Pri tem med preide iz prozornega, tekočega stanja v gosto in motno. Ta proces je reverzibilen in poteče v obratno smer ob rahlem segrevanju [1].

V medu najdemo okrog 200 različnih spojin. Vsebuje 70-80% sladkorjev in 10-20% vode [2]. Preostanek predstavljajo proteini, organske kisline, vitamini, minerali, pigmenti, fenoli, različne hlapne spojine in trdni delci [3].

(16)

2

Razmerje različnih sladkorjev v medu je odvisno od njegovega geografskega in botaničnega izvora, pa tudi načina pridelave in shranjevaja. Tako lahko iz razmerja koncentracij fruktoze in glukoze pogosto sklepamo na vrsto medu, še posebej, če ta izvira le od ene rastlinske vrste [3].

Vsebnost proteinov v medu je odvisna od vrste čebel, ki so ga pridelale. Večina proteinov izvira iz cvetnega prahu, nekatere pa prispevajo čebele pri pretvorbi nektarja v med (npr.

z izločki njihovih žlez slinavk) [3].

V medu najdemo tudi okrog 0,57% organskih kislin, ki so povezane z njegovo končno barvo, okusom in pH vrednostjo. Največ je glukonske kisline, ki je produkt encimske cepitve glukoze, prisotne pa so tudi citronska, ocetna, mravljična, fumarna, galakturonska, malonska in druge kisline [3]. Med njimi najdemo tudi kinurensko kislino, ki jo preiskujem v tej diplomski nalogi.

1.2 Kinurenska kislina

1.2.1 Prisotnost kinurenske kisline v organizmih in živilih

Kinurenska kislina je organska kislina, ki nastane v organizmu kot razgradni produkt triptofana. Njeno prisotnost so dokazali v urinu, serumu, plodovnici in sklepni tekočini, v koncentracijah od 0,02 do 0,8 µM [4]. Glede na njeno delovanje na določene receptorje so sklepali, da se nahaja tudi v možganih, kjer te receptorje najdemo. Nadaljnje študije so pokazale še prisotnost kinurenske kisline v prebavnem traktu, skozi katerega njena koncentracija vseskozi narašča: najmanj so je našli v človeški slini (0,003 μM), največ pa v črevesni sluzi podgan (16,1μM) [5].

V različnih koncentracijah se nahaja tudi v živilih predvsem v zelenjavi (npr. v brokoliju in krompirju). Veliko kinurenske kisline najdemo v medu, še več pa v nekaterih zeliščih in začimbah: regratu, krvavem mlečniku, šentjanževki, koprivi, poprovi meti, listih breze in nekaterih sredozemskih začimbah [4, 5]. Nahaja se tudi v alkoholnih pijačah: največjo koncentracijo so določili v medici, ki ji sledijo vino, pivo in žgane pijače [6].

1.2.2 Vplivi kinurenske kisline na organizem

Znani so številni različni biološki vplivi kinurenske kisline. Nekateri so že podrobno raziskani, mehanizmi drugih pa še niso znani. Opisala bom nekaj primerov, povzetih po novejših znanstvenih študijah.

Prisotnost kinurenske kisline je povezana z delovanjem prebavil: pomagala naj bi pri težavah z kolitisom, razjedami in obstrukcijo debelega črevesa [4].

(17)

3

Neravnovesje procesov, ki v telesu uravnavajo tvorbo kinurenske kisline in drugih derivatov triptofana, nekatere študije povezujejo s psihotičnimi in razpoloženjskimi motnjami. Iz triptofana se s pomočjo encimov tvori spojina kinurenin, ta pa lahko vstopa v enega od dveh procesov pretvorbe, ki se med seboj izključujeta: prvi kot končni produkt da kinurensko kislino, drugi pa 3-hidroksikinurenin (ta se naprej pretvori v 3- hidroksiantralno kislino in kinolinsko kislino). 3-hidroksikinurenin in njegovi derivati so znani kot nevrotoksične spojine, ki lahko sprožijo oksidativni stres in celično smrt.

Običajno v telesu nastaja približno enaka količina kinurenske kisline in 3- hidroksikinurenina. Drugače je pri osebah s psihotičnimi in razpoloženjskimi motnjami:

v krvi in cerebrospinalni tekočini oseb s hudo depresijo so opazili zmanjšano koncentracijo kinurenske kisline in/ali povečano koncentracijo metabolitov 3- hidroksikinurenina. Nasprotno pa so nekatere študije pokazale zvišano raven kinurenske kisline pri osebah z bipolarno motnjo in shizofrenijo [7].

Pri osebah z zvišano ravnjo maščob v krvi (hiperlipidemija) se v mišičnih in maščobnih tkivih pojavita vnetje ter odpornost na inzulin. Uporaba kinurenske kisline lahko oba pojava oslabi, saj poveča raven oksidacije maščobnih kislin v mišicah. Poleg tega povzroči tudi pretvorbo belih maščobnih celic v rjave, kar nadalje zniža njihovo odpornost na inzulin [8].

Zanimivi so tudi podatki, ki nakazujejo možnost uporabe kinurenske kisline kot sredstvo za preprečevanje debelosti (angl. anti-obesogen). Študija, objavljena leta 2019, je raziskovala vpliv kinurenske kisline v prehrani novorojenih podgan: našli so jo v mleku samic in njeno vsebnost še povečali z umetnim dodajanjem kinurenske kisline v vodo, ki so jo samice pile. Mladiči, hranjeni z mlekom z visoko koncentracijo kinurenske kisline, so s časom razvili manjšo telesno težo kot normalno hranjeni mladiči, brez razlik v kostni gostoti in skupni površini telesa. Raziskovalci so tako odkrili možno povezavo med načinom hranjenja dojenčkov in njihovo telesno težo v odrasli dobi. Kinurenska kislina je namreč naravno prisotna v materinem mleku, njena koncentracija pa se s časom dojenja še povečuje (teden dni po začetku dojenja: 10 μg/L; po 6 mesecih: okrog 60 μg/L). V prilagojenem mleku v prahu, ki se uporablja kot nadomestek, je koncentracija kinurenske kisline le okrog 5 μg/L. Uporaba nadomestnega mleka v prahu se v zadnjih letih povsod po svetu povečuje, zato bi povečanje vsebnosti kinurenske kisline v mleku v prahu za dojenčke morda lahko prispevalo k reševanju vedno hujše problematike debelosti pri prebivalcih razvitih delov sveta [9].

(18)

4

1.2.3 Struktura in določanje kinurenske kisline

Struktura molekule kinurenske kisline je prikazana na sliki 1. Pri molekuli lahko opazimo pojav keto-enolne tavtomerije: na sliki 1 je enolna oblika, keto obliko pa prikazuje slika 3 (poglavje 3.5, str. 13).

Slika 1: Struktura molekule kinurenske kisline v enolni obliki

Pri obsevanju s svetlobo primerne valovne dolžine elektroni v molekuli kinurenske kisline prehajajo na višje energijske nivoje (ekscitacija) in se nato po zelo kratkem času spustijo v prvoten položaj (relaksacija), energijo pa oddajo v obliki fotona. Temu pojavu pravimo fluorescenca. Značilen je le za 5-10% vseh znanih organskih spojin, zato ga lahko izkoriščamo za visoko specifično detekcijo s fluorescenčnim detektorjem, ponavadi v kombinaciji s HPLC. Kinurensko kislino lahko določamo tudi z UV detekcijo, z masnim spektrometrom in z jedrsko magnetno resonanco [10].

1.3 Tekočinska kromatografija z UV in FL detekcijo

1.3.1 Princip določanja s tekočinsko kromatografijo

Kromatografija je tehnika ločevanja, ki temelji na različni hitrosti potovanja spojin skozi neko kromatografsko sredstvo (ponavadi kolono). Sistem je sestavljen iz stacionarne faze, ki miruje, in mobilne faze, ki potuje preko stacionarne; fazi se razlikujeta po polarnosti.

Preiskovane spojine se glede na svojo polarnost med fazama nenehno porazdeljujejo - premikajo se torej le, ko se nahajajo v mobilni fazi. Zato je njihova hitrost potovanja različna glede na polarnost (torej glede na njihovo topnost v mobilni oz. stacionarni fazi).

Tako se s časom spojine ločijo [11].

(19)

5

Za tekočinsko kromatografijo je značilno, da je mobilna faza tekočina, spojine pa potujejo skozi kolono v raztopini. Topila, ki jih uporabljamo kot mobilno fazo, morajo biti čista in brez trdnih delcev, saj bi ti zamašili kolono [11].

Sestavni deli naprave za HPLC (tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti) so:

 razplinjevalnik - iz topila izloči mehurčke zraka, ki bi sicer motili signal na detektorju;

 črpalka - potiska mobilno fazo skozi kolono pod visokim tlakom (nekaj 100 barov);

 injektor - vnaša vzorec v tok mobilne faze tik pred kolono;

 kolona - cevka iz nerjavečega jekla, premera nekaj milimetrov in dolžine od 5 do 25 cm. Polnjena je z drobnimi delci silikagela, na katere je nanešena stacionarna faza;

 detektor - spremlja sestavo mobilne faze ob izstopu iz kolone preko merjenja absorbance, fluorescence, lomnega količnika ipd. [11].

Signal z detektorja vodimo v računalnik, ki nam izriše kromatogram (graf odvisnosti signala od časa, ki je potekel od injiciranja vzorca). Kromatografski vrh za vsako spojino se na kromatogramu pojavi ob značilnem času, ki mu pravimo retencijski čas; pove nam, koliko časa se je ta spojina zadrževala na koloni. Retencijski čas nam pomaga spojino identificirati. Ploščina vrha je sorazmerna s koncentracijo oz. količino spojine, ki jo je detektor zaznal [10].

1.3.2 UV detekcija

Tekočini na izhodu iz kolone merimo absorbanco v UV delu spektra elektromagnetnega valovanja. Absorbanca je pri primerno nizkih količinah analita sorazmerna s koncentracijo. Optimalno valovno dolžino merjenja določimo tako, da posnamemo absorpcijski spekter za širši obseg valovnih dolžin in izberemo tisto, pri kateri naša preiskovana spojina najbolj intenzivno absorbira [10].

Sestavni deli UV detektorja so:

 vir svetlobe - običajno devterijeva ali ksenonova žarnica;

(20)

6

 monokromator - optični filter, prizma ali uklonska mrežica, ki omogoči izbiro valovne dolžine;

 senzor: fotocelica, fotopomnoževalka ali fotodioda [10].

Ta način detekcije ni destruktiven - preiskovana spojina ostane nespremenjena. Zaznamo vse komponente raztopine, ki absorbirajo elektromagnetno valovanje izbrane valovne dolžine, zato je potrebna previdnost pri izbiri topil: mobilna faza ne sme absorbirati UV svetlobe (biti mora prozorna za uporabljeno valovno dolžino) [10].

1.3.3 Fluorescenčna detekcija

Molekule pri absorpciji elektromagnetnega valovanja prejmejo energijo, ki jo v večini primerov oddajo v obliki sproščene toplote pri trkih z drugimi molekulami. Pri nekaterih spojinah opazimo pojav fluorescence, ko molekule oddajo energijo v obliki emitiranega fotona z daljšo valovno dolžino od vzbujevalne. Ker fluorescira le majhno število znanih spojin, je metoda HPLC-FL zelo selektivna. Princip detekcije je podoben kot pri merjenju absorbance, le da je senzor postavljen pravokotno glede na pot vpadnega žarka in tako v idealnem primeru zazna samo tisto svetlobo, ki je posledica fluorescence. Intenziteta emitirane svetlobe je sorazmerna intenziteti vzbujevalne, zato uporabljamo močne vire svetlobe - tako dosežemo večjo občutljivost tehnike [10].

1.4 Parametri za validacijo analizne metode

Pri uvajanju analizne metode mora le-ta prestati postopek validacije, tj. sistematičnega preverjanja karakteristik metode glede na naše zahteve. Zanimajo nas selektivnost, občutljivost, linearnost, robustnost, merilno območje ipd. [10]. V nadaljevanju so opisani parametri, ki sem jih izbrala za validacijo metode pri tej diplomski nalogi: linearnost, meja zaznave, meja določitve in ponovljivost.

1.4.1 Linearnost

Tekočinska kromatografija je za razliko od »direktnih« analiznih tehnik (npr.

gravimetrija, volumetrija) osnovana na zvezi med odzivom instrumenta in koncentracijo analita. Preden lahko začnemo izvajati meritve na raztopinah vzorcev, je zato potrebno izvesti kalibracijo oz. umerjanje. V ta namen se najpogosteje uporablja umeritvena krivulja, kjer izmerimo odziv instrumenta za serijo raztopin z znano koncentracijo analita (imenujemo jih standardne raztopine). Želimo, da se na grafu odvisnosti odziva od koncentracije te meritve čim bolj natančno prilegajo premici - temu pravimo linearnost.

Merilo za prileganje premici je korelacijski koeficient r, izračunan po enačbi 1.

(21)

7

𝑟 =

^∑^𝑁^𝑖=1^[(x^𝑖^{−𝑥̅)∙(y}^𝑖^−𝑦̅)]

√[∑^𝑁_𝑖=1(x_𝑖−𝑥̅)²]∙[∑^𝑁_𝑖=1(y_𝑖−𝑦̅)²]

(1)

Koeficient r se mora za doseg linearnosti čim bolj približati vrednosti ±1, pogosteje pa računamo kar njegovo kvadratno vrednost r²(koeficient determinacije), ki jo želimo čim bližje vrednosti 1 [10]. Sicer pa nam računalniški program, kot je Microsoft Excel, vrednost r² izračuna avtomatsko ob izrisu premice.

1.4.2 Meja zaznave (LOD) in meja določitve (LOQ)

Ta dva parametra nam podata informacijo o razponu merilnega območja, in sicer kako nizke koncentracije vzorca s preiskovano metodo še lahko zanesljivo izmerimo.

Meja zaznave (tudi meja detekcije, angl. limit of detection, LOD) je najmanjša še zanesljivo izmerjena količina analita, ki daje različen odziv od ozadja (šuma, angl. noise).

Izračunamo jo kot tisto koncentracijo analita, ki daje signal enak slepi vrednosti, povečani za 3-kratni standardni odklon slepe vrednosti. Pri HPLC jo eksperimentalno določimo kot tisto koncentracijo standardne raztopine, pri kateri je na kromatogramu razmerje med višino vrha za analit in višino nihanja ozadja 3:1 [10, 12].

Podobno je meja določitve (tudi meja kvantifikacije, angl. limit of quantitation, LOQ) najmanjša količina analita, ki jo lahko določimo s sprejemljivo točnostjo. Ustreza signalu slepe vrednosti, povečanemu za 10-kratno vrednost standardnega odklona slepega vzorca.

Eksperimentalno jo pri HPLC določimo kot koncentracijo, pri kateri je razmerje med višino vrha in ozadjem 10:1 [10, 12].

1.4.3 Ponovljivost

Ponovljivost je natančnost merilnih rezultatov, kot jo dobimo pri večkratnem zaporednem merjenju istega analita v kratkem časovnem obdobju pri enakih pogojih: torej ista metoda, isti analitik in isti laboratorij. Želimo, da so si meritve med seboj čim bolj podobne - da je negotovost merilnih rezultatov čim manjša. Merilo za ponovljivost je relativni standardni odklon RSD, ki ga izračunamo kot količnik standardnega odklona s (enačba 2) in povprečja meritev x̄ [10].

𝑠 = √

^∑^𝑁^𝑖=1^(𝑥^𝑖^−𝑥̅)²

𝑁−1 (2)

(22)

(23)

9

2 Namen dela

Namen tega diplomskega dela je bil najprej raziskati literaturo s področja medu, kinurenske kisline, tekočinske kromatografije, ultravijolične in fluorescenčne detekcije ter parametrov za validacijo analiznih metod.

Sledilo je eksperimentalno delo, katerega cilj je bil razviti metodo za določanje kinurenske kisline v medu s HPLC-UV in HPLC-FL: določiti vse pogoje merjenja ter ustrezne kemikalije in tehnike za pripravo raztopin. Za validacijo metode sem s pomočjo standardnih raztopin želela določiti linearnost, mejo zaznave, mejo določitve in ponovljivost meritev; glede na te parametre pa nato primerjati, katera od obeh metod je natančnejša in zanesljivejša. Ker je pojav fluorescence glede na sam mehanizem bolj specifičen od absorpcije UV svetlobe, sem pričakovala nižjo mejo zaznave in določitve pri HPLC-FL.

Naslednji korak je bil izris umeritvene krivulje in preko nje določitev vsebnosti kinurenske kisline v raztopinah različnih vzorcev medu. Glede na podatke iz literature sem za analizo izbrala nekaj vzorcev medu s pričakovano nizko koncentracijo kinurenske kisline, nekaj vzorcev s srednjo in nekaj z visoko koncentracijo. Predvsem sem želela potrditi predpostavko, da je vsebnost kinurenske kisline izrazito največja v kostanjevem medu.

(24)

(25)

11

3 Eksperimentalni del

3.1 Topilo

Za raztapljanje vzorcev in standardov sem uporabila 0,1% raztopino amonijaka (NH3) v MQ vodi. To topilo sem izbrala na podlagi testa topnosti, saj se je čista kinurenska kislina slabše raztapljala v čisti vodi, organskih topilih ali v rahlo kislem, brez težav pa se je raztopila v rahlo bazičnem.

3.2 Vzorci

Analizirala sem vzorce kostanjevega, lipovega in akacijevega medu; skupaj 12 vzorcev.

Točnega izvora medu ne poznam, saj sem vse vzorce skupaj dobila od podjetja Medex.

Vsak vzorec sem zatehtala in raztopila v 0,1% raztopini NH3, nato pa prefiltrirala skozi najlonski filter z velikostjo por 5μm. Filtriranje je iz raztopin odstranilo ostanke cvetnega prahu in drugih trdnih delcev - ti bi namreč lahko zamašili HPLC kolono.

3.3 Standardi

3.3.1 Osnovna standardna raztopina

Kot standard sem uporabila kinurensko kislino v prahu proizvajalca Sigma Aldrich (čistost ≥98%). Zatehtala sem 100mg standarda in ga raztopila v 0,1% NH3, da sem pripravila osnovno standardno raztopino z masno koncentracijo γ = 500 mg/L.

3.3.2 Standardne raztopine za umeritveno krivuljo

Osnovno standardno raztopino sem nadalje redčila z 0,1% NH3 in pripravila 8 standardnih raztopin za umeritveno krivuljo v razponu masnih koncentracij od γ = 0,2 mg/L do γ = 10 mg/L.

3.3.3 Raztopine za določitev ponovljivosti, LOD in LOQ

Za določitev ponovljivosti meritev sem iz osnovne standardne raztopine po petkrat pripravila dve od standardnih raztopin: γ = 0,5 mg/L in γ = 5 mg/L.

Za določitev meje zaznave in meje določitve sem standardne raztopine razredčila do še nižjih koncentracij, in sicer do γ = 0,001 mg/L.

3.4 Pogoji HPLC analize

Na HPLC napravi Hewlett Packard 1100 Series sem razvila naslednjo analizno metodo:

(26)

12

 Mobilna faza pri HPLC je bila sestavljena iz spremenljivih deležev acetonitrila (CH3CN) in 0,1% raztopine mravljične kisline (HCOOH) v MQ vodi.

 Sestava mobilne faze je bila med potekom ločbe prve 3 minute in zadnje 3 minute nespremenjena (potekala je izokratska elucija), v vmesnem času pa je delež acetonitrila naraščal z 10% na 90% in delež vodne raztopine mravljične kisline hkrati sorazmerno upadal (gradientna elucija, kot jo prikazuje slika 2).

Slika 2: Spreminjanje sestave mobilne faze med ločbo

 Pretok mobilne faze je znašal 1 mL/min.

 Valovna dolžina UV detekcije je bila nastavljena na 240 nm.

 Na FL detektorju je bila valovna dolžina vzbujanja nastavljena na 240 nm, valovna dolžina emisije pa na 410 nm.

 Uporabila sem HPLC XBridge kolono dimenzij 150 mm x 4,6 mm. Polnjena je bila s stacionarno fazo C8 z velikostjo delcev 3,5 μm.

 Tlak na koloni se je gibal okrog vrednosti 150 bar.

 Injekcijski volumen vzorca je bil 20 μL.

 Ločba je potekala 23 minut, na koncu pa so sledile še 3 minute izpiranja kolone.

Pri teh pogojih je na kromatogramih retencijski čas vrha za kinurensko kislino znašal 4,9 minut.

3.5 Spektrofotometrična določitev valovnih dolžin za FL detektor

Kot opisano pri točki 3.1, sem raztopine vzorcev in standardov pripravila v 0,1% NH3, ki ima bazičen pH (okrog 10). Kinurenska kislina je v bazičnem deprotonirala in tvorila

(27)

13

kinurenatni ion. Na HPLC koloni pa se je pod vplivom kisle mobilne faze (0,1%

HCOOH) ponovno protonirala in v taki obliki potovala do fluorescenčnega detektorja.

Slika 3: Prikaz deprotonacije molekule kinurenske kisline

Valovne dolžine vzbujanja in emisije se razlikujejo pri deprotonirani in protonirani obliki spojine. Da bi lahko določila te valovne dolžine za protonirano obliko kinurenske kisline, sem z nekaj kapljicami 0,1M HCl nakisala standardno raztopino kinurenske kisline z γ = 10 mg/L do pH = 2.

Na fluorescenčnem spektrofotometru Cary Eclipse sem nato s to raztopino posnela spektre v bazičnem in v kislem (sliki 4, 5).

Slika 4: Spekter vzbujanja v kislem in bazičnem

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

220 240 260 280 300 320 340 360

Intenziteta

Valovna dolžina vzbujanja (nm)

Spekter vzbujanja: 10 mg/L kinurenska kislina

pH = 2, emisijska λ = 400 nm pH = 10, emisijska λ = 380 nm

(28)

14

Slika 5: Emisijski spekter v kislem in bazičnem

Za protonirano obliko kinurenske kisline (v kislem) sem določila valovno dolžino vzbujanja 240 nm in valovno dolžino emisije 410 nm. Te parametre sem nato nastavila na fluorescenčnem detektorju na HPLC.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

250 300 350 400 450 500 550

Intenziteta

Valovna dolžina emisije (nm)

Emisijski spekter: 10 mg/L kinurenska kislina

pH = 2, vzbujevalna λ = 240 nm pH = 10, vzbujevalna λ = 280 nm

(29)

15

4 Rezultati in razprava

4.1 Umeritvena krivulja in validacija analizne metode

4.1.1 Umeritvena krivulja in linearnost Tabela 1: Meritve za izris umeritvene krivulje

γ standardne

raztopine (mg/L) A (UV detektor) A (FL detektor)

0,2 34,40 13,50

0,5 84,80 33,40

1,0 173,1 68,10

2,0 363,1 138,1

3,5 603,3 235,7

5,0 896,5 347,8

8,0 1431 556,6

10 1763 686,5

Slika 6: Umeritvena krivulja

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A

y (mg/L)

UMERITVENA KRIVULJA

(30)

16

Obe premici na grafu umeritvene krivulje sta linearni na celotnem območju merjenja.

Vrednost r² je pri meritvah na UV detektorju znašala 0,9997, pri meritvah FL detektorja pa 0,9998, kar pomeni, da se točke dovolj natančno prilegajo premici.

4.1.2 Ponovljivost pri pripravi raztopin

Standardni raztopini z γ = 0,5 mg/L in γ = 5 mg/L sem iz osnovne standardne raztopine pripravila vsako po petkrat in nato primerjala meritve med sabo. Podatki, standardni odkloni in relativni standardni odkloni (v odstotkih) meritev z UV detektorja in s FL detektorja so zbrani v tabeli 2. Relativni standardni odkloni se gibljejo med 0,01 in 0,05 - pretvorjeno v odstotke torej 1-5%.

Tabela 2: Podatki za oceno ponovljivosti

γ standarda (mg/L)

A (UV detektor)

A (FL

detektor) γ standarda (mg/L)

A (UV detektor)

A (FL detektor)

0,5 79,5 32,6 5 885,0 344,2

0,5 87,8 33,6 5 912,0 353,1

0,5 80,9 32,2 5 897,4 349,7

0,5 88,6 34,8 5 896,8 347,5

0,5 87,3 33,8 5 891,1 344,5

povprečje 84,8 33,4 povprečje 896,5 347,8

SD 4,27 1,03 SD 10,03 3,73

RSD 0,0504 0,0308 RSD 0,0112 0,0107

Ocenjujem, da gre za majhne odklone in dobro ponovljivost meritev, kar pomeni, da pri pripravi raztopin ni prihajalo do omembe vrednih napak.

4.1.3 Meja zaznave in meja določitve

Pri meritvah z UV detektorjem sem mejo zaznave ocenila na γ = 0,025 mg/L, mejo določitve pa na γ = 0,075 mg/L.

Pri meritvah s FL detektorjem sem mejo zaznave ocenila na γ = 0,002 mg/L, mejo določitve pa na γ = 0,005 mg/L.

Fluorescenčni detektor je torej lahko zanesljivo določil nižje koncentracije analita kot ultravijolični, saj je bil šum v primerjavi s signalom pri HPLC-FL približno 10x nižji kot pri HPLC-UV.

(31)

17

4.2 Določitev kinurenske kisline v vzorcih

4.2.1 Primeri kromatogramov vzorcev

Na slikah od 7 do 9 so prikazani trije kromatogrami vzorcev: primer akacijevega, lipovega in kostanjevega medu. Zgornja linija predstavlja signal z UV detektorja, spodnja pa s FL detektorja. Vrh za kinurensko kislino je označen in se nahaja pri retencijskem času 4,9 minut.

Slika 7: Kromatogram A043 (akacijev med, nizka vsebnost kinurenske kisline)

Slika 8: Kromatogram L061 (lipov med, srednja vsebnost kinurenske kisline)

(32)

18

Slika 9: Kromatogram K4 (kostanjev med, visoka vsebnost kinurenske kisline)

4.2.2 Vsebnost kinurenske kisline v vzorcih

V tabeli 3 so zbrani rezultati meritev vsebnosti kinurenske kisline v vzorcih medu.

Rezultati so podani na 2 veljavni mesti, z enoto miligram kinurenske kisline na gram medu. Upoštevano je povprečje meritev z obeh detektorjev (UV in FL) s podanim relativnim standardnim odmikom.

Tabela 3: Vsebnost kinurenske kisline v vzorcih

interna oznaka

vzorca vrsta medu w (mg/g) RSD (± %)

A105 akacijev 0,0011 12

A116 akacijev 0,00056 28

A043 akacijev 0,0010 11

A015 akacijev 0,0011 7

L061 lipov 0,021 4

L021 lipov 0,030 6

L051 lipov 0,038 7

L058 lipov 0,031 3

L131 lipov 0,063 4

K4 kostanjev 0,75 3

(33)

19

V primerjavi z lipovim medom je vsebnost kinurenske kisline v kostanjevem medu višja za približno 20-krat, v primerjavi z akacijevim pa kar 700-krat. Odklon meritev je pričakovano največji pri akacijevem medu, ker je pri majhnih količinah analita merjenje manj zanesljivo kot pri večjih količinah.

(34)

(35)

21

5 Zaključek

5.1 Povzetek ugotovitev

Ugotovila sem, da je glede na dostopno literaturo kinurenska kislina zanimiva in biološko zelo pomembna spojina, a so njeni vplivi na organizem še relativno slabo raziskani.

Potrdila sem, da se nahaja v vzorcih medu, in sicer največ v kostanjevem, najmanj pa v akacijevem medu. Tekočinska kromatografija z UV in FL detekcijo je primerna tehnika za določanje kinurenske kisline. Glede na določene parametre za validacijo analizne metode določanje s FL detekcijo omogoča zanesljivo zaznavo nižjih koncentracij kot pa UV detekcija.

5.2 Možnosti za izboljšavo metode in nadaljnje raziskovanje

Tekočinska kromatografija je za določanje kinurenske kisline v medu povsem primerna analizna tehnika, verjetno pa bi še zanesljivejše rezultate kot detektorja UV in FL dal detektor z masno spektrometrijo.

Validacijo analizne metode bi poleg parametrov, ki sem jih določala v tej diplomski nalogi, koristno dopolnila še npr. določitev izkoristka (angl. recovery). V primeru analize kinurenske kisline v medu bi ta parameter določili tako, da bi eni od raztopin vzorca z zelo nizko izmerjeno vsebnostjo analita dodali znano količino standardne raztopine (angl.

spiking) in jo analizirali na HPLC po običajnem postopku. Razlika med pričakovano (izračunano) in eksperimentalno vrednostjo bi nam dala informacijo o pravilnosti prvotne meritve analita v vzorcu, oziroma o vplivu matriksa na meritev [10].

Kinurensko kislino bi bilo seveda mogoče določiti še v mnogih drugih vrstah medu - sama sem izbrala akacijo, lipo in kostanj, ker so ti v literaturi navedeni kot primeri medu z nizko, srednjo in visoko koncentracijo te spojine. V tej diplomski nalogi so moji rezultati omenjene navedbe zanesljivo potrdili.

(36)

(37)

23

6 Literatura

[1] E. Crane, P. K. Visscher: Honey. V: Encyclopedia of Insects. 2. izd., H. Resh (ur.), R. T. Cardé (ur.), Oxford: Elsevier 2009, str. 459-461.

[2] M. Oroian: Measurement, prediction and correlation of density, viscosity, surface tension and ultrasonic velocity of different honey types at different temperatures. J.

Food Eng. 2013, 119, 167–172.

[3] P. M. da Silva, C. Gauche, L. V. Gonzaga, A. C. O. Costa, R. Fett: Honey: Chemical composition, stability and authenticity. Food Chem. 2016, 196, 309-323.

[4] M. P. Turski, M. Turska, W. Zgrajka, M. Bartnik, T. Kocki, W. A. Turski:

Distribution, Synthesis, and Absorption of Kynurenic Acid in Plants. Planta Med.

2011, 77, 858-864.

[5] M. P. Turski, S. Chwil, M. Turska, M. Chwil, T. Kocki, G. Rajtar, J. Parada-Turska:

An exceptionally high content of kynurenic acid in chestnut honey and flowers of chestnut tree. J. Food Compos. Anal. 2016, 48, 67-72.

[6] M. Turska, R. Rutyna, M. Paluszkiewicz, P. Terlecka, A. Dobrowolski, J. Pelak, M.

P. Turski, B. Muszyńska, W. Dabrowski, T. Kocki, T. Plech: Presence of kynurenic acid in alcoholic beverages – Is this good news, or bad news? Med. Hypotheses 2019, 122, 200-205.

[7] B. E. Wurfel, W. C. Drevets, S. A. Bliss, J. R. McMillin, H. Suzuki, B. N. Ford, H.

M. Morris, T. K. Teague, R. Dantzer, J. B. Savitz: Serum kynurenic acid is reduced in affective psychosis. Transl. Psychiatry 2017, 7.

[8] T. W. Jung, J. Park, J. L. Sun, S. H. Ahn, A.M. Abd El-Aty, A. Hacimuftuoglu, H.

Kim, J. Shim, S. Shin, J. H. Jeong: Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 2020, 518.

[9] P. Milart, P.Paluszkiewicz, P. Dobrowolski, E. Tomaszewska, K. Smolinska, I.

Debinska, K. Gawel, K. Walczak, J. Bednarski, M. Turska, M. Raban, T. Kocki, W.

A. Turski: Kynurenic acid as the neglected ingredient of commercial baby formulas.

Sci. Rep. 2019, 9.

[10] B. Pihlar, H. Prosen: Osnove analizne kemije. Ljubljana: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 2019, str. 11, 27, 35-36, 137-143, 166-168, 190.

(38)

24

[11] D. Dolenc: Vaje iz organske analize: navodila za laboratorijske vaje. Ljubljana:

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 2018, str. 52-58.

[12] M. Thompson, S. L. R. Ellison, R. Wood: Harmonized Guidelines for single- laboratory validation of methods of analysis (IUPAC Technical Report). Pure Appl.

Chem. 2002, 74, 835–855.

(39)

25