UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Anja ZUPANC
PROTIADHEZIVNA AKTIVNOST EKSTRAKTOV MIKROALG VRST Arthrospira platensis IN Chlorella
vulgaris NA ZOBNI POVRŠINI
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Živilstvo
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Anja ZUPANC
PROTIADHEZIVNA AKTIVNOST EKSTRAKTOV MIKROALG VRST Arthrospira platensis IN Chlorella vulgaris NA ZOBNI POVRŠINI
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Živilstvo
ANTIADHESIVE ACTIVITY OF Arthrospira platensis AND Chlorella vulgaris MICROALGAE EXTRACTS ON DENTAL SURFACE
M. SC. THESIS
Master Study Programmes: Field Food Science and Technology
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Živilstvo. Delo je bilo opravljeno na Katedri za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil na Oddelku za živilstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala izr. prof. dr.
Barbko Jeršek in za recenzentko prof. dr. Natašo Poklar Ulrih.
Mentorica: izr. prof. dr. Barbka JERŠEK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Recenzentka: prof. dr. Nataša POKLAR ULRIH
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Petra Terpinc
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: izr. prof. dr. Barbka Jeršek
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Nataša Poklar Ulrih
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum zagovora:
Anja Zupanc
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 579.61:616.314-083:579.24:582.2/.3(043)=163.6
KG mikroalge, ekstrakti, Arthrospira platensis, Chlorella vulgaris, zobne površine, protibakterijske lastnosti, protiadhezivna aktivnost
AV ZUPANC, Anja, dipl. inž. živ. in preh. (UN)
SA JERŠEK, Barbka (mentorica), POKLAR ULRIH, Nataša (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021
IN PROTIADHEZIVNA AKTIVNOST EKSTRAKTOV MIKROALG VRST
Arthrospira platensis IN Chlorella vulgaris NA ZOBNI POVRŠINI TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja Živilstvo)
OP X, 52 str., 4 pregl., 10 sl., 8 pril., 58 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Mikroalge proizvajajo zunaj- in znotrajcelične presnovke z različnimi biološkimi aktivnostmi, kot so protibakterijske in protiadhezivne lastnosti, zato so zanimive na različnih področjih, vključno pri preprečevanju obolenj v ustni votlini. Namen magistrskega dela je bil ugotoviti protibakterijske in protiadhezivne lastnosti ekstraktov mikroalg vrst Arthrospira platensis in Chlorella vulgaris z bakterijami vrst Streptococcus cristatus in Staphylococcus warner, ki so bile izolirane iz ustne votline. Minimalno inhibitorno koncentracijo (MIC) ekstraktov mikroalg MC, MS, CMAC in CMAS (M: ekstrakcija z metanolom; CMA: ekstrakcija z mešanico kloroforma, metanola in acetona; C: C. vulgaris; S.: A. platensis) smo določili z metodo razredčevanja v mikrotitrski ploščici. Za proučevanje bakterijske adhezije smo uporabili 0,1 MIC ekstraktov mikroalg. Protiadhezivne lastnosti ekstraktov smo določili najprej na polistirenski površini z metodo barvanja z barvilom kristal vijolično in v nadaljevanju na zobni površini z metodo štetja kolonij na trdnem gojišču. Rezultati so pokazali, da ima najboljšo protibakterijsko aktivnosti ekstrakt CMAS (MIC 10 mg/L). Pri subinhibitorni koncentraciji 0,1 MIC je protiadhezivno aktivnost imel ekstrakt CMAS pri bakterijah vrste Strep. cristatus, saj je bila adhezija na polistiren zmanjšana za 84 %, in pri bakterijah vrste Staph. warneri, kjer je bila adhezija zmanjšana za 36 %. Tudi na zobni površini je ekstrakt CMAS inhibiral adhezijo bakterij vrste Staph. warneri, medtem ko ni vplival na adhezijo bakterij vrste Strep. cristatus. Rezultati eksperimentalnega dela potrjujejo kompleksnost proučevanja bioaktivnih lastnosti naravnih ekstraktov, ki je odvisna od mnogih dejavnikov. Protibakterijska in protiadhezivna aktivnost ekstrakta je odvisna ne samo od vrste ekstrakta, ampak tudi od postopka ekstrakcije, vrste uporabljenega topila ter od postopka testiranja bioaktivnih lastnosti (npr. izbira topila, v katerem so ekstrakti raztopljeni, izbira bakterij, izbira površine, izbira metode) in od vrste uporabljenih mikroorganizmov. Dobljeni rezultati kažejo na protiadhezivne lastnosti ekstraktov mikroalg vrst A. platensis in C. vulgaris in nakazujejo možnosti njihove uporabe tudi na področju ustne higiene.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 579.61:616.314-083:579.24:582.2/.3(043)=163.6
CX microalgae, extracts, Arthrospira platensis, Chlorella vulgaris, dental surfaces, antibacterial activity, antiadhesive activity
AU ZUPANC, Anja
AA JERŠEK, Barbka (supervisor), POKLAR ULRIH, Nataša (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2021
TI ANTIADHESIVE ACTIVITY OF MICROALGAE EXTRACTS OF Arthrospira platensis AND Chlorella vulgaris ON DENTAL SURFACE
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Food Science and Technology) NO X, 52 p, 4 tab., 10 fig., 8 ann., 58 ref.
LA sl AL sl/en
AB Microalgae produce extracellular and intracellular metabolites with various biological activities, such as antibacterial and antiadhesive properties making them very interesting in various fields, including prevention of oral disease. The aim of the master thesis was to determine antibacterial and antiadhesive properties of Arthrospira platensis and Chlorella vulgaris microalgae extracts on Streptococcus cristatus and Staphylococcus warneri strains, isolated from oral cavity. Minimal inhibitory concentration (MIC) of MC, MS, CMAC and CMAS microalgae extracts (M: methanol extraction; CMA: extraction with mixture of chloroform, methanol and acetone; C: C. vulgaris; S: A. platensis) was determined by the microdilution method.
To study bacterial adhesion, we use 0,1 MIC of microalgal extracts. The antiadhesive properties of the extracts were determined first on polysryrene surface by crystal violet staining method and then on dental surface by colony count method. The results showed that CMAS extract had the best antibacterial activity (MIC 10 mg/mL). At a subinhibitory concentration of 0.1 MIC, CMAS extract had antiadhesive activity against Strep. cristatus, as adhesion to polystyrene was reduced for 84 %, while adhesion of Staph. warneri was reduced for 36 %. On the dental surface, CMAS extract inhibited the adhesion of Staph. warneri, while it had no effect on adhesion of Strep. cristatus. The results of the experimental work confirm the complexity of studying the bioactive properties of natural extracts, which depends on many factors. The results show that the antibacterial and anti-adhesive activity of the microalgal extract depend on the extraction process, the type of solvent used, and the procedure used to test the bioactive properties (e.g. choice of the solvent in which the extracts are dissolved, choice of bacteria, choice of the surface, choice of the method) and type of microorganisms used. Obtained results show the antiadhesive properties of A. platensis and C. vulgaris microalgae extracts and suggest their possible application in field of oral hygiene.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO SLIK VII
KAZALO PREGLEDNIC VIII
KAZALO PRILOG IX
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X
1 UVOD 1
1.1 CILJI IN HIPOTEZE 2
1.1.1 Cilji magistrske naloge 2
1.1.2 Hipoteze magistrske naloge 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 ČLOVEŠKI MIKROBIOM 3
2.2 USTNA VOTLINA 3
2.2.1 Zobje in zobna površina 4
2.2.2 Naselitev bakterij v ustni votlini 5
2.2.3 Bakterije v ustni votlini 5
2.2.3.1 Bakterije vrste Streptococcus cristatus 6
2.2.3.2 Bakterije vrste Staphylococcus warneri 6
2.2.4 Neravnovesja v ustni votlini 7
2.3 ADHEZIJA IN TVORBA BIOFILMA 7
2.3.1 Preprečevanje bakterijske adhezije 9
2.4 MIKROALGE 10
2.4.1 Mikroalge vrste Arthrospira platensis 11
2.4.2 Mikroalge vrste Chlorella vulgaris 12
2.4.3 Ekstrakti mikroalg vrst A. platensis in C. vulgaris 14
3 MATERIAL IN METODE 16
3.1 MATERIAL 16
3.1.1 Bakterije 16
3.1.2 Ekstrakti mikroalg 16
3.1.3 Mikrobiološka gojišča 17
3.1.4 Uporabljene raztopine in reagenti 17
3.1.5 Testne površine 18
3.1.6 Laboratorijska oprema in naprave 18
3.2 METODE 19
3.2.1 Zasnova poskusa in shema poteka dela 19
3.2.2 Oživitev bakterij 21
3.2.3 Priprava inokuluma 21
3.2.5 Priprava delovne raztopine ekstraktov mikroalg vrst A. platensis in C. vulgaris 21
3.2.6 Priprava raztopine resazurina 21
3.2.7 Protibakterijsko delovanje ekstraktov mikroalg 22 3.2.8 Protiadhezivno delovanje ekstraktov mikroalg na polistirenu 23 3.2.9 Protiadhezivno delovanje ekstraktov na zobni površini 24 3.2.10 Metoda štetja kolonij na trdnem gojišču 25
3.2.10 Statistična obdelava rezultatov 26
4 REZULTATI 27
4.1 PROTIBAKTERIJSKO DELOVANJE EKSTRAKTOV 27
4.2 PROTIADHEZIVNO DELOVANJE EKSTRAKTOV MIKROALG NA
POLISTIRENSKI POVRŠINI 29
4.2.1 Bakterije vrste Streptococcus cristatus 29
4.2.2 Bakterije vrste Staphylococcus warneri 30
4.3 PROTIADHEZIVNO DELOVANJE EKSTRAKTA MIKROALG VRSTE A.
platensis NA ZOBNI POVRŠINI 31
4.3.1 Bakterije vrste Streptococcus cristatus 31
4.3.2 Bakterije vrste Staphylococcus warneri 32
5 RAZPRAVA 33
5.1 PROTIBAKTERIJSKO DELOVANJE EKSTRAKTOV 33
5.2 PROTIADHEZIVNO DELOVANJE EKSTRAKTOV 35
5.3 PROTIADHEZIVNE LASTNOSTI EKSTRAKTOV NA ZOBNI POVRŠINI 37
6 SKLEPI 40
7 POVZETEK 41
8 VIRI 43
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO SLIK
Slika 1: Shematski prikaz zgradbe človeškega zoba (Hitij, 2011) ... 5 Slika 2: Shema rasti biofilma (Lin, 2017) ... 9 Slika 3: Liofilizirani ekstrakti iz mikroalg vrst Arthrospira platensis (a) in Chlorella vulgaris (b) ... 16 Slika 4: Shema eksperimentalnega dela ... 20 Slika 5: Primer načrta izvedbe metode razredčevanja v mikrotitrski ploščici za določitev minimalne inhibitorne koncentracije ekstraktov mikroalg ... 22 Slika 6: Primer načrta izvedbe metode za določitev protiadhezivnih lastnosti ekstraktov mikroalg v mikrotitrski ploščici ... 23 Slika 7: Vpliv ekstraktov mikroalg vrst Arthrospira platensis in Chlorella vulgaris na adhezijo bakterij vrste Streptococcus cristatus na polistirensko površino ... 29 Slika 8: Vpliv ekstraktov mikroalg vrst Arthrospira platensis in Chlorella vulgaris na adhezijo bakterij vrste Staphylococcus warneri na polistirensko površino ... 30 Slika 9: Vpliv ekstrakta CMAS na adhezijo pri bakteriji vrste Streptococcus cristatus na zobni površini ... 31 Slika 10: Vpliv ekstrakta CMAS na adhezijo pri bakterijah vrste Staphylococcus warneri na zobni površini ... 32
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Ekstrakti mikroalg vrst Chlorella vulgaris PROD1 in Arthrospira platensis F&M-C256 ... 16 Preglednica 2: Laboratorijske naprave ... 18 Preglednica 3: Laboratorijski pribor, uporabljen pri eksperimentalnem delu ... 19 Preglednica 4: Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) ekstraktov mikroalg vrst
Arthrospira platensis in Chlorella vulgaris za bakterije vrst Streptococcus cristatus in Staphylococcus warneri izolirane iz ustne votline ... 28
KAZALO PRILOG
Priloga A: Primer mikrotitrske ploščice pri vizualnem določanju minimalne inhibitorne koncentracije z raztopino resazurina pri ekstraktu mikroalg vrste Chlorella vulgaris, pridobljen z ekstrakcijo v metanolu
Priloga B: Primer mikrotitrske ploščice pri vizualnem določanju minimalne inhibitorne koncentracije z raztopino resazurina pri ekstraktu mikroalg vrste Arthrospira platensis, pridobljen z ekstrakcijo v metanolu
Priloga C: Primer mikrotitrske ploščice pri vizualnem določanju minimalne inhibitorne koncentracije z raztopino resazurina pri ekstraktu mikroalg vrste Chlorella vulgaris, pridobljen z ekstrakcijo v mešanici kloroforma, metanola in acetona
Priloga D: Primer mikrotitrske ploščice pri vizualnem določanju minimalne inhibitorne koncentracije z raztopino resazurina pri ekstraktu mikroalg vrste Arthrospira platensis, pridobljen z ekstrakcijo v mešanici kloroforma, metanola in acetona
Priloga E: Adherirane bakterije vrste Streptococcus cristatus na zobni površini
Priloga F: Planktonske celice bakterij vrste Streptococcus cristatus v gojišču TSB-KA Priloga G: Adherirane bakterije vrste Staphylococcus warneri na zobni površini
Priloga H: Planktonske celice bakterij vrste Staphylococcus warneri v gojišču TSB-KA
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI CFU Kolonijska enota (ang. Colony forming unit)
CMAC Ekstrakt mikroalg vrste Chlorella vulgaris PROD1, pridobljen z ekstrakcijo v mešanici kloroforma, metanola in acetona
CMAS Ekstrakt mikroalg vrste Arthrospira platensis F&M-C256,
pridobljen z ekstrakcijo v mešanici kloroforma, metanola in actona DNA Deoksiribonukleinska kislina
DMSO Dimetil sulfoksid (ang. Dimethyl sulfoxide) dH2O Destilirana voda
EPS Zunajcelične polimerne snovi (ang. Extracelular polymeric substances)
GC - MS Plinska kromatografija – masna spektrometrija (ang. Gas chromatography – mass spectrometry)
LC - MS Tekočinska kromatografija – masna spektrometrija (ang. Liquid chromatography – mass spectrometry)
MBC Minimalna baktericidna koncentracija (ang. Minimum bactericidal concentration)
MC Ekstrakt mikroalg vrste Chlorella vulgaris PROD1, pridobljen z ekstrakcijo v metanolu
MHB Tekoče gojišče Mueller Hinton
MIC Minimalna inhibitorna koncentracija (ang. Minimum inhibitory concentration)
MS Ekstrakt mikroalg vrste Arthrospira platensis F&M-C256, pridobljen z ekstrakcijo v metanolu
MTP Mikrotitrska ploščica
OD Optična gostota
PCR Verižna reakcija s polimerazo (ang. Polymerase chain reaction) PSs Polisaharidi iz mikroalg (ang. Polysaccharides obtained from
microalgae)
PUFA Večkrat nenasičena maščobna kislina (ang. Polyunsaturated fatty acid)
QS Medcelično komuniciranje (ang. Quorum sensing) Strep. cristatus Bakterije vrste Streptococcus cristatus
Staph. warneri Bakterije vrste Staphylococcus warneri TSA Trdno gojišče Triptični sojin agar TSB Tekoče gojišče Triptični sojin bujon
UV Ultravijolično sevanje
ŽMJ Mikrobiološka zbirka laboratorija za živilsko mikrobiologijo na oddelku za živilstvo Biotehniške fakultete
1 UVOD
Bakterije so v okolju ubikvitarne. Lahko so prosto plavajoče planktonske celice, lahko se pritrdijo na površino in tvorijo biofilm (Marshall in Blainey, 1991). V človeškem telesu je naseljenih vsaj desetkrat več bakterij, kot je število človeških celic (Huang in sod., 2011).
Te bakterije lahko koristno vplivajo na zdravje. Naseljene niso naključno, temveč specifično na določenem mestu. Mesta, na katerih jih je moč zaslediti, so npr. koža, ustna votlina, prebavila in spolni organi. V primeru pojavljanja na drugih predelih človeškega telesa, kjer niso specifični, lahko povzročajo nevarnost, kot sta vnetje ali okužba. Bakterije lahko tvorijo večvrstne skupnosti in razvijajo heterogene strukture, znane kot biofilmi. Tvorba biofilma je kompleksen pojav, ki vključuje več stopenj, od začetne adhezije do tvorbe zrelega tridimenzionalnega biofilma z mnogimi mikrobnimi interakcijami. Biofilme je mogoče najti skoraj povsod, npr. v ekosistemih, ki vsebujejo dovolj hranljivih snovi, in v okolju, kjer je prisotno vsaj malo vlage (Costerton in sod., 1995). Tudi ustna votlina je odlično okolje, kjer so bakterije najpogosteje naseljene v biofilmu (Huang in sod., 2011). V ustni votlini naj bi bilo več kot 700 različnih vrst bakterij (Hayashi in sod., 2015). Sestava bakterijske populacije znotraj ustne votline, ki vključuje tako trde (zobne) kot mehke (sluznico) površine, razpoke in subepitelijska tkiva, je odvisna od številnih okoljskih dejavnikov, kot sta pH in imunska aktivnost gostitelja. Bakterije rodu Streptococcus so primarni kolonizatorji zobnih površin, zato jih omenjajo kot prevladujoče bakterije v ustni votlini.
Poleg njih so tudi bakterije rodov Enterococcus, Actinomyces, Prevotella, Derxia, Fusobacterium in druge (Jenkinson, 1994). Bakterije, ki normalno naseljujejo ustno votlino, so odgovorne za ustno zdravje, medtem ko lahko druge bakterije povzročajo različna obolenja (Kreth in Herzberg, 2015).
Določene vrste bakterij so aktivnejše pri tvorbi biofilmov na zobni površini, zaradi česar prihaja do mnogih obolenj in s tem povezanih bolezenskih stanj, vključno s kariesom in parodontalno boleznijo (Hayashi in sod., 2015). Posledično lahko pride do izgube zob. Le- te je treba nadomestiti z zobnimi implantati ali protezami. Za tovrstno rehabilitacijo se uporabljajo različni materiali, kot so npr. različne kovine, akrilat, amalgam, nanohibridni kompoziti (Sivaraman in sod., 2018). A tudi na teh površinah ni izključena možnost nastanka biofilma. Za preprečevanje primarne in sekundarne okužbe imajo pomembno vlogo materiali s protimikrobnimi in protiadhezivnimi lastnostmi (Wang in sod., 2014).
Mikroalge so mikroskopsko majhni avtotrofni organizmi, ki izkoriščajo svetlobno energijo in jo s fotosintezo pretvorijo v kemijsko. Proizvajajo znotrajcelične in zunajcelične presnovke z različnimi biološkimi aktivnostmi, kot so protibakterijske, protiglivne, citotoksične, algicidne, imunosupresivne in protivirusne lastnosti. Večina teh bioaktivnih presnovkov, izoliranih iz mikroalg, se akumulira v biomasi, lahko pa jih alge tudi izločajo v okolje. Količina presnovkov se izloča v obliki prevleke, sluzi ali kapsul (Challouf in sod., 2011). Prva uporaba mikroalg sega nekaj tisoč let nazaj na Kitajsko, vendar sta se
proizvodnja in biotehnologija mikroalg začeli hitreje razvijati šele v sredini prejšnjega stoletja. Dandanes je njihova uporaba razširjena po vsem svetu (Priyadarshani in Rath, 2012). Poznanih je mnogo različnih vrst alg, ocenjujejo, da nekje med 30.000 in 1.000.000 različnih vrst. V grobem jih lahko glede na njihovo morfologijo razdelimo na zelene, zlato rjave, rjave, rdeče alge, evglenoide, dinoflagelate in diatomeje. Vsekakor sta med najbolj znanimi mikroalge vrst Arthrospira platensis in Chlorella vulgaris (Jeran in sod., 2020).
Mikroalge rodu Arthrospira, poznane kot mikroalge rodu Spirulina, so cianobakterije, bogate z beljakovinami, aminokislinami, vitamini in minerali. Zaradi pomembnih mikro- in makrohranil se vse več uporabljajo kot prehransko dopolnilo. Znane so tudi njihove bioaktivne lastnosti, saj z visokim deležem beljakovin, železa, alfalinolenske kisline in vitaminov izboljšajo zdravstveno stanje pri raznih alergijah, srčnožilnih boleznih, rakavih obolenjih, anemijah. Uporabljajo se tudi v farmacevtski industriji in pri proizvodnji biogoriv (Madeira in sod., 2017). Mikroalge rodu Chlorella so enocelične zelene mikroalge, ki se uporabljajo v zdravilne namene in kot dodatek hrani. Vsebujejo edinstveno in raznoliko sestavo funkcionalnih makro- in mikrohranil, vključno z beljakovinami, omega-3- maščobnimi kislinami, polisaharidi, vitamini in minerali. Klinične študije navajajo, da lahko dodatek mikroalg vrste C. vulgaris izboljša hiperlipidemijo in hiperglikemijo, ščiti pred oksidativnim stresom, rakavimi obolenji in kronično boleznijo pljuč (Panahi in sod., 2016).
Ekstrakti mikroalg rodov Arthrospira in Chlorella imajo tudi protimikrobni učinek in protiadhezivne lastnosti. Lastnosti so odvisne od različnih dejavnikov, kot sta način gojenja mikroalg ter način pridobitve bioaktivnih snovi (Alghaimi in Omran, 2020).
1.1 CILJI IN HIPOTEZE 1.1.1 Cilji magistrske naloge
Cilj magistrske naloge je bil preveriti, ali ekstrakti mikroalg vrst Arthrospira platensis in Chlorella vulgaris delujejo protibakterijsko na bakterije vrst Streptococcus cristatus in Staphylococcus warneri, izolirane iz ustne votline, in ali s protiadhezivnim delovanjem preprečujejo bakterijsko adhezijo na polistirenski in zobni površini.
1.1.2 Hipoteze magistrske naloge
H1: Protibakterijska aktivnost ekstrakta mikroalg vrste Chlorella vulgaris bo večja v primerjavi s protibakterijsko aktivnostjo ekstrakta mikroalg vrste Arthrospira platensis.
H2: Ekstrakti mikroalg vrst Arthrospira platensis in Chlorella vulgaris bodo na bakterije vrst Streptococcus cristatus in Staphylococcus warneri delovali protiadhezivno na polistirenski in zobni površini.
2 PREGLED OBJAV 2.1 ČLOVEŠKI MIKROBIOM
Zdravje je za ljudi največjega pomena in ni le odsotnost bolezni, ampak je stanje telesnega in duševnega blagostanja. Najboljši način, kako ohranjati zdravje in živeti zdravo in aktivno življenje, je odvisen od vsakega posameznika. A znanstveniki so ugotovili, da ključ do zdravja ne leži zunaj telesa, temveč znotraj. Za to so odgovorni majhni organizmi, mikroorganizmi, ki prebivajo v našem telesu (Sarojini, 2018).
Ljudje smo po genetski sestavi skoraj enaki, a majhne razlike v DNA povzročijo ogromno fenotipsko raznolikost. Ravno nasprotno je z metagenomom človeškega mikrobioma (celotno vsebnostjo DNA mikrobov našega telesa), ki je precej bolj spremenljiv. Človeško telo ni sterilno, temveč ga poseljujejo bakterije, virusi, arheje in evkarionti. Le-te tvorijo združbo mikroorganizmov, tako imenovani mikrobiom (Lloyd-Price in sod., 2016).
Mikroorganizmi so v človeškem telesu porazdeljeni specifično, na tkivih ali znotraj njih, kjer lahko tvorijo biofilme. Razloga specifične porazdelitve bakterij sta zgradba in fiziologija gostitelja. Porazdelitev bakterij je odvisna od strukture, imunskega sistema, temperature, vlage, dostopnosti hranil in drugih lastnosti gostitelja ter okolja (Proctor in Relman, 2017).
V človeškem telesu je naseljenih vsaj desetkrat več bakterij, kot je število človeških celic.
Človek ima kot gostitelj največ bakterij v prebavnem traktu, vaginalnem območju, na koži in v dihalnih poteh (Huang in sod., 2011). Nekoč je bilo nejasno, kako pomemben je točno določen del telesa za rast specifičnih bakterij. V raziskavi (Costello in sod., 2009), v kateri je sodelovalo osem ljudi, so vzorčili različna mesta na človeškem telesu in ugotovili, da je s prestavitvijo določene združbe bakterij na drugi del telesa ta manj raznolika in slabše raste.
Zato imajo biofilmi bakterij na človeškem telesu in v njem močno preferenco naselitve in kolonizacije. Človeški prebavni trakt vsebuje bogato in raznoliko mikrobioto. Veliko število črevesnih bakterijskih vrst na površini črevesne sluznice tvori goste biofilme. V črevesju najdemo skupaj približno 1014 različnih bakterij. V prebavilih večina mikroorganizmov kolonizira debelo črevo. Bakterijske celice v vaginalnem predelu pri zdravih ženskah običajno delimo na rezidenčne bakterije, nerezidenčne bakterije in občasno prebivajoče bakterije. Mikroorganizmi v zdravi nožnici ohranjajo ravnovesje z gostiteljem in okoljem.
Tudi ustna votlina ni izjema. Govorimo o zapletenem in raznovrstnem mikrobiomu (Huang in sod., 2011).
2.2 USTNA VOTLINA
Ustna votlina predstavlja prostor, kjer se začne prebavna pot. Gre za dinamičen ekosistem, v katerem se lahko zaradi spremenjenih razmer spreminja tudi mikrobna populacija (Proctor
in Relman, 2017). Toplo in vlažno okolje v ustni votlini z veliko hranilnimi snovmi je idealno za bakterijske združbe. A kljub temu so lahko nihanja v ustni votlini zelo velika, npr.
temperature se lahko gibajo od 0 do 70 °C v kratkem časovnem intervalu (nekaj sekund), podobno je tudi z razpoložljivostjo hranil ali spremembo pH (npr. uživanje kisle hrane) – naselitev ustne votline z mikroorganizmi je specifična za posamezno področje ali tkivo (Lin, 2017).
2.2.1 Zobje in zobna površina
Ljudje se rodimo brez zob, vendar se razvoj človekova zobovja začne v šestem tednu nosečnosti. Ločimo tri razvojna obdobja, ki se med seboj prekrivajo. Razvoj zoba se začne s pojavom zobne letvice. To razvojno obdobje imenujemo zgodnji razvoj zoba. Sledi mu drugo razvojno obdobje, in sicer izdelava zobnih tkiv. Ta se prične na griznem robu in se širi v apikalni smeri. V tem času nastanejo dlesen, zobna pulpa, pozobnica, alveolna kost, dentin, sklenina in cement. Nazadnje sledi obdobje izraščanja zob, ko se zob začne pomikati proti ustni votlini. Otroci imajo mlečne zobe. Teh je skupno 20, so manjši od stalnih zob in so mlečno bele barve zaradi slabše mineralizacije zobne krone. Po petem letu starosti začnejo izraščati stalni zobje, ki postopoma nadomestijo mlečne. V ustni votlini je takrat mešano zobovje. Ko zrastejo stalni zobje, govorimo o drugem rodu zob, ki jih je 32 (Hitij, 2011).
Zob je izrastek v čeljusti, sestavljen iz zobne krone in zobne korenine (Slika 1). Zobna tkiva so iz podobnega materiala kot kosti. Med zobno krono in zobno korenino se nahaja zobni vrat, ki je nejasno opredeljeni del, saj obsega tako nekaj krone kot tudi korenine ob skleninsko-cementni meji. Dentin, sklenina, zobni cement in zobna pulpa so tkiva, ki sestavljajo zob, medtem ko so zobni cement, pozobnica, alveolna kost in dlesen tkiva, ki sestavljajo obešalni aparat zoba. Obešalni aparat predstavlja prostor, kjer je zob pričvrščen v kost. Zob in obešalni aparat zoba skupaj sestavljata zobni organ. Zobje so del zgornje in spodnje čeljusti ter tako tvorijo zgornji in spodnji zobni lok. Zgornji zobni lok ima obliko elipse, medtem ko spodnji zobni lok obliko parabole. Osnovna naloga zob je trganje in žvečenje hrane. Pri ljudeh razlikujemo štiri vrste zob, in sicer sekalce, podočnike, ličnike in kočnike. Vsaka vrsta zob opravlja svojo funkcijo. Imamo osem stalnih sekalcev, ki tvorijo glasove, pomagajo voditi premike spodnje čeljusti, imajo lepotni pomen. Najpomembnejša naloga je, da z njimi odgriznemo hrano. Stalni podočniki so najdaljši zobje zaradi dolge korenine. Nahajajo se na meji med sekalci in ličniki, njihova naloga pa je trganje hrane in drobljenje grižljajev, tvorba glasov, vodijo stranske premike spodnje čeljusti in imajo prav tako lepotni pomen pri podpiranju lica in ustnic. Ličniki se nahajajo pod licem, imajo grizno ploskev, njihova naloga pa je žvečenje hrane. Prvi ličnik sodeluje s podočnikom pri trganju grižljaja, vzdržuje grizno višino ter podpira ustni kot in lice. Stalni kočniki se nahajajo čisto zadaj v ustni votlini, njihova značilnost pa je zelo velika grizna ploskev (od 3 do 6 vrškov).
Glavna naloga je žvečenje hrane, prav tako pa vzdržujejo grizno višino in podpirajo lice (Hitij, 2011).
Slika 1: Shematski prikaz zgradbe človeškega zoba (Hitij, 2011)
2.2.2 Naselitev bakterij v ustni votlini
Spreminjanje razmer v ustni votlini se dogaja ves čas, saj gre za dinamičen prostor. Dojenčki se rodijo brez zob in ostanejo brez njih do svojega šestega meseca starosti. Nato otrokom začnejo rasti mlečni zobje, ki jih postopoma izgubijo in nadomestijo s stalnim zobovjem v starosti od šest do dvanajst let. Pri dojenčkih kolonizirajo ustno sluznico bakterije vrst Strep.
salivarius in Strep. mitis. V trenutku, ko začnejo zobje izraščati, predstavljajo novo okolje za mikroorganizme. Tako je mogoče bakterije vrste Strep. sanguinis, ki prednostno kolonizirajo zobno sklenino, zaznati šele po izraščanju zob. Mikrobioto ustne votline lahko ločimo tudi glede na to, ali se bakterije nahajajo na ustni sluznici ali so na zobni sklenini (Proctor in Relman, 2017).
2.2.3 Bakterije v ustni votlini
Bakterije in biofilmi so sestavni del zdrave ustne votline (Lin, 2017). V ustni votlini naj bi bilo več kot 700 različnih bakterijskih vrst (Hayashi in sod., 2015). Te raznovrstne bakterije kolonizirajo zobe, jezik, ustno sluznico, trdo in mehko nebo, parodontalne žepe in druge predele, ki so del ustne votline. Porazdelitev bakterij v ustni votlini ni naključna. Naselitev specifičnih vrst bakterij na določenem delu ustne votline je pogojena z okoljskimi razmerami. Večina bakterij koristi človekovemu zdravju, saj omejijo rast patogenih mikroorganizmov, zagotavljajo okoljsko stabilnost, izboljšajo delovanje epitelijskih pregrad in pripomorejo k boljšemu delovanju imunskega sistema (Lin, 2017). Manjšina bakterij je škodljiva. Tekmovanje med koristnimi in škodljivimi bakterijami vodi v zdrav oziroma bolezenski status človeka. Konkurenca med predstavniki bakterijske ustne mikrobiote je precej zapletena (Huang in sod., 2011).
Mikrobiota v ustni votlini je dokaj stabilen sistem mikroorganizmov. Najpogosteje v ustni votlini najdemo bakterije rodov Streptococcus, Prevotella, Leptotrichia, Actinomyces, Fusobacterium, Capnocytophaga, Corynebacterium, Campylobacter, Porphyromonas, Lactobacillus, Bacteroides, Gemella in Eubacterium. Bakterije rodu Streptococcus spadajo med najpomembnejše bakterije ustne votline (Johansson in sod., 2016).
Mikrobiota ustne votline zdravega posameznika je povezana s številnimi dejavniki, ki jih Gao in sod. (2018) razvrstijo kot:
• čas (človeška mikrobiota je personalizirana in se sistematično spreminja glede na del dneva),
• starost,
• prehrana (bakterije v ustni votlini se spreminjajo glede na način prehranjevanja),
• spremembe razmer v ustni votlini,
• drugi dejavniki (obstajajo močne povezave med tem, ali so bili posamezniki dojeni kot dojenčki; spol),
• čiščenje zob.
2.2.3.1 Bakterije vrste Streptococcus cristatus
Strep. cristatus je vrsta bakterij, ki precej spominja na bakterije vrste Strep. sanguis, vendar ima fibrile drugače razporejene. Ti sevi so bili prvotno izolirani iz človeškega grla in so jih imenovali Strep. sanguis I oziroma skupina čopastih fibrilov, ker niso imeli dovolj fenotipskih podatkov, ki bi omogočili zanesljivo razlikovanje vrst. Bakterije vrste Strep.
cristatus se od drugih vrst rodu Streptococcus razlikujejo po tem, da lahko hidrolizirajo arginin, ne pa eskulina, lahko proizvajajo L-fukozidazo, medtem ko P-glukozidaze ali alkanalne fosfataze ne. Ti podatki z rezultati DNA-hibridizacije in nenavadne ultrastrukture čopastih fibrilov, določenih z elektronsko mikroskopijo, potrjujejo njihovo identifikacijo.
Bakterije vrste Strep. cristatus so grampozitivne, katalaza negativne in se združujejo v verižicah. Kolonije so po dveh dneh rasti pri 37 °C na gojišču s krvjo sivkasto bele, svetleče, in alfahemolitične s premerom od 1 do 2 mm (Handley in sod., 1991).
2.2.3.2 Bakterije vrste Staphylococcus warneri
Bakterije rodu Staphylococcus so značilni predstavniki mikrobiote kože. V raziskavi, ki so jo izvedli v Severni Karolini in New Jerseyu, sta Kloos in Schleifer (1975) identificirala štiri nove vrste stafilokokov, ki sta jih klasificirala na podlagi sekvenc 16S rRNA in glede na morfološke, fiziološke in biokemične lastnosti. Te štiri vrste stafilokokov so Staph. warneri, Staph. capitis, Staph. hominis in Staph. simulans. So grampozitivne bakterije s celicami v obliki kokov, ki se pojavljajo pretežno v parih in posamično, občasno so v tetradah. Kolonije bakterij so okrogle, na sredini rahlo povišane, gladke, svetleče ter neprosojne. Premer kolonij
je od 3 do 5 mm. Gre za katalaza pozitivne, oksidaza in koagulaza negativne bakterije (Kloos in Schleifer, 1975).
2.2.4 Neravnovesja v ustni votlini
Spremembe v ustni votlini lahko vodijo do raznih bolezni. Kserostomija (suha usta) je ena od sprememb, ki vpliva na spremembo mikrobiote v ustni votlini. Zaradi bakterij v zobnih oblogah lahko pride do kariesa, ki je še vedno najpogostejša bolezen ustne votline (Hayashi in sod., 2015). Leta 2010 naj bi prizadela 2,4 milijarde ljudi. Prehod iz zdravega v bolezensko stanje lahko povzročijo razne bolezni, kot so gingivitis, parodontitis ter okužba in zavrnitev zobnih vsadkov (Lin, 2017). Zobni karies in parodontoza sta najpogostejši bolezni, ki sta posledici delovanja bakterij v ustni votlini. Te bolezni povzročajo mešane bakterijske populacije. Osrednje bakterije pri tovrstnih okužbah so bakterije vrst Strep. sanguis, Strep.
mutans, Lb. buccalis, saj so le-te pogosto prvi mikroorganizmi, ki kolonizirajo ustno površino in so številčno prevladujoči mikroorganizmi v človeških ustih. Medsebojni vplivi drugih bakterij iz ustne votline s peroralnimi bakterijami vrste Strep. mutans so ključni za razvoj mešanih mikrobnih skupnosti in za prehod iz zdravega v bolezensko stanje.
Streptokoki proizvajajo vrsto zunajceličnih snovi, ki spodbujajo njihovo vključevanje v biofilme in jim tudi omogočajo komunikacijo z ostalimi vrstami bakterij. Gre za majhne signalne molekule, kot so bakteriocini, sekundarni metabolni produkti, vključno z vodikovim peroksidom in mlečno kislino ter vrsto zunajceličnih encimov (Jakubovics in sod., 2014). Poleg tega raziskave kažejo, da so bakterije v ustni votlini vpletene v možnost nastanka drugih bolezni (npr. srčnožilnih) in jih kot ustne mikrobiome, ki vplivajo na ustno higieno in na splošno zdravje, vedno bolj proučujejo (Lin, 2017).
2.3 ADHEZIJA IN TVORBA BIOFILMA
Bakterije so majhni enocelični organizmi s spremenljivo hidrofobnostjo celičnih površin.
Bakterijske celice so lahko prosto plavajoče in jih imenujemo planktonske celice, lahko pa se pritrdijo in adherirajo na površino in tvorijo biofilm (Marshall in Blainey, 1991).
Adhezija bakterij je splet delovanja specifičnih proteinov, ki medsebojno delujejo in ustvarjajo biomehansko točko prenosa med celičnim aktinskim citoskeletom in njegovim okoljem. Osrednji element tega prenosa je adhezijski receptor integrin, heterodimerni transmembranski protein, ki se veže zunajcelično na ligande. Adhezija je posledica delovanja proteinskih adapterjev, ki se vežejo na integrin ter tudi drug na drugega. Ko se celica torej izpostavi površini, se nanjo najprej vežejo proteini in s tem se ustvari proteinska plast, ki je odvisna od lastnosti površine. Oprijem je določen s privlačnimi in odbojnimi silami med površinama. Na površini se začnejo kopičiti tudi hranilne snovi, zato prihaja do elektrostatskih privlačnih sil, hidrofobnih interakcij in povezovanja molekul z vpletenostjo mehanskih sil. Ker so elektrostatske sile večinoma odbojne, bolj vplivajo na oprijem
hidrofobne interakcije. Na bakterijskih celicah pa so prisotni tudi adhezini, s katerimi celice z molekularnimi interakcijami premagujejo odbojne sile med celico in površino (MacKay in Khadra, 2020).
Biofilm lahko opišemo kot kompleksno skupnost mikroorganizmov, pri čemer so mikrobne celice pritrjene na biološke ali nebiološke površine (Cao in sod., 2019). Najpomembnejša značilnost biofilma je proizvodnja zunajceličnih polimernih snovi (EPS), v katere so bakterije vgrajene in zaščitene pred različnimi dejavniki (Malhotra in sod., 2019). Biofilm je sestavljen iz skupkov celic, ki predstavljajo do 35 % suhe mase, glavna komponenta pa je voda, katere vsebnost je lahko do 97 %. V biofilmu najdemo tako žive kot tudi nežive bakterije ter EPS, ki ga sestavljajo polisaharidi, eDNA (zunejcelične molekule DNA), lipidi in proteini. Biofilm lahko sestoji iz več različnih vrst bakterij ali pa iz ene vrste ali celo seva bakterij. Bakterije znotraj biofilma se glede metabolizma razlikujejo od planktonskih celic.
Bakterije v biofilmu medsebojno komunicirajo s pošiljanjem signalov, ki uravnavajo gensko izražanje sosednjih bakterij in ta pojav imenujemo medcelično sporazumevanje (QS, ang.
quorum sensing) (Cao in sod., 2019).
Rast biofilma je zelo kompleksen pojav, v katerem si sledi pet stopenj (Slika 2), ki so adhezija planktonskih celic, reverzibilno in ireverzibilno pritrjevanje bakterij, kolonizacija, rast in zorenje biofilma ter razpad biofilma (Malhotra in sod., 2019). Eden od ključnih celičnih organelov, ki omogoča nastanek biofilma, so flagele, njihova funkcionalnost in stroga regulacija rotacije. Flagele omogočajo gibljivost in s tem omogočajo bakterijskim celicam, da dosežejo površino in željen habitat uspešneje v primerjavi z bakterijami, ki flagel nimajo. Začetno pritrjevanje bakterij na površino je šibko, nato se lahko bakterije tudi sprostijo. V naslednji fazi tvorbe biofilma je vezava celic nepovratna. Na površini se z različnimi mehanizmi ireverzibilno adherirajo in ob tem začnejo izločati EPS. To izločanje EPS je pomembno, saj omogoča interakcije celic s površino, kamor se le-te adherirajo, prav tako omogočajo interakcije z ostalimi celicami, ki nato tvorijo biofilm. V matriksu celic so pomembni tudi proteini, ki imajo strukturno in fiziološko funkcijo. Ko stopnja kolonizacije celic napreduje, se mikrobna združba razvije v zrel biofilm s kompleksno tridimenzionalno strukturo. Medtem ko biofilm raste v kompleksnosti, bakterije izločajo specifične molekule, ki lahko delujejo kot kemijski signali in tako komunicirajo med seboj. Znotraj biofilma bakterije kažejo heterogenost in igrajo različne vloge glede na njihovo lokacijo. Ko biofilm dozoreva, je njegova možnost preživetja kljub neugodnim okoljskim razmeram (kot sta omejenost hranil ali kisika) boljša. Bakterije prehajajo iz biofilma pasivno ali aktivno – individualno ali v skupinah in tako se lahko razširijo v novo okolje. V končni fazi, ko postaja konkurenca glede hranil in kisika vse večja, bakterije začnejo zapuščati biofilm in se pritrdijo na drugem mestu, kjer začnejo z rastjo novega biofilma (Cao in sod., 2019).
Slika 2: Shema rasti biofilma (Lin, 2017)
2.3.1 Preprečevanje bakterijske adhezije
Številne bakterije so se adaptirale na zelo raznolika okolja in razvile mehanizme, ki jim omogočajo adhezijo na različne površine in tvorbo biofilmov v različnih okoljskih razmerah.
Ravno zaradi tega je zaviranje in preprečevanje bakterijske adhezije precej težavno. A kljub temu obstajajo metode, s pomočjo katerih lahko preprečimo ali vsaj zmanjšamo adhezijo, oz. metode, s katerimi odstranimo biofilm in te so npr. redno čiščenje in razkuževanje površin, uporaba kemijskih sredstev, uporaba materialov, ki ovirajo bakterijsko oprijemanje in premazovanje površin s protimikrobnimi sredstvi (Hori in Matsumoto, 2010).
Uporaba protimikrobnih sredstev je enostaven in pogosto uporabljen način za nadzor bakterijske adhezije. Mikroorganizmi v biofilmih so na splošno odpornejši proti protimikrobnim sredstvom kot planktonske celice. Zlasti odpornost patogenih bakterij v biofilmih proti antibiotikom je vzrok številnih bakterijskih okužb. Klor, kot najpogostejše uporabljeno razkužilo, je zmerno oksidativen in reagira z različnimi sestavinami bakterijskih celic. Vendar je učinkovitost klora v boju proti bakterijam v biofilmu nekajkrat manjša kot pri planktonskih celicah. Poleg klora je pogosto uporabljen biocid tudi srebro. Zaradi stalne uporabe istih kemikalij postanejo mikroorganizmi nanje odporni, zato kombinacija dveh protimikrobnih sredstev poveča protimikrobno učinkovitost, kar bi bila učinkovita strategija za preprečevaje bakterijske adhezije (Hori in Matsumoto, 2010).
Način preprečevanja bakterijske adhezije je tudi površinska modifikacija materialov. Z vezavo različnih spojin na površino bi ustvarili modifikacijo površine in s tem preprečili začetno pritrjevanje celic. Površinsko modicifirano steklo, s spojino polietilen oksid, je zaviralo bakterijsko adhezijo z zmanjšanjem elektrostatskega privlaka med celicami in površino za 98 %., s spojino poli-4-vinil-N-heksilpiridin bromid za 94 %. Za preprečevanje bakterijske adhezije poročajo o metodi, ki temelji na elektroodbojnih interakcijah. Pri tem gre za elektroodbojno interakcijo med bakterijami z negativnim površinskim nabojem in površino (Hori in Matsumoto, 2010).
Planktonske celice
Reverzibilna in ireverzibilna adhezija Kolonizacija in rast biofilma Razpad zrelega biofilma
2.4 MIKROALGE
Mikroalge so mikroskopsko majhni avtotrofni organizmi, ki izkoriščajo svetlobno energijo ter jo s fotosintezo pretvorijo v kemijsko. Na ta način iz enostavnih molekul proizvajajo večje molekule za sintezo različnih bioaktivnih komponent, kot so beljakovine, lipidi, polisaharidi in vitamini. Ta njihov potencial proizvodnje bogatih hranilnih snovi ali uporaba za energijo je splošno priznan in precej uporaben v primerjavi z višjimi rastlinami (Priyadarshani in Rath, 2012). Gre za skupino enoceličnih organizmov, ki jih lahko imenujemo tudi fitoplankton (Tang in sod., 2020).
Prva omenjena uporaba mikroalg v prehrani človeka sega 2000 let nazaj na Kitajsko, kjer je tamkajšnje prebivalstvo uporabilo Nostoc (zelena cianobakterija) kot hrano in s tem preživelo lakoto (Priyadarshani in Rath, 2012).
Mikroalge so izredno uporabne in so kot take komercialno zanimive. Gre za genetsko zelo raznoliko skupino organizmov s širokim razponom fizioloških in biokemijskih lastnosti.
Tako naravno proizvajajo veliko različnih bioaktivnih spojin (Priyadarshani in Rath, 2012).
Zaradi enostavnih načinov gojenja (potrebujejo namreč le vodo, sončno svetlobo in CO2), hitre rasti ter sposobnosti preživetja v težkih razmerah se dandanes uporabljajo za različne industrijske namene (Tang in sod., 2020).
Letno se na svetu proizvede približno 7000 ton suhe biomase alg. Postopek pridobivanja biomolekul na osnovi biomase mikroalg se začne z izbiro ustreznega seva mikroalg kot tudi načina gojenja, ki mu sledi nadaljnja predelava biomase (npr. predobdelava, obiranje, ekstrakcija in čiščenje). Biogoriva in bioproizvodi so končni proizvodi. Mikroalge se lahko gojijo šaržno, polkontinuirano ali kontinuirano v odprtih ali zaprtih sistemih v različnih načinih gojenja. Ko dosežejo svojo zrelo fazo, sledi nabiranje, ki obsega kemijske, biološke in mehanske metode. Gre za pomemben korak ločitve biomase mikroalg od gojišča. Le tako je omogočena učinkovita ekstrakcija in čiščenje spojin z visoko vrednostjo iz biomase mikroalg za nadaljnjo predelavo (Tang in sod., 2020).
Številne sodobne zdravstvene težave, kot so razne alergijske reakcije in hiperaktivnost, pripisujejo uporabi sintetičnih spojin v hrani, izdelkih za nego kože in farmacevtskih izdelkih. Potrošniki vse bolj posegajo po izdelkih, proizvedenih iz naravnih virov. Mikroalge predstavljajo velik potencial, saj proizvajajo mnogo koristnih bioloških snovi, kot so polisaharidi, lipidi, beljakovine, encimi, vitamini in karotenoidi, ki jih je mogoče komercializirati na različne načine (Tang in sod., 2020). Poleg uporabe v hrani pa se mikroalge uporabljajo tudi v ribogojstvu, perutninarstvu, farmacevtski industriji in pri proizvodnji biogoriv (Priyadarshani in Rath, 2012). Na trgu se je povpraševanje po proizvodih iz mikroalg in njihovo gojenje močno povečalo, še posebno od leta 2005 naprej.
Na tržišču najdemo številne izdelke na osnovi mikroalg, ki so pridobljeni iz različnih
mikroalg rodov Chlorella in Arthrospira. Kljub temu izzivi, povezani z uporabo visoko kakovostnih spojin iz biomase mikroalg, v velikem obsegu še vedno ostajajo, predvsem zaradi visokih ekonomskih stroškov, povezanih s predelavo biomase. Proizvajalci tovrstnih izdelkov morajo biti pozorni tudi na varnost izdelkov, predvsem zaradi kemikalij, ki se uporabljajo pri gojenju, pobiranju in čiščenju spojin iz mikroalg (Tang in sod., 2020;
Michalak in sod., 2020).
2.4.1 Mikroalge vrste Arthrospira platensis
Mikroalge vrste Arthrospira platensis so modro-zelene avtotrofne mikroalge, ki so bolj znane pod komercialnim imenom Spirulina, z najpomembnejšima vrstama A. maxima in A.
platensis. So spiralne oblike in imajo celično membrano, celično steno in zunanjo membrano. Mikroalge se razmnožujejo nespolno s celično delitvijo. Minerale pridobivajo iz anorganskih virov v okolju. Uspevajo v plitvih alkalnih ribnikih in jezerih, kjer je pH v območju od 9 do 11, koncentracija soli pa zelo visoka (okoli 30 g/L). Takšno okolje je za večino drugih organizmov neprimerno (Soni in sod., 2017).
Zapisi o mikroalgah vrste A. platensis in njihovi uporabi v prehrani segajo že v leto 1519.
Odkrili naj bi jih španski raziskovalec Hernando Cortez in konkvistadorji v Mehiki. Tam naj bi jo Azteki, prebivalci Mehike, pridobivali iz jezera Texcoco, kjer se danes nahaja Mexico City. Azteki naj bi jo potem posušili in iz nje izdelovali nekakšen kruh in ga nato prodajali (Belay, 2008). O mikroalgah vrste A. platensis je pisal tudi Pierre Dangeard, francoski raziskovalec alg (fikolog). Leta 1940 je prejel vzorec omenjene cianobakterije od francoskega kolega farmakologa iz ekvatorialne Afrike, blizu današnjega jezera Čad.
Njegovi zapisi pravijo, da naj bi tam uživali nekakšne piškote iz posušene biomase cianobakterij, ki naj bi jih domačini poimenovali Dihe in jih prodajali na lokalni tržnici.
Dihe je bil prehranski produkt filamentov, spiralno oblikovan iz modrih alg vrste A.
platensis, ki so jo pridobili iz jezer ali ribnikov, jo posušili in razkosali. Njegovo poročilo je ostalo neopaženo, a je 25. let pozneje mikroalge vrste A. platensis na novo odkril belgijski botanik J. Leonard. Ta naj bi potrdil, da je bila Diha sestavljena iz posušene biomase mikroalg vrste A. platensis, ki je bila požeta iz jezera v bližini jezera Čad. Leta 1996 so Francozi v Lake Texococu postavili prvi komercialni proizvodni obrat za proizvodnjo mikroalg vrste A. platensis v prehranske namene (Belay, 2008).
Letno se mikroalg vrste A. platensis proizvede ogromno, že samo v proizvodnem obratu v ZDA v največji sezoni približno 3 tone na dan. Najboljši čas, ki je primeren za žetev teh mikroalg, je zgodaj zjutraj, in sicer iz treh razlogov: (i) delež proteinov v mikroalgah rodu Arthrospira je najvišji zjutraj, (ii) nizke temperature omogočajo boljše delovne razmere in (iii) preostanek dneva je namenjen sušenju biomase. Proces pridobivanja biomase poteka s pomočjo dveh korakov. Prvi je filtracija, s katero pridobijo biomaso, ki vsebuje približno 10
% suhe snovi. Drugi korak je odstranjevanje ostankov gojišča, pridobljena biomasa ima
približno 20 % suhe snovi. Pridobivanje tovrstnih mikroalg poteka s filtriranjem, ki omogoča učinkovito zbiranje in ločevanje mikroalg rodu Arthrospira iz gojišča. Nato so uporabljene različne tehnike pridobivanja biomase, in sicer filtracije, flotacije, centrifugiranja in ionske izmenjave (Soni in sod., 2017).
Mikroalge vrste A. platensis vsebujejo zelo veliko makro- in mikrohranil. Poznane so kot bogat vir biološko aktivnih komponent, kot so beljakovine, maščobne kisline, ogljikovi hidrati, vitamini in pigmenti (Michalak in sod., 2020). So odličen vir beljakovin, saj le-te predstavljajo od 60 do 70 % suhe teže. Beljakovine so lahko prebavljive in vsebujejo vse esencialne aminokisline. Med aminokislinami najvišje vrednosti predstavlja levcin (10,9 % vseh aminokislin), sledita mu valin (7,5 %) in izolevcin (6,8 %) (Sanchez in sod., 2003).
Zaradi tega so mikroalge vrste A. platensis boljše od rastlinskih virov beljakovin. Kot bogat vir vitaminov je opredeljena zaradi vsebnosti vitaminov C in E. Vsekakor pa prevladujeta provitamin A in vitamin B12. Zaradi tega so mikroalge odličen dodatek pri zdravljenju anemije. Mikroalge vrste A. platensis vsebujejo med 4 in 7 % maščob, med drugim tudi esencialne maščobne kisline, kot sta linolna in α-linolenska. Okoli 14 % je ogljikovih hidratov. Mikroalge vrste A. platensis v celični steni nimajo celuloze, zaradi česar so primerne za ljudi s slabo črevesno absorpcijo (Sanchez in sod., 2003). Mikroalge so odličen vir mineralov, kot so železo, kalcij, krom, baker, magnezij, fosfor, kalij, natrij in cink (Soni in sod., 2017). Železo iz mikroalg vrste A. platensis se 60-odstotno bolje absorbira kot iz drugih prehranskih dodatkov. Mikroalge vrste A. platensis vsebujejo tudi pigmente, ki so odgovorni za značilno barvo. Največ je klorofila, najdemo pa tudi karotene in lutein (Sanchez in sod., 2003; De Jesus Raposo in sod., 2015).
2.4.2 Mikroalge vrste Chlorella vulgaris
Mikroalge vrste C. vulgaris so enocelične zelene alge kroglaste oblike s premerom od 2 do 10 µm (Li in sod., 2013). Imajo togo celično steno, ki ohranja celično obliko in predstavlja zaščito pred zunanjim okoljem. Debelina in sestava celične stene nista konstantni in se spreminjata glede na fazo rasti in okoljske razmere. V celici so prisotni tudi mitohondriji in kloroplasti, zato precej spominja na rastlinsko celico. Mikroalge vrste C. vulgaris so negibljive celice, ki se razmnožujejo nespolno. Ena celica mikroalge vrste C. vulgaris se v optimalnih razmerah razmnožuje z avtosporulacijo. Pri tem se v matični celici oblikujejo štiri hčerinske celice, ki imajo svojo celično steno. Po zorenju teh novo nastalih celic se stena matične celice razgradi, kar omogoča sproščanje hčerinskih celic in preostalih ostankov matične celice (Safi in sod., 2014).
Letna proizvodnja mikroalg je v letu 2009 dosegla 2000 ton suhe mase, ki je danes že presežena (Safi in sod., 2014). Glavni proizvajalci so Japonska, Nemčija in Tajvan, glavni porabniki pa Japonska, ZDA in evropske države (Li in sod., 2013). Hitra rast in prilagajanje na okolje predstavljata odlično možnost za proizvodnjo omenjene mikroalge. V normalnih
razmerah rasti se vsebnost beljakovin v mikroalgah povečuje, medtem ko se pri neugodnih razmerah poveča vsebnost lipidov in škroba. Omejevanje dušika in fosforja, visoka koncentracija CO2, prekomerna izpostavljenost svetlobi ali zvišanje temperature so dejavniki, ki predstavljajo stres za mikroalge vrste C. vulgaris in zato se njena produktivnost zniža ali celo ustavi. Postopki čiščenja mikroalg so različni. Najpogostejša tehnika je centrifugiranje in predstavlja 20–30 % stroškov proizvodnje biomase. Postopek je zelo učinkovit, ni zamuden in omogoča obdelavo velikih količin. Uporabljajo se tudi druge metode, kot so flokulacija, flotacija in filtracija ali kombiniranje dveh metod – za pridobitev čim večje količine biomase. V fazi eksponentne rasti imajo celice mikroalg visok negativni površinski naboj in jih je težko nevtralizirati, zato se celice odbijajo. V stacionarni fazi se negativni naboj zmanjša, kar omogoča, da se celice združijo in tvorijo grudice, kar povzroči proces, imenovan avtoflokulacija. Do avtoflokulacije lahko pride tudi z interakcijami med mikroalgami in bakterijami ali izločenimi organskimi molekulami. Flotacija se lahko pojavi tudi naravno, ko se poveča vsebnost lipidov v mikroalgah. Ta metoda torej ne zahteva sintetičnih kemikalij, vendar njena ekonomska uspešnost še ni znana, zlasti v industrijskem obsegu. Filtracija je metoda, ki vključuje neprekinjeno prehajanje mešanice z mikroalgami preko filtra, na katerem se celice mikroalg stalno koncentrirajo, do določene debeline. Zaradi majhne velikosti mikroalg vrste C. vulgaris se uporablja ultra- ali mikrofiltracija. Na potek filtracij vplivajo različni parametri, kot so vrsta filtra, transmembranski tlak, hitrost filtracije, turbulentno križanje in faza rasti (Safi in sod., 2014).
Mikroalge vrste C. vulgaris vsebujejo številne bioaktivne molekule. Zaradi bogate hranilne vrednosti se mikroalge uporabljajo kot prehranski dodatek in dodatek krmi. C. vulgaris ima antioksidativno in protivnetno delovanje, poleg tega naj bi preprečevala nastanek tumorjev.
Ti učinki so posledica vsebnosti beljakovin, lipidov, vitaminov in mineralov in ostalih pomembnih spojin (Habashy in sod., 2018). Beljakovine so osrednjega pomena pri kemijski sestavi mikroalg. Skupna vsebnost beljakovin v zrelih mikroalgah vrste C. vulgaris predstavlja 42–58 % suhe biomase in se spreminja glede na razmere rasti. V normalnih razmerah rasti lahko doseže 5–40 % lipidov v suhi masi. Te so v glavnem sestavljene iz glikolipidov, voskov, fosfolipidov in manjših količin prostih maščobnih kislin (triacilglicerolov). Kljub temu lahko v neugodnih razmerah rasti vsebnost lipidov doseže 58
%. Ogljikovi hidrati predstavljajo skupino reducirajočih sladkorjev in polisaharidov, kot sta škrob in celuloza. Škrob je najpogostejši polisaharid v mikroalgah vrste C. vulgaris. Eden najpomembnejših polisaharidov je β-glukan (1,3). Najpogostejši pigment je klorofil, ki lahko doseže 1–2 % suhe mase. Mikroalge vsebujejo tudi pomembne količine karotenoidov, ki delujejo kot pomožni pigmenti. Pigmenti so bioaktivne molekule, saj delujejo antioksidativno, imajo zaščitni učinek proti degeneraciji mrežnice, uravnavajo holesterol v krvi, preprečujejo kronične bolezni (srčnožilni rak in rak debelega črevesa) ter krepijo imunski sistem. Mikroalge vrste C. vulgaris so odličen vir mineralov in vitaminov (Safi in sod., 2014). Številne raziskave so pokazale izjemen potencial C. vulgaris na okoljskem področju. Zaradi visoke tolerance in sposobnosti odstranjevanja onesnaževal se pogosto
uporabljajo za čiščenje različnih vrst odpadnih vod (tekstilne, kanalizacijske, komunalne, kmetijske). Zagotavljajo odstranjevanje hranil, CO2, težkih kovin in patogenov, ki so prisotni v odpadnih vodah (Wang in sod., 2018). Poleg tega ekstrakti modro-zelenih alg izločajo veliko snovi, ki vplivajo na rast in razvoj rastlin, zato se jih uporablja tudi v agrokmetijske namene (Safi in sod., 2014).
Poleg širokega spektra uporabe zaradi bioloških in farmakoloških lastnosti se mikroalge vrste C. vulgaris uporabljajo za proizvodnjo biogoriv (Kumar in sod., 2020). Mikroalge vsebujejo veliko lipidov in hitro rastejo (Wang in sod., 2019). C. vulgaris je ena redkih mikroalg, ki jo lahko na trgu najdemo kot prehransko dopolnilo, aditiv, barvilo ali emulgator za živila. Ti izdelki so pojavljajo v različnih oblikah – kot kapsule, tablete, ekstrakti in prah (Safi in sod., 2014).
2.4.3 Ekstrakti mikroalg vrst A. platensis in C. vulgaris
Ekstrakti različnih mikroalg imajo protimikrobno in protiadhezivno aktivnost, vendar je za izvajanje raziskav in proučevanje bioloških funkcij bioaktivnih komponent mikroalg pomembna prava izbira ekstrakta. Ključnega pomena v metodah ekstrakcije aktivnih spojin iz mikroalg je izbira topila. Ekstrakti mikroalg so namreč heterogena mešanica polarnih in nepolarnih spojin. Topila, ki se običajno uporabljajo pri ekstrakciji, so heksan, kloroform in eter kot nepolarna topila ter etil acetat, metanol, aceton in diklorometan kot polarna topila.
Pri ugotavljanju protimikrobnih in protiadhezivnih lastnosti sta pomembni koncentracija ekstraktov ter izbira testnih sevov (Lopez in Soto, 2019).
Raziskav, ki bi poročale o protimikrobni in protiadhezivni aktivnosti ekstraktov mikroalg vrst A. platensis in C. vulgaris oziroma molekul, pridobljenih iz tovrstnih mikroalg, je malo (Lopez in Soto, 2019). Kljub temu v izbrani literaturi navajajo spojine, ki so odgovorne za protimikrobno delovanje in pomembne pri inhibiciji adhezije (Lopez in Soto, 2019; De Jesus Raposo in sod., 2015).
Biološko aktivne učinkovine, ki jih mikroalge sintetizirajo, so znotrajcelični in zunajcelični produkti (De Jesus Raposo in sod., 2015). Glavne bioaktivne komponente, pridobljene iz mikroalg rodu Chlorella, so karotenoidi, sulfati, polisaharidi, steroli, omega-3 večkrat nenasičene maščobne kisline (PUFA), kloforil, glikozidi, terpenoidi, flavonoidi, fenoli in tanini. Glavne bioaktivne komponente, pridobljene iz mikroalg rodu Arthrospira, pa so polisaharidi, fenolne kisline, tokoferoli, omega-3 večkrat nenasičene maščobne kisline (PUFA), oleinska, linolenska in palmitoleinska kislina (Lopez in Soto, 2019; Jafari in sod., 2018).
Polisaharidi (PSs) in oligosaharidi so kompleksne in heterogene makromolekule, ki jih sintetizirajo mikroalge vrst A. platensis in C. vulgaris s protimikrobnimi in protiadhezivnimi
lastnostmi. Polisaharidna bioaktivna komponenta, ekstrahirana iz mikroalg vrste A.
platensis, je spirulan, iz mikroalg vrste C. vulgaris pa β-(1,3)-glukan. Ti dve spojini s spodbujanjem proizvodnje in ekspresije receptorja dektin-1 in drugih podobnih receptorjev v bakterijah povzročata protibakterijski in protiadhezivni odziv, poleg tega pa imata še protivirusno in proliferativno delovanje ter preprečujejta rast celic tumorja (De Jesus Raposo in sod., 2015). Singh in sod. (2021) so iz metanolnega ekstrakta mikroalg vrste A. platensis identificirali dve specifični bioaktivni molekuli s protibakterijskim in protivirusnim delovanjem, N-arahidonoil dopamin in fluokinolon. N-arahidonoil dopamin je pokazal interakcijo z encimom sterol-14-alfa demetilaza, medtem ko fluokinolon vpliva na OMP-F protein, ki je prisoten v zunanjih membranah bakterij. Maščobne kisline z več kot 10 ogljikovimi atomi so tiste, ki so identificirane iz ekstraktov mikroalg vrste C. vulgaris s protibakterijskimi lastnostmi (Alwathnani in Perveen, 2017). Etanolni ekstrakti iz mikroalg vrst C. vulgaris in Dunaliella salina naj bi prispevali k zaviranju nastanka biofilma, ki ga povzročajo bakterije vrste Strep. mutans na zobni površini (Lopez in Soto, 2019). Jafari in sod. (2018) so pokazali protimikrobne in protiadhezivne lastnosti ter zaviralne učinke mikroalg vrst D. salina in C. vulgaris pri bakterijah vrste Strep. mutans. Inhibicijo adhezije s pomočjo vodnih in etanolnih ekstraktov mikroalg rodu Chlorella na bakterije vrste P.
aeruginosa so preučevali Gayatri in sod. (2019). V študiji, pri kateri so uporabili ekstrakte mikroalg vrst A. platensis, raztopljene v metanolu, so ugotavljali njihov potencial pri preprečevanju tvorbe biofilma (LewisOscar in sod., 2017).
3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL
3.1.1 Bakterije
Za magistrsko nalogo smo pri praktičnem delu uporabili dva bakterijska seva, in sicer bakterije vrst Streptococcus cristatus ŽMJ476 ter Staphylococcus warneri ŽMJ478. Oba seva sta bila izolirana iz človeških ustnih votlin (Kokalj, 2018). Pred začetkom izvedbe poskusa sta bila seva shranjena v zmrzovalniku pri –80 ℃.
3.1.2 Ekstrakti mikroalg
Pri eksperimentalnem delu smo uporabili štiri različne ekstrakte (Preglednica 1). Vse ekstrakte smo pridobili iz Univerze v Firencah (Universita degli Studi di Firenze, Firence, Italija; posredoval jih je dr. Alberto Niccolai). Ekstrakta z oznakama MC in CMAC sta bila pridobljena iz mikroalg vrste Chlorella vulgaris PROD1 (Slika 3b), medtem ko sta bila ekstrakta z oznakama MS in CMAS pridobljena iz mikroalg vrste Arthrospira platensis F&M-C256 (Slika 3a). Ekstrakte smo iz Italije dobili v liofilizirani obliki (Preglednica 1).
Raztopili smo jih v metanolu, tako da smo dobili koncentracijo 40 mg/mL. Raztopljene ekstrakte smo razdelili v alikvote po 0,5 mL in jih shranili pri –20 ℃.
Preglednica 1: Ekstrakti mikroalg vrst Chlorella vulgaris PROD1 in Arthrospira platensis F&M-C256 Oznaka
ekstrakta Mikroalge – vrste Masa mikroalge
(mg)
Topilo za
ekstrakcijo Masa liofiliziranega
ekstrakta (mg)
Volumen metanola (mL) MC Chlorella vulgaris
PROD1 1004,6 metanol 282,1 7,05
MS Arthrospira platensis
F&M-C256 1000,6 metanol 121,9 3,05
CMAC Chlorella vulgaris
PROD1 1011,3 kloroform,
metanol, aceton
159,6 3,99
CMAS Arthrospira platensis
F&M-C256 1008,3 kloroform, metanol,
aceton
137,4 3,44
Slika 3: Liofilizirani ekstrakti iz mikroalg vrst Arthrospira platensis (a) in Chlorella vulgaris (b) (Niccolai, 2020)
(a) (b)
3.1.3 Mikrobiološka gojišča
Za mikrobiološke preiskave smo uporabili trdno gojišče TSA s 5 % ovčjo krvjo (TSA-KA), tekoče gojišče TSB s 5 % ovčjo krvjo (TSB-KA) ter tekoče gojišče TSB. Vse smo pripravili po navodilih proizvajalcev:
• trdno gojišče TSA (triptični sojin agar, ang. Tryptic Soy Agar, Biolife, 4021502, Milano, Italija),
• tekoče gojišče TSB (triptični sojin bujon, ang. Tryptic Soy Broth, Biolife, 4021552, Milano, Italija),
• trdno gojišče KA (krvni agar z ovčjo krvjo, ang. Blood Agar Base, Merck, 110886, Dermstad, Nemčija; defibrirana ovčja kri, Biognost, Zagreb, Hrvaška),
• TSA-KA (triptični sojin agar s 5 % ovčje krvi),
• TSB-KA (triptični sojin bujon s 5 % ovčje krvi),
• tekoče gojišče MHB (Mueller Hinton bujon, ang. Mueller Hinton buyon, CM0405, Oxoid, Velika Britanija).
Gojišče TSA-KA smo pripravili tako, da smo v 750-mililitrsko steklenico zatehtali 20 g TSA in z merilnim valjem dolili 475 mL dH2O. Vse smo dobro premešali, da se je TSA povsem raztopil, in avtoklavirali (15 min pri 121 ℃). Po avtoklaviranju smo gojišče ohladili in v brezprašni komori aseptično dodali 25 mL ovčje krvi in gojišče razlili na plošče. Plošče smo do uporabe shranili v hladilniku pri 4 ℃.
Gojišče TSB-KA smo pripravili tako, da smo v 750-mililitrsko steklenico zatehtali 15 g TSB in z merilnim valjem dolili 475 mL dH2O. Vse smo dobro premešali, da se je TSB povsem raztopil, in avtoklavirali (15 min pri 121 ℃). Po avtoklaviranju smo gojišče ohladili in v brezprašni komori aseptično dodali 25 mL ovčje krvi. Pripravljeno gojišče smo do uporabe shranili v hladilniku pri 4 ℃.
3.1.4 Uporabljene raztopine in reagenti
• fiziološka raztopina, pripravljena s kalijevim dihidrogen fosfatom (KH2PO4) (Merck, 1.06404.1000, Darmstadt, Nemčija),
• destilirana voda (dH2O),
• resazurin (Sigma, 1002435299, Nemčija),
• menadion (Sigma, 101124963, Nemčija),
• barvilo kristal vijolično (Grams crystal violet solution, Merck, 1.09218.2500, Dermstadt, Nemčija),
• metanol (Merck, 1.06009.100, Darmstadt, Nemčija),
• ciren (Sigma-Aldrich, 807796, Darmstadt, Nemčija),
• DMSO – dimetilsulfoksid (Merck, 1.02931.1000, Darmstadt, Nemčija),
• Etanol, 96 %, denaturirani (ITRIJ, 1170, Kropa, Slovenija),
• ocetna kislina, 100 % (Merck, 1.00063.2500, Nemčija).
3.1.5 Testne površine
Protiadhezivno delovanje ekstraktov na bakterijske celice smo preizkušali na dveh različnih površinah – na polistirenu in na zobni površini. Polistirensko površino je predstavljala mikrotitrska ploščica (MTP) s 96 luknjicami, narejena iz polistirena (Thermo Fisher Scientific, Whaltam, MA, ZDA). Zobno površino so predstavljale zobne ploščice humanega izvora. Zobne ploščice smo pridobili iz Univerze v Firencah (Universita degli Studi di Firenze, Firence, Italija). Dr. Alberto Niccolai je zobne ploščice oblikoval, očistil, steriliziral in izmeril površino vsake ploščice. Zobne ploščice je dr. Alberto pridobil od zobozdravnikov, ki so mu zagotovili, da gre za zdrave zobe po njihovi ekstrakciji, tako od moških kot tudi žensk, starih med 38 in 73 let. Bolniki so bili z darovanjem vnaprej seznanjeni. Skupno smo imeli na voljo 79 sterilnih zobnih ploščic, ki so bile posamično shranjene v 1,5-mililitrskih sterilnih epruvetah, ki so bile označene in z izmerjeno površino.
3.1.6 Laboratorijska oprema in naprave
V Preglednici 2 so prikazane pri eksperimentalnem delu uporabljene laboratorijske naprave.
Preglednica 2: Laboratorijske naprave Laboratorijska naprava Proizvajalec in država
analitska tehnica Sartorius analytic, Nemčija
avtoklav Sutjeska, Jugoslavija
avtomatske pipete Eppendorf, Nemčija
čitalec mikrotitrskih ploščic varioskan, Thermo scientific, ZDA
digestorij smbc 122 av, Iskra pio d. o. o., Slovenija
hladilnik Lth, Slovenija
inkubator Kambič, Slovenija
jeklenka z mešanico plinov Un 1956, Slovenija
brezprašna komora Thermo scientific, ZDA
namizno mešalo Vibromix 10, tehtnica, Slovenija
plinski gorilnik Usbeck, Nemčija
stresalnik mikrotitrskih plošč Eppendorf, Nemčija
sušilnik Salondry compact, Phillips, ZDA
spiralec mikrotitrskih plošč Integra vacusafe, Švica
tehtnica Mettler, toledo, Švica
ultrazvočna kopel Omnilab 950, bl pharma 425 000001268
vodna kopel Kambič, Slovenija
zamrzovalna skrinja –80 ℃ heto ultra freeze
V Preglednici 3 je prikazan laboratorijski pribor, ki smo ga uporabili pri eksperimentalnem delu.
Preglednica 3: Laboratorijski pribor, uporabljen pri eksperimentalnem delu Laboratorijski pribor Proizvajalec in država
avtomatske pipete in nastavki Eppendorf, Nemčija
brisi Flmedical, Italija
cepilne zanke Vwr, Velika Britanija
centrifugirke, 15 ml Tpp, Švica
kivete Brand, Nemčija
epruveta, 1,5 ml Sarstedt, Nemčija
petrijeve plošče labortehnika Golias, Slovenija
parafilm Pechiney plastic packaging company, ZDA
polistirenske mikrotitrske ploščice s 96 luknjicami
Thermo fisher scientific, Whaltam, ZDA
steklene čaše in epruvete Brand, Nemčija
Poleg že zgoraj naštetega pribora in opreme (Preglednica 3) smo uporabljali še zaščitno haljo, rokavice za enkratno uporabo, plastična očala, alkoholni flumaster za označevanje, pisalo, papirnate brisačke, trak za avtoklaviranje, trikotno palčko za razmaz, škarje, stojalo za epruvete, alufolijo, pinceto in žlice.
3.2 METODE
3.2.1 Zasnova poskusa in shema poteka dela
Na Sliki 4 je prikazana shema poteka eksperimentalnega dela in po korakih opisano zaporedje uporabljenih metod.
Slika 4: Shema eksperimentalnega dela
